TheraScreen : K-RAS Mutation Kit for deteksjon av 7 mutasjoner i K-RAS-genet

TheraScreen : K-RAS Mutation Kit for deteksjon av 7 mutasjoner i K-RAS-genet Til bruk på Roche LightCycler 480 Real-Time PCR-system (instrument II) (katalognr.: 05015278001) og Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR-system (delenummer: 4351105) Omfatter bruksanvisning for LightCycler Adapt Software v 1.1 fra Roche Diagnostics (katalognr. 05474914001) for TheraScreen : K-RAS Mutation Kit CE-IVD Bruksanvisning Produktkoder Kit-størrelse DxS-produktkode Roche Diagnostics bestillingsnummer 20 reaksjoner KR-21 05366216190 80 reaksjoner KR-22 05366224190 Instruksjonsversjon: DU001g Revisjonsdato: Mai 2009 Lagres ved 18 C til 25 C Side 1 av 37

Innhold 1. Tiltenkt bruk / Indikasjoner for bruk...3 2. Oppsummering og forklaring av testen...3 3. Teknologiske prinsipper...4 4. Reagenser...6 5. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER...7 6. Betingelser for oppbevaring, stabilitet og forsendelse...8 7. Instrument...9 8. Prøver...9 9. K-RAS mutasjonsdeteksjonsprotokoll... 13 10. Testbegrensninger... 24 11. Analysens ytelseskarakteristika... 25 12. Teknisk assistanse... 33 13. Detaljer om produsenter og distributører... 34 14. Utgivelsesdato for siste versjon... 34 15. References... 35 Merknader til kjøper:... 37 Side 2 av 37

VIKTIG: Les disse instruksjonene nøye, og gjør deg kjent med alle delene i K-RAS Kit før bruk. 1. Tiltenkt bruk / Indikasjoner for bruk Tiltenkt bruk DxS TheraScreen : K-RAS Mutation Kit (K-RAS Kit) er en in vitrodiagnostisk test tiltenkt deteksjon av syv somatiske mutasjoner i K-RASonkogenet og vil gi en kvalitativ vurdering av mutasjonsstatus. K-RAS Kit skal brukes av øvet personale i et profesjonelt laboratoriemiljø med DNAprøver ekstrahert fra formalinfiksert parafin-lagret kolorektalt vev. Indikasjoner for bruk Resultatene for K-RAS Kit skal hjelpe legen å identifisere pasienter med kolorektal kreft som ikke har utbytte av antiepidermal vekstfaktorreseptorbehandling (EGFR), f.eks. panitumumab eller cetuksimab. K-RAS Kit er ikke tiltenkt å diagnostisere kolorektal kreft. Det er tiltenkt som et middel for andre relevante prognostiske faktorer som er brukt, for å velge egnede pasienter til anti-egfr-behandling, basert på pasientens mutasjonsstatus. Pasientens mutasjonsstatus, i tilegg til andre sykdomsfaktorer, vil vurderes av en lege for å vurdere behandlingsmetode. Beslutninger som gjelder behandling av kreftpasienter, må ikke tas basert på K-RASmutasjonsstatus alene. 2. Oppsummering og forklaring av testen K-RAS Kit er et CE-merket diagnostisk utstyr i samsvar med EU-direktiv 98/79/EF om medisinsk utstyr til bruk i in vitro-diagnostikk. Mutasjonene i K-RAS-onkogenet finnes ofte ved human kreft (1-4). Tilstedeværelsen av disse mutasjonene korrelerer med en mangel på respons av enkelte kreftbehandlinger med EGFR-hemmer hos pasienter med metastatisk kolorektal kreft (5-10)(14-21). Deteksjon av syv mutasjoner i K-RAS-genet er mulig i en bakgrunn av villtype av genomisk DNA i en PCR-analyse i sanntid basert på DxS Scorpions -teknologi. Denne linjen er i høyeste grad selektiv. Gitt at det er nok kopier av DNA, er det mulig med deteksjon av ca. 1 % mutant i en bakgrunn av villtype av genomisk DNA. K-RAS Kit vil detektere syv K-RAS-mutasjoner i kodon 12 og 13 av K-RASonkogenet, som vist i tabell 1. Side 3 av 37

Tabell 1: K-RAS-mutasjoner detektert med DxS Kit COSMIC ID-er er hentet fra Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (katalog over somatiske mutasjoner ved kreft) http://www.sanger.ac.uk/genetics/cgp/cosmic/ Mutasjon Base-endring Cosmic ID Gly12Ala (GGT>GCT) 522 Gly12Asp (GGT>GAT) 521 Gly12Arg (GGT>CGT) 518 Gly12Cys (GGT>TGT) 516 Gly12Ser (GGT>AGT) 517 Gly12Val (GGT>GTT) 520 Gly13Asp (GGC>GAC) 532 3. Teknologiske prinsipper K-RAS Kit kombinerer to teknologier, ARMS og Scorpions (11, 12, 13), for å detektere mutasjoner i PCR-analyser i sanntid. ARMS Allel- eller mutasjonsspesifikk amplifikasjon aktiveres av ARMS. Taq DNApolymerase er ekstremt effektiv til å skille mellom en match og en mismatch ved 3 -enden av en PCR-primer. Spesifikt muterte sekvenser kan også amplifiseres selektivt, også i prøver der hoveddelen av sekvensene ikke bærer mutasjonen: Når primeren har full match utføres amplifikasjonen med full effektivitet. Når 3 -basen mismatcher, oppstår kun et lavt nivå bakgrunnsamplifikasjon. Scorpions Deteksjon av amplifikasjon utføres med Scorpions. Scorpions er bifunksjonelle molekyler som inneholder en PCR-primer kovalent bundet til en probe. Fluoroforen i denne proben interagerer med en slukker som også er innlemmet i proben, og som reduserer fluorescens. Under en PCR-reaksjon separeres fluoroforen og slukkeren når proben bindes til ampliconet. Dette fører til en økning i fluorescens fra reaksjonsrøret. Dataanalyser: Ct-metode Scorpions sanntidsanalyser bruker det antallet PCR-sykluser som er nødvendig for å detektere fluorescenssignalet over et bakgrunnssignal. Dette blir en måling av målmolekylene som er til stede ved begynnelsen av reaksjonen. Punktet der signalet detekteres over bakgrunnsfluorescensen, kalles "syklusterskel" (Ct). Ct-verdier for prøven kalkuleres som differansen mellom mutasjonsanalyse-ct og kontrollanalyse-ct fra den samme prøven. Side 4 av 37

Prøver klassifiseres som mutasjonspositive dersom de gir en Ct mindre enn 1 % Ct-verdien for prøven. Over denne verdien kan prøven enten inneholde mindre enn 1 % mutasjon (under grensen for analysen), eller prøven er negativ for mutasjon. Med ARMS-primere kan det oppstå noe inneffektiv priming, noe som gir en svært sen bakgrunns-ct fra DNA som ikke inneholder en mutasjon. Alle Ct-verdier beregnet fra bakgrunnsamplifikasjon vil være større enn 1 % Ct-verdiene, og prøven vil klassifiseres som negativ for mutasjon. K-RAS Kit er CE-merket til bruk i in vitro-diagnostikk, enten på Roche Diagnostics LightCycler 480 Real-Time PCR-system (instrument II) (LightCycler 480-instrument) 96 brønners, Roche delenummer: 05015278001 eller Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR-system, delenummer 4351105 (ABI7500). For LightCycler 480 Instrument må K-RAS Kit brukes sammen med LightCycler Adapt Software v1.1 for TheraScreen K-RAS Mutation Kit CE-IVD (LightCycler Adapt Software). Denne programvaren er utviklet for å automatisere prosessen med å få frem et positivt eller negativt amplifikasjonsplot og kalkulere en egnet terskel man kan oppnå en Ct-verdi fra. Disse brukes for å beregne Ct-verdier for prøver som sammenlignes med 1 % cut-off-verdiene. Programvaren rapporterer et positivt eller negativt mutasjonsresultat og fjerner all subjektivitet fra analysene og vurderingen av data for K-RAS Kit. Format for K-RAS Kit Åtte analyser leveres med K-RAS Kit. Én kontrollanalyse. Syv mutasjonsanalyser. Alle reaksjonsblandinger inneholder en eksogenkontrollanalyse (internkontroll) merket med HEX (for å kunne detekteres med JOE-detektor på ABI7500). Disse kontrollerer nærvær av hemmere som kan føre til falske negative resultater. Kontrollanalyse Kontrollanalysen merket med FAM brukes for å vurdere totalt DNA i en prøve. Kontrollanalysen forsterker en del av ekson 4 av K-RAS-genet. Primerne og proben er utformet for å unngå kjente K-RAS-polymorfier. Mutasjonsanalyser Hver mutasjonsanalyse merket med FAM, inneholder en Scorpion pluss en ARMS-primer for å skille mellom villtype-dna og mutant DNA detektert av en PCR-analyse i sanntid. Side 5 av 37

4. Reagenser K-RAS Kit inneholder egnede reagenser for å utføre kvalitetsvurderinger av prøver og utføre K-RAS-analyser for opptil 20 eller 80 reaksjoner, avhengig av kitstørrelse. Kit-størrelse DxS-produktkode Roche Diagnostics bestillingsnummer 20 reaksjoner KR-21 05366216190 80 reaksjoner KR-22 05366224190 Antallet prøver som kan testes, er avhengig av størrelsen på prøvebatchen. Tabell 2: Innhold i K-RAS Kit Medfølgende reagenser 20 reaksjoner 80 reaksjoner Rør Volum Volum Kontrollreaksjonsblanding 1300 µl 5200 µl 1 12ALA reaksjonsblanding 650 µl 2600 µl 2 12ASP reaksjonsblanding 650 µl 2600 µl 3 12ARG reaksjonsblanding 650 µl 2600 µl 4 12CYS reaksjonsblanding 650 µl 2600 µl 5 12SER reaksjonsblanding 650 µl 2600 µl 6 12VAL reaksjonsblanding 650 µl 2600 µl 7 13ASP reaksjonsblanding 650 µl 2600 µl 8 Blandet standard 300 µl 1000 µl 9 Taq DNA-polymerase 60 µl 240 µl 10 Utstyr og reagenser som ikke følger med K-RAS Kit Brukeren må ha følgende utstyr og forbruksartikler: LightCycler 480 Instrument eller ABI7500 Real-time PCR Machine som kan utføre sykluser som definert i punkt 9; K-RAS mutasjonsdeteksjonsprotokoll. LightCycler Adapt Software v 1.1 fra Roche Diagnostics (katalognr. 05474914001). 0,2 ml DNAse-frie PCR-plater (LightCycler 480 Instrument multibrønnplate 96, katalognr. 04729692 001, eller ABI MicroAmp Optical 96-well reaction Plate, delenummer 4306737, med MicroAmp Optikal Adhesive Film, delenummer 4311971). Sterile rør til fremstilling av Master Mix. Tilpassede pipetter til klargjøring av PCR-blanding. Tilpassede pipetter for å pipettere DNA-templat. Sterilt, nukleasefritt H 2 O. Side 6 av 37

5. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Til bruk i in vitro-diagnostikk K-RAS Kit er ikke tiltenkt å screene eller å diagnostisere noen type kreft, inkludert kolorektal kreft. Den skal brukes som et tillegg til andre prognostiske faktorer, for å velge pasienter som ikke har utbytte av anti-egfr-kreftbehandling. Behandlingen for kreftpasienter må ikke baseres bare på K-RASgenmutasjonsstatus. En lege må vurdere pasientens mutasjonsstatus i tillegg til andre sykdomsfaktorer. Innholdet i K-RAS Kit kan fryses og tines opptil 8 ganger uten at det virker inn på analyseytelsen. IKKE frys og tin reagensene i K-RAS Kit mer enn 8 ganger. Vær oppmerksom på at tumorprøver er ikke-homogene, og at data fra en tumorprøve kanskje ikke stemmer overens med andre deler fra samme tumor. Tumorprøver kan også inneholde vev som ikke er fra tumoren. DNA fra vev som ikke stammer fra tumoren, antas å ikke inneholde K-RAS-mutasjoner detektert med K-RAS Kit. Alle analyser i K-RAS Kit genererer korte PCR-produkter. K-RAS Kit vil imidlertid ikke virke på kraftig fragmentert DNA. DNA-vurderinger må baseres på polymerasekjedereaksjon og kan variere fra kvantifisering basert på optiske tetthetsavlesninger. Flere kontrollreaksjonsblandinger følger med for å vurdere kvalitet og kvantitet for DNA i prøver før K-RAS Kit benyttes. Reagenser for K-RAS Kit er optimalt fortynnet. Videre fortynninger for reagenset anbefales ikke og vil føre til tap av ytelse. Det er ikke anbefalt å bruke mindre enn 25 µl reaksjonsvolumer, da dette vil øke risikoen for falske negative. Alle reagenser i K-RAS Kit settes sammen spesifikt til bruk sammen med de bestemte testene. K-RAS Kit-reagensene må ikke substitueres dersom optimal ytelse skal opprettholdes. For å sikre optimal aktivitet og ytelse må Scorpions-primere (dette gjelder alle fluorescensmerkede molekyler) beskyttes for lys for å unngå fotobleking. Vær svært forsiktig med tanke på å forebygge kontaminering av PCRreaksjoner med syntetisk kontrollmateriale. Det anbefales at separate, tilpassede pipetter brukes til å klargjøre reaksjonsblandinger og tilsette DNA-templat. Klargjøringen og pipetteringen av reaksjonsblandinger må utføres i et eget område for tilsetting av templat. Rør må aldri åpnes etter en PCR-reaksjon. Side 7 av 37

Hver analyse i K-RAS Kit har spesielle egenskaper. Beregning av resultatet må gjøres med henvisning til korrekte analyseparametere, (se delen om tolking av rapport/data). Mutasjons-Ct-verdier på 38 eller mer må scores som negativt eller under kitets grenser. Analysene inneholder en eksogenkontrollreaksjon (internkontroll) i tillegg til reaksjonen av interesse (se delen om teknologiske prinsipper). Hvis begge analysene mislykkes, må dataene kasseres. Det kan nemlig finnes hemmere som kan føre til falske negative resultater. Fortynning av prøven kan redusere effekten av hemmere, men det er viktig å merke seg at dette også vil fortynne DNA-et. Generelle laboratorieforholdsregler må tas, inkludert, men ikke begrenset til: a) Ikke pipetter med munnen. b) Ikke røyk, spis eller drikk i områder der prøver eller kit-reagenser håndteres c) Vask hendene etter at testen er utført Bruk bare Taq-polymerasen (Taq) som leveres med kitet. Ikke erstatt den med Taq fra andre kit av samme eller andre typer, eller med Taq fra en annen leverandør. Bare de reagensene som er nødvendig for hver analysering skal tines. Ikke tin hele kitet hver gang. Dette minimaliserer mengden fryse/tinesykluser. Sikkerhetsinformasjon Forsiktig: Alle kjemikalier og biologisk materiale må betraktes som potensielt farlig. Prøver kan være smittefarlige og må behandles deretter. K-RAS Kit må kun brukes av personer som er opplært i relevante laboratorieteknikker. Personer som arbeider med komponenter i dette K-RAS Kit, må alltid ha på seg en egnet laboratoriefrakk, beskyttelseshansker og vernebriller. Etter bruk må deler fra K-RAS Kit kastes som klinisk avfall. 6. Betingelser for oppbevaring, stabilitet og forsendelse Oppbevaring Alt innholdet i K-RAS Kit må lagres umiddelbart etter mottak ved 18 C til 25 C i en mørk fryser med konstant temperatur. Unngå unødvendig frysing/tining av innholdet i K-RAS Kit. Stabilitet Ikke bruk K-RAS Kit etter bestemt utløpsdato. Innholdet i K-RAS Kit er stabilt frem til utløpsdatoen når det oppbevares under anbefalte oppbevaringsbetingelser i originalemballasjen. Side 8 av 37

Innholdet i K-RAS Kit kan fryses/tines opptil 8 ganger uten at det virker inn på analyseytelsen. IKKE frys og tin reagensene i K-RAS Kit mer enn 8 ganger. Forsendelsesbetingelser Innholdet i K-RAS Kit sendes på tørris og må fortsatt være fryst ved ankomst. Hvis K-RAS Kit ikke er fryst ved ankomst, hvis den ytre pakningen er åpnet under frakt, hvis forsendelsen ikke inneholder en pakkseddel, bruksanvisning eller reagenser, må det lokale Roche Diagnostics-kontoret kontaktes. Se punkt 12 som omhandler teknisk assistanse for kontraktdetaljer. 7. Instrument Se instrumentets bruksanvisning for fullstendige instruksjoner om installasjon og bruk av PCR-instrumentet i sanntid. 8. Prøver Prøvematerialet må være humant genomisk DNA, ekstrahert fra formalinfikserte parafinlagrede kolorektale tumorprøver. Prøvetaking og klargjøring 1. Prøvetransport: Standard patologimetodologi for å sikre prøvekvalitet. 2. Anbefalt prøveekstraksjonsprosess: DNA-ekstraksjon, ved bruk av Qiagen QIAamp DNA FFPE tissue kit (katalognummer 56404). Følgende tilføyelser til Qiagen-protokollen må brukes: FFPE-deler må samles på glassplater. Overflødig parafin må skrapes vekk rundt vevsdelene med en ny, steril skalpell. Skrap bort materiale fra vevsdeler inn i mikrosentrifugerør. Bruk en ny skalpell for hver prøve som skal ekstraheres. Proteinase K-fordøying må fortsette til den er fullført. Dette kan ta opptil 48 timer. Prøvene må elueres i 200 µl ATE-buffer fra Qiagen extraction kit. Alle alternative metoder for prøvepreparering må valideres av sluttbrukeren. 3. Oppbevaring av ekstrahert DNA: Oppbevares ved 20 C før analysering. Prøvevurderingsprotokoll Den ekstra kontrollanalyseblandingen som leveres med K-RAS Kit, må brukes for å vurdere totalt DNA i en prøve. Kontrollanalysen forsterker en del av ekson 4 av K-RAS-genet. Prøvene må bare settes opp med kontrollanalysen som bruker den blandede standarden som positiv kontroll og vann som ikke-templat-kontroll. Side 9 av 37

Legg merke til at prøvene må samles for å oppnå optimal bruk av reagensene i K-RAS Kit. Alle forsøksanalyseringer må inneholde kontroller. Hvis prøver testes individuelt, vil mer reagens bli brukt opp og antall prøver som kan testes med K-RAS Kit, vil bli redusert. Plateoppsett for prøvevurderingsprotokoll 1. Tin kontrollreaksjonsblandingen og blandet standard fra K-RAS Kit til romtemperatur. Bland hver oppløsning ved å vende hvert rør 10 ganger straks de er tint, for å unngå lokale konsentrasjoner av salter. Klargjør egnede blandinger for DNA-prøvene, en blandet standardreaksjon og en ikke-templat-kontrollreaksjon, samt to reaksjoner ekstra. 2. Lag Master Mix ved å bruke reagensmengdene per reaksjon angitt i tabell 3. Tabell 3: Volumer for kontrollanalysers Master Mix Analyse Master Mix Reaksjonsblanding Taq (µl)x1 (µl)x1 Kontrollanalyse 19,8 0,2 3. IKKE vortex Taq eller noen reaksjonsblandinger som inneholder Taq, da dette kan forårsake inaktivering av enzymet. 4. Sørg for at Taq holder romtemperatur før bruk. Snurr flasken for å sikre at Taq er samlet på bunnen av flasken, og pipetter ved å plassere pipettespissen rett under overflaten av Taq for å minimalisere risikoen for at spissen dekkes av overskytende Taq. 5. Bland Master Mix ved å pipettere den forsiktig opp og ned. 6. Tilsett umiddelbart 20 µl kontroll-master Mix til hver av reaksjonsbrønnene. 7. Tilsett umiddelbart 5 µl prøve, blandet standard eller vann (for ikketemplat-kontroller) til reaksjonsbrønnene. 8. Platen må settes opp med blandet standard tilsatt i brønn A1 og ikketemplat-kontroll (vann) tilsatt i A2. Alle andre brønner i bruk må inneholde prøver. 9. Forsegl og snurr PCR-platen lett for å samle reagensene i bunnen av brønnene. 10. Følg instrumentoppsett for egnet plattform. Prøvevurderingsprotokoll instrumentoppsett for LightCycler 480 1. Sett platen umiddelbart inn i LightCycler 480 Instrument. Side 10 av 37

2. Velg LightCycler 480-programvareikonet som finnes på skrivebordet til arbeidsstasjonen som er tilknyttet instrumentet. Logg deg inn i programmet og velg "New Experiment from Template" i "Overview"- skjermbildet. Fra de viste analyseringsmodellene velges "K-RAS LC480II Run Template". Denne modellen vil ha følgende parametere: 1. Deteksjonsformatet er "DxS IVD Assays". 2. Reaksjonsvolumet er 25. 3. Et første pausetrinn ved 95 C i 4 minutter. 4. En 2-trinns amplifikasjon i 45 sykluser med en denaturering ved 95 C i 30 sekunder og hybridisering ved 60 C i 1 minutt. Fluorescenstilgangen er en enkelt tilgang i 60 C-trinnet. 3. Velg "Sample Editor"-fanen, og under "Step 1: Select Workflow" velges "Abs Quant"-avkrysningsboksen. Sørg for at begge filtrene er valgt (465 510 nm og 533 580 nm) under "Select Filter Combinations". Sett opp prøvenavnene under trinn 2 og trinn 3. Kvantiteringsprøvetypen må settes til "unknown". Replikatkolonnene skal være tomme. 4. Velg "Experiment"-knappen og klikk på "Start Run"-knappen for å lagre eksperimentet og starte syklusen. 5. Når analysen er fullført, velges "Analysis"-fanen, og "Abs Quant/2nd Derivative Max" velges fra "Create New Analysis"-vinduet. Godkjenn standardinnstillingene fra "Create New Analysis"-skjermbildet. Sørg for at "Filter Comb"-knappen er "465-510", og velg "Calculate"-knappen. Ct-verdier vises i "Samples"-tabellen. 6. Velg "Filter Comb"-knappen og endre filtrene til 533 580 nm. Velg "Calculate"-knappen og få frem Ct-verdiene for den eksogene kontrollen fra "Samples"-tabellen. Instrumentoppsett for prøvevurderingsprotokoll-abi7500 1. Sett platen umiddelbart inn i ABI7500-instrumentet. 2. Velg 7500 System Software-ikonet på skrivebordet til arbeidsstasjonen som er tilknyttet instrumentet. Åpne en ny analyseringsfil fra filmenyen i 7500 Sequence Detection Software version 1.4. 3. Under "Assay" velges "Standard Curve (Absolute Quantification)". Under "Run Mode" velges "Standard 7500". 4. Flytt til vinduet for detektoroppsett ved å velge "Next"-knappen. Tilføy en FAM- og en JOE-detektor med slukkeren satt til "none" i detektorlisten. Hvis disse detektorene ikke allerede finnes, velges "New Detectors"-knappen og en FAM- og en JOE-detektor settes opp med slukkeren satt til "none". Side 11 av 37

5. Sett "Passive Reference" til "None" og velg "Next"-knappen. 6. Velg hele platen og sjekk avmerkingsboksen for FAM- og JOEdetektorer for å sikre at begge fluoroforer overvåkes i hver brønn. Velg "Finish"-knappen. 7. Under "Instrument"-fanen settes syklusen slik det er angitt i tabell 4. Tabell 4: ABI7500 syklusbetingelser Temperatur Klokkeslett Sykluser Datainnsamling Nivå 1 95 o C 4 min 1 Nivå 2 95 o C 30 sek 60 o C 1 min 40 FAM, JOE 8. Velg "Start"-knappen for å lagre eksperimentet og starte syklusen. 9. Når analyseringen er fullført, må den passive referansen være satt til "none" i skjermbildet for brønninspeksjon. I Amplification Plot-fanen velges alle brønnene i bruk, og JOE-fluoforen velges fra rullegardinmenyen for detektoren. 10. Sjekk JOE-signalet fra hver prøve og sammenlign med JOE-signalet i NTC-brønnen. Legg merke til alle prøver som har en senere amplifikasjonskurve eller mislykket amplifikasjon for eksogenkontrollen sammenlignet med NTC. 11. I Amplification Plot-fanen velges alle brønnene i bruk, og FAM-fluoforen velges fra rullegardinmenyen for detektoren. Bruk de automatiske grunnlinjeinnstillingene og manuell Ct. Still deretter inn terskelen manuelt i midten av den eksponentielle fasen med logskalaen for Y- aksen, slik det er beskrevet i bruksanvisningen til ABI7500. 12. Velg "Analyse"-knappen for å få frem Ct-verdier. Tolking av prøvevurdering Vurder NTC Ct-verdiene for å sikre at det ikke finnes noen kontaminering som gir positiv amplifikasjon i FAM-kanalen (Ct mindre enn 40), eller en mislykket eksogenkontrollreaksjon i HEX-kanalen (ingen Ct) som indikerer et oppsettsproblem. Den blandede standarden skal gi en kontrollanalyse-ct (FAM-kanal) på 26 29 på ABI7500 og 29 på LightCycler 480 Instrument. Data må ikke brukes hvis noen av disse 2 analysekontrollene mislykkes. Kontrollanalyse-Ct 29 35: Vær forsiktig ved tolkning av resultatene, da lave mutasjonsnivåer ikke kan detekteres. Side 12 av 37

Kontrollanalyse-Ct 35 38: Det finnes kun noen få amplifiserbare kopier DNA i slike prøver, og mutasjoner kan bare sees hvis de fleste kopiene er mutert. Kontrollanalyse-Ct 38: Avvis prøve fordi det finnes minimalt med DNA og fordi K-RAS Kit ikke vil kunne detektere mutasjoner. Merk: Hvis en prøve gir en sen kontrollanalyse, skal prøveeksogenkontroll- Ct sammenlignes med eksogenkontrollen for NTC. Hvis eksogenkontrollen for prøven er forlenget eller negativ sammenlignet med NTC, kan det finnes en hemmer. Det er mulig å redusere effekten av en hemmer ved å fortynne prøven, selv om dette også vil fortynne DNA-et. Prøvefortynning: En kontroll-ct på < 24 vil overbelaste mutasjonsanalysene. Prøver med en kontroll-ct på < 24 må fortynnes. Ct-verdier oppnådd med 2. derivatmetode på LightCycler 480 Instrument, kan være litt forskjellig fra de som oppnås med LightCycler Adapt Software. Det anbefales at konsentrerte prøver fortynnes for å falle innenfor > 24- men < 29-området (Ct-verdier basert på 7500 Sequence Detection Software eller LightCycler 480 Instrument Software) med utgangspunkt i at fortynning med ½ vil øke Ct med 1. 9. K-RAS mutasjonsdeteksjonsprotokoll Les disse instruksjonene nøye og bli kjent med alle delene i K-RAS Kit før bruk. For å bruke K-RAS Kit effektivt må prøver samles i en batch-størrelse på 10 (for å fylle en plate med 96 brønner). Mindre batch-størrelser innebærer at færre prøver kan testes med K-RAS Kit. Forsøksoppsett for LightCycler 480 Instrument For hver DNA-prøve må kontroll- og mutasjonsanalyser analyseres i samme PCR-serie for å unngå serie-til-serie-variasjoner. 1. Tin reaksjonsblandingene og blandede standarder fra K-RAS Kit til romtemperatur. Bland hver oppløsning ved å vende hvert rør 10 ganger straks de er tint, for å unngå lokale konsentrasjoner av salter. Klargjør egnede blandinger for DNA-prøvene, blandet standard og ikke-templat-kontroller, samt to reaksjoner ekstra per blanding, slik det er vist i tabell 5. Tabell 5: K-RAS-Master Mix-volumer Analyse Reaksjonsblanding (µl) x 1 Master Mix Taq (µl) x 1 Reaksjonsblanding (µl) per plate (x 14) Side 13 av 37 Taq (µl) per plate (x 14) Kontrollanalyse 19,8 0,2 277,2 2,8 Mutasjonsanalyser 19,8 0,2 277,2 2,8 2. IKKE vortex Taq eller noen reaksjonsblandinger som inneholder Taq, da dette kan forårsake inaktivering av enzymet.

3. Sørg for at Taq holder romtemperatur før bruk. Snurr flasken for å sikre at Taq er samlet på bunnen av flasken, og pipetter ved å plassere pipettespissen rett under overflaten av Taq for å minimalisere risikoen for at spissen dekkes av overskytende Taq. 4. Bland Master Mix ved å pipettere dem forsiktig opp og ned. 5. Tilsett umiddelbart 20 µl av Master Mix til reaksjonsbrønnene. 6. Tilsett umiddelbart 5 µl prøve, blandet standard eller vann (for ikketemplat-kontroller) til reaksjonsbrønnene. Hver DNA-prøve må kontrolleres med både kontrollen og alle mutasjonsanalysene. Plateoppsettet er vist i tabell 6. Tabell 6: Plateoppsett for K-RAS Kit Oppsett for 96 brønner Analyse 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Kontroll B 12ALA C 12ASP D 12ARG E 12CYS F 12SER G 12VAL H 13ASP Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 7. Forsegl og snurr PCR-platen lett for å samle reagensene i bunnen av brønnene. 8. Sett platen umiddelbart inn i LightCycler 480 Instrument. Instrumentoppsett for LightCycler 480 1. Velg LightCycler 480 Instrument software-ikonet på skrivebordet på arbeidsstasjonen som er tilknyttet instrumentet. Logg deg inn i programmet og velg "New Experiment from Template" fra oversiktssiden. 2. Velg "K-RAS LC480II Run Template" fra "Run Templates"-listen (se under Prøvevurderingsprotokoll LightCycler 480 instrumentoppsett hvis du ønsker mer informasjon). 3. Velg "Sample Editor"-fanen, og under "Step 1: Select Workflow" velges "Abs Quant"-avkrysningsboksen. Side 14 av 37

Sørg for at begge filtrene er valgt (465 510 nm og 533 580 nm) under "Select Filter Combinations". Sett opp prøvenavnene under trinn 2 og trinn 3. I kolonne 1 må prøvenavnet være Mixed Standard. I kolonne 2 må prøvenavnet være NTC. I kolonnene 3 12 må prøvenavnene legges inn. Navnene må være identiske for alle brønner i kolonne 1. Kvantiteringsprøvetypen må settes til "unknown". Replikatkolonnen må stå tom fordi replikater ikke tas med i beregningen av LightCycler Adapt Software. 4. Velg "Experiment"-knappen og klikk på "Start Run"-knappen for å lagre forsøket og starte syklusen. Prøveanalysering på LightCycler 480 Instrument 1. Når en serie på LightCycler 480 Instrument er fullført, eksporteres forsøket ved hjelp av navigeringsvinduet (.ixo-fil) til en egnet plassering som kan nås med LightCycler Adapt Software. 2. VIKTIG: LightCycler Adapt Software er godkjent til bruk på et enkelt datasystem som er definert som en enkelt kontrollenhet (arbeidsstasjon), levert av Roche Diagnostics til bruk sammen med LightCycler 480 Instrument II. Denne valideringen av LightCycler Adapt Software gjelder kun for kontrollenheten som er en "frittstående" datamaskin (dvs. ikke en del av nettverket). Bruk av alle andre datamaskiner er ikke mulig siden programvaren ikke vil fungere som planlagt. 3. Åpne LightCycler Adapt Software ved å klikke på LightCycler Adapt Software-ikonet på skrivebordet på arbeidsstasjonen og fylle inn brukernavnfeltet. Dette navnet registreres som rapportforfatter. 4. I hovedvinduet brukes søkeknappen til å velge en enkelt seriefil for LightCycler 480 Instrument (programvaren må lukkes og åpnes på nytt for å fjerne et valg). 5. Velg en rapporttype (pdf eller csv). Hvis csv velges, vil en pdf-versjon opprettes automatisk i tillegg. 6. Velg "Analyse" for å lage resultatrapporten. Rapporten lagres automatisk i mappen som inneholder seriefilen og får samme navn som seriefilen. 7. Rapporten vises automatisk. 8. Det rapporterbare resultatet vises i "Mutation Status"-kolonnen i "Sample Result Table". Tolking av rapport for LightCycler Adapt Software 1. LightCycler Adapt Software-rapporten inneholder generell informasjon om analysen. 1.1. Rapportforfatteren er personen som har brukt programvaren og laget rapporten. 1.2. Analysens dato og klokkeslett er angitt. Side 15 av 37

2. Rapporten gir en detaljert analyseoversikt og inneholder seriefilens navn, algoritmedefinisjonsfil og algoritmesekvens. Algoritmedetaljene er faste og kan ikke endres. 3. Resultatdelen inneholder fullt navn og filbane til LightCycler 480 Instrument-serien i tillegg til følgende informasjon: 3.1. Serienummeret tilhørende LightCycler 480 Instrument. 3.2. Instrument name identifikator til LightCycler 480 Instrument i LightCycler 480 Instrument software. 3.3. Run Date dato og klokkeslett for LightCycler 480 Instrumentserien. 3.4. Run Operator navnet på personen som var logget på LightCycler 480 Instrument software når forsøket ble utført. 3.5. Experiment Name seriefilens navn. 3.6. Software Version programvareversjonen som brukes på LightCycler 480 Instrument. 3.7. Lot Number fra "Lot No"-feltet i forsøkets oppsettsskjermbilde i LightCycler 480 Instrument software. 4. Plateoppsettet er angitt med prøvenavn som er hentet fra prøveredigeringsskjermbildet i LightCycler 480 Instrument Software. 5. Et "Run Summary Result" er angitt der serien er gyldig eller ugyldig. Dette avhenger av seriekontrollene i kolonnene 1 og 2. 6. Seriekontroller 6.1. LightCycler Adapt Software beregner automatisk Ct-verdien for blandet standard med formelen mutasjon-ct-kontroll-ct= Ct 6.2. LightCycler Adapt Software sammenligner verdiene med forventede verdier som er angitt i tabell 7. Tabell 7: Forventede Ct-verdier for LightCycler Adapt Software Analyse Ct for blandet standard 12ALA -0,61 12ASP -0,61 12ARG 0,34 12CYS -0,79 12SER -0,13 12VAL 0,1 13ASP -0,74 6.3. Ct- og Ct-verdier rapporteres. 6.4. Følgende flagg/advarsler rapporteres for seriekontrollene i kolonne 1 og 2: Side 16 av 37

Tabell 8: Flagg/advarsler for seriekontroller i LightCycler Adapt Software Flagg/advarsler CT_OUT_OF_RANGE EXO_FAIL DELTA_CT_OUT_OF_RANGE EXO_CONTROL_INVALID TARGET_CHANNEL_INVALID Betydning FAM-Ct for kontrollanalyse er utenfor området Eksogenkontrollen har Ct<30 eller er negativ for blandet standard når FAM-resultatet er negativt Mutasjon- Ct-verdi er utenfor det angitte området. Reaksjonen for eksogenkontrollen er mislykket i NTC FAM-reaksjonen har en positiv Ct-verdi i NTC 6.4.1. Betydningene av flaggene/advarslene er beskrevet mer detaljert nedenfor: 6.4.1.1. CT_OUT_OF_RANGE Kontrollanalysen for blandet standard må ha en Ct-verdi på 26,60 ± 2. Hvis analysen er utenfor dette området, vises flagget/advarselen for alle brønner med blandet standard, siden Ct-verdier ikke beregnes og blandet standard er feil. Dette indikerer at kontrollanalysen ikke fungerer korrekt. 6.4.1.2. EXO_FAIL Flagget/advarselen vises hvis analysen for eksogenkontrollen er under 30 i noen av brønnene for blandet standard: Dette kan indikere at det finnes PCRkontaminasjon i denne blandingen. Hvis analysen for eksogenkontrollen mislykkes når en FAM-reaksjon mislykkes i av brønnene for blandet standard, vises også flagg/advarsel for EXO_FAIL. Dette indikerer at det er et problem med denne analysen som kan føre til falske negative resultater. Blandet standard er allerede ugyldiggjort grunnet FAM-feilen. 6.4.1.3. DELTA_CT_OUT_OF_RANGE Hvis Ct-verdien for blandet standard er innenfor ±2,00 av verdien angitt i tabell 7, vil programvaren rapportere en gyldig status. Hvis Ct er under forventet område, vil statusen være ugyldig og flagget/advarselen vil vises. Dette indikerer et problem med en analyse og kan føre til falske resultater. 6.4.1.4. EXO_CONTROL_INVALID I brønnene for ikketemplat-kontroll må analysen for eksogenkontrollen gi et positivt resultat i alle 8 brønner (Ct < 41). Flagget/advarselen vises hvis det oppnås et negativt resultat og hvis ugyldig status vises. Dette indikerer et problem med analysen som kan føre til falske resultater. 6.4.1.5. TARGET_CHANNEL_INVALID I de 8 brønnene for ikke-templat-kontroll må FAM-resultatet være negativt (Ct > 38). All amplifikasjon indikerer kontaminasjon. Et positivt resultat vil føre til at flagget/advarselen vises og ugyldiggjør ikke-templat-kontrollen. 6.5. I tilfeller der noen av brønnene for blandet standard eller ikketemplat-kontroll har ugyldig status, vil resultatet for serieoppsummeringen være "Run Invalid". Side 17 av 37

I "Sample Result Table" vil prøvenavn og kontroll-ct-verdier rapporteres, men mutasjonsstatusen vil rapporteres som "invalid". Blandet standard indikerer at alle analysene utføres korrekt. Hvis dette viser seg å ikke være tilfelle, kan det føre til en varsling om falsk positiv eller falsk negativ mutasjon. Ikke-templat-kontrollen indikerer at det ikke finnes kontaminasjon i Master Mix og at eksogenkontrollen fungerer som forventet. 6.6. Hvis det mot all sannsynlighet skulle skje at LightCycler Adapt Software oppdager en feilmelding, kan du ta en titt under teknisk assistanse under punkt 12. 7. Prøveresultater 7.1. "Sample Result Table" rapporterer prøvenavn som er innhentet fra LightCycler 480 Instrument software og kontrollanalysens Ctverdier. 7.2. LightCycler 480 Adapt Software beregner Ct-verdier og avgjør om en prøve er positiv eller negativ på mutasjon basert på 1 % cutoff-verdier oppgitt i tabell 9. Tabell 9: 1 % cut-off-verdier for LightCycler Adapt Software Analyse 1 % delta Ct 12ALA 6,25 12ASP 7,72 12ARG 6,83 12CYS 6,95 12SER 8,95 12VAL 6,5 13ASP 9,09 7.3. Hvis en mutasjon- Ct-verdi for en prøve er under tilsvarende 1 % Ct-cut-off-verdi, kalles prøven mutasjonspositiv. LightCycler Adapt Software vil rapportere hvilken mutasjon som finnes, men vil kun rapportere en enkelt mutasjon. Hvis det er 2 positive Ctverdier, vil den minste verdien bli rapportert. Det forutsettes at den andre verdien er produsert ved kryssreaktivitet for en mutasjonsprimerbinding og priming fra en annen mutasjon. I sjeldne tilfeller med dobbeltmutasjon vil den kliniske beslutningen være identisk med tilfellet for en enkelt mutasjon. 7.4. Hvis prøvens Ct-verdier er større enn 1 % Ct-verdiene, rapporteres prøven som mutasjonsnegativ (kan inneholde en mutasjon, men dette er på et nivå som ligger under grensene for kitet). 7.5. Flagg/advarsler 7.5.1. LightCycler Adapt Software vil rapportere flere flagg/advarsler for prøvene i "Sample Result Table", slik det er beskrevet i tabell 10. Side 18 av 37

Tabell 10: LightCycler Adapt Software, flagg/advarsler for prøver Flagg/advarsler Betydning REP_DILUTION Kontrollens Ct er mindre enn 24 CONF_LEVEL Kontrollens Ct er større enn 28,9 og ingen mutasjon er rapportert LIMITED Kontrollens Ct er større enn 35 EXO_FAIL Eksogenkontrollanalysen er mislykket når FAM-reaksjonen også er mislykket i en mutasjonsreaksjon, eller eksogenkontrollens Ct er mindre enn 30. FAIL Programvaren kan ikke påvise om kurven er positiv eller negativ 7.5.2. Betydningene av flaggene/advarslene er forklart mer detaljert nedenfor: 7.5.2.1. REP_DILUTION Kontrollens Ct < 24. Analysene er validert til et nivå av DNA som gir en kontroll-ct på 24 eller mer. Hvis en prøve gir en lavere kontrollanalyse-ct, bør den fortynnes for å sikre at den faller innenfor gyldig arbeidsområde. 7.5.2.2. CONF_LEVEL Kontroll-Ct > 28,9. Flagget/advarselen CONF_LEVEL vil vises i en negativ prøve med kontroll- Ct > 28,9. Mutasjon-Ct-verdier klassifiseres som negative eller utenfor grensene for kitet når de er større enn eller lik 38. Det er nødvendig å ha en kontroll-ct på 28,9 eller mindre for å gi nok DNA for å muliggjøre deteksjon av 1 % mutasjon, forutsatt 1 % cut-off-verdier og en Ct-cut-off-verdi på 38. Hvis kontroll-ct er større enn 28,9 og en mutasjon er detektert, vises den positive mutasjonen. Flagget/advarslen vises ikke fordi prøven inneholder en bestemt mutasjon. Hvis kontroll-ct er over 28,9 og prøven synes å være mutasjonsnegativ, vises imidlertid flagget/advarslen for å varsle at lavnivåmutasjoner kan ha unnsluppet. Når kontroll-ct øker over 28,9, minker sensitiviteten for mutasjonsdeteksjonen. 7.5.2.3. LIMITED Kontroll-Ct > 35. Dette indikerer at det er veldig lite amplifibart DNA tilgjengelig. Derfor kan bare mutasjoner med en høy prosentdel detekteres. Hvis en positiv mutasjon gir en Ct < 38 for LIMITED-prøver, vil mutasjonen fortsatt være gyldig og rapporteres. Forekomsten av mutasjoner med lavt nivå i en prøve med et negativt resultat og LIMITED-flagg/advarsel kan ikke ses bort fra. 7.5.2.4. EXO_FAIL Programvaren sjekker for amplifikasjon av eksogenkontrollanalysen for å fastslå om det kan finnes en hemmer som kan føre til et falskt negativt resultat. Følgende logikk brukes: Side 19 av 37

a. Eksogenkontrollreaksjonen vil bare bli vurdert i brønnene for mutasjonsreaksjoner, ikke i brønnene for kontrollanalyser, med unntak av blandet standard og NTC-kolonner (se punkt 6) eller hvis det finnes en eksogenkontroll-ct < 30. b. Hvis det er et positivt mutasjonsfunn, men eksogenkontrollanalysen er mislykket i brønnen med positiv mutasjon, vises ikke EXO_FAIL-flagg/advarsel fordi det kan være kompetitiv hemming fra FAMreaksjonen. Mutasjonsstatusen er gyldig. c. Hvis det er et positivt mutasjonsfunn for en prøve i en mutasjonsbrønn, og hvis en eksogenkontrollanalyse mislykkes i en annen mutasjonsbrønn for samme prøve, vil mutasjonen i den første brønnen bli funnet og resultatet er gyldig. EXO_FAIL-flagg/advarsel vil imidlertid bli vist. Dette indikerer at det er et problem med analysen i den mislykkede brønnen for eksogenkontrollanalysen, og en mutasjon kan ha unnsluppet i denne brønnen. Det er mulig at mutasjonsfunnet kanskje skyldes kryssreaktivitet mellom analysene og ikke er en sann mutasjon som har unnsluppet. Mutasjonsstatusen i analysen som rapporterer det positive mutasjonsfunnet, forblir imidlertid gyldig, fordi det finnes en tydelig mutasjon. Den kliniske beslutningen forblir den samme uavhengig av hvilken mutasjon som finnes. d. Hvis prøven blir funnet negativ, men en eksogenkontrollreaksjon er mislykket i noen av mutasjonsanalysene, vil EXO_FAIL-flagg/advarsel vises, og statusen er ugyldig. Det er mulig at en mutasjon kan ha unnsluppet. e. Hvis eksogenkontrollanalyse-ct er < 30 i noen av de 8 brønnene, vil EXO_FAIL-flagg/advarsel vises, og statusen er ugyldig. Det er mulig at det er PCRproduktkontaminasjon i denne analysen. f. LightCycler 480 Instrument-seriefilen kan kontrolleres for å fastslå mulig årsak til at eksogenkontrollanalysen mislyktes. Hvis alle eksogenkontrollreaksjonene har mislyktes i en kolonne, kan det finnes en hemmer. Hvis den har mislyktes i bare 1 brønn, kan det være et problem med plateoppsettet. 7.5.2.5. FAIL FAIL-flagg/advarsel vises når programvaren ikke kan avgjøre om en amplifikasjonskurve er positiv eller negativ, f.eks. hvis kurveformen er ikke er normal. 7.5.3. LightCycler Adapt Software sjekker at prøvenavnet inne i en kolonne er identisk for å sikre at mutasjon- og kontrollanalyse-ct-verdier som brukes for å kalkulere Ctverdier, er fra samme prøve. Side 20 av 37

Prøvenavnene oppgis av prøveforfatterskjermbilde i forsøksseriefilen på LightCycler 480 Instrument. Hvis det er en mismatch i kolonnen, rapporterer programvaren SAMPLE MISMATCH i Sample Name-kolonnen i Sample Result Table. I plateoppsettet rapporterer programvaren prøvenavnet etterfulgt av (MISMATCH). Hvis dette er en skrivefeil, kan navnet korrigeres i LightCycler 480 Instrument-seriefilen, og dataene reanalyseres med LightCycler Adapt Software. Forsøksoppsett for ABI7500 For hver DNA-prøve må kontroll og mutasjonsanalyser analyseres i samme PCR-serie for å unngå serie-til-serie-variasjoner. 1. Tin reaksjonsblandingene og blandede standarder fra K-RAS Kit til romtemperatur. Bland hver oppløsning ved å vende hvert rør 10 ganger straks de er tint, for å unngå lokale konsentrasjoner av salter. Preparer egnede blandinger for DNA-prøvene, blandet standard og ikke-templat-kontroller, samt to reaksjoner ekstra per blanding, slik det er som vist i tabell 11. Tabell 11: K-RAS Master Mix-volumer Analyse Reaksjonsblanding (µl) x 1 Master Mix Taq (µl) x 1 Reaksjonsblanding (µl) per plate (x 14) Taq (µl) per plate (x 14) Kontrollanalyse 19,8 0,2 277,2 2,8 Mutasjonsanalyser 19,8 0,2 277,2 2,8 2. IKKE vortex Taq eller noen reaksjonsblandinger som inneholder Taq, da dette kan forårsake inaktivering av enzymet. 3. Sørg for at Taq har romtemperatur før bruk. Snurr flasken for å sikre at Taq er samlet på bunnen av flasken, og pipetter ved å plassere pipettespissen rett under overflaten av Taq for å minimalisere risikoen for at spissen dekkes av overskytende Taq. 4. Bland Master Mix ved å pipettere dem forsiktig opp og ned. 5. Tilsett umiddelbart 20 µl av Master Mix til reaksjonsbrønnene. 6. Tilsett umiddelbart 5 µl prøve, blandet standard eller vann (for ikketemplat-kontroller) til reaksjonsbrønnene. Hver DNA-prøve må kontrolleres med både kontrollen og alle mutasjonsanalysene. Plateoppsettet er vist i tabell 12. Side 21 av 37

Tabell 12: Plateoppsett for ABI7500 K-RAS Oppsett for 96 brønner Analyse 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Kontroll B 12ALA C 12ASP D 12ARG E 12CYS F 12SER G 12VAL H 13ASP Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 7. Forsegl og snurr PCR-platen lett for å samle reagensene i bunnen av brønnene. 8. Sett platen umiddelbart inn i ABI7500-instrumentet. Instrumentoppsett for ABI7500 1. Velg 7500 System Software-ikonet på skrivebordet på arbeidsstasjonen tilkoblet instrumentet. Åpne en ny analyseseriefil fra filmenyen med 7500 Sequence Detection Software version 1.4. 2. Velg "Standard Curve (Absolute Quantification)" under "Assay". Velg "Standard 7500" under "Run Mode". 3. Flytt til vinduet for detektoroppsett ved å velge "Next"-knappen. Tilføy en FAM- og en JOE-detektor, med slukkeren satt til "none", til detektorlisten. Hvis disse detektorene ikke allerede finnes, velger du "New Detectors"-knappen og angi en FAM- og en JOE-detektor med slukkeren satt til "none". 4. Sett "Passive Reference" til "None" og velg "Next"-knappen. 5. Velg hele platen og sjekk avmerkingsboksen for FAM- og JOEdetektorer for å sikre at begge fluoroforer overvåkes i hver brønn. Velg "Finish"-knappen. 6. Under "Instrument"-fanen settes syklusen slik det er angitt i tabell 13. Side 22 av 37

Tabell 13: ABI7500 syklusbetingelser Temperatur Klokkeslett Sykluser Datainnsamling Nivå 1 95 o C 4 min 1 Nivå 2 95 o C 30 sek 60 o C 1 min 40 FAM, JOE 7. Velg "Start"-knappen for å lagre forsøket og starte syklusen. Prøveanalysering for ABI7500 1. Sørg for at den passive referansen settes til "none" i brønninspeksjonsskjermbildet. 2. Kontroller at hver brønn gir et JOE-signal fra eksogenkontrollanalysen. a. Fortsett med analyseringen hvis eksogenkontrollanalysen gir et positivt resultat. b. Hvis eksogenkontrollanalysen mislykkes, men FAM-reaksjonen har amplifert, må du fortsette med analyseringen, da FAM-reaksjonen har utkonkurrert eksogenkontrollreaksjonen c. Data må forkastes hvis både FAM- og eksogenkontrollreaksjonene har mislyktes, da det kan være nærvær av hemmere. Disse hemmerne kan føre til falske negative resultater. 3. I Amplification Plot-fanen velges alle brønnene i bruk, og FAM-fluoforen velges fra rullegardinmenyen for detektoren. Bruk de automatiske grunnlinjeinnstillingene og manuell Ct. Still deretter inn terskelen manuelt i midten av den eksponentielle fasen med logskalaen for Y-aksen, slik det er beskrevet i bruksanvisningen til ABI7500. 4. Analyser dataene og beregn Ct-verdi på følgende måte [prøvemutasjonsanalyse-ct] [prøvekontrollanalyse-ct] = Ct Data kan eksporteres til Microsoft Excel for å forenkle analyseringen. ABI7500 datatolking 1. Kontroll-Ct-verdier: 1.1. Kontroll-Ct-verdien må være 24 for ikke å overbelaste analysen. 1.2. Kontroll-Ct < 29: K-RAS Kit kan detektere så lite som 1 % mutasjon i disse prøvene. 1.3. I prøver med kontroll-ct 29 vil ikke kitet detektere så lavt som 1 % mutasjon, men vil fortsatt kunne detektere høynivåmutasjoner. 1.4. Kontroll-Ct 35. Det finnes kun noen få amplifiserbare kopier DNA i slike prøver, og mutasjoner kan bare sees hvis de fleste kopiene er mutert. 1.5. Kontroll-Ct 38. DNA er begrenset og data må ikke brukes. Side 23 av 37

2. Ct-verdier for blandet standard 2.1. Ct-verdier for blandet standard bør være som angitt i tabell 14, men variasjoner på ±2 kan forekomme grunnet forskjellige innstillinger på forskjellige instrumenter. Tabell 14: Ct-verdier for blandede standarder og 1 % Cut-off-punkter for ABI7500 Analyser Ct for blandet standard Godkjent område for blandet standard 1 % Ct for prøve 12ALA 0,70 2,70 til 1,30 6,5 12ASP 1,04 3,04 til 0,96 8 12ARG 0,02 2,02 til 1,98 8 12CYS 0,98 2,98 til 1,02 7 12SER 0,02 1,98 til 2,02 9 12VAL 0,19 2,19 til 1,81 6,5 13ASP 1,12 3,12 til 0,88 9 3. Ct-verdier for prøver: 3.1. Hvis prøvens Ct-verdi er større enn 1 %-verdien (som indikert i tabell 14), klassifiseres DNA-prøven som mutasjonsnegativ eller under grensene for K-RAS Kit. 3.2. Hvis prøvens Ct er mindre enn 1 %-verdien, klassifiseres DNAprøven som mutasjonspositiv. 3.3. Mutasjons-Ct-verdier på 38 eller mer må scores som negative eller under kitets grenser. 10. Testbegrensninger Det er nødvendig å ha en prøvekontrollanalyse-ct på < 29 på ABI7500 og < 28,9 på LightCycler 480 Instrument for å detektere 1 % mutasjon i en bakgrunn av villtype-dna. Analysene vil ikke kunne detektere 1 % mutasjon i prøver med større kontroll-ct-verdier, og sensitiviteten for mutasjonsdeteksjon vil minke når kontroll-ct øker over disse verdiene. Kontroll-Ct-verdien for prøve-dna baseres på konsentrasjonen som bestemmes med PCR. Verdier basert på avlesninger av optisk tetthet svarer ikke til kontrollanalyse-ct-verdier i fragmenterte DNA-prøver. Ekstra kontrollreaksjonsblanding følger med for å vurdere prøve-ct-er før kitet brukes. Analysen må regnes som negativ eller under kitets grenser hvis en prøve gir et mutasjonspositivt resultat der mutasjons-ct 38. Dette utføres automatisk av LightCycler Adapt Software. Noe kryssreaktivitet kan inntreffe mellom mutasjonsreaksjoner. Hvis f.eks. et høyt nivå 12ALA-mutasjon observeres, vil også noen av de andre mutasjonsreaksjonene avgi et positivt resultat. Dette er fordi ARMS-primere detekterer andre mutasjoner innen noen få baser etter hverandre. Side 24 av 37

Ved syntetisk kontrollmateriale danner kryssreaktiviteten et lesbart mønster på ABI7500 som lar de sanne positive bestemmes fra flere signaler (se tabell 15). Tabell 15: Mønster for kryssreaktivitet på ABI7500 fra syntetisk kontrollmateriale Ja indikerer et sant signal. Antall indikerer cirka antall sykluser etter det sanne signalet slik at et kryssreaktivitetssignal kan sees. Verdier som gjelder for sykluser under 9, er ikke registrert, da disse vil være i den negative sonen. Positiv prøve 12ALA signal 12ASP signal 12ARG signal 12CYS signal 12SER signal 12VAL signal 13ASP signal 12ALA Ja 9-6 3 6-12ASP 9 Ja - - - - - 12ARG - - Ja - - - - 12CYS - 7 4 Ja - - - 12SER 9 6 9 - Ja - 8 12VAL 4 - - - - Ja - 13ASP - - - - - - Ja Merk: Kryssreaktivitetsmønsteret kan være forskjellig på DNA-prøver, dvs. parafin-lagrede DNA-prøver. K-RAS Kit er utviklet for å detektere en mutasjon i en DNA-prøve. Hvis en annen mutasjonsanalyse gir et positivt resultat, er dette sannsynligvis kryssreaktivitet. Doble mutanter er imidlertid likevel observert. Videre undersøkelser bør utføres hvis mønsteret ikke passer mønsteret for kryssreaktivitet. 11. Analysens ytelseskarakteristika Analyseytelse er karakterisert for K-RAS Kit på ABI7500 og LightCycler 480 Instrument (ved hjelp av LightCycler Adapt Software for å oppnå Ctverdier). Mange forskjellige tester er utført på hvert instrument. Resultatene for disse testene er oppsummert nedenfor. 1 % cut-off-validering: LightCycler 480 Instrument: Deteksjonen av 1 % mutasjon i en bakgrunn av K-RAS mutasjonsnegativ cellelinje-dna ble bestemt over et område av tre forskjellige konsentrasjoner av cellelinje-dna for å fastsette en cut-off- Ct-verdi for hver mutasjonsanalyse. For hver analyse ble 1 %-standarder testet i triplikat på 3 separate serier for både kontrollanalyse og mutasjonsanalyse. Dette ble gjentatt av 3 forskjellige brukere. Ct-verdier ble levert av LightCycler Adapt Software. 1 % Ct-verdiene ble beregnet fra alle kombinasjoner av mutasjons- og kontroll-ct-verdier av replikatene innen en serie. Side 25 av 37

Cut-off Ct-verdier ble satt som gjennomsnittsverdien i alle serier og konsentrasjoner. Resultatene fra denne testingen er oppsummert i delen om tolking av data. ABI7500: For hver analyse ble 1 %-fortynninger testet i triplikat for 3 kitlot og på 3 separate serier for både kontrollanalyse og mutasjonsanalyse. Blandet standard ble brukt på hver plate for å sikre at analysene ble utført innenfor de spesifiserte kriteriene. 1 % Ct-verdiene ble beregnet fra gjennomsnittlige Ct-verdier av replikatene innen en serie og lot. Cut-off Ct-verdier ble satt som gjennomsnittsverdien (til nærmeste 0,5) av alle lot, serier og konsentrasjoner, for konsentrasjoner der alle replikater ga en Ct-verdi. Resultatene fra denne testingen er oppsummert i tabell 16 nedenfor. Tabell 16: Valideringsresultater for 1 % cut-off-verdier for ABI7500 Gj.snitt 1% Ctverdier Analyse 12ALA 6,68 6,5 12ASP 8,2 8 12ARG 8,16 8 12CYS 6,94 7 12SER 8,83 9 12VAL 7,67 7,5* 13ASP 8,89 9 * 1 % cut-off for 12Val ble endret til 6,5 basert på gjennombruddsstudien. Se drøftingene nedenfor. Bestemmelse av Ct for blandet standard LightCycler 480 Instrument: Ct-verdier for blandet standard er gjennomsnittsverdier innhentet fra 50 serier der blandet standard ble testet. Ct-verdier ble levert av LightCycler 480 Adapt Software. Forventede Ct-verdier for blandet standard vises i delen om tolking av data. ABI7500: Verdien for blandet standard er angitt med gjennomsnittet for 422 Ct verdier. Disse ble beregnet fra mange forskjellige kitlot og serier. Forventede Ct-verdier for blandet standard vises i delen om tolking av data. Validering av gjennombrudd: Gjennombrudd er definert som ikkespesifikk amplifikasjon i mutasjonsanalyser for et villtype-dna-mål som finnes i en enkelt prøve. Dette fører til et målbart nivå bakgrunnsstøy. Gjennombruddet fra villtype-dna ble vurdert for hver mutasjonsanalyse. Gjennombruddsstudien sikret at tidligere fastsatt 1 % cut-off-verdi ble under gjennombruddsnivå og vil hindre rapportering av et falskt positivt resultat. Side 26 av 37