Forelesning uke 36 Båndspredning: Den totale båndspredningen i en kromatografisk kolonne vil være lik summen av de individuelle båndspredningsprosessene. Båndspredningen kan angis i form av platehøyden, og hver båndspredningsprosess gir sitt bidrag til denne parameteren: Eddy-diffusjon, bidrag H E Longitudinal diffusjon, bidrag H L assetransportbegrensninger i mobilfasen, bidrag H assetransportbegrensninger i stillestående mobilfase, bidrag H S assetransportbegrensninger i stasjonærfasen, bidrag H S Den totale platehøyden blir: H = H E + H L + H + H S + H S De enkelte båndspredningsprosessene er knyttet til fysiske forhold i kolonnen. Bidragene fra båndspredningsprosessene kan beregnes: H E = λd P λ: materialavhengig konstant, d p : partikkeldiameter H L 2γ D B u u = = γ: konstant, D : analyttens diffusjonskoeffisient i mobilfasen, ū : lineær mobilfasehastighet d H = u = u : platehøydekoeffisient, øvrige symboler som før. ' 2 p D For åpne kolonner erstattes d p av kolonnediameteren d c. d H = u = u S : platehøydekoeffisient, øvrige symboler som før. ' 2 S p S S D ' 2 S f S S DS d H = u = u S : platehøydekoeffisient, d f : tykkelse på stasjonærfaselaget, D S : diffusjonskoeffisient i stasjonærfasen. Platehøyden kan nå skrives som: B H= A+ + ( + + ) u u S S Denne likningen kalles for van Deemter likningen. 1
Relativ betydning av de enkelte ledd i van Deemter likningen for to vanlige kromatografiske systemer: Båndspredningsledd HPL pakket kolonne G åpen kolonne A - Eddydiffusjon Viktig d p avgjørende Bortfaller i åpne kolonner. B Longitudinal diffusjon indre viktig, D er liten. Viktig p.g.a. store D. massetransport i P Viktig, avhenger av d p, og D Av betydning, avhenger av D og d f. S massetransport i stillestående P S assetransport i SP Viktig, avhenger av d p, D og partiklenes porøsitet. Av betydning, avhenger av D S og d f. Lite viktig. Viktig, avhenger av D S og d f. Generelt sett oppnås best resultat i et HPL-system for kolonner pakket med små, ikkeporøse partikler, lave lineære mobilfasehastigheter og størst mulig diffusjonskoeffisienter. For G-systemer basert på åpne kolonner oppnås best resultat for smale kolonner med tynne stasjonærfaser under forhold hvor bæregasshastigheten er optimal. Optimalisering av mobilfasehastigheten. For å optimalisere mobilfasehastigheten plottes van Deemter likningen for det aktuelle kromatografiske systemet. Den generelle formen til van Deemter-likningen er vist under. Der kurven har sitt minimum leser vi av den minste platehøyden for systemet, og følgelig også den optimale mobilfasehastigheten. H (mm) H min u opt u(cm/s) Figur 1: Generell form på van Deemter kurven. Optimal mobilfasehastighet avleses i minimumspunktet til kurven. 2
obilfasens optimale hastighet kan også formuleres matematisk. I kurvens minimumspunkt er tangenten til kurven lik null, dvs: dh d B B = A+ + u = + = 0 2 du du u u Vi løser for mobilfasehastigheten: u opt = B Den minimale platehøyden, H min, blir da: B H B min = A+ + = A+ 2 B B Båndspredning utenfor kolonnen Hittil har vi bare sett på båndspredningsfenomener i den kromatografiske kolonnen. Prosesser utenfor kolonnen vil imidlertid også bidra til den totale båndspredningen: Dødvolum i detektor Dødvolum i koblinger Dødvolum i detektor Båndspredning i rør pga. diffusjonsprosesser og laminær strømning Dårlig arbeidsteknikk Båndspredningsprosesser som finner sted før prøven går inn på den kromatografiske kolonnen er mest kritisk. 3
KVANTITATIV ANALYSE Kvantitativ analyse i kromatografi bygger på sammenhengen mellom mengde stoff som når en detektor og hvordan detektoren reagerer på denne stoffmengden. Detektorens respons registreres som toppene i et kromatogram, der selve kvantifiseringen skjer ved utmåling av toppenes areal eller deres høyde (husk at for symmetriske topper så er topphøyden proporsjonal med toppens areal). Vi skiller mellom 4 kvantifiseringsmetoder: Intern standard metode Ekstern standard metode Standard tilsetting metode Arealnormaliseringsmetoden Intern standard metode Topparealet til en topp, A, er proporsjonalt med mengde stoff av komponent X som har nådd detektoren: A = D Q (1) RF Q er mengde av stoff, proporsjonalitetsfaktoren D RF er detektorresponsfaktoren for komponent X. Stoffmengden Q som har nådd detektoren er proporsjonal med konsentrasjonen ( ) av analytten X og volumet (v i ) av prøven som har blitt injisert på kromatografen: Q vi I intern standard metode skjer kvantifiseringen ved å sette til en kjent mengde av en referansesubstans til den ukjente prøven. Arealet av intern standardtoppen blir: A = D Q (2) IS RFIS IS Ved å dele likning (1) på likning (2) får vi: A D Q D v D = = = A D Q D v D RF RF i RF IS RFIS IS RFIS i IS RFIS IS Vi kan eliminere injeksjonsvolumene v i, da intern standard og prøve som kjent befinner seg i samme injeksjonsvolum. Konsentrasjonen til den ukjente komponent X kan nå beregnes ut fra kjent konsentrasjon av intern standard og detektorresponsfaktorene: A D = der D = A D D IS ' RF ' RF IS RF RFIS D RF kalles for den relative (detektor)responsfaktoren. 4
I praksis er det ikke nødvending å ha kjennskap til den relative responsfaktoren. Kvantifisering skjer i stedet ved å plotte arealforholdene som funksjon av konsentrasjonsforholdene for et passende antall standardløsninger (normalt 5 stk.). Ved å gå inn på standardkurven ved målt arealforhold i ukjent prøve, kan konsentrasjonsforholdet i den ukjente prøven avleses direkte. Siden mengden av intern standard tilsatt prøven er kjent, kan vi regne oss tilbake til mengden av analytt opprinnelig i prøven. A /A IS A prøve /A IS prøve / IS / IS Figur 2: Standardkurve for intern standard metode. Ekstern standard metode I de tilfeller hvor prøveopparbeidingen stort sett består i å lage prøveløsninger, kan ekstern standard metode benyttes til kvantifisering. Teknikken forutsetter at man har stabile, reproduserbare injeksjonsvolum på kromatografen. I ekstern standard metode sammenliknes arealtellinger for prøven direkte med arealtellinger fra analyser av standardløsninger med kjente konsentrasjoner. Ved å trekke en kalibreringskurve som gir sammenhengen mellom arealtellinger og konsentrasjon, kan man gå inn direkte på kurven og avlese konsentrasjonen av analytt i prøveløsningen. A A prøve prøve Figur 3: Standardkurve for ekstern standard metode. 5
Standard tilsetting metode I denne metoden deles den opprinnelige prøven opp i flere deler. En av delprøvene analyseres slik den er, og arealtellingen A 0 registreres. Til den neste delprøven tilsettes en viss mengde av analytten, slik at konsentrasjonen i denne prøven øker med et kjent inkrement. Prøven analyseres og det nye topparealet A 1 registreres. For de øvrige delprøvene økes analyttkonsentrasjonen med et tilsvarende antall inkrementer (eksempelvis 2 opprinnelig inkrement, 3 opprinnelig inkrement, osv.). Dette gir opphav til en pseudo-standardkurve, der arealtellingene plottes som funksjon av økningen i analyttkonsentrasjonen. Ved å ekstrapolere kurven til null arealtellinger, kan den opprinnelige konsentrasjonen i prøven avleses som avstanden langs -aksen fra origo til skjæringspunktet. etoden forutsetter, som for ekstern standard metode, at man i utgangspunktet har høy grad av reproduserbarhet i injeksjonsvolumene. Signal A 4 Opprinnelig konsentrasjon leses av som avstanden langs -aksen. A 3 A 2 A 1 A 0-2X -X X 2X 3X 4X engde stoff tilsatt Figur 4: Standardkurve for standard tilsetting metode. Konsentrasjonen i ukjent prøve avleses som avstanden langs -aksen fra origo til skjæringspunkt. 6
Arealnormalisering Ved arealnormalisering blir alle topparealene summert, og innholdet av hver forbindelse blir angitt som den prosentvise andelen av totalarealet: A i Areal i % = 100% Ai i Denne metoden vil gi riktig relativ sammensetning hvis alle forbindelser har den samme detektorresponsen. Hvis dette ikke er tilfellet, må arealene korrigeres for ulikheter i detektorresponsen ved å multiplisere hvert toppareal med forbindelsens arealresponsfaktor: Korrigert areal = målt areal arealresponsfaktor Det korrigerte arealet, A corr, brukes deretter i formelen for arealnormaliseringen. 7