Metabolic Engineering for Utvikling av Mikrobielle Cellefabrikker Trygve Brautaset NTNU 1 1
Bioteknologi - OECD definisjonen Anvendelse av naturvitenskap og teknologi på levende organismer og på deler, produkter og modeller av disse, slik at levende eller ikke-levende materialer endres for å frambringe kunnskap, varer og tjenester OECD definisjonen ligger til grunn for Nasjonal Strategi for Bioteknologi og Programplan for BIOTEK2021 «Bioteknologi for verdiskapning» 2 2
Mikroorganismer (bakterier, gjær) anvendes i utstrakt grad som cellefabrikker (cell factories) innenfor bioteknologi Bakteriecelle (metabolisme) Bioteknologi - OECD definisjonen Anvendelse av naturvitenskap og teknologi på levende organismer og på deler, produkter og modeller av disse, slik at levende eller ikke-levende materialer endres for å frambringe kunnskap, varer og tjenester OECD definisjonen ligger til grunn for Nasjonal Strategi for Bioteknologi og for Programplan for BIOTEK2021 «Bioteknologi for verdiskapning» 3 3
Mikrobielle cellefabrikker Råmateriale for vekst Bakteriecelle (metabolisme) 4 4
Mikrobielle cellefabrikker Råmateriale for vekst Bakteriecelle (metabolisme) Biodrivstoff; Antibiotika; Vaksiner; Enzymer; Biopolymerer; Platformkjemiaklier; Fórkomponenter 5 5
Bioøkonomien fokus også på råmaterialene; fornybare, ikke konkurranse med matproduksjon, pris, tilgjengelighet, renhet, Biomasse; Metan; Metanol; Sollys; Bakteriecelle (metabolisme) Biodrivstoff; Antibiotika; Vaksiner; Enzymer; Biopolymerer; Platformkjemiaklier; Fórkomponenter ANTIBIOTICS LYSINE GLUTAMIC ACID ENZYMES VITAMINS SUGAR Bacteria Yeast Fungi PRODUCT ORGANIC ACIDS BIO-POLYMERS PIGMENTS BIO-ETHANOL 6 6
Metabolic engineering er teknologi for å utvikle mikrobielle cellefabrikker Råmateriale Bakteriecelle (metabolisme) Biodrivstoff; Antibiotika; Vaksiner; Enzymer; Biopolymerer; Platformkjemiaklier; Fórkomponenter Industriell anvendelse påkrever at cellens produksjonsevner forbedres ved metabolic engineering: - Høyere produksjonsutbytte - Mindre biprodukter - Sekresjon av produkt - Nye produkter - Alternative råmaterialer 7 7
Metabolic engineering = målrettet forbedring av cellulære egenskaper, ved modifisering av spesifikke biokjemiske reaksjoner eller innføring av nye, med bruk av rekombinant DNA teknologi 8
Eks: naturlige produkter her de 20 naturlige aminosyrere strategier for hvordan øke produksjonsnivået i cellen - Overuttrykk nøkkel-enzymer - Bytte ut nøkkel-enzymer - Slå ut konkurrerende spor - Øke tilgang forløpermetabolitter - Øke substratopptak - Reduserende kraft og energi - Sekresjon av produkt - 9
Eks: unaturlige produkter feks terpenoider og karotenoider konstruere syntetiske spor ved å innføre heterologe enzymer 10
Synthetic pathway for 1-butanol production in E. coli - 2-Acetyl-CoA is a metabolite naturally produced by E. coli - The synthetic pathway involves six reaction steps catalyzed by five enzymes - Heterologous enzymes recruited from three different bacterial species; R. eutropha; cyan, C. acetobutylicum; blue, S. collinus; orange, T. denticola. Jens Nielsen Nature Chemical Biology 7, 195 196 (2011) 11
Fra metabolic engineering til syntetisk biologi 12
Metabolske nettverk beskriver alle cellens biokjemiske reaksjoner; dvs metabolitter og enzymene som omdanner disse 13
Systembiologi er bruk av matematisk modellering for å beskrive og kvantifisere metabolske nettverk 14
Fra metabolic engineering til syntetisk biologi og koblet til systembiologi Moderne metabolic engineering tar innover seg alle disse disiplinene! 15
Mange fordeler ved å anvende bakterier og gjær som cellefabrikker - Kan dyrkes til store celletall i fermentorer) - Enkle å modifisere genetisk - Akkumulert stor kunnskap biokjemi, genetikk, fysiologi, metabolske nettverksmodeller - Kan lett destrueres - Mindre energikrevende og mindre biprodukter enn kjemisk industri - Helt nye produkter mulig - 16
Men ; bakterier er jo så små? Om én bakterie vokser og deler seg ubegrenset vil summen av bakterier utgjøre jordens masse på mindre enn 3 døgn! Eks. naturlige aminosyrer L-lysin og L-glutamat (tilsetningskomponenter i dyrefôr og mat) L-lysin: 1.5 millioner tonn per år L-glutamat: 2 millioner tonn per år I all hovedsak av Corynebacterier Samlet produksjon norsk fiskeoppdrett: 1.2 millioner tonn per år (2012) 17 17
«Synthia» en milepæl innenfor metabolic engineering og syntetisk biologi J Craig Venter Institute 2003 - Syntetisk virus 2008 - Syntetisk bakteriekromosom 2010 Mikroinjeksjon av syntetisk bakteriekromosom til dannelse av SYNTHIA Craig Venter: - this is probably the first living creature on this planet whose parent is a computer 18 18
Dermed har vi i dag to prinsipielt ulike metoder for å utvikle mikrobielle cellefabrikker: Skape syntetisk liv fra enkeltkomponenter; Bottom Up Engineere nye funksjoner inn i etablerte mikrobielle vertsceller (chassis; karosseri); Top-Down Fortsatt klart mest anvendt metode 19
Mikrobiell produksjon av antimalariamedisinen Artemisinin; gjærcellen som karosseri for å bygge inn helt nye funksjoner og egenskaper San Francisco firmaet Amyris arbeider nå med å oppskalere og videreutvikle teknologien prisen på Artemisinin forventet å reduseres med 90 %... 20
Metabolic engineering av Escherichia coli for produksjon av biodrivstoff (n-butanol) - Gener rekruttert fra 3 ulike organismer til konstruksjon av nye komplekse biosyntesespor - Produksjonsutbytte 5g/l n-butanol 21
Konsolidert bioprosess i Escherichia coli for anvendelse innenfor bioraffineri - Bakterien skiller ut cellulaser for nedbrytning av hemicellulose til glukose som den så anvender som råmateriale for vekst - Konstruert inn 3 nye biosyntesespor; Peiene; Butanol; Fettsyre etylester 22
Eksempler egen forskning ved NTNU og SINTEF 23 23
Inspirasjonen til kreativitet ligger i naturen selv naturlige "gencluster" som koder for komplekse biosyntesespor - Plukke og sette sammen til nye syntetiske spor i velegnet karosseri cellefabrikk! 24
Marin bioprospektering nye bakterier; nye produkter; nye biosyntetiske spor; nye gener! Mikroorganismer fra havoverflaten/sedimenter Antimicrobial and Anticancer compounds Polyunsaturated fatty acids (DHA) Carotenoids Metagenome-library Novel enzymes New patent in 2008 25
Metabolic engineering av bakterien Bacillus methanolicus for produksjon av fin- og bulk kjemikalier fra metanol Homoserine HDI, HDII Aspartate AKI, AKII, AKIII Aspartate-4-P Asd Aspartate semialdehyde DapA 2,3-Dihydrodipicolinate DapB L-Δ 1 -Tetrahydrodipicolinate DapH ATP ADP NADH + H + NAD + + P i Pyruvate H 2 O NAD(P)H + H + NAD(P) + H 2 O + Acetyl-CoA CoASH Andre produkter fra metanol: - L-glutamat - Terpenoider - Enzymer -. PatA N-acetyl-2-amino- 6-keto-L-pimelate N-acetyl-L,L-2,6- diaminopimelate DapL L,L-diaminopimelate DapF meso-diaminopimelate LysA Lysine decarboxylase CO 2 Lysine (In) Glutamate α-ketoglutarate H 2 O Acetate CO 2 Cadaverine (In) Lysine exporter Cadaverine exporter Lysine (Out) Cadaverine (Out) 26
Kartlegge og forstå metylotrofi som basis for å overføre til andre bakterier Methanol oxidation Carbohydrate uptake 3 methanol mdh NAD + NADH Cyclic formaldehyde oxidation (PP pathway) H+ H 2 O 6PG GL6P G6P pgl NADPH NADP + zwf glucose ptsg HPr PTSI PEP Pyruvate mannitol mtlf mtla HPr PTSI PEP Pyruvate NADP + NADPH CO 2 P i ADP THF gnd THF NADP + NADPH H 2 O H + H + ATP NAD + NADH 3 formaldehyde MTHF MeTHF FTHF formate fold fold fdha Linear formaldehyde oxidation (tetrahydrofolate pathway fhs CO 2 pgi mtld M1P 3 Ru5P 3 H6P 3 F6P 2 FBP rpe rpib 1 Ri5P tkt 2 X5P hps phi pfk GAP 1 S7P tkt Formaldehyde assimilation (RuMP cycle) P i glpx tal H 2 O 1 E4P 1 SBP fba ATP ADP fba 2 GAP 2 DHAP 1 Pyruvate 27
PROMYSE: Products from methanol by synthetic cell factories (2012 2015) Work programme FP7-KBBE-2011-3-6-04: Applying Synthetic Biology principles towards the cell factory notion in biotechnology FP7 Project PROMYSE SINTEF - Coordinator ETHZ - Sveits UNIBI - Tyskland RUG - Nederland INSAT Frankrike DECHEMA (Tyskland) PROMAR (Norge) InSilico (Tyskland) BASF (Tyskland) 28
Systems biology of bacterial methylotrophy for biotechnological products from methanol (2016 2018) MetApp encompasses genome-scale modelling, quantitative multi-omics and highthroughput genetic analysis, tests of orthogonality, data management, and model refinement and abstraction to deduce and experimentally evaluate strategies for methanol-based production of sought-after chemicals 29
Annnen metabolic engineering aktivitet ved SINTEF og NTNU Mikrobiell produksjon av polyumetta fett (DHA, EPA) fra lignocellulose antibiotika antikreft forbindelser Biopolymerer Biodrivstoff Karotenoider. 30
Nye teknologier som driver metabolic engineering og syntetisk biologi framover DNA syntese; DNA sekvensering; Omics teknologier Helt nye DNA kloning- og manipuleringsmetoder Gibson DNA assembly Circular polymerase extension cloning (CPEC) Golden Gate Multiplex automated genome engineering (MAGE) Conjugative assembly of genome engineering (CAGE) Modell-basert forståelse av genetiske systemer (systembiologi!) 31
McKinsey & Company anslår at metabolic engineering/syntetisk biologi sektoren vil vokse til 100 milliarder USD innen 2025, særlig innenfor Medisin og farmasi Fin- og spesial kjemikalier Energi og miljø Biomaterialer Dvs; hovedsakelig innenfor mikrobielle cellefabrikker! 32 32
Takk for oppmerksomheten! 33 33