Nutec NORSK UNDERVANNSTEKNOLOGISK SENTER A.S Postboks 6, 5034 Ytre Laksevåg. Telefon (05) 34 16 00. Telex: 42892 nulec n. Telefax: (05) 34 47 20 Rapport nr: 1-93 Revisjon nr: 0 Dato: Prosjekt nr: 12.03.93 11230.3 Rapportens tittel: Kontrollert av: E. Thorsen / // TESTING AV HYPERBAR TOKSISITET I ET BIOLOGISK MODELLSYSTEM Godkjent av: - B.K. Kambestad Klient/oppdragsgiver: EIf Petroleum Norge A/S FUDT (Norsk Hydro, Statoil, Oljedirektoratet) Klientsikontaktpersons referanse: P.B. Ellingsen, Eif, C. Hordnes, N. Hydro J.M. Ertsaas, Statoil, J.A. Ask, Oljedir. Arbeidet utført av: Rapportskiver signtur: Rune Djurhuus, Anne Gurd Lindrup og Harald Sundland ALti- - t.i, i / Sammendrag: Rapporten beskriver et ekspenmentelt modellsystem for testing av toksiske, kjemiske forbindelser under hyperbare forhold. Dette innebærer bruk av museceller dyrket i kultur og eksponering av disse for toksiske forbindelser i kombinasjon med 50 bar overtrykk (0.4 bar O, 49.6 bar He). Den toksiske effekten på cellene er målt ved bestemmelse av cellekolonidannelse (Idoneeffektivitet) etter en 24 t eksponering for toksisk agens og trykk, og ved inhibering av cellevekst etter 72 timers kontinuerlig eksponering for toksisk agens og trykk. Forsøk med kaprolaktam og fenol viste at trykkeljgassblandingen økte den toksiske effekten av både kaprolaktam og fenol, men den kombinerte effekten av trykket og kaprolaktam eller fenol var omtrent lik det en additiv effekt av de to skulle tilsi. Trykkei/gassblandingen i seg selv hadde en meget betydelig toksisk/veksthemmende effekt på cellene. Eksponering i 24 t for 50 bar med etterfølgende vekst ved 1 bar i 7 døgn reduserte kloneeffektivitet med gjennomsnittlig 48 %, mens kontinuerlig eksponering av kulturene i 72 timer reduserte veksten med 38.4-87.9 % i forhold til kontroll. Cellekultursystemet så ut til å være godt egnet for å studere akutt-toksiske effekter under hyperbare forhold, både av trykket i seg selv og av forskjellige kjemiske forbindelser under trykk. Flere cellekultursystemer bør imidlertid benyttes for å bekrefte og kvantifisere universelle effekter og om mulig etablere kvantitative sammenhenger mellom toksikologiske data fra dyremodeller og tilsvarende verdier fra cellekultureksperimenter. Dette vil gi et bedre grunnlag for fastsettelse av hyperbare grenseverdier for toksiske kjemiske forbindelser. Emneord på engelsk: Cell culture - Hyperbaric Toxicity Testing Chemicals Emneord på norsk: Cellekultur Hyperbar Toksisitet Testing Kjemikalier C ERKLÆRING VED FORDELING: Fortrolig Graderingen gjelder til: frigivelse ISBN: 82-7280-282-1 Fri Distribusjon U akiifuig tlllatcl,c fra N1TTEC ml rqpxmn ikka gjcigia aiit mm i in bftrt Antall Sider : 27
INNHOLD INNLEDNING 3 2 MATERIALE OG METODER 6 2.1 KJEMIKALIER 6 2.2 CELLELINJE OG KULTURBETINGELSER 6 2.3 EKSPONERING AV CELLEKULTURER FOR TRYKK 6 2.4 BESTEMMELSE AV KLONEEFFEKTIVITET 6 2.5 BESTEMMELSE AV VEKSTINHIBERING 7 2.6 PREPARERING AV TESTSUBSTANS 7 3 RESULTATER 8 3.1 INNLEDENDE FORSØK KAPROLAKTAM 8 3.2 INNLEDENDE FORSØK 2,4-TOLUEN DIISOCYANAT 8 3.3 EKSPONERING FOR KAPROLAKTAM OG FENOL UNDER HYPERBARE BETINGELSER 8 3.4 EFFEKT AV HØYT TRYKK 10 4 DISKUSJON 11 4.1 EKSPONERING FOR TOKSISKE AGENS 11 4.2 EKSPONERING FOR HØYT TRYKK 12 4.3 VURDERING AV METODIKK OG FORSLAG TIL VIDERE ARBEID 13 5 KONKLUSJON 15 6 REFERANSER 16 7 FIGURER 19
virker inn i denne sammenhengen. Tidligere arbeider med metallsalter som finnes i sveiserøyk under hyperbare forhold, endringen. celledelingen (10). har vist at trykket har til dels betydelige effekter og at disse ikke kan forutsies. Dette INNLEDNING 3 trykk etc. Cellekulturer gir uante muligheter for manipulering med forsøksbetingelser, har få eller ingen etiske problematiske sider, er billigere i drift enn arbeid med f. eks. dyremodeller, og gir vanligvis meget reproduserbare resultater. Dette prosjektet har som målsetning å undersøke hvordan kjemiske forbindelser som er giftige ved normale betingelser, oppfører seg når de utsettes for trykk som tilsvarer det 3.Biologisk indikator: Det eksisterer flere muligheter for å måle den basert på toksikologiske data fremkommet under hyperbare forhold. Det eksisterer i dag ikke grenseverdier for kjemiske forurensninger i dykkesystemer forbindelser kun kan gjøres på bakgrunn av eksperimentelle data (1, 2). innebærer at fastsettelse av hyperbare grenseverdier for denne type kjemiske forbindelser ved overflaten, er det svært lite kunnskap om hvordan et økt totaltrykk Til tross for at det eksisterer en del data vedrørende toksisitet av mange kjemiske påvirkninger slik som toksiske kjemiske forbindelser, biologiske påvirkninger, stråling, representerer et velegnet, biologisk modellsystem når man vil studere effekter av ytre For å studere dette trenger man et modellsystem. I det foreliggende arbeidet er det valgt man har ved dypdykking. Dette innebærer å finne ut om og hvordan den giftige effekten å bruke cellekulturer, d.v.s. at enkeltceller fra dyr og mennesker dyrkes i et omgivende (toksisiteten) endres under trykk, og evt. hvilke mekanismer som ligger bak denne næringsmedium. Disse cellene formerer seg med tilnærmet konstant hastighet og cellekulturer har også vist betydelige effekter av trykket i seg selv, både på 2. Eksponeringsmetode: Denne vil være avhengig av de kjemiske/fysikalske cellemorfologi (4, 7, 8) og på protein- og RNA-syntese (9). Studier med Cellekulturer har vært benyttet både til generelle toksikologiske studier (3) og til studier av toksiske effekter under hyperbare betingelser (1, 2, 4-6). Andre arbeider med Ved bruk av cellekulturer som modellsystem for å studere hyperbar toksikologi er det sjøpinnsvin-egg viste at høyt trykk reduserte både DNA-syntesen og forsinket tre forhold som må vurderes nøye: 1. Cellekultur: Det enkleste og sannsynligvis sikreste er å benytte en etablert cellelinje. egenskapene til testagenset. Den må være genetisk stabil, godt karakterisert m.h.p. vekstkinetikk, kloneeffektivitet og morfologi, og den må være lett å dyrke.
på cellulære strukturer som cytoskjelett f.eks. evne til å stenge ute fargestoffer på DNAIRNA syntese effekter - på enzymsystemer o.l. eller lignende. Membraneffekter kan observeres svært raskt, i noen tilfeller i løpet av minutter. Andre - effekter - effekter biologiske/biokjemiske effekten på målcellen som: til formering - evne - membraneffekter, - metabolske effekter 4 isolert og karakterisert i USA i 1973 (11), og som idag er tilgjengelig fra cellebanken American Type Culture Collection (ATCC). Cellene vokser som enkelt cellelag på fast effekt er derfor nedsatt formeringsevne. På den annen side kan det forekomme effekter over tid kan virke skadelig på cellene (f.eks. skader på arvestoffet, DNA). modellsystem til forsøkene. Dette er en veletablert, ilcke-transformert cellelinje, som ble måle disse ved hjelp av overlevelse/formeringsevne. overflate (monolayer), er lett å dyrke og er brukt til testing av cytotoksisitet og I det foreliggende arbeidet ble det valgt å starte med å se på akutt-toksiske effekter og som ikke gir utsiag på formeringsevnen, men som endrer cellulære egenskaper som En fibroblast cellelinje (bindevevsceller) isolert fra muse-embryo ble valgt som Det er tidligere ved NUTEC (2) gjort forsøk med å eksponere cellekulturer for kreftfremkallende aktivitet i flere sammenhenger (12-16). ovenfor under hyperbare betingelser, ble det i denne omgang valgt å eksponere cellene det foreliggende arbeidet har det primære målet vært å utprøve metoder som er egnet for vekstmediet. Siden dette er et vandig medium, må enten forbindelsene være å studere hyperbar toksisitet. For å høste erfaring med fibroblastcellelinjen beskrevet gass/damp-fase av løsningsmiddel ved å dyrke cellene på en gasspermeabel membran. I effekter) kan observeres i løpet av timer, mens effekt på formeringsevne kan ta døgn før det observeres. Det er viktig å understreke at man kan ha observerbare effekter som effekter (DNAIRNA syntese, intracellulære strukturer som cytos kjelett, metabolske vannløselige, eller la seg løse i en liten mengde av et lavtoksisk løsningsmiddel som er via vekstmediet. Det betyr at de kjemiske forbindelsene som skal undersøkes, løses i ikke gir utsiag på formerings evne. Det sikreste bevis på en cytotoksisk/cytostatisk Overlevelse/formeringsevne ble målt ved et klonogent assay og ved bestemmelse av blandbart med vann. Dette kan f.eks. være etanol, aceton dimetylsulfoksid (DMSO) 1) Et klonogent assay utføres generelt ved at et lite antall celler såes ut på en petriskål. veksthemmende effekt (vekstinhibering). sådd ut, betegnes som kloneeffektivitet. Ved å tilsette toksiske agens vil man få en Cellene fester seg til skålen og begynner å dele seg. Fordi antallet pr. skål er lavt (50- fargestoff og telles opp i et mikroskop. Antall kolonier i % av antall celler som ble vil gi opphav til en koloni med celler. Disse cellekoloniene kan farges med et 300) vil de opprinnelige cellene sitte så langt fra hverandre på skålen at hver enkelt
5 reduksjon i antall kolonier pr. skål, og dette brukes som et mål for toksisk effekt, og man beregner antall kolonier i testgruppen som av antall kolonier i kontroligruppen (relativ kloneeffektivitet). Vanligvis vil man eksponere cellene for et toksisk agens i 24 timer kort tid etter cellene er sådd ut (før den første delingen har startet) og etterpå la cellene vokse videre uten toksisk agens tilstede inntil cellekoloniene er passelig store (7-9 døgn). 2) Vekstinhibering av cellene bestemmes ved å så ut et litt større antall celler (2000-5000 pr. 25 cm2), la disse formere seg inntil de er kommet i starten på den eksponentielle vekstfasen. Deretter eksponeres kulturene kontinuerlig for testagenset. Ved et eller flere tidspunkt bestemmes antall celler pr. dyrkningsskål (eller flaske) ved hjelp av en elektronisk celleteller. I de foreliggende eksperimentene er det valgt å eksponere cellene i 3 døgn og deretter beregne netto tilvekst av celler i denne perioden. Reduksjon i tilvekst er da et utrykk for vekstinhibering. Her må det understrekes at den reduksjon i celletall som her observeres vil være et resultat av både et drap av celler (cytotoksisk effekt) og en kontinuerlig veksthemmende effekt (cytostatisk effekt), i motsetning til det klonogene assayet som i hovedsak indikerer en ren cytotoksisk effekt. For å utprøve metodene som er beskrevet ovenfor under hyperbare betingelser, bør man benytte et lite antall kjemiske forbindelser som gir forskjellig toksisk respons. Dersom det samtidig kan brukes forbindelser som er relevante for hyperbare dykkesystemer vil det være en fordel. I dette tilfelle ble det valgt å benytte tre forbindelser: Kaprolaktam, 2,4-toluen diisocyanat (TDI) og fenol. 1) Kaprolaktam ble valgt fordi den representerer et problem i forbindelse med avgassing fra enkelte pustegass-slanger (17). 2) TDI er benyttet ved produksjonen av en rekke plastmaterialer, også enkelte pustegass slanger og kan gi meget sterke allergiske reaksjoner (18). Pustegass som inneholder detekterbare mengder av TDI er overhodet ikke pustbar ifig. Oljedirektoratets normer for hyperbare systemer (19). Forbindelser som reagerer med celleoverfiaten fører ofte til toksiske effekter på celler som er bundet til en overflate og det er derfor mulig at denne forbindelsen ville ha høy toksisitet i et assay av den typen som er beskrevet ovenfor. TDI er lite vannløselig, men løses lett i aceton. 3) Fenol er en forbindelse som i dyremodeller er mer toksisk enn kaprolaktam, og den er blitt påvist i signifikante mengder i hyperbare dykkesystemer. Den er løselig i vann i rimelig grad.
6 2 MATERIALE OG METODER 2.1 KJEMIKALIER E-kaprolaktam og 2,4-toluen diisocyanat var fra Sigma Chemical Co (St. Louis, MO), L glutamin, Giemsa-løsning og fenol var fra Merck, Darmstadt, Tyskland). 2.2 CELLEUNJE OG KULTURBETINGELSER Stamkulturer av ikke-transfonnerte C3H/1OT1/2 Cl 8 mus-embryo fibroblaster (11) ble dyrket som tidligere beskrevet (15). Ved forsøk ble cellene (passasje 14-21) sådd ut på plastskåler (Ø 6 cm, Nunc, Danmark) eller plastflasker (25 cm2, Nunc, Danmark) i Basal Medium Eagle (BioWhittaker, mc., Walkersville, MD) tilsatt 10 % varmeinaktivert, føtalt kalveserum (BioWhittaker, mc.). I eksperimenter som omfattet trykksetting, ble cellekulturmediet tilsatt HEPES buffer (BioWhittaker, mc.) til 25 mm i mediet, inklusiv monobare kontrollgrupper. Alle stamkulturer og eksperimentelle kulturer ble dyrket uten tilsetning av antibiotika til mediet. Monobart (ved I bar) ble cellene dyrket ved 37 C i en atmosfære av 50 mbar CO2 i luft og 95-100 % relativ luftfuktighet. 2.3 EKSPONER1NG AV CELLEKULTURER FOR TRYKK Inkubering under trykk ble foretatt i et sylinderformet trykk-kammer med volum på 8.0 1. Kammeret hadde kontroll for regulering av temperatur, gass-blanding og trykk. Fuktigheten ble holdt mellom 95 og 100 % ved å ha et lite kar med destillert vann i bunnen av kammeret. Den relative fulctigheten ble målt kontinuerlig under trykksetting. Etter at kulturene var plassert i trykk-kammeret ble dette lukket igjen og gjennomstrømmet av He/O Utløpet ble stengt igjen og 50 mbar CO2 tilsatt. Deretter ble det trykksatt med He/0 blanding (80/20) til partialtrykket av 02 var 0.4 bar, videre trykksatt med ren He til totalt 51 bar (50 bar overtrykk). Temperaturen ble målt på tre forskjellige punkter i kammeret og holdt ved 36.5 ± 1.0 C. Kompresjon ble foretatt med 0.8-1.0 bar/min. for å unngå temperaturøkninger i kammeret. Dekompresjon ble foretatt med 0.5-0.6 bar/min, for å unngå temperaturfall og cellesprengning. 2.4 BESTEMMELSE AV KLONEEFFEKT1VITET 2 blanding (80/20) inntil luften i kammeret var skiftet ut. 2 200 celler ble sådd ut pr. skål (6 cm). 24 timer senere ble mediet fjernet, og nytt medium (5 mi/skål) tilsatt med Økende konsentrasjoner av testsubstans. Grupper som skulle eksponeres for trykk, ble satt i trykk-karnmer og trykksattjinkubert som angitt ovenfor. 24 timer senere ble irykk-kammeret dekomprimert, kulturene tatt ut og mediet fjernet. Nytt medium (5 mi/skål) uten testsubstans ble tilsatt og kulturene inkubert videre monobart. 9 døgn etter utsåing ble mediet fjernet, cellene vasket med en isoton bufferløsning ( Buffered Saline Solution, BSS ), fiksert med metanol og farget med Giemsa. Kolonier av celler ble talt opp, og antall kolonier pr. skål angitt som % av
kontroll. Hver gruppe bestod av 6 skåler. 5000 celler ble sådd ut pr. flaske (25 cm2) eller skål (6 cm). 3-4 døgn senere (tidlig i bruk. 2.6.3 Fenol flasker, i de øvrige forsøk bestod hver gruppe av 5 skåler. satt i trykk-kammer og trykksatt/inkubert som angitt ovenfor. 72 timer senere ble trykk eksponentiell vekstfase) ble mediet fjernet, og nytt medium (5 mi/skål) tilsatt med 7 2.6.1 Kaprolaktam 2.6.2 2,4-toluen-diisocyanat (TDI) 2.6 PREPARERING AV TESTSUBSTANS 2.5 BESTEMMELSE AV VEKSTINHIBERING TDI er lite vannløselig og ble derfor løst i aceton som er atoksisk i lave konsentrasjoner. Tilsats av TDI fra denne stamløsningen (20 mm i aceton) til cellekulturmediet ga 0.5 % For å minimalisere evt. hydrolyse av kaprolaktam ble stamløsning av denne (2.0 M i kammeret dekomprimert, kulturene tatt ut og mediet fjernet. Cellene ble vasket med Industrial (Coulter Electronics Ltd., Luton, UK). I et forsøk bestod hver gruppe av 4 Økende konsentrasjoner av testsubstans. Grupper som skulle eksponeres for trykk ble dest. H20) laget og sterilfiltrert gjennom 0.2..tm filter umiddelbart før tilsats til cellekulturmediet. BSS, trypsinert og antall celler pr. skål talt v.h.a. en Coulter Counter Model D Fenol har en løselighet i vann på 0.7 12 M ved 16 C. En stamløsning på 200 mm i vann aceton i mediet i gruppen med høyest konsentrasjon. Aceton-innholdet i samtlige denne løsningen ikke sterilfiltrert før bruk. grupper inklusiv kontroll ble derfor justert til 0.5 % aceton. P.g.a. aceton-innholdet ble ble laget, løsningen ble sterilfiltrert gjennom 0.2. im filter og oppbevart ved -20 C til
3.3.2 Fenol enn LD 90 90 og 1C 8 3.3 EKSPONERING FOR KAPROLAKTAM OG FENOL UNDER HYPERBARE 3.3.1 Kaprolaktam 3 RESULTATER 3.1 INNLEDENDE FORSØK KAPROLAKTAM Tendensen er den samme som for kaprolaktam, trykket Økte den toksiske effekten av Det ble gjort et forsøk med TDI under monobare forhold, både med bestemmelse av Det ble først gjort et innledende forsøk med kaprolaktam under monobare betingelser. denne sammenhengen. hadde stoppet veksten fullstendig allerede 24 timer etter tilsats (data ikke vist). Den høyeste benyttede konsentrasjon på 50 mm ga 77.3 % kloneeffektivitet i forhold til sitt toksiske potensiale. På bakgrunn av dette ble det ikke gjort videre forsøk med TDI i tidspunkt etter tilsats av kaprolaktam i det sistnevnte eksperimentet, viste at 50 mm kontroll (Fig.1), samme konsentrasjon ga derimot fullstendig inhibering av vekst ved kontinuerlig eksponering i 5 døgn (Fig.2). Registrering av antall celler pr. skål på flere Det ble utført 2 forsøk med bestemmelse av kloneeffektivitet og 2 forsøk med BETINGELSER 3.2 INNLEDENDE FORSØK 2,4-TOLUEN DIISOCYANAT toksisk effekt ved disse to metodene (data ikke vist). Dette kan skyldes at forbindelsen kloneeffektivitet og vekstinhibering. Konsentrasjoner fra I nm til 0.1 mm ga ingen spalter av en eller begge cyanat-gruppene i en reaksjon med vann (20) og dermed mister effekten av kaprolaktam. Samtidig ga den kombinerte effekten av trykket og og viser at trykket (eller gassblandingen) i seg selv hadde en betydelig (og variabel) toksisk effekt og reduserer kloneeffektivitet med mellom ca 40 og 60 % og bestemmelse av vekstinhibering under hyperbare forhold. Resultatene er gitt i Fig. 3-6 vekstinhiberingen med 40-80 %. Figurene viser også klart at trykket Økte den toksiske Fra kurvene i Fig. 3-6 ble det beregnet verdier tilsvarende LD kaprolaktam noe varierende resultater, men samlet sett tydet forsøkene på at trykket og den konsentrasjonen som gir 90 % celledrap) og 1C kaprolaktam hadde en tilnærmet additiv effekt. dvs, den konsentrasjonen som gir 90 % inhibering av cellevekst). LD eksperimentelle forutsetninger fordi kloneeffektivitet måler en ren cytotoksisk effekt for kaprolaktam på disse cellene er gitt i Tabell i og viser at 1C vekstinhibering enn når det blir målt som kloneeffektivitet. Dette er å forvente ut fra (celledrap) mens vekstinhibering måler summen av både celledrap og inhibering av Det ble utført 2 hyperbare forsøk med fenol og resultatene fra disse er vist i Fig. 7 og 8. veksten etterpå., d.v.s. at kaprolaktam har toksisk effekt ved lavere konsentrasjoner målt som 90 (Inhibitor konsentrasjon 90 %; 90 (Letal dose 90 %; dvs. 90 verdiene er noe lavere 90 verdier
LD 90 90, M 90 2) Kunne ikke beregnes fra dette forsøket.,m fra Fig. 2, 5 og 6. LD trykket alene svært stor effekt og reduserte antall celler med over 80 % (Fig.8). Dette Dette gir likevel en indikasjon på effekten av fenol og høyt trykk. I dette tilfelle hadde 90 er 90 og 1C 90 for fenol var lavere enn tilsvarende 9 TABELL 1: Toksisitet av kaprolaktam og trykk på C3HJ1OTIt2 Cl 8 celler. 90 verdier er beregnet fra kurvene i Fig. 1, 3 og 4 og 1C fenol, og den kombinerte effekten av trykket og fenol så ut til å tilsvare omtrent det en Forsøk i bar 50 bar I bar 50 bar additiv effekt av de to skulle tilsi. LD kolonidannelsen med 38.4 % (Fig. 7). står i kontrast til forsøket med kloneeffektivitet der trykket bare reduserte verdier for kaprolaktam (Tabell 2) og viste at fenol var merkbart mer toksisk overfor Gjennomsnitt 0.16 0.066 0.038 0.023 disse cellene enn kaprolaktam, både ved 1 bar og ved 50 bar. Beregningen av 1C betingelser.verdier for fenol er beregnet fra Fig. 7 og 8. TABELL 2: Toksisitet av kaprolaktam og fenol under hyperbare 4 0.031 0.028 I 0.12 3) 0.070 2 0.19 3) 0.061 3 0.042 0.018 1) Innledende forsøk med kaprolaktam kun ved I bar. 3) Beregnet ved ekstrapolering av kurvene i Fig. 3 og 4. 1) Verdiene er usikre, se Fig. 8. Kaprolaktam 0.16 0.066 0.038 0.023 Fenol 0.013 0.0061 0.0035 1) 0.001 1) Forbindelse i bar 50 bar 1 bar 50 bar, M 1C Innledende 1) 2) - 0.040 - LD,M 1C ved slutten av eksponeringsperioden var lavere enn antall celler/skål ved begynnelsen av imidlertid usikker fordi antall celler/skål i kontrofigruppen som var eksponert for 50 bar 90 er beregnet (Fig. 8), kurven fremstiller isteden total tilvekst etter utsåing i % av monobar kontroll. eksponeringen. Det kunne derfor ikke beregnes netto tilvekst under eksponeringen
10 3.4 EFFEKT AV HØYT TRYKK Et gjennomgående trekk ved samtlige forsøk der cellekulturene er eksponert for høyt trykk er at trykket/gassblandingen i seg selv ser ut til å ha en meget betydelig toksisk/veksthemmende effekt på cellene. En sammenstilling av data fra de forskjellige forsøkene er gitt i Tabell 3 og viser at en eksponering for 50 bar i 24 timer og etterfølgende inkubering ved i bar i 7 døgn, ga en gjennomsnittlig kolonidannelse på 52 i forhold til kulturer som utelukkende hadde vært eksponert for I bar i samme periode. TABELL 3: Effekt av 50 bar overtrykk på overlevelse/vekst av C3HJ1OT1/2 Cl 8. Cellene er enten eksponert i 24 timer for 50 bar og deretter dyrket ved i bar i 7 døgn eller de er eksponert i 72 timer for 50 bar. Tallene er hentet fra kontroligruppene (0- pkt.) i Fig. 3-8 og viser kontroll ved 50 bar i % av kontroll ved 1 bar.. Kontroll v/50 bar i % av kontroll v/i bar Forsøk Eksponering Enkeitforsøk Gjennomsnitt i 5Obari24t+lbari7dg 37.3 2 50 barn 24t+ i bari7 dg 56.0 52.0 6 50bari24t+lbari7dg 62.8 3 50 bar i 72 t 22.3 For stor spredning 4 50 bar i 72 t 61.6 til å beregne 7 5Obari72t 12.1 gjennomsnitt Som det fremgår av Tabell 3 ga kontinuerlig eksponering av kulturene i 72 timer for 50 bar svært varierende vekst, og det var derfor ikke hensiktsmessig å beregne et gjennomsnitt fra resultatene. Et markant trekk ved kloneeffektivitets-eksperimentene var at i kulturskålene som var eksponert for trykk, var koloniene svært små i forhold til de monobare kontrollene, og dette var uavhengig om de var eksponert for toksisk agens eller ikke.
dyreforsøk. 50 90 Som nevnt ovenfor ble det ikke påvist toksisk effekt av 11)1 i konsentrasjoner fra i nm til 0.1 mm. Det er et praktisk problem forbundet med å eksponere cellene for større 4.1 EKSPONERING FOR TOKSISKE AGENS (DMSO). Selv om dette løsningsmiddelet er lite toksisk, har det betydelige effekter på 4 DISKUSJON 11 4.1.2 Eksponering for kaprolaktam og fenol under hyperbare betingelser ikke godt nok grunnlag for å trekke klare konklusjoner på hvorvidt den kombinerte effekten avviker fra en ren additiv effekt. Disse resultatene er i tråd med et nylig arbeid 4.1.1 2,4-toluen-diisocyanat (TDI) Data i litteraturen kan tyde på at TDI reagerer lett med vann og kan spalte av en eller den endrer sitt toksiske potensiale. Dette kan bety at en må se på helt andre Resultatene for fenol er riktignok kun basert på to forsøk, men tendensen var den konsentrasjoner av TDI enn 0.1 mm fordi forbindelsen er så lite vannløselig. En eksponeringsmetoder for evt. å undersøke effekt av TDI på cellekulturer under trykk. mulighet er å Øke mengden aceton i mediet, men dette kan i seg selv ha effekter på gjennom membranen (21). Det kan derfor bidra til en Økt transport av TDI inn i celien, cellemembranen og bidrar ofte til å lette transport av forskjellige forbindelser inn cellene. En annen mulighet er å benytte et annet løsningsmiddel som dimetylsulfoksid forbindelsene hadde en tilnærmet additiv effekt på cellene. Resultatene gir imidlertid begge cyanat gruppene i en reaksjon med vann (20). Dermed er det også sannsynlig at noe som kan gi et helt feilaktig bilde av den egentoksiske effekten av TDI. konsentrasjoner av toluen, mens ved høyere konsentrasjoner var effekten noe mindre Resultatene viste at trykket Økte den toksiske effekten av både kaprolaktam og fenol. enn additiv. Et annet arbeid har vist at den kombinerte effekten av metallsalter og trykk ved NUTEC av Jakobsen og medarbeidere (2) som viste at ved eksponering av rotte samme som for kaprolaktam. Samtidig indikerte forsøkene at trykket og hver av disse glioma celler for toluen og høyt trykk, fant man en additiv effekt ved lave for orak inntak av kaprolaktam i rotter er oppgitt til 2140 mg/kg, tilsvarende verdi for metallsaltene, og mindre enn additiv ved høye konsentrasjoner (1). fenol er 414 mg/kg (22). På molbasis tilsvarer dette h.h.v. 18.9 og 4.4 mmol/kg for kaprolaktam. Data fra forsøkene beskrevet i den foreliggende rapporten ga LD kaprolaktam og fenol. Ut fra disse verdiene er fenol 4.3 ganger mer toksisk enn basert på cellekulturer. De data som eksisterer, er stort sett fra forsøk med dyr. LD (175 bar) på veksten av hamsterceller var additiv ved lave konsentrasjoner av de fleste et innbyrdes forhold som er av samme størrelsesorden som litteraturdata for betingelsene (eksponenng ved 1 bar). Resultatene med kaprolaktam og fenol gir dermed verdier for kaprolaktam og fenol på h.h.v. 0.16 og 0.013 M (jfr. Tabell 2) som gir et og 7) viser at fenol er 14.6 ganger mer toksisk enn kaprolaktam under disse forhold på 12.3. Beregning av tilsvarende LD Så langt har det ikke vært mulig å oppspore toksisitetsdata for kaprolaktam og fenol 50 verdier fra toksisitetskurvene (Fig. 3, 4
verdier og ikke LD Et gjennomgående trekk ved forsøkene var at trykkerlgassblandingen i seg selv hadde en meget betydelig toksisk/veksthemmende effekt på cellene (jfr. Tabell 3). Tilsvarende 90. 50 verdier er det fordi det i de foreliggende forsøk med eksponering 90 12 cellene, og i endel tilfeller hadde dette sammenheng med endringer i cytoskjelettet (4, 7, 25). Det er også vist at røde blodceller eksponert for trykk opp til 400 bar ga eksponering for trykk og deretter vekst under monobare forhold i 7 døgn, var antall cellekolonier pr. skål mindre enn i kontrollgruppen, men også antall celler pr. koloni tilfelle er det en irreversibel skade, og fordi veksthemmingen tilsynelatende nedarves gjennom flere cellegenerasjoner, kan årsaken være en skade på arvestoffet (DNA). Det permanent veksthemming etter at den ytre påvirkning er fjernet. Det er i flere andre arbeider vist at trykket i seg selv gir morfologiske endringer av Det bør bemerkes til ovenstående at når det i Resultater ovenfor er beregnet LD effekter (23, 24), men det er uklart i hvor stor grad dette kan slå ut i et eksperimentelt komponentene i gassblandingen. Det er tidligere vist at hamsterceller dyrket i kultur ved oppsett som det som er benyttet her. monobart og hyperbart var det da bedre å bruke LD for 50 bar ikke var mulig å beregne LD avgjøre om det kun var en effekt av trykket i seg selv eller en effekt av de enkelte 4.2 EKSPONERING FOR HØYT TRYKK transporten gjennom cellemembranen (8). Observasjoner gjort i mikroskop av cellene i veksten av cellene. Imidlertid er det kjent at forhøyet partialtrykk av 02 har toksiske observasjoner er gjort av andre, men i mindre grad og ved høyere trykk (1, 2, 4). På det foreliggende arbeidet både etter endt eksponering for trykk og ved avslutning av ved i bar og ved 50 bar (data ikke vist). bakgrunn av de forsøk som ble utført i det foreliggende arbeidet var det ikke mulig å eksperimentet ga ingen klare morfologiske forskjeller mellom celler som var eksponert signifikante endringer i cellemorfologien og at dette ble fulgt av endringer i kation å få fastslått om resultatene ovenfor er et resultat av skade på DNA. er tidligere gjort en undersøkelse som viste at 6 av 153 dykkere hadde betydelige endringer på kromosomene i lymfocytter i perifert blod (26). Det vil derfor være viktig en akutt toksisk effekt som dreper noen av cellene, får de overlevende cellene en skade. Resultatene fra kloneeffektivitets-eksperimentene bør trekkes frem. Etter 24 t standard betingelser i luft (6). Dette indikerer at He som sådan ikke har effekt på i bar i ren He atmosfære ga samme vekst som når de samme cellene ble dyrket under eller 2) en kontinuerlig veksthemming i resten av vekstperioden. Dersom det siste er Denne medfører enten: i) forsinket oppstart av celledelingen og deretter normal vekst Tidligere undersøkelser av toksiske effekter av trykk og kjemiske forbindelser har stort var drastisk redusert, minst med en faktor på 10, kanskje 100. Dette betyr at i tillegg til en biologisk parameter som f.eks. økning i antall celler (1, 2, 4, 6). Denne metoden vil imidlertid ikke kunne kvantifisere en ren cytotoksisk effekt i form av celledrap eller sett vært utført ved eksponering i inntil 24 timer og deretter umiddelbar bestemmelse av 50. For å kunne sammenligne eksponering
4.3 VURDERING AV METODIKK OG FORSLAG TIL VIDERE ARBEID 13 Cellekultursystemet så ut til å være godt egnet for å studere akutt-toksiske effekter under hyperbare forhold, både av trykket i seg selv og av forskjellige kjemiske forbindelser under trykk. Det må imidlertid benyttes andre eksponeringsmetoder enn de som er benyttet her for noen ikke-vannløselige forbindelser. Slike metoder har vært forsøkt tidligere i dette prosjektet, bl.a. ved eksponering for løsemidler som toluen (2). Det er imidlertid nødvendig å utvilde denne metodikken videre for å kunne benytte den rutinemessig. I tillegg er det viktig å etablere metoder for å måle andre effekter enn de rent cytotoksiske. Dette kan være metoder som viser effekter på DNA (arvestoffet), på cellemembranen ved f.eks. immunologiske metoder, effekter på intracellulære strukturer som cytoskjelett og metabolske effekter. En av de sentrale intracellulære komponenter/mekanismer i denne sammenheng er tripeptidet glutation (GSH) som utgjør en av cellens viktigste forsvarsmekanismer mot toksiske forbindelser (27). Det vil derfor være av stor interesse å tindersøke om GSH påvirkes av høyt trykk alene, og om dette evt. har betydning for de observerte toksiske effekter av komponenter i dykkeatmosfæren. Oksygen står også sentralt i denne sammenhengen. Det er tidligere ved NUTEC gjort undersøkelser som viser at økning i partialtrykk av 02 fra 20 til 40-50 kpa har betydelige effekter på lungefunksjonen (28, 29). Dannelse av oksygenradikaler er en viktig årsak i denne forbindelsen. Siden GSH nettopp har en viktig funksjon i å fjerne slike radikaler, er det nærliggende å se på om denne funksjonen endres under trykk. Dette kan gjøres ved målinger både av GSH og av ett eller flere GSH syntetiserende enzymer, i celler i kultur som er eksponert for 02 og andre toksiske forbindelser under normobare og hyperbare forhold. Dette vil kunne gi viktig informasjon om mekanismer ved hyperbar toksisitet. Både for å verifisere ren cytotoksisk effekt ved de allerede etablerte metoder og for å finne egnede systemer for å undersøke de andre effektene som er nevnt ovenfor, er det ønskelig å bruke andre cellekultursystemer enn de som er benyttet i 1992. Cellekulturer er tross alt et eksperimentelt modellsystem, og en kan i utgangspunktet ikke utelukke at en bestemt toksisk effekt er spesifikk for et enkelt cellekukursystem. For å bekrefte (eller avkrefte) at denne effekten er universell og kvantifisere denne, er det nødvendig å undersøke slike toksiske effekter i flere systemer. Det vil her være naturlig å inkludere humane celler for å komme nærmere det species man egentlig Ønsker å undersøke. I tillegg kan det være naturlig i noen tilfeller å velge cellekultursystemer som bedre avspeiler det cellulære målet for de toksiske agens. Dette innebærer f. eks. bruk av hjerneceller til å undersøke effekt av løsemidler og Iungevevsceller og endoteiceller til å undersøke f. eks. oksygentoksisitet. Det bør gjøres en forsøksserie med de etablerte metodene og toksiske agens med kjent effekt for om mulig å etablere kvanritative sammenhenger mellom toksikologiske data fra dyremodeller (LD Dermed vil man lettere kunne overføre resultatene fra cellekulturer (som ofte opererer med konsentrasjoner av kjemiske forbindelser i løsning) dl in vivo situasjonen hos dyr og mennesker. 50, LD 90) og tilsvarende verdier fra cellekultureksperimentene.
14 Effekten av trykket i seg selv bør undersøkes videre for å avdekke eventuelle skader på DNA. Dette kan gjøres ved å gjøre kloneeffektivitets-forsøk med et stort antall skåler, høste disse på flere tidspunkter etter en 24 t eksponering, og til slutt registrere både antall kolonier og antall celler pr. skål. Dersom dette viser en permanent veksthemming gjennom flere cellegenerasjoner, bør det gjøres DNA analyser, f.eks. søster kromatid skift el. (30).
%. additiv effekt av de to skulle tilsi. disse cellene enn kaprolaktam ved i bar. 2. Beregninger av LD 90 og 1C 90 viste at fenol var 12.3 ganger mer toksisk overfor kombinerte effekten av trykket og kaprolaktam eller fenol var omtrent lik det en 5 KONKLUSJON 15 1. 50 bar overirykk Økte den toksiske effekten av både kaprolaktam og fenol, og den 4. Trykket/gassblandingen i seg selv hadde en meget betydelig toksisk/veksthemmende 6. Det bør arbeides videre med å etablere metoder som avdekker effekten av 5. Resultatene indikerte at trykket/gassblandingen i seg selv enten gir en forsinket hyperbare grenseverdier for toksiske kjemiske forbindelser. døgn reduserte kloneeffektivitet med gjennomsnittlig 48 %. Kontinuerlig effekt på cellene. Eksponering i 24 t for 50 bar med etterfølgende vekst ved 1 bar i 7 oppstart av celledelingen og deretter normal vekst eller en irreversibel veksthemming en reaksjon med vann (referanse) og dermed mister sitt toksiske potensiale. forhold. Dette kan skyldes at forbindelsen spalter av en eller begge cyanat-gruppene i eksponering av kulturene i 72 timer reduserte veksten med 38.4-3. TDI ga ingen toksisk effekt i konsentrasjoner fra i nm til 0.1 mm under monobare i resten av vekstperioden. fra cellekultureksperimenter. Dette vil gi et bedre grunnlag for fastsettelse av trykketjgassblandingen i seg selv. Flere cellekultursystemer bør benyttes for å bekrefte og kvantifisere universelle effekter og om mulig etablere kvantitative sammenhenger mellom toksikologiske data fra dyremodeller og tilsvarende verdier 87.9
16 6 REFERANSER 1. Jenssen J, Syversen T. Effects of high pressure and metal saks on cell growth. Alt. Lab. Animals 1991; 19: 245-249. 2. Jakobsen K. Årsrapport for FUDT deiprosjekt Kjemisk arbeidsmiljø - 1991. NUTEC. 52/91, 1992. toksikologi 3. Wilson AP. Cytotoxicity and viability assays. In: Freshney, RI eds. Animal cell culture. Oxford: IRL Press Ltd., 1986: 183-2 16. 4. Syversen T, Jenssen J. High hydrostatic pressure potentiation of the toxic effects of chromate in cell culture. Undersea Biomed. Res. 1987; 14: 11-19. 5. Jenssen J, Syversen T. High hydrostaric pressure and chromate-induced effects on cell cycie kinetics. Undersea Biomed. Res. 1987; 14: 21-29. 6. Jenssen 3, Syversen T. Efffects of high pressure and vanadium on cell growth. Undersea Biomed. Res. 1988; 15: 353-359. 7. Dibb W, Morild E, Lærum OD. Effects of high hydrostatic pressure on normal and neoplastic rat ceils in culture. Virchows Arch. 1981; 38: 169-176. 8. Hall AC, Ellory JC. Effects of high hydrostatic pressure on t passive monovalent cation transport in human red ceils. J. Membrane Biol. 1986; 94: 1-17. 9. Landau JV. Hydrostatic pressure on the biosynthesis of macromolecules. In: Zimmermann AM eds. High pressure effects on cellular processes. New York: Academic Press, mc., 1970: 45-70. 10. Zimmermann AM. High pressure studies on synthesis in marine eggs. In: Zimmermann AM eds High pressure effects on cellular processes. New York: Academic Press, mc., 1970: 235-257. 11. Reznikoff CA, Brankow DW, Heidelberger C. Establishment and characterization of a cione of C3H mouse embryo ceils sensitive to postconfluence inhibition of cell division. Cancer Res. 1973; 33: 323 1-3238. 12. von Hofe EH, BillingsPC, Heidelberger C, Landolph JR. In vitro genotoxicity studies using complex hydrophobic mixtures: Efficient delivery of a petroleum sample to cultured C3H/IOT1/2 celis via lipid vesicle incorporation. Environm. Mutagen. 1986; 8: 589-609. 13. Boreiko CJ. Methodology for cell transformation assays with C3HJ1OTI/2 mouse embryo fibroblasts. 3. Tissue Cult. Meth. 1986; 10: 165-172.
14. Patierno SR, Lehman NL, Henderson BE, Landolph JR. Study of the ability of phenacetin, acetaminophen, and aspirin to induce cytotoxicity, mutation, and morphological transformation in C3H/1OT1/2 cione 8 mouse embryo celis. Cancer Res. 1989; 49: 1038-1044. 15. Djurhuus R, Svardal AM, Ueland PM, Male R, Lillehaug JR. Growth support and toxicity of homocysteine and its effect on methionine metabolism in non transformed and chemically transformed C3H/1OT1/2 celis. Carcinogenesis 1988; 9: 9-16. 16. Djurhuus R, Svardal AM, Ueland PM. Differential effects on growth, 17 homocysteine, and related compounds of two inhibitors of S adenosylhomocysteine catabolism, 3-deazaadenosine, and 3-deazaaristeromycin, in C3HJ1OT1/2 ceils. Cancer Res. 1989; 49: 324-330. 17. Djurhuus R, Sundland H, Lindrup AG, Jensen E, Solheim E, Jakobsen K. Test av fleksible slanger for pustegass. NUTEC 02/93, 1993. 18. Dean JH, Murray MI, Ward EC. Toxic responses of the immune system. In: Klaassen CD, Amdur MO, Doull J eds. Toxicology. The basic science of poisons. New York: Macmillan Publishing Company, 1986: 143-145. 19. Oljedirektoratet. Rapport om hyperbare grenseverdier for kontaminanter, Oljedirektoratet, OD-92-05, 1992. 20. Budavan S, O Neil MJ, Smith A, Heckelman PE. The Merck Index. An encyclopedia of chemicals, drugs, and biologicals. Rahway, N.J., Merck & Co. mc. 1989. 21. Klaassen CD. Distribution, Excretion, and absorption of toxicants. In: Klaassen CD, Amdur MO, Doull J eds. Toxicology. The basic science of poisons. New York: Macmillan Publishing Company, 1986: 33-63. 22. National Institute for Occupational Safety and Heahh. Registry of toxic effects of chemical substances. Lewis RJ, Tatken RL eds. Cincinatti, OH: U.S. Department of Health and Human Services, 1980. 23. Ciark JM, Lambertsen CJ. Oxygen toxicity: a review. Pharmacol. Rev. 1971; 23: 37-133. 24. Thet LA. Repair of oxygen-induced lung injury. In: Taylor AE, Matalon S, Ward P eds. Physiology of oxygen radicals. Bethesda, Maryland: American Physiological Society, 1986: 87-108. 25. Salmon ED. Pressure-induced depolymerization of brain microtubules in vitro. Science 1975; 189: 884-886.
47: 242-247. 1992. aberrations in divers. Undersea Biomed. Res. 1984; 11: 193-204. 27. Meister A, Anderson ME. Glutathione. Ann. Rev. Biochem. 1983; 52: 711-760. 29. Thorsen E, Segadal K, Reed J, Elliott C, Gulsvik A, Hjelle J. Effekten av forhøyet 18 30. Thilly WG, Call KM. Genetic toxicology. In: Klaassen CD, Amdur MO, Doull I Company, 1986: 174-194. 26. Fox DP, Robertson FW, Brown T, Whitehead AR, Douglas 1DM. Chromosome eds. Toxicology. The basic science of poisons. New York: Macmillan Publishing partialtrykk av oksygen på lungefunksjon ved metningsdykking. NUTEC. 45-9 la, 28. Thorsen E, Segadal K, Myrseth E, Påsche A, Gulsvik A. Pulmonary mechanical function and diffusion capacity after deep saturation dives. Br. J. md. Med. 1990;
7 FIGURER 19
1 >20. 60 I : N FIGUR 1: Toksisitet av kaprolaktam på C3H/IOTI/2 Cl 8. 200 celler ble sådd ut pr. skål (6 cm) og eksponert for kaprolaktam i 24 t. 9 døgn etter standard avvik. Hvert punkt representerer gjennomsnittet av 6 skåler. utsåing ble cellene farget og antall kolonier bestemt. Resultatene er angitt som antall kolonier pr. skål i % av kontroll (relativ kloneeffektivitet) ± 0 10-1 [Kaprolaktam], M
L 120 100 I _ cc 80 60 i 0-f I 0 io i0 102 10.1 [Kaprolaktam], M. FIGUR 2: Effekt av kaprolaktam på vekst av C3H/1OT1/2 Cl 8. 5000 celler ble sådd ut pr. skål (6 cm). 24 t senere ble det skiftet medium og nytt medium inneholdende kaprolaktam ble tilsatt. 5 døgn senere ble antall celler pr. skål bestemt. Resultatene er angitt som netto tilvekst (antall celler/skål dag 6 antall celler /skål dag 1) i % av kontroll uten kaprolaktarn. 2 parallelle skåler ble benyttet for hver konsentrasjon. r
c140 [Kaprolaktam], M.2: i:: 120 100 representerer gjennomsnittet av 6 skåler. FIGUR 3: Toksisitet av kaprolaktam og trykk på C3HJ1OT1/2 Cl 8 (Forsøk 1). kolonier bestemt. Resultatene er angitt som antall kolonier pr. skål i % av kaprolaktam samtidig i 24 t. 9 døgn etter utsåing ble ceflene farget og antall kontroll (relativ kloneeffektivitet) ved i bar ± standard avvik. Hvert punkt 200 celler ble sådd ut pr. skål (6 cm) og eksponert for trykk (50 bar) og 0 io- 1O2 10 i
60. [Kaprolaktam], M : O24tlbar 24t5Obar 140. 120. c 0. i,. I I 0 i0 10-2 io- > 20. C 40. i :: standard avvik. Hvert punkt representerer gjennomsnittet av 6 skåler. FIGUR 4: Toksisitet av kaprolaktam og trykk på C3H/1OT1/2 Cl 8 kolonier pr. skål i % av kontroll (relativ kloneeffektivitet) ved I bar ± (Forsøk 2). 200 celler ble sådd ut pr. skål (6 cm) og eksponert for trykk (50 bar) og kaprolaktam samtidig i 24 t. 9 døgn etter utsåing ble cellene farget og antall kolonier bestemt. Resultatene er angitt som antall
> 0 0 d) c C.) 0 I halvparten ble eksponert for trykk (50 bar) i 72 t. Etter dekompresjon av trykk-kammeret ble kulturene tatt ut og antall celler pr. flaske bestemt. (Forsøk 3). 5000 celler ble sådd ut pr. flaske (25 cm 2). 4 døgn senere ble det skiftet medium og nytt medium inneholdende kaprolaktam ble tilsatt. avvik. Hvert punkt representerer gjennomsnittet av 4 flasker. Halvparten av kulturene ble inkubert på vanlig måte ved i bar og FIGUR 5: Effekt av kaprolaktam og trykk på vekst av C3H/1OTI/2 Cl 8 Resultatene er angitt som netto tilvekst (antall celler/flaske dag 7 - celler /flaske dag 4) i % av kontroll uten kaprolaktam v/i bar ± standard 0 i0 10-2 10- i [Kaprolaktam], M antall
[Kaprolaktam], M 00 rj). Is på vanlig måte ved i bar og halvparten ble eksponert for trykk (50 bar) i 72 t. Etter medium inneholdende kaprolaktam ble tilsatt. Halvparten av kulturene ble inkubert punkt representerer gjennomsnittet av 5 skåler. dekompresjon av trykk-kammeret ble kulturene tatt ut og antall celler pr. skål FIGUR 6: Effekt av kaprolaktam og trykk på vekst av C3H/1OT1/2 Cl 8 (Forsøk 4). celler/skål dag 4) i % av kontroll uten kaprolaktam v/i bar ± standard avvik. Hvert bestemt. Resultatene er angitt som netto tilvekst (antall celler/skål dag 7-5000 celler ble sådd ut pr. skål (6 cm). 4 døgn senere ble det skiftet medium og nytt 0 io 10-2 10-. 1 antall
c I cl 140 120 100 80 60 40 20 0 0 i- io- 4 io- [Fenol], M 3 10-2 101 FIGUR 7: Toksisitet av fenol og trykk på C3H/1OT1/2 Cl 8 (Forsøk 6). 200 celler ble sådd ut pr. skål (6 cm) og eksponert for trykk (50 bar) og kaprolaktam samtidig i 24 t. 9 døgn etter utsåing ble cellene farget og antall kolonier bestemt. Resultatene er angitt som antall kolonier pr. skål i % av kontroll (relativ kloneeffektivitet) ved i bar ± standard avvik. Hvert punkt representerer gjennomsnittet av 6 skåler.
tilvekst (antall celler/skål dag 6 - c > rdd c ( 0 [Fenol], M 10-I > c i. I. c-) 5000 celler ble sådd ut pr. skål (6 cm). 3 døgn senere ble det skiftet medium og nytt medium inneholdende fenol ble tilsatt. Halvparten av kulturene ble inkubert v/ i bar. Hvert punkt representerer gjennomsnittet av 5 skåler. Etter dekompresjon av trykk-kammeret ble kulturene tatt ut og antall celler pr.skål bestemt. Resultatene for cellene eksponert ved i bar er gitt som netto på vanlig måte ved i bar og halvparten ble eksponert for trykk (50 bar) i 72 t. fenol ± standard avvik. Obs! Etter 72 t v/50 bar var det mindre antall celler i antall FIGUR 8: Effekt av fenol og trykk på vekst av C3H/IOTI/2 Cl 8 (Forsøk 7). 0 io 1O io 10-2 kontrollgruppen enn det var før eksponeringen startet. Resultatene for cellene eksponert for 50 bar er derfor gitt som total tilvekst etter utsåing i % av kontroll celler/skål dag 3) i % av kontroll uten