Sammendrag Måling av mikrobiologisk vannkvalitet er en sentral funksjon i kontroll av den totale vannkvaliteten. De tradisjonelle metodene for å detektere koliforme indikatorbakterier tar 1-2 døgn, og kimtallsanalyser tar 1-2 døgn ved 37 C og 3-7 døgn ved 20 C. Dette betyr at analyse resultatene først er klare etter at vannet har nådd fram til kunden. Det hjelper lite at man får vite at det vannet man allerede har drukket var forurenset. Derfor er det et behov for raskere metoder som kan påvise foruresning slik at tiltak som å justere produksjonparametre kan iverksettes før problemene oppstår. Målet har vært å redusere deteksjonstiden til målorganismene samt å forbedre sensitiviteten, slik at tiden det tar å få resultatene blir redusert. Colifast Systems ASA har utviklet metoder og instrumentering som har redusert deteksjonstiden til totale og termostabile koliforme bakterier fra 24-48 timer (standard metodene) og ned til 2-12 timer, og samtidig er sensitiviteten like bra som standard metodene. I tillegg er en on-line enhet under utvikling for kontinuerlig å kunne måle kvaliteten til bl.a. råvann som skal brukes til drikkevann. Innledning De fleste patogene mikroorganismer som kan spres via drikkevann, har tilknytning til magetarmkanalen hos mennesker og dyr. Den mikrobielle vannkvaliteten overvåkes i dag ved å bestemme mengden indikatororganismer. Dette er bakterier som normalt er tilstede i stort antall i feces. Indikatorene er som oftest ikke selv patogene, men de indikerer om vannet er forurenset og om det derfor er fare for forekomst av patogene organismer. Dyrkbare koliforme bakterier, termostabile koliforme bakterier og Escherichia coli, som påvises ved hjelp av oppdyrkning på selektive medier, er fortsatt de mest benyttede indikatorene på fekal vannforurensning (Norsk Standard, 1990). For bestemmelse av generell mikrobiologisk vannkvalitet bestemmes mengden dyrkbare heterotrofe bakterier (kimtall) (Norsk Standard, 1990). På tross av at millioner av vanntester blir analysert over hele verden, er forurenset vann fremdeles en hovedårsak til sykdom og lidelse (Lippy og Waltrip, 1984). Nye metoder for å måle mikrobiologisk vannkvalitet har i løpet av de siste årene dukket opp på markedet. Disse metodene er raskere (18 timer) og enklere å utføre enn de tradisjonelle metodene.colifast Systems har klart å redusere deteksjonstiden ytterligere til 2-12 timer.
Colifast-teknologien Colifast metoden er basert på en enzymatisk reaksjon. Mediet inneholder substratet 4- metylumbelliferon (MU)-β-D-galaktosid, og dette substratet blir hydrolysert av enzymet β-dgalaktosidase som finnes i koliforme bakterier. Det fluorescerende produktet 4- methylumbelliferon (MU) blir dannet som et resultat av hydrolyse reaksjonen (se Figure 1). Mediet inneholder inhibitorer for å hindre vekst av ikke-koliforme bakterier. 4-methylumbelliferyl-ß- D-galactoside 4-methylumbelliferone R ß-D-galactosidase + R C 3 C 3 Non-fluorescent substrate Fluorescent product Figure 1. Colifast-teknologien er basert på en enzymatisk reaksjon hvor substratet blir hydrolysert av β-dgalaktosidase og et fluoriscerende produkt bli dannet (4-methylumbelliferone). CA-100, et automatisert analyseapparat CA-100 er et automatisert analyseapparat som kan detektere bakterier i vann. ovedkomponentene i CA-100 er to inkubatorblokker, en robotarm som tar prøvene, et fluorometer (ex 380nm og em 450nm), et rensesystem og en programvare som behandler resultatene. Resultatene måles i fluorescerende enheter. Økning i mengde koliforme bakterier medfører økning i mengde β-d-galaktosidase (enzym) som igjen fører til økning i MU produksjon (det fluoriscerende produktet) som betyr et høyere fluorescenssignal på CA-100. De to inkubatorblokkene kan programmeres til å ha hver sin temperatur. For koliforme bakterier er det vanlig å analysere totale koliforme ved 37 C og termostabile koliforme ved 44 C. Prøvene kan prepareres på to måter; enten ved å filtrere vannprøven på et filter som puttes i et prøveglass inneholdende Colifast-media, eller så kan prøven tilsettes direkte til mediet. vilken metode man velger er avhengig av type vann og innhold av koliforme bakterier.
Resultatbehandling Programvaren registrerer resultatene fra CA-100 instrumentet og gir informasjon om vannprøvene på et P/A-format (Presence/Absence). Det betyr at den forteller om det er tilstedeværelse (+) eller fravær (-) av koliforme bakterier i vannprøven. Plottes fluorescens signalet fra CA-100 som en funksjon av tiden, får man kurver som vist i Figure 2. Når bakterier overføres til nye omgivelser som for eksempel Colifast-mediet, vil vekst vanligvis ikke starte med en gang, men først etter en tidsperiode kalt lag-fase (se Figure 2). I løpet av lag-fasen vil bakteriene tilpasse metabolismen til det nye mediet, og eventuelt reparere skade på cellene dersom de har vært utsatt for stress som for eksempel klorering. Når bakteriene begynner å vokse og dele seg tar det ikke lang tid før dette skjer eksponensielt, og dette kalles eksponensiell fase. Jo flere bakterier man har i vannprøven, desto tidligere vil man få økning i fluorescenssignalet. 800 Eksponensiell fase 700 Fluorescerende enheter (EFU) 600 500 400 300 200 >100 cfu Lag fase ~100 cfu ~50 cfu 100 0 0-100 100 200 300 400 500 600 700 Tid (minutter) Figure 2. Fluorescensutvikling fra elvevannsprøver målt med CA-100. Fluorescensen følger mønsteret til bakterieveksten og består av en lag-fase (før vekst) og en eksponesiell fase. Jo flere koliforme bakterier som finnes i vannprøven, desto tidligere observeres økning i fluorescens. Dersom man ønsker semikvantitativ informasjon, kan dette gjøres på to måter. Vann med lavt innhold av bakterier (<50 cfu) vil gi en flat profil i lag-fasen (se Figure 2). Når bakterieveksten starter for fullt vil dette gi utslag som eksponensiell økning i fluorescens (eksponensiell fase i Figure 2). Det tidspunktet da fluorescensen overstiger en fastsatt terskel ( fail level ), som for eksempel kan være 3ppb (tilsvarer ca. 30 EFU i Figure 2) med 4- methylumbelliferone, kalles deteksjonstiden (TTD). Jo flere bakterier det er i vannprøven desto raskere blir deteksjonstiden. Ut fra deteksjonstiden er det mulig å kvantifisere på en logskala. Dersom man ikke får et signal innen 12-13 timer (for totale koliforme) er det ingen bakterier i vannprøven. Figure 3 og Figure 4 viser deteksjonstiden til henholdsvis termostabile og totale koliforme bakterier målt ved CA-100 instrumentet.
10 000 cfu per sample volume 1 000 100 10 1 0 2 4 6 8 10 Time (hours) 12 14 Figure 3. Deteksjonstid (TTD) for termostabile koliforme bakterier (44 C). Tid fra initiell deteksjon til 95% deteksjon (tid når 95% av positive prøver er detektert) av termostabile koliforme bakterier ved bruk av CA-100 instrumentet. 10 000 cfu per sample volume 1 000 100 10 1 0 2 4 6 8 10 Time (hours) 12 14 Figure 4. Deteksjonstid (TTD) for totale koliforme bakterier (37 C). Tid fra initiell deteksjon til 95% deteksjon (tid når 95% av positive prøver er detektert) av totale koliforme bakterier ved bruk av CA-100 instrumentet. Dersom det finnes et høyere antall bakterier i vannet (f.eks.råvann), vil man kunne observere en lineær økning i fluorescens-signalet i bakterienes lag-fase (se Figure 2). Stigningstallet til den lineære økningen, også kalt hydrolysehastigheten, har vist seg å være proporsjonal med mengde koliforme bakterier i en vannkilde, og den kan derfor brukes som en indikator parameter for vannkvalitet. Denne metoden kan gi semikvantitativ informasjon allerede etter 90 minutter. Økningen i fluorescens før vekst skyldes at substratet i mediet hydrolyseres av enzymer (β-d-galaktosidase) i vannprøven. Disse enzymene kommer fra koliforme bakterier men kan i tillegg være frie enzymer eller stamme fra andre organismer som produserer β-dgalaktosidase.
Resultater koliforme bakterier ydrolysehastighet målt i elvevann Totalt 117 vannprøver ble tatt fra Lysaker elva (slo) i løpet av november og desember 1998. Prøvene ble målt 5 ganger i løpet av 4 timer på CA-100 instrumentet. Det ble observert lineær stigning i fluorescens signalet i bakterienes lag-fase (se Figure 2). Stigningstallet som er lik hydrolysehastigheten, ble sammenlignet med antall termostabile koliforme bakterier (cfu) målt på tradisjonell metode (mfc-agar). Regresjonen til hydrolysehastigheten ga r 2 > 0.95 og r 2 < 0.98. Log cfu ble plottet mot log FU rate (hydrolysehastighet), og korrelasjonen ga regresjonen r 2 på 0.65 (Figure 5). 0,5000 0,4500 0,4000 0,3500 0,3000 0,2500 0,2000 0,1500 log rate FU (EFU/min) 0,1000 0,0500 0,0000 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 2,1 2,2 2,3 2,4 2,5 2,6 2,7-0,0500-0,1000-0,1500-0,2000-0,2500-0,3000-0,3500-0,4000-0,4500-0,5000-0,5500-0,6000-0,6500-0,7000 log cfu FC/10 ml Figure 5. Korrelasjonsgraf mellom log cfu målt med mfc (antall bakterier målt med tradisjonell metode) og log FU rate (hydrolysehastighet) målt med CA-100. Det er blitt laget en matematisk model som kan forutsi antall bakterier (cfu) basert på dagens fluorescensmåling (FU rate) og sammenhengen mellom cfu og FU for de to siste foregående målingene. ydrolysehastigheten av MU-galaktosid korrelerer relativt bra til nivået av koliforme bakterier i en vannkilde hvor man kjenner historiske data. Denne metoden kan derfor brukes som et verktøy i overvåkning av råvannskilder.
Ekstern utprøving av CA-100 Gøteborg Vannverk Gøteborg Vannverk har brukt CA-100 til å måle kvaliteten på råvannskilden sin. De har målt stigningen i fluoresens-signalet i løpet av 105 minutter (mindre enn 2 timer), og de har erfart at det er en sammenheng mellom hydrolysehastigheten og antall bakterier målt med tradisjonelle metoder (mfc-agar). Figure 6 viser variasjonene i bakterienivå (termostabile koliforme) i råvannskilden til Gøteborg Vannverk, målt ved tradisjonell metode og på CA-100 instrumentet. Vi ser av Figure 6 at kurvene følger hverandre. E. coli (CFU/100ml) solid line 700 Garn (upstream rawwater intake) ydrolyse rate of MUGal (ppbmu/min) dashed line 0,18 600 500 400 0,16 0,14 0,12 0,1 300 200 100 0,08 0,06 0,04 0,02 0 0 1998-06-22 1998-06-29 1998-07-06 1998-07-13 1998-07-20 1998-07-27 1998-08-03 1998-08-10 1998-08-17 1998-08-24 1998-08-31 1998-09-07 1998-09-14 1998-09-21 1998-09-28 1998-10-05 1998-10-12 1998-10-19 1998-10-26 1998-11-02 1998-11-09 1998-11-16 1998-11-23 1998-11-30 1998-12-07 1998-12-14 1998-12-21 1998-12-28 1999-01-04 1999-01-11 Figure 6. Resultater fra råvannskilden til Gøteborg vannverk (juni 1998 - januar 1999). eltrukken linje viser antall bakterier (cfu) målt med tradisjonell metode (mfc), og stiplet linje viser hydrolysehastigheten til MUGal (substratet i Colifast-mediet) målt med CA-100. Kurvene følger hverandre og viser en god korrelasjon. Målet for Gøteborg vannverk er å kunne få vite om nivået av fekal forurensning er høyere enn normalt. Med CA-100 får de svar raskt nok til å stenge inntaket eller behandle vannet dersom nivået er for høyt, og dermed kan de hindre at forurenset vann når konsumentene. Østfold I Østfold har Interconsult Group og Næringsmiddeltilsynet i Borg prøvet ut et CA-100 instrument på vannprøver fra ledningsnett, råvann, badevann og beredskapstesting. Fredrikstad og Sarpsborg kommune samt Borregaard Industrier har levert vannprøver til prosjektet. 243 vannprøver ble analysert for totale og termostabile koliforme bakterier på CA- 100 og resultatene ble verifisert med briljantgrøntbuljong og API 20E (akrediterte metoder). De samme vannprøvene ble kjørt parallellt på tradisjonell membranfilter metode (mendo- og mfc-agar). Presence-Absence format ga god overensstemmelse mellom Colifast-metoden og de tradisjonelle metodene med 94% for totale og 87% for termostabile koliforme bakterier. I 12 tilfeller (2.5%) detekterte Colifast-metoden koliforme bakterier uten at den tradisjonelle
membranfilter-metoden plukket opp noen bakterier. Det har vist seg at Colifast-metoden er mer sensitiv enn den tradisjonelle membranfiltermetoden. Grunnen kan være at det er lettere for bakterier å vokse i flytende media enn på agar, og i tillegg kan enzymene i stressede bakterier være aktive lenge før bakteriecellen er i stand til å dele seg. Tre falske positive bakterier, dvs ikke-koliforme bakterier (Aeromonas, Plesiomonas, oxidase +) vokste i Colifast-mediet ved 37 C. I dette prosjektet ble bare Colifast-metoden verifisert og ikke membranfiltermetoden. Derfor kan det ikke sies om Colifast-metoden er mer eller mindre spesifikk enn den tradisjonelle membranfiltermetoden ut fra dette prosjektet. Resultater kimtall Det er også mulig å undersøke nivå av heterotrofe bakterier (kimtall) på CA-100. Et studie med 15 rene kulturer og 3 elvevannsprøver ble utført våren 1999. Innstøping av 1ml prøve i R2A-agar ble brukt som referanse metode (1-2 døgn ved 37 C). Det var stor forskjell i deteksjontid på hurtigvoksende og saktevoksende bakterier. De hurtigvoksende bakteriene ble detektert fra 5-8 (10) timer for nivåer på 10-6000 cfu/ml. De saktevoksende bakteriene brukte mer enn 15 timer for samme nivåer. Naturlig overflatevann (råvann, elvevann) domineres av hurtigvoksende bakterier. Vannprøver fra tre elver i slo-området med kimtall på 5-1000 cfu/ml, hadde deteksjonstid fra 7 til 9.5 time. Det er ønskelig å kunne si om en vannkilde inneholder et høyere nivå av bakterier enn normalt. østen 1999 ble det startet feltarbeid med kimtall på CA-100 ved Vikelvdalen Vannbehandlingsanlegg i Trondheim og Denver Water i Colorado. n-line konseptet Et on-line instrument er under utvikling. Det skal være en videreføring av CA-100 instrumentet som er et laboratorie apparat. Fordelene med å kunne plassere et instrument online er, yppigere analyser ved å øke frekvensen av prøveuttagninger Plassering av instrumentet oppstrøms for råvannsinntaket medfører at analyseresultatene er ferdige før vannet tas inn til behandling. Dette er ikke mulig med de tradisjonelle metodene. Mange råvannskilder ligger krunglete til for manuelle prøveuttak, dermed vil et on-line instrument være tidsbesparende og forenklende
Konklusjon Raskere metoder for måling av mikrobiologisk vannkvalitet er et behov fordi de tradisjonelle metodene gir historisk informasjon. Colifast sitt automatiserte CA-100 instrument detekterer koliforme bakterier i løpet av 2-12 timer mot tradisjonelt 1-2 døgn for de tradisjonelle metodene. Resultatene er lovende, både for et Presence/Absence format (tilstedeværelse/fravær av koliforme bakterier) og for semikvantifisering. Takk Takk til enrik Rydberg, Gøteborg Vannverk, Lillian vell, Interconsult AS, Ingunn olme, Næringsmiddeltilsynet i Borg, Karl F. Eckner og Stephanie Jullien som alle har lagt ned mye arbeid med analysering av vannprøver med CA-100 instrumentet, og har gitt oss gode resultater. Litteratur 1. Eckner, K. F. 1998. Comparison of Membrane Filtration and Multiple-Tube Fermentation by the Colilert and Enterolert Methods for Detection of Waterborne Coliform Bacteria, Escherichia coli, and Enterococci Used in Drinking and Bathing Water Quality Monitoring in Southern Sweden. Appl. Environ. Microbiol. 64: 3079-3083. 2. Lippy, E. C., og S. C. Waltrip. 1984. Waterborne disease outbreaks. J. Am. Water Works Assoc. 76:60-67. 3. Norsk Standard. 1990, 1.utgave. NS 4751 Metoder for bakteriologisk undersøkelse av drikkevann NS 4791 eterotroft kimtall. Innstøpningsteknikk.