Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit

Transkript

1 August 2012 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 24 Versjon 2 Til bruk i in vitro-diagnostikk Til bruk sammen med Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM - eller Rotor-Gene Q 5plex HRM-instrumentet NO QIAGEN Manchester Ltd, Skelton House, Lloyd Street North, Manchester, M15 6SH, Storbritannia R NO Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN prøve- og analyseteknologi QIAGEN er den ledende leverandøren av innovativ prøve- og analyseteknologi som gjør det mulig å isolere og påvise innhold i enhver biologisk prøve. Våre avanserte høykvalitetsprodukter og -tjenester sikrer suksess fra prøve til resultat. QIAGEN setter standarden når det gjelder: Rensing av DNA, RNA og proteiner Nukleinsyre- og proteinanalyser microrna-forskning og RNAi Automatisering av prøve- og analyseteknologi Vårt mål er å gjøre det mulig for deg å oppnå enestående suksess og gjennombrudd. Du finner mer informasjon på 2 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

3 Innhold Tiltenkt bruk 4 Sammendrag og forklaring av testen 4 Prosedyreprinsipp 5 Reagenser 8 Materialer som medfølger 11 Settets innhold 11 Materialer som er nødvendige, men ikke medfølger 12 Advarsler og forholdsregler 13 Sikkerhetsinformasjon 13 Generelle forholdsregler 13 Oppbevaring og håndtering av reagenser 14 Prøvetaking, klargjøring for analyse og oppbevaring 15 Prosedyre 16 DNA-ekstraksjon 16 Protokoll: DNA-prøvevurdering 17 Deteksjon av KRAS-mutasjoner 29 Tolkning av resultater 40 Feilsøkingsveiledning 42 Flagg i therascreen KRAS Assay Package 43 Kvalitetskontroll 48 Begrensninger 48 Forventede resultater 49 Ytelseskarakteristikker 49 Analytisk ytelse 49 Variabilitet ved prøvehåndtering 69 Variabilitet mellom partier 70 Referanser 70 Symboler 72 Kontaktinformasjon 73 Vedlegg: Installasjon av therascreen KRAS Assay Package 74 Bestillingsinformasjon 78 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012 3

4 Tiltenkt bruk therascreen KRAS RGQ PCR Kit er en kvalitativ PCR-analyse i sanntid som brukes på Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM- eller Rotor-Gene Q 5plex HRMinstrumentet for å påvise sju somatiske mutasjoner i det humane KRASonkogenet ved hjelp av DNA ekstrahert fra formalinfiksert parafininnstøpt (FFPE) kolorektal kreftvev (CRC). therascreen KRAS RGQ PCR Kit er beregnet på å hjelpe leger med å identifisere pasienter med kolorektal kreft som ikke har utbytte av antiepidermal vekstfaktorreseptorbehandling (EGFR), f.eks. panitumumab eller cetuksimab. Sammendrag og forklaring av testen Det blir ofte funnet mutasjoner i KRAS-onkogenet ved human kreft (1 4). Tilstedeværelsen av disse mutasjonene korrelerer med en mangel på respons på enkelte kreftbehandlinger med EGFR-hemmer hos pasienter med metastatisk kolorektal kreft (6 19). Ved hjelp av teknologier som Scorpions og ARMS (Amplification Refractory Mutation System) (20, 21) gjør therascreen KRAS RGQ PCR Kit det mulig å detektere sju mutasjoner i kodon 12 og 13 i KRAS-onkogenet mot en bakgrunn av villtype av genomisk DNA (se tabell 1). Basert på data i COSMIC-databasen (2012 v59) utgjør de sju mutasjonene detektert av therascreen KRAS RGQ PCR Kit >97 % av alle rapporterte KRAS-mutasjoner hos CRC-pasienter (21). Tabell 1. Liste over mutasjoner og COSMIC-ID-er* Mutasjon Base-endring COSMIC-ID GLY12ALA (G12A) GGT>GCT 522 GLY12ASP (G12D) GGT>GAT 521 GLY12ARG (G12R) GGT>CGT 518 GLY12CYS (G12C) GGT>TGT 516 GLY12SER (G12S) GGT>AGT 517 GLY12VAL (G12V) GGT>GTT 520 GLY13ASP (G13D) GGC>GAC 532 * COSMIC ID-er er hentet fra Catalog of Somatic Mutations in Cancer (22) ( Testen er svært spesifikk og sensitiv, og den gjør det mulig å detektere en lav prosentandel mutant DNA mot en bakgrunn av villtype-dna. Forutsatt at det er 4 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

5 nok kopier av DNA, er det mulig å detektere 0,8 % mutant i en bakgrunn av villtype av genomisk DNA (se "Ytelseskarakteristikker", side 49 for informasjon om deteksjonsgrense for hver mutasjon). therascreen KRAS RGQ PCR Kit brukes i en polymerasekjedereaksjon (PCR)- prosedyre. Fordelen med dette settet er at det er svært målspesifikt, og at resultatene bestemmes raskt og effektivt uten subjektivitet. Settets begrensninger inkluderer nødvendigheten av å ha DNA fra tumoren. Prosedyreprinsipp therascreen KRAS RGQ PCR Kit gir åtte separate PCR-amplikasjonsreaksjoner: sju mutasjonsspesifikke reaksjoner i kodon 12 og 13 i ekson 2 i KRASonkogenet, og en villtype-kontroll i ekson 4. Settets hovedkomponenter blir beskrevet nedenfor. Mutasjonsreaksjonsblandinger Hver reaksjonsblanding bruker en mutasjonsspesifikk ARMS-primer til selektivt å amplifisere det muterte DNA-et, og deretter en Scorpions-primer til å detektere amplifikasjonsproduktet. ARMS Allele-spesifikk amplifikasjon oppnås ved hjelp av ARMS, som benytter seg av Taq DNA-polymerasens evne til å skille mellom en matchet og ikke-matchet base ved 3'-enden av en PCR-primer. Når primeren har full match, utføres amplifikasjonen med full effektivitet. Når 3'-basen ikke matcher, oppstår kun et lavt nivå bakgrunnsamplifikasjon. En mutert sekvens blir derfor selektivt amplifisert også i prøver der hoveddelen av DNA-et ikke bærer mutasjonen. Scorpions Deteksjon av amplifikasjon utføres med Scorpions. Scorpions er bifunksjonelle molekyler som inneholder en PCR-primer kovalent bundet til en probe. Proben inneholder fluoroforen karboksyfluorescein (FAM ) og en slukker. Sistnevnte slukker fluoroforens fluorescens. Når proben bindes til ARMS-amplikonet under PCR, skilles fluorofonen og slukkeren, noe som fører til en detekterbar økning i fluorescens. Kontrollreaksjon Control Reaction Mix (kontrollreaksjonsblanding CTRL) bruker en Scorpionsprimer og en umerket primer til å amplifisere en kort sekvens av ekson 4 i KRAS-genet. Kontrollreaksjonen brukes til å bestemme om et tilstrekkelig nivå av amplifiserbart DNA er til stede i prøven, og er en faktor som brukes i analytiske beregninger til å bestemme mutasjonsstatus. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012 5

6 Internkontroll Alle de åtte reaksjonsblandingene inneholder en internkontroll som brukes til å detektere reaksjonsfeil (f.eks. som følge av tilstedeværelse av hemmere). Internkontrollen benytter en ikke-kras-relatert oligonukleotid målsekvens, en umerket primer og en Scorpions-primer merket med heksaklorofluorescein (HEX ) for å skille den fra de FAM-merkede Scorpions-primerene i kontrollog mutasjonsreaksjonene. Positiv kontroll therascreen KRAS RGQ PCR Kit inneholder også en KRAS-positiv kontroll (PC). Den positive kontrollen er en blanding av syntetiske oligonukleotider som representerer hver av mutasjonene detektert av settet. Deteksjon av den positive kontrollen bekrefter at de enkelte reaksjonsblandingene i settet fungerer som de skal. Negativ kontroll therascreen KRAS RGQ PCR Kit inneholder nukleasefritt vann til ikketemplatkontroll (NTC) som skal brukes til "ikke-templatkontroll" (NTC)- reaksjonen. NTC fungerer som en negativ kontroll og vurderer potensiell kontaminering under analyseoppsett. Taq DNA-polymerase Taq DNA-polymerasen er enzymet til polymerasekjedereaksjonen som brukes av therascreen KRAS RGQ PCR Kit. Plattform og programvare therascreen KRAS RGQ PCR Kit er utelukkende beregnet for bruk med enten Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM- eller Rotor-Gene Q 5plex HRM-instrumentet. Rotor-Gene Q-instrumentet programmeres for ulike syklusparametere, eller analyseserier, av therascreen KRAS Assay Package therascreen KRAS Assay Package består av to templater: "therascreen KRAS QC Locked Template" (for DNA-prøvevurdering) og "therascreen KRAS Locked Template" (for deteksjon av KRAS-mutasjoner). Disse templatene inneholder PCR-analyseparameterne og beregner resultatene. Man bruker de samme analyseparameterne både til DNA-prøvevurdering med Control Reaction Mix (kontrollreaksjonsblanding) og til deteksjon av KRAS-mutasjoner ved hjelp av mutasjonsreaksjonsblandingen: 1. Pause ved 95 C i 15 minutter for å aktivere Taq DNA-polymerasen. 2. PCR for 40 sykluser ved 95 C i 30 sekunder for å denaturere, og 60 C i 1 minutt for å hybridisere og forlenge. 6 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

7 PCR-syklusen der fluorescensen fra en bestemt reaksjon krysser den forhåndsdefinerte terskelverdien gitt av therascreen KRAS Assay Package, er definert som C T -verdien. Når man bruker kontrollreaksjonen til å vurdere DNA-prøven, er det på bakgrunn av de oppnådde C T -verdiene mulig å bestemme om prøvene inneholder DNA-nivåer som er egnet for analyse, og hvilke prøver som må fortynnes før analyse. Vurdering av prøven ved hjelp av de ulike mutasjonsreaksjonsblandingene for å bestemme deres respektive C T -verdier gjør det mulig for therascreen KRAS Assay Package-programvaren å foreta en beregning for å bestemme prøvens C T -verdi ved hjelp av følgende ligning: C T = [mutasjonsanalyse-c T -verdi] [kontrollanalyse-c T -verdi] Basert på forhåndsbestemte analytiske C T - og C T -verdier bestemmer Rotor- Gene Q-programvaren DNA-prøvenes mutasjonsstatus kvalitativt, og rapporterer hvilke prøver som inneholder hvilken mutasjon.0f* * En tumor vil sjelden inneholde mer enn én mutasjon. I så fall vil mutasjonen som gir den laveste C T -verdien bli identifisert. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012 7

8 Reagenser Reaksjonsblandinger består av to deler, og inneholder FAM-merkede reagenser for å detektere mål og en HEX-merket internkontroll. Reaksjonsblandingene og de positive kontrollreagensene inneholder Tris EDTA-buffer, og den positive kontrollen inneholder bæreren Poly A RNA. Tabell 2. Reagenser som er inkludert i therascreen KRAS RGQ PCR Kit Reagens Control Reaction Mix (kontrollreaksjonsblanding) Ingredienser Umerket primer til kontroll, Scorpions-primer til kontroll, umerket primer til internkontroll, Scorpions-primer til internkontroll, internkontrolltemplat, deoksynukleotidtrifosfater, magnesiumklorid, Tris EDTA-buffer, PCR-buffer 2 rør x 600 µl 12ALA reaksjonsblanding 12ASP reaksjonsblanding 12ARG reaksjonsblanding 12ALA ARMS-primer, Scorpions-primer, umerket primer til internkontroll, Scorpionsprimer til internkontroll, internkontrolltemplat, deoksynukleotidtrifosfater, magnesiumklorid, Tris EDTA-buffer, PCR-buffer 12ASP ARMS-primer, Scorpions-primer, umerket primer til internkontroll, Scorpionsprimer til internkontroll, internkontrolltemplat, deoksynukleotidtrifosfater, magnesiumklorid, Tris EDTA-buffer, PCR-buffer 12ARG ARMS-primer, Scorpions-primer, umerket primer til internkontroll, Scorpionsprimer til internkontroll, internkontrolltemplat, deoksynukleotidtrifosfater, magnesiumklorid, Tris EDTA-buffer, PCR-buffer 1 rør x 600 µl 1 rør x 600 µl 1 rør x 600 µl Tabellen fortsetter på neste side. 8 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

9 Tabell 2. Forts. Reagens 12CYS reaksjonsblanding 12SER reaksjonsblanding 12VAL reaksjonsblanding 13ASP reaksjonsblanding KRAS positiv kontroll Taq DNApolymerase Ingredienser 12CYS ARMS-primer, Scorpions-primer, umerket primer til internkontroll, Scorpionsprimer til internkontroll, internkontrolltemplat, deoksynukleotidtrifosfater, magnesiumklorid, Tris EDTA-buffer, PCR-buffer 12SER ARMS-primer, Scorpions-primer, umerket primer til internkontroll, Scorpionsprimer til internkontroll, internkontrolltemplat, deoksynukleotidtrifosfater, magnesiumklorid, Tris EDTA-buffer, PCR-buffer 12VAL ARMS-primer, Scorpions-primer, umerket primer til internkontroll, Scorpionsprimer til internkontroll, internkontrolltemplat, deoksynukleotidtrifosfater, magnesiumklorid, Tris EDTA-buffer, PCR-buffer 13ASP ARMS-primer, Scorpions-primer, umerket primer til internkontroll, Scorpionsprimer til internkontroll, internkontrolltemplat, deoksynukleotidtrifosfater, magnesiumklorid, Tris EDTA-buffer, PCR-buffer Kontrolltemplat, 12ALA-templat, 12ASPtemplat, 12ARG-templat, 12CYS-templat, 12SER-templat, 12VAL-templat, 13ASPtemplat, Poly A RNA, Tris EDTA-buffer Taq-polymerase: 50 % glyserol/vann 1 rør x 600 µl 1 rør x 600 µl 1 rør x 600 µl 1 rør x 600 µl 1 rør x 250 µl 1 rør x 70 µl Vann til NTC Nukleasefritt vann 1 rør x 1,9 ml Vann til fortynning av prøve Nukleasefritt vann 1 rør x 1,9 ml Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012 9

10 Plattformer therascreen KRAS RGQ PCR Kit er utelukkende beregnet for bruk med enten Rotor-Gene Q 5plex HRM- eller Rotor-Gene Q MDx-instrumentet, som er installert med Rotor-Gene Q-programvaren, versjon (build 9) eller nyere, og therascreen KRAS Assay Package, versjon , som er tilgjengelig separat på CD (QIAGEN, katalognr ). Du finner informasjon om instrumentet i instrumentets brukerhåndbok. Se "Vedlegg: Installasjon av therascreen KRAS Assay Package", side 74, for instruksjoner om hvordan du installerer therascreen KRAS Assay Package. Rotor-Gene Q-instrumentene må vedlikeholdes i henhold til kravene i instrumentets brukerhåndbok. 10 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

11 Materialer som medfølger Settets innhold therascreen KRAS RGQ PCR Kit (24) Katalognr Antall klargjøringer 24 Farge ID Rør-ID Volum Rød Control Reaction Mix (kontrollreaksjonsblanding) 1 CTRL 2 x 600 µl Lilla Oransje Rosa Grønn Gul Grå Blå Beige 12ALA Reaction Mix (reaksjonsblanding) 12ASP Reaction Mix (reaksjonsblanding) 12ARG Reaction Mix (reaksjonsblanding) 12CYS Reaction Mix (reaksjonsblanding) 12SER Reaction Mix (reaksjonsblanding) 12VAL Reaction Mix (reaksjonsblanding) 13ASP Reaction Mix (reaksjonsblanding) KRAS Positive Control (KRAS positiv kontroll) 2 12ALA 600 µl 3 12ASP 600 µl 4 12ARG 600 µl 5 12CYS 600 µl 6 12SER 600 µl 7 12VAL 600 µl 8 13ASP 600 µl 9 PC 250 µl Mint Taq DNA Polymerase (Taq DNA-polymerase) Taq 70 µl Hvit Water for NTC (vann til NTC) NTC 1,9 ml Hvit Water for Sample Dilution (vann til fortynning av prøve) Dil. 1,9 ml therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbook (Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit) (engelsk) 1 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

12 Materialer som er nødvendige, men ikke medfølger Bruk alltid egnet laboratoriefrakk, engangshansker og vernebriller ved arbeid med kjemikalier. Se gjeldende sikkerhetsdatablad (SDS) som leveres av leverandøren av produktet, hvis du ønsker mer informasjon. Remser med mikrorør, 0,1 ml og lokk til bruk med 72-brønners rotor (QIAGEN, katalognr or ) Sterile mikrosentrifugerør til klargjøring av Master Mix-blandinger Sterile pipettespisser med aerosolbarriere Permanent tusj Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM- eller Rotor-Gene Q 5plex HRMinstrumentet med fluorescenskanaler for Grønn og Gul (deteksjon av henholdsvis FAM og HEX) Rotor-Gene Q-programvaren, versjon eller nyere Merk: therascreen KRAS Assay Package-programvaren fungerer kun sammen med programvareversjon (build 9) eller nyere. CD med programvaren therascreen KRAS Assay Package, versjon (QIAGEN, katalognr ) Lasteblokk for 72 x 0,1 ml rør, aluminiumsblokk for manuelt reaksjonsoppsett (QIAGEN, katalognr ) Dedikerte pipetter1f* (justerbare) til prøveklargjøring Dedikerte pipetter* (justerbare) til klargjøring av PCR Master Mix Dedikerte pipetter* (justerbare) til pipettering av templat-dna Termomikser, oppvarmet orbital inkubator, varmeblokk eller vannbad egnet til inkubering ved 56 C og 90 C* Bordsentrifuge* med rotor for 1,5 ml rør Bordvorteksmikser* QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN, katalognr ; se "DNAekstraksjon", side 16) Xylen Etanol ( %)2F * Kontroller før bruk at instrumentene er testet og kalibrert i henhold til produsentens anbefalinger. Bruk ikke denaturert alkohol som inneholder andre stoffer, som f.eks. metanol eller metyletylketon. 12 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

13 Advarsler og forholdsregler Til bruk i in vitro-diagnostikk. Til profesjonell bruk. Sikkerhetsinformasjon Bruk alltid egnet laboratoriefrakk, engangshansker og vernebriller ved arbeid med kjemikalier. Se gjeldende sikkerhetsdatablader (SDS) hvis du ønsker mer informasjon. Disse er tilgjengelige i praktisk og kompakt PDF-format på der du kan søke etter, vise og skrive ut sikkerhetsdatabladet for hvert QIAGEN -sett og hver enkelt komponent. Generelle forholdsregler Testen er beregnet for bruk med formalinfikserte, parafininnstøpte vevsprøver. Alle kjemikalier og biologiske materialer er potensielt farlige. Prøver kan være smittefarlige og må behandles som smittefarlig biologisk materiale. Kast prøve- og analyseavfall i henhold til lokale sikkerhetsprosedyrer. Reagensene til therascreen KRAS RGQ PCR Kit er optimalt fortynnet. Fortynn ikke reagensene mer, siden dette kan føre til tap av ytelse. Bruk ikke reaksjonsvolumer (reaksjonsblanding pluss prøve) som er mindre enn 25 µl. Alle reagensene i therascreen KRAS RGQ PCR Kit er satt sammen spesielt for bruk med testene i therascreen KRAS RGQ PCR Kit. Alle reagensene i therascreen KRAS RGQ PCR Kit er utelukkende beregnet for bruk sammen med de andre reagensene i samme therascreen KRAS RGQ PCR Kit. Bytt ikke ut reagenser i ett therascreen KRAS RGQ PCR Kit med reagenser i et annet therascreen KRAS RGQ PCR Kit, siden dette kan påvirke ytelsen. Bruk kun Taq DNA-polymerasen (Taq) som er inkludert i therascreen KRAS RGQ PCR Kit. Bytt ikke ut med Taq DNA-polymerase fra andre sett av samme eller en annen type, eller med Taq DNA-polymerase fra en annen leverandør. Se brukerhåndboken til Rotor-Gene Q 5plex HRM- eller Rotor-Gene Q MDx-instrumentet hvis du ønsker mer informasjon om advarsler, forholdsregler og prosedyrer. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

14 Bruk ikke komponenter som er gått ut på dato eller oppbevart feil. Merk: Det er svært viktig å forhindre at kontroll- og reaksjonsblandingsreagensene kontamineres med de syntetiske materialene i den positive kontrollreagensen. Merk: Bruk individuelle, dedikerte pipetter til klargjøring av reaksjonsblandinger og tilsetting av positive kontrollreagenser. Merk: Klargjør og pipetter reaksjonsblandinger i et område som er atskilt fra området som brukes til å tilsette den positive kontrollen. Merk: Rotor-Gene Q-instrumentet må ikke åpnes før analyseringen er ferdig. Merk: Rotor-Gene Q-rørene må ikke åpnes etter at analyseringen er ferdig. Merk: Det er viktig at prøvetesting utføres riktig og at man unngår feil ved innsetting av prøve, innlasting og og pipettering. Oppbevaring og håndtering av reagenser therascreen KRAS RGQ PCR Kit sendes på tørris. Hvis en komponent i therascreen KRAS RGQ PCR Kit ikke er frosset ved ankomst, hvis ytteremballasjen er blitt åpnet under frakt, eller hvis forsendelsen ikke inneholder en pakkseddel, brukerhåndbok eller reagenser, må du kontakte QIAGENs tekniske serviceavdeling eller den lokale distributøren (se bak på omslaget eller gå inn på therascreen KRAS RGQ PCR Kit skal umiddelbart etter mottak plasseres i en mørk fryser som holder en konstant temperatur på mellom 15 C og 25 C. Når therascreen KRAS RGQ PCR Kit oppbevares under de spesifiserte oppbevaringsforholdene, er settet stabilt frem til angitt utløpsdato. Når reagenser er åpnet, kan de oppbevares i originalemballasjen ved 15 til 25 C frem til utløpsdatoen som står på emballasjen. Gjentatt tining og frysing bør unngås. Ikke frys og tin reagensene mer enn 6 ganger. Reagensene må tines ved romtemperatur i minimum 1 time og maksimum 4,5 timer. Når reagensene er klare til bruk, kan PCR-reaksjonene settes opp. Rotor-Gene Q-rørene, som inneholder Master Mix og DNA-prøven, kan lastes over på Rotor-Gene Q-instrumentet umiddelbart. Den totale tiden fra oppsett av PCR-reaksjonene til analysering må ikke overskride: 7 timer hvis oppbevart ved romtemperatur Merk: Denne tiden inkluderer både PCR-oppsett og oppbevaring. 18 timer hvis oppbevart i fryser (2 8 C) Merk: Denne tiden inkluderer både PCR-oppsett og oppbevaring. Merk: Scorpions (i likhet med alle fluorescensmerkede molekyler) i reaksjonsblandingsreagensene er lyssensitive. Beskytt kontroll- og reaksjonsblandingsreagenser mot lys for å unngå fotobleking. 14 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

15 Reagensene i therascreen KRAS RGQ PCR Kit er optimalt fortynnet og trenger ingen videre rensing eller behandling før de brukes i analysen i henhold til instruksjonene i håndboken for therascreen KRAS RGQ PCR Kit. Vær spesielt oppmerksom på utløpsdatoene og oppbevaringsbetingelsene angitt på komponentenes esker og etiketter. Bruk ikke komponenter som er gått ut på dato eller oppbevart feil. Prøvetaking, klargjøring for analyse og oppbevaring therascreen KRAS RGQ PCR Kit er beregnet for bruk på DNA-prøver ekstrahert fra formalinfiksert parafininnstøpt (FFPE) tumorvev som er tatt fra pasienter med kolorektal kreft (CRC). Tumorer er heterogene både hva angår genotype og fenotype. Mutasjonspositive tumorer kan inneholde villtype-dna, og histologi kan likeledes vise regioner av ikke-tumorvev. Alle vevsprøver skal behandles som potensielt smittefarlig materiale. For å klargjøre vevsprøver for DNA-ekstraksjon: Ved bruk av standardmaterialer og -metoder: Fikser vevsprøven i 10 % nøytral bufret formalin (NBF) og støp vevsprøven inn i parafin. Ved bruk av et mikrotom: Skjær 5 µm seriesnitt fra parafinblokken og legg dem på objektglass. Få en fagperson (f.eks. en patolog) til å vurdere et hematoksilyn- og eosinfarget snitt for tumorinnhold og arealbestemmelse. Merk det fargede objektglasset for å skille mellom tumor og normalt vev. Bruk seriesnitt til DNA-ekstraksjon. Bruk snitt med >20 % tumorinnhold per areal til behandling uten makrodisseksjon (se nedenfor). For snitt som har <20 % tumorinnhold per areal, makrodissekeres ett eller flere snitt. Ikke-tumorvev skal kastes. For snitt som har et areal på <4 mm 2, må to eller flere snitt behandles for å øke det totale tumorarealet til minst 4 mm 2 (gjelder for prøver både med og uten makrodisseksjon). Ikke-tumorvev skal kastes. Skrap bort overflødig parafin fra vevet med en ny, steril skalpell. Merk: Bruk tørre skalpeller. Dette trinnet må ikke utføres under laminære strømningsforhold eller avtrekkshette. Skrap tumorvevet fra snittene over i merkede mikrosentrifugerør. Bruk en ny skalpell for hver prøve. Merk, håndter og oppbevar tumorprøver, blokker, objektglass, prøver og mikrosentrifugerør som er klare for ekstraksjon på en kontrollert måte i henhold til lokale prosedyrer. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

16 Oppbevar FFPE-blokker og objektglass ved romtemperatur. Objektglass kan oppbevares ved romtemperatur i opptil 4 uker før DNA-ekstraksjon. Genomisk DNA kan oppbevares ved 2 8 C i 1 uke etter ekstraksjon, deretter ved 15 til 25 C i opptil 8 uker før bruk. Prosedyre DNA-ekstraksjon Bruk QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN, katalognr ) til å rense genomisk DNA fra prøver som er klargjort fra FFPE CRC-prøver. Merk: therascreen KRAS RGQ PCR Kit er validert for bruk med DNA ekstrahert ved hjelp av QIAamp DNA FFPE Tissue Kit. Bruk ikke noe annet DNAekstraksjonsprodukt. Utfør DNA-ekstraksjonen i henhold til instruksjonene i håndboken QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook (april 2010) med følgende endringer: Se håndboken QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook for informasjon om klargjøring av prøver før DNA-ekstraksjon. QIAamp DNA FFPE Tissue Kit må kun brukes manuelt. Den automatiske protokollen for QIAcube skal ikke brukes. RNase-trinnet beskrevet i håndboken QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook skal ikke brukes. QIAGEN deparafineringsløsning skal ikke brukes. Bruk kun xylen/etanolmetoden for deparafinering beskrevet i håndboken QIAamp DNA FFPE Tissue Handbook. Proteinase K-nedbrytning (trinn 11 i håndboken QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook) må utføres i 1 time. Prøvene må elueres i 200 µl elueringsbuffer (ATE-buffer) fra QIAamp DNA FFPE Tissue Kit. Oppbevar genomisk DNA ved 2 8 C i 1 uke etter ekstraksjon, og deretter ved 15 til 25 C i opptil 8 uker før bruk. 16 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

17 Protokoll: DNA-prøvevurdering Denne protokollen brukes til å vurdere totalt amplifiserbart DNA i prøver. Viktige punkter før du starter Opptil 24 prøver kan vurderes med Control Reaction Mix (kontrollreaksjonsblanding CTRL) som er tilgjengelig. Bruk Control Reaction Mix (kontrollreaksjonsblanding CTRL) til å vurdere DNA før testing. Merk: Det er viktig å bruke Control Reaction Mix (kontrollreaksjonsblanding CTRL) som beskrevet nedenfor til denne vurderingen, og ikke spektrofotometri eller andre alternative metoder. Sterkt degradert DNA vil kanskje ikke bli amplifisert, selv om primerne genererer korte DNAfragmenter. For å sikre effektiv bruk av reagensene i therascreen KRAS RGQ PCR Kit, må DNA-prøver samles i den grad det er mulig for å opprette fulle analyseringer. Testing av prøver enkeltvis eller i små antall bruker opp mer reagens, og reduserer det totale antall prøver som kan testes med et enkelt therascreen KRAS RGQ PCR Kit. Bruk ikke vorteks på Taq DNA-polymerase (Taq) eller enhver blanding som inneholder Taq DNA-polymerase, siden dette kan forårsake inaktivering av enzymet. Pipetter Taq DNA-polymerase ved å plassere pipettespissen rett under væskeoverflaten for å unngå at spissen dekkes av overskytende enzym. Dette må du gjøre før du starter: Kontroller at therascreen KRAS Assay Package-programvaren er installert før Rotor-Gene Q-instrumentet tas i bruk første gang (se "Vedlegg: Installasjon av therascreen KRAS Assay Package", side 74). Før bruk må alle reagenser tines helt i minst 1 time ved romtemperatur (15 25 C), blandes ved å snu rørene 10 ganger, og sentrifugeres en kort stund for å samle innholdet i bunnen av røret. Kontroller at Taq DNA-polymerase (Taq) holder romtemperatur (15 25 C) før hver bruk. Sentrifuger røret en kort stund for å samle enzymet i bunnen av røret. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

18 Prosedyre 1. Tin Control Reaction Mix (kontrollreaksjonsblanding CTRL), nukleasefritt vann til ikke-templatkontroll (NTC) og KRAS positiv kontroll (PC) ved romtemperatur (15 25 C) i minst 1 time. Tider for opptining av reagenser, PCR-oppsett og oppbevaring før analysestart er angitt i tabell 3. Når reagensene er tint, blandes de ved å snu hvert rør 10 ganger for å unngå lokale konsentrasjoner av salter. Deretter sentrifugeres de en kort stund for å samle innholdet i bunnen av røret. Tabell 3. Tider for opptining, PCR-oppsett og oppbevaringstemperaturer Minimum Opptiningstid Maksimum Oppbevaringstemperatur etter PCR-oppsett 1 time 4,5 timer Romtemperatur (15 25 C) Maks. tid for PCR-oppsett og oppbevaring 7 timer 1 time 4,5 timer 2 8 C 18 timer Merk: PCR-oppsett skal utføres ved romtemperatur. Begrepet "Oppbevaring" viser til tiden mellom fullføringen av PCR-oppsettet og starten på PCR-analysen på Rotor-Gene Q-instrumentet. Merk: Bring Taq DNA-polymerase (Taq) til romtemperatur (15 25 C) samtidig med de andre reagensene (se "Oppbevaring og håndtering av reagenser", side 14). Sentrifuger røret en kort stund for å samle enzymet i bunnen av røret. 2. Klargjør nok Control Reaction Mix (kontrollreaksjonsblanding) [CTRL] pluss Taq DNA-polymerase [Taq]) til DNA-prøvene, en KRAS-positiv kontroll (PC)-reaksjon og nukleasefritt vann til ikke-templatkontroll (NTC)-reaksjon i henhold til volumene i tabell 4. Inkluder reagenser til 2 ekstra prøver, slik at det blir nok til PCR-oppsettet. Master Mix inneholder alle komponentene som er nødvendige for PCR, unntatt prøven. 18 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

19 Tabell 4. Klargjøring av Master Mix for kontrollanalyse Komponent Control Reaction Mix (kontrollreaksjonsblanding CTRL) Taq DNA-polymerase (Taq) Volum 19,76 µl x (n+2)* 0,24 µl x (n+2)* Totalt volum 20,0 µl/reaksjon * n = antall reaksjoner (prøver pluss kontroller). Klargjør nok Master Mix til 2 ekstra prøver (n+2), slik at det blir nok til PCR-oppsettet. Verdien n skal ikke overskride 24 (pluss kontroller), siden 24 er det maksimale antall prøver som får plass i en analyseserie. Merk: Ved klargjøring av Master Mix tilsettes den påkrevde mengden Control Reaction Mix (kontrollreaksjonsblanding CTRL) først, og Taq DNA-polymerasen (Taq) til slutt. 3. Plasser riktig antall PCR 4-rør (én remse innholder fire rør) i lasteblokken i henhold til oppsettet i tabell 5. Ikke sett på lokkene. Merk: La lokkene ligge i plastbeholderen til de skal brukes. Tabell 5. Analyseoppsett for DNA-prøvevurdering i lasteblokken Analyse Kontroll 1 (PC) Kontroll 2 (NTC) Kontroll Kontroll Kontroll Kontroll Kontroll Kontroll Hvert rør skal inneholde et totalt reaksjonsvolum på 25 µl (20 µl Master Mix klargjort i tabell 4 pluss 5 µl NTC/prøve/PC). Tallene angir posisjoner i lasteblokken og indikerer endelig rotorposisjon. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

20 4. Klargjør en pipette med et volum som er lavere enn det totale reaksjonsblandingsvolumet, og bland Master Mix godt ved å aspirere helt opp og ned 10 ganger. Tilsett 20 µl Master Mix i hvert PCR-rør umiddelbart. Merk: Se røroppsettet i tabell 5 under oppsett av reaksjonsblandingene. Ved DNA-prøvevurdering skal masterblanding for kontrollanalyse tilsettes i ett PC-rør, ett NTC-rør og ett rør for hver DNA-prøve. 5. Tilsett umiddelbart 5 µl nukleasefritt vann til ikke-templatkontroll (NTC) i NTC-røret (rørposisjon 2), og sett på lokket. 6. Tilsett 5 µl av hver DNA-prøve i prøverørene (rørposisjon 3 26), og sett på lokkene. 7. Tilsett 5 µl KRAS positiv kontroll (PC) i PC-røret (rørposisjon 1), og sett på lokket. 8. Bruk en permanent tusj og merk lokkene på de første rørene i den laveste tallposisjonen i hvert PCR 4-rør (f.eks. posisjon 1, 5 og 9) for å vise hvilken retning rørene skal lastes inn i 72-brønners rotoren i Rotor-Gene Q-instrumentet. 9. Vend rør med påsatt lokk 4 ganger for å blande prøven og reaksjonsblandingen. 10. Plasser alle PCR 4-rørene i de relevante posisjonene i 72-brønners rotoren i henhold til analyseoppsettet (tabell 5) ved hjelp av retningsmerkingen. Merk: Hvis rotoren ikke er helt full, må alle ubrukte posisjoner i rotoren fylles med et tomt rør med lokk. Dette sikrer at Rotor Gene Q-instrumentets termiske effektivitet opprettholdes. 11. Sett rotoren med 72 brønner inn i Rotor-Gene Q-instrumentet. Se til at låseringen (leveres med Rotor-Gene Q-instrumentet) er plassert øverst på rotoren for å sikre rørene under analysen. 12. Start Rotor-Gene Q-programvaren, og åpne samtidig templatet ved å dobbeltklikke på ikonet "therascreen KRAS QC Locked Template" på skrivebordet på datamaskinen som er koblet til Rotor-Gene Q- instrumentet (figur 1). Figur 1. Ikonet "therascreen KRAS QC Locked Template" (therascreen KRAS QC låst templat). 20 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

21 13. Fanen "Setup" (oppsett) vises som standard (figur 2). Kontroller at låseringen er forsvarlig festet, og merk av i boksen "Locking Ring Attached" (låsering festet). Lukk lokket på Rotor-Gene Q- instrumentet. Figur 2. Fanen "Setup" (oppsett) og boksen "Locking Ring Attached" (låsering festet). Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

22 14. Legg inn analyse-id i feltet "Run ID" (analyse-id) i henhold til de lokale navnereglene. Legg inn prøvenavnet i feltet "Sample Name" (prøvenavn) i henhold til de lokale navnereglene, og trykk på returtasten. Prøvenavnet legges til i prøvelisten nedenfor, og prøven tilordnes en "Sample ID" (prøve-id) (1, 2, 3 osv.). I tillegg blir feltet "Layout of the pipetting adapter" (oppsett for pipetteringsadapter) til høyre oppdatert med prøvenavnet (figur 3). Merk: Kontroller i feltet "Layout of the pipetting adapter" (oppsett for pipetteringsadapter) at det tilføyde prøvenavnet er uthevet og vises i en annen farge, og at prøvenavnet er i prøveposisjonen (figur 3). Merk: Hvis prøvenavn har mer enn 8 tegn, er det ikke alltid hele navnet vises i feltet "Layout of the pipetting adapter" (layout for pipetteringsadapter). Figur 3. Inntasting av "Run ID" (analyse-id) og "Sample Name" (prøvenavn). 22 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

23 15. Gjenta trinn 14 for å legge inn navnene på alle ytterligere prøver (figur 4). Merk: Når du skal redigere et prøvenavn, klikker du på "Sample Name" (prøvenavn) i prøvelisten. Den valgte prøven vises i feltet "Sample Name" (prøvenavn) ovenfor. Rediger prøvenavnet i henhold til lokale navneregler, og trykk på returtasten for å oppdatere navnet. Figur 4. Inntasting av ytterligere prøvenavn i feltet "Sample Name" (prøvenavn). Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

24 16. Når alle prøvenavnene er lagt inn, kontrollerer du at de er riktige. Legg om nødvendig til eventuell tilleggsinformasjon i feltet "Notes" (notater), og klikk på knappen "Start Run" (start analyse) (figur 5). Merk: Hvis en rotorposisjon er tom, vises en "Warning" (advarsel) (figur 5 og 6) for å minne brukeren på at alle ubrukte posisjoner i rotoren må fylles med et tomt rør med lokk. Kontroller at alle rotorposisjoner er fylt med et tomt rør med lokk, og klikk på "OK" for å fortsette. Figur 5. Feltet "Notes" (notater), knappen "Start Run" (start analyse) og "Warning" (advarsel) om ubrukte rotorposisjoner. Figur 6. "Warning" (advarsel) om ubrukte rotorposisjoner. 24 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

25 17. Vinduet "Save As" (lagre som) vises. Velg et relevant filnavn, og lagre PCR-analysen som en *.rex-analysefil på ønsket sted ved å klikke på knappen "Save" (lagre) (figur 7). Figur 7. Lagring av analysefilen. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

26 18. PCR-analysen starter. Merk: Når analyseserien starter, åpnes fanen "Run Progress" (analysefremdrift) automatisk for å vise temperaturregistrering og resterende analyseringstid (figur 8). Figur 8. Fanen "Run Progress" (analysefremdrift). 26 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

27 19. Når kjøringen er ferdig, åpnes fanen "Analysis" (analyse) automatisk. Merk: Hvis fanen "Analysis" (analyse) ikke åpnes av seg selv, klikker du på fanen "Analysis" (analyse) (figur 9). Merk: Du finner en beskrivelse av beregningsmetoden i avsnittet "Tolkning av resultater", side 40. Figur 9. Fanen "Analysis" (analyse) og rapportering av resultater. 1 = Fanen "Analysis" (analyse), 2 = "Sample QC Result Table" (tabell for prøvekontrollresultater). 20. Kontrollresultater rapporteres som vist i "Sample QC Result Table" (tabell for prøvekontrollresultater) (figur 9). Analysekontroller (PC og NTC, henholdsvis rørposisjon 1 og 2). Hvis resultatene er innenfor akseptable områder, vil hvert resultat vise "Valid" (gyldig). Hvis ikke, vises "Invalid" (ugyldig). Prøvekontrollreaksjon-C T >32,00 vil vise "Invalid" (ugyldig). Kvantitet av DNA er ikke tilstrekkelig for mutasjonsanalyse. Test prøven på nytt. Hvis kvantiteten av DNA fortsatt er utilstrekkelig, må du ekstrahere mer tumorvev hvis det er mulig (se "Feilsøkingsveiledning", side 42). Prøvekontrollreaksjon-C T <21,92 vil vise "Invalid" (ugyldig). DNAkonsentrasjon er for høy for mutasjonsanalyse. Fortynn med nukleasefritt vann til fortynning (Dil.) og test på nytt. Fortynn til en C T på 21,92 32,00. En 1:1-fortynning øker C T -verdien med ca. 1,0. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

28 Prøvekontrollreaksjon-C T på 21,92 32,00 (21,92 kontroll-c T 32,00) vil vise "Valid" (gyldig). DNA-konsentrasjon er egnet for mutasjonsanalyse. Merk: Hvis du blir nødt til å ekstrahere eller fortynne mer, må kontrollreaksjonen gjentas for å bekrefte at DNA-konsentrasjonen er egnet for bruk. 21. Rapportfiler kan genereres ved å klikke på knappen "Report" (rapport). Vinduet "Report Browser" (rapportfunksjon) vises. Velg "KRAS Analysis Report" (KRAS-analyserapport) under "Templates" (templater) og klikk på knappen "Show" (vis) (figur 10). Merk: Rapporter kan lagres på et annet sted i Web Archive-format ved å klikke på knappen "Save As" (lagre som) øverst til venstre i hver rapport. Figur 10. Valg av "KRAS Analysis Report" (KRAS-analyserapport). 28 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

29 Protokoll: Deteksjon av KRAS-mutasjoner Denne protokollen gjelder for deteksjon av KRAS-mutasjoner. Viktige punkter før du starter Så snart en prøve har bestått prøvevurderingen, kan den testes med KRASmutasjonsanalyse. For å sikre effektiv bruk av therascreen KRAS RGQ PCR Kit, må prøvene deles inn i batcher på 7 (for å fylle rotoren med 72 brønner). Mindre batchstørrelser innebærer at færre prøver kan testes med therascreen KRAS RGQ PCR Kit. Bruk ikke vorteks på Taq DNA-polymerase (Taq) eller enhver blanding som inneholder Taq DNA-polymerase, siden dette kan forårsake inaktivering av enzymet. Pipetter Taq DNA-polymerase ved å plassere pipettespissen rett under væskeoverflaten for å unngå at spissen dekkes av overskytende enzym. Dette må du gjøre før du starter: Før bruk må alle reagenser tines helt i minst 1 time ved romtemperatur (15 25 C), blandes ved å snu rørene 10 ganger, og sentrifugeres en kort stund for å samle innholdet i bunnen av røret. Kontroller at Taq DNA-polymerase (Taq) holder romtemperatur (15 25 C) før hver bruk. Sentrifuger røret en kort stund for å samle enzymet i bunnen av røret. Protokoll 1. Tin alle reaksjonsblandingsrør, nukleasefritt vann til ikke-templatkontroll (NTC) og KRAS positiv kontroll (PC) ved romtemperatur (15 25 C) i minst 1 time. Tider for opptining av reagenser, PCRoppsett og oppbevaring før analysestart er angitt i tabell 6. Når reagensene er tint, blandes de ved å snu hvert rør 10 ganger for å unngå lokale konsentrasjoner av salter. Deretter sentrifugeres de en kort stund for å samle innholdet i bunnen av røret. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

30 Opptiningstid Minimum Maksimum 1 time 4,5 timer Tabell 6. Tider for opptining, PCR-oppsett og oppbevaringstemperaturer Oppbevaringstemperatur etter PCR-oppsett Romtemperatur (15 25 C) Maks. tid for PCRoppsett og oppbevaring 7 timer 1 time 4,5 timer 2 8 C 18 timer Merk: PCR-oppsett skal utføres ved romtemperatur. Begrepet "Oppbevaring" viser til tiden mellom fullføringen av PCR-oppsettet og starten på PCR-analysen på Rotor-Gene Q-instrumentet. Merk: La Taq DNA-polymerase (Taq) oppnå romtemperatur (15 25 C) samtidig med de andre reagensene (se "Oppbevaring og håndtering av reagenser", side 14). Sentrifuger røret en kort stund for å samle enzymet i bunnen av røret. 2. Merk åtte mikrosentrifugerør (medfølger ikke) i henhold til hver tilhørende reaksjonsblanding vist i tabell 7, side 31. Klargjør nok Master Mix (kontroll- eller mutasjonsreaksjonsblanding [CTRL, 12ALA, 12ASP, 12ARG, 12CYS, 12SER, 12VAL eller 13ASP] pluss Taq DNA-polymerase [Taq]) til DNA-prøvene, en KRAS-positiv kontroll (PC)-reaksjon og nukleasefritt vann til ikke-templatkontroll (NTC)- reaksjon i henhold til volumene i tabell 7, side 31. Inkluder reagenser for 2 ekstra prøver, slik at det blir nok til PCR-oppsettet. Master Mix inneholder alle komponentene som er nødvendige for PCR, unntatt prøven. 30 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

31 Tabell 7. Klargjøring av Master Mix for analyse* Analyse Reaksjonsblandingsrør Reaksjonsblandingsvolum Volum Taq DNApolymerase (Taq) Kontroll CTRL 19,76 µl x (n+2) 0,24 µl x (n+2) 12ALA 12ALA 19,76 µl x (n+2) 0,24 µl x (n+2) 12ASP 12ASP 19,76 µl x (n+2) 0,24 µl x (n+2) 12ARG 12ARG 19,76 µl x (n+2) 0,24 µl x (n+2) 12CYS 12CYS 19,76 µl x (n+2) 0,24 µl x (n+2) 12SER 12SER 19,76 µl x (n+2) 0,24 µl x (n+2) 12VAL 12VAL 19,76 µl x (n+2) 0,24 µl x (n+2) 13ASP 13ASP 19,76 µl x (n+2) 0,24 µl x (n+2) * n = antall reaksjoner (DNA-prøver pluss kontroller). Klargjør nok til 2 ekstra prøver (n+2), slik at det blir nok til PCR-oppsettet. Verdien n skal ikke overskride 7 (pluss kontroller), siden 7 er det maksimale antall prøver som får plass i en analyseserie. Merk: Ved klargjøring av Master Mix tilsettes den påkrevde mengden kontroll- eller mutasjonsreaksjonsblanding først, og Taq DNA-polymerasen (Taq) til slutt. 3. Plasser riktig antall PCR 4-rør (hver remse inneholder fire rør) i lasteblokken i henhold til oppsettet i tabell 8, side 32. Ikke sett på lokkene. Merk: La lokkene ligge i plastbeholderen til de skal brukes. 4. Klargjør en pipette med et volum som er lavere enn det totale reaksjonsblandingsvolumet, og bland Master Mix godt ved å aspirere helt opp og ned 10 ganger. Tilsett 20 µl Master Mix i hvert relevant PCR-rør umiddelbart. Merk: Se røroppsettet i tabell 8, side 32, under oppsett av reaksjonsblandingene. Ved deteksjon av KRAS-mutasjoner skal Master Mix tilsettes i åtte PC-rør, åtte NTC-rør og åtte rør for hver DNA-prøve. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

32 Tabell 8. Analyseeoppsett for deteksjon av KRAS-mutasjoner i lasteblokken* Kontroller Prøvenummer Analyse PC NTC Kontroll ALA ASP ARG CYS SER VAL ASP * Hvert rør skal inneholde et totalt reaksjonsvolum på 25 µl (20 µl Master Mix klargjort i tabell 3 pluss 5 µl NTC/prøve/PC). Tallene angir posisjoner i lasteblokken og indikerer endelig rotorposisjon. 5. Tilsett umiddelbart 5 µl nukleasefritt vann til ikke-templatkontroll (NTC) i NTC-rørene (rørposisjon 9 16), og sett på lokkene. 6. Tilsett 5 µl av hver DNA-prøve i prøverørene (rørposisjon 17 72), og sett på lokkene. 7. Tilsett 5 µl KRAS positiv kontroll (PC) i PC-rørene (rørposisjon 1 8), og sett på lokkene. 8. Bruk en permanent tusj og merk lokkene på de første rørene i den laveste tallposisjonen i hvert PCR 4-rør (f.eks. posisjon 1, 5 og 9) for å vise hvilken retning rørene skal lastes inn i 72-brønners rotoren i Rotor-Gene Q-instrumentet. 9. Vend rørene med påsatt lokk 4 ganger for å blande prøven og reaksjonsblandingen. 10. Plasser alle PCR 4-rørene i de relevante posisjonene i rotoren med 72 brønner i henhold til analyseoppsettet (tabell 8) ved hjelp av retningsmerkingen. Merk: Maks. 7 prøver kan inkluderes i hver PCR-analyse. Hvis rotoren ikke er helt full, må alle ubrukte posisjoner i rotoren fylles med et tomt rør med lokk. Dette sikrer at Rotor-Gene Q-instrumentets termiske effektivitet opprettholdes. 32 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

33 11. Sett rotoren med 72 brønner inn i Rotor-Gene Q-instrumentet. Se til at låseringen (leveres med Rotor-Gene Q-instrumentet) er plassert øverst på rotoren for å sikre rørene under analysen. 12. Start Rotor-Gene Q-programvaren og åpne samtidig templatet ved å dobbeltklikke på ikonet "therascreen KRAS Locked Template" (therascreen KRAS låst templat) på skrivebordet på datamaskinen som er koblet til Rotor-Gene Q-instrumentet (figur 11). Figur 11. Ikonet "therascreen KRAS Locked Template" (therascreen KRAS låst templat). 13. Fanen "Setup" (oppsett) vises som standard (figur 12). Kontroller at låseringen er forsvarlig festet, og merk av i boksen "Locking Ring Attached" (låsering festet). Lukk lokket på Rotor-Gene Q- instrumentet. Figur 12. Fanen "Setup" (oppsett) og boksen "Locking Ring Attached" (låsering festet). Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

34 14. Legg inn analyse-id i feltet "Run ID" (analyse-id) i henhold til de lokale navnereglene. Legg inn prøvenavnet i feltet "Sample Name" (prøvenavn) i henhold til de lokale navnereglene, og trykk på returtasten. Prøvenavnet legges til i prøvelisten nedenfor, og prøven tilordnes en "Sample ID" (prøve-id) (1, 2, 3 osv.). I tillegg blir feltet "Layout of the pipetting adapter" (oppsett for pipetteringsadapter) til høyre oppdatert med prøvenavnet (figur 13). Merk: Kontroller i feltet "Layout of the pipetting adapter" (oppsett for pipetteringsadapter) at det tilføyde prøvenavnet er uthevet og vises i en annen farge, og at alle åtte analyser i kolonnen under prøvesirkelen er uthevet (figur 13). Merk: Du kan legge til maks. 7 prøver. Prøve-ID-ene (i prøvesirklene) tilordnes automatisk fra 1 til 7. Merk: Hvis prøvenavn har mer enn 8 tegn, er det ikke alltid hele navnet vises i feltet "Layout of the pipetting adapter" (layout for pipetteringsadapter). Figur 13. Inntasting av "Run ID" (analyse-id) og "Sample Name" (prøvenavn). 34 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

35 15. Gjenta trinn 14 for å legge inn navnene på alle ytterligere prøver (figur 14). Merk: Når du skal redigere et prøvenavn, klikker du på "Sample Name" (prøvenavn) i prøvelisten. Den valgte prøven vises i feltet "Sample Name" (prøvenavn) ovenfor. Rediger prøvenavnet i henhold til lokale navneregler, og trykk på returtasten for å oppdatere navnet. Figur 14. Inntasting av ytterligere prøvenavn i feltet "Sample Name" (prøvenavn). Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

36 16. Når alle prøvenavnene er lagt inn, kontrollerer du at de er riktige. Legg om nødvendig til eventuell tilleggsinformasjon i feltet "Notes" (notater), og klikk på knappen "Start Run" (start analyse) (figur 15). Merk: Hvis en rotorposisjon er tom, vises en "Warning" (advarsel) (figur 15 og 16) for å minne brukeren på at alle ubrukte posisjoner i rotoren må fylles med et tomt rør med lokk. Kontroller at alle rotorposisjoner er fylt med et tomt rør med lokk, og klikk på "OK" for å fortsette. Figur 15. Feltet "Notes" (notater), knappen "Start Run" (start analyse) og "Warning" (advarsel) om ubrukte rotorposisjoner. Figur 16. "Warning" (advarsel) om ubrukte rotorposisjoner. 36 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

37 17. Vinduet "Save As" (lagre som) vises. Velg et relevant filnavn, og lagre PCR-analysen som en *.rex-analysefil på ønsket sted (figur 17). Figur 17. Lagring av analysefilen. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

38 18. PCR-analysen starter. Merk: Når analyseserien starter, åpnes fanen "Run Progress" (analysefremdrift) automatisk for å vise temperaturregistrering og resterende analyseringstid (figur 18). Figur = Fanen "Run Progress" (analysefremdrift). 38 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

39 19. Når analysen er ferdig, åpnes fanen "Analysis" (analyse) automatisk. Merk: Hvis fanen "Analysis" (analyse) ikke åpnes av seg selv, klikker du på fanen "Analysis" (analyse) (figur 19). Merk: Du finner en beskrivelse av beregningsmetoden i avsnittet "Tolkning av resultater", side 40. Figur 19. Fanen "Analysis" (analyse) og rapportering av resultater. 20. Analyseresultater rapporteres som følger (figur 19): Feltet "Run Controls, Positive Control" (analysekontroller, positiv kontroll). Hvis resultatene er innenfor akseptable områder, vil "Positive Control Status" (positiv kontrollstatus) vise "Valid" (gyldig). Hvis ikke, vises "Invalid" (ugyldig). Feltet "Run Controls, Negative Control" (analysekontroller, negativ kontroll). Hvis både "NTC" og "Internal Control" (internkontroll) er innenfor akseptable områder, vil "Negative Control Status" (negativ kontrollstatus) vise "Valid" (gyldig). Hvis ikke, vises "Invalid" (ugyldig). Feltet "Sample Result Table" (tabell for prøveresultater). For mutasjonspositive prøver rapporteres spesifikke mutasjoner under kolonnen "KRAS Mutation Status" (KRAS mutasjonsstatus). Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

40 21. Rapportfiler kan genereres ved å klikke på knappen "Report" (rapport). Vinduet "Report Browser" (rapportfunksjon) vises. Velg "KRAS Analysis Report" (KRAS analyserapport) under "Templates" (templater), og klikk på knappen "Show" (vis) (figur 20). Merk: Rapporter kan lagres på et annet sted i Web Archive-format ved å klikke på knappen "Save As" (lagre som) øverst til venstre i hver rapport. Figur 20. Valg av "KRAS Analysis Report" (KRAS analyserapport). Tolkning av resultater Tolkning av analyse- og mutasjonsfunn foretas automatisk av therascreen KRAS Assay Package med en gang en analysering er fullført. Følgende informasjon beskriver hvordan therascreen KRAS Assay Package tolker analyse- og mutasjonsfunn. PCR-syklusen der fluorescensen fra en bestemt reaksjon krysser en terskelverdi, defineres som C T -verdien. C T -verdier indikerer kvantiteten av spesifikt input- DNA. Lave C T -verdier indikerer høyere input-dna-nivåer, og høye C T -verdier indikerer lavere input-dna-nivåer. Reaksjoner med en C T -verdi klassifiseres som positiv amplifikasjon. Rotor-Gene Q-programvaren interpolerer fluorescenssignaler mellom to hvilke som helst registrerte verdier. C T -verdiene kan derfor være ethvert reelt tall (ikke begrenset til heltall) innenfor området 0 til Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

41 For therascreen KRAS RGQ PCR Kit er terskelverdien satt til 0,05 relative fluorescensenheter. Denne verdien er konfigurert i therascreen KRAS Assay Package for både grønn og gul kanal. Terskelverdien ble definert under utviklingen av therascreen KRAS RGQ PCR Kit. Det utføres en beregning for å bestemme C T -verdien ved hjelp av ligningen: C T = [mutasjonsanalyse-c T -verdi] [kontrollanalyse-c T -verdi] Analysekontrollene (positiv kontroll, NTC og internkontroller) vurderes for å sikre at det oppnås akseptable C T -verdier og at reaksjonene fungerer som de skal. C T -verdier for prøven beregnes som differansen mellom mutasjonsanalyse-c T og kontrollanalyse-c T fra den samme prøven. Prøver klassifiseres som mutasjonspositive hvis de gir en C T som er mindre enn eller lik cutoff- C T - verdien for prøven. Over denne verdien kan prøven enten inneholde mindre enn den mutasjonsprosenten som kan detekteres av therascreen KRAS RGQ PCR Kit (utenfor analysenes grense), eller prøven kan være mutasjonsnegativ, noe som vil bli rapportert som "No Mutation Detected" (ingen mutasjon detektert). Ingen amplifikasjon i mutasjonsreaksjoner vil bli registrert som "No Mutation Detected" (ingen mutasjon detektert). C T -verdier beregnet fra bakgrunnsamplifikasjon forventes å være større enn cutoff- C T -verdiene, og prøven vil bli klassifisert som "No Mutation Detected" (ingen mutasjon detektert). Analyseresultatene vises som "Mutation Positive" (mutasjonspositiv), "No Mutation Detected" (ingen mutasjon detektert), "Invalid" (ugyldig) eller, hvis en analysekontroll mislykkes, "Run Control Failed" (analysekontroll mislyktes). For mutasjonspositive prøver vil spesifikke mutasjoner bli rapportert. Andre mulige resultater kan vises som beskrevet i "Protokoll: DNA-prøvevurdering", avsnitt "Protokoll: Deteksjon av KRAS-mutasjoner" og "Feilsøkingsveiledning", i denne brukerhåndboken. En tumor vil sjelden inneholde mer enn én mutasjon. I så fall vil mutasjonen som gir den laveste C T -verdien bli identifisert. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

42 Feilsøkingsveiledning Denne feilsøkingsveiledningen kan være nyttig for å løse problemer som kan oppstå. Hvis du ønsker mer informasjon, kan du også se siden med ofte stilte spørsmål på vårt tekniske supportsenter: Forskerne ved QIAGENs tekniske avdelinger er alltid klare til å svare på eventuelle spørsmål, enten det dreier seg om innholdet og protokollene i denne håndboken eller prøve- og analyseteknologi (du finner kontaktinformasjon bak på omslaget eller ved å gå til Ugyldige resultater a) Oppbevaringsforholdene for én eller flere komponenter stemte ikke overens med instruksjonene i "Oppbevaring og håndtering av reagenser", side 14 b) Det aktuelle therascreen KRAS RGQ PCR Kit er gått ut på dato Kommentarer og forslag Kontroller oppbevaringsforholdene og utløpsdatoen (se etiketten) til reagensene, og bruk om nødvendig et nytt sett. Kontroller oppbevaringsforholdene og utløpsdatoen (se etiketten) til reagensene, og bruk om nødvendig et nytt therascreen KRAS RGQ PCR Kit. NTC-prøver viser positive resultater i FAM-kanalen Kontaminering oppsto under klargjøring av PCR Gjenta PCR med nye reagenser. Lukk om mulig PCR-rørene rett etter tilsetting av prøven som skal testes. Sørg for at arbeidsområde og instrumenter dekontamineres regelmessig. 42 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

43 Flagg i therascreen KRAS Assay Package Tabell 9 viser en liste over flagg som kan genereres av therascreen KRAS Assay Package, hva de betyr, og hvilke tiltak som skal iverksettes. Tabell 9. Flagg i therascreen KRAS Assay Package Flagg Betydning Tiltak PC_CTRL_ASSAY _FAIL PCR-analyse ugyldig FAM C T utenfor område for positiv kontroll i kontrollreaksjon. Gjenta hele PCR-analysen. PC_MUTATION _ASSAY_FAIL PCR-analyse ugyldig FAM C T utenfor område for en eller flere mutasjonskontrollreaksjoner. Gjenta hele PCR-analysen. PC_CTRL _INVALID_DATA PCR-analyse ugyldig Fluorescensdata i positiv kontroll (kontrollreaksjonsblanding) kan ikke tolkes. Gjenta hele PCR-analysen. PC_MUTATION _INVALID_DATA PCR-analyse ugyldig Fluorescensdata i positiv kontroll (mutasjonsreaksjonsblanding) kan ikke tolkes. Gjenta hele PCR-analysen. NTC_INT_CTRL _FAIL PCR-analyse ugyldig Gjenta hele PCR-analysen. Internkontroll over område for negativ kontroll. Tabellen fortsetter på neste side. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

44 Tabell 9. Forts. Flagg Betydning Tiltak NTC_INT_CTRL _EARLY_CT PCR-analyse ugyldig Internkontroll under område for negativ kontroll. Gjenta hele PCR-analysen. NTC_INVALID _CT NTC_INVALID _DATA SAMPLE_CTRL _INVALID_DATA SAMPLE_CTRL _HIGH_CONC SAMPLE_CTRL _LOW_CONC PCR-analyse ugyldig FAM ugyldig (mindre enn grense) for negativ kontroll. PCR-analyse ugyldig Fluorescensdata i negativ kontroll kan ikke tolkes. Prøve ugyldig Fluorescensdata i prøvekontroll kan ikke tolkes. Prøve ugyldig FAM C T for lav i prøvekontroll. Lav konsentrasjon i prøvekontroll (advarsel, ikke feil). Gjenta hele PCR-analysen. Gjenta hele PCR-analysen. Sett opp ny PCR-analyse for å gjenta den eller de relevante prøvene. Fortynn prøven for å øke kontroll-c T -verdien. Denne fortynningen skal beregnes ut fra forutsetningen om at 1:1- fortynning med vannet i settet vil øke C T med 1,0. Når prøven er fortynnet, må ny PCR-analyse settes opp for å gjenta prøve. Ingen. Tabellen fortsetter på neste side. 44 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

45 Tabell 9. Forts. Flagg Betydning Tiltak SAMPLE_CTRL _FAIL Prøve ugyldig FAM C T for høy i prøvekontrollreaksjon. Sett opp ny PCR-analyse for å gjenta prøve. Hvis prøven er ugyldig etter gjentatt PCRanalyse, må prøven ekstraheres fra ett eller flere nye FFPE-snitt. Sett opp ny PCR-analyse for å teste ny ekstraksjon. Hvis den er ugyldig, tilbakestill den andre ekstraksjonen. Hvis prøven ikke gir et gyldig resultat etter denne analysen, gis prøven en ubestemt mutasjonsstatus, og det skal ikke utføres ytterligere testing. SAMPLE_INT _CTRL_FAIL C T for høy (eller ingen C T ) for internkontroll (HEX), FAM-kanal mutasjonsnegativ. Hvis prøven gir gyldig status ingen tiltak. Hvis prøven gir ugyldig status, må ny PCR-analyse settes opp for å gjenta prøven. Hvis prøven er ugyldig etter gjentatt PCR-analyse, må prøven ekstraheres fra ett eller flere nye FFPE-snitt. Sett opp ny PCR-analyse for å teste ny ekstraksjon. Hvis den er ugyldig, skal denne andre ekstraksjonen gjentas. Hvis prøven ikke gir et gyldig resultat etter denne analysen, gis prøven en ubestemt mutasjonsstatus, og det skal ikke utføres ytterligere testing. Tabellen fortsetter på neste side. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

46 Tabell 9. Forts. Flagg Betydning Tiltak SAMPLE_INT _CTRL_EARLY_CT Mutasjonsrør ugyldig C T HEX for lav for prøve (internkontroll) Hvis prøven gir gyldig status ingen tiltak. Hvis prøven gir ugyldig status, må ny PCR-analyse settes opp for å gjenta prøven. Hvis prøven er ugyldig etter gjentatt PCR-analyse, må prøven ekstraheres fra ett eller flere nye FFPE-snitt. Sett opp ny PCR-analyse for å teste ny ekstraksjon. Hvis den er ugyldig, skal denne andre ekstraksjonen gjentas. Hvis prøven ikke gir et gyldig resultat etter denne analysen, gis prøven en ubestemt mutasjonsstatus, og det skal ikke utføres ytterligere testing. Tabellen fortsetter på neste side. 46 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

47 Tabell 9. Forts. Flagg Betydning Tiltak SAMPLE_INVALID _DATA MUTATION _EARLY_CT Mutasjonsrør ugyldig Fluorescensdata i internkontroll kan ikke tolkes. Mutasjonsrør ugyldig C T FAM for lav for prøve. Hvis prøven gir gyldig status ingen tiltak. Hvis prøven gir ugyldig status, må ny PCR-analyse settes opp for å gjenta prøven. Hvis prøven er ugyldig etter gjentatt PCR-analyse, må prøven ekstraheres fra ett eller flere nye FFPE-snitt. Sett opp ny PCR-analyse for å teste ny ekstraksjon. Hvis den er ugyldig, skal denne andre ekstraksjonen gjentas. Hvis prøven ikke gir et gyldig resultat etter denne analysen, gis prøven en ubestemt mutasjonsstatus, og det skal ikke utføres ytterligere testing. Hvis prøven gir gyldig status ingen tiltak. Hvis prøven gir ugyldig status, må ny PCR-analyse settes opp for å gjenta prøven. Hvis prøven er ugyldig etter gjentatt PCR-analyse, må prøven ekstraheres fra ett eller flere nye FFPE-snitt. Sett opp ny PCR-analyse for å teste ny ekstraksjon. Hvis den er ugyldig, skal denne andre ekstraksjonen gjentas. Hvis prøven ikke gir et gyldig resultat etter denne analysen, gis prøven en ubestemt mutasjonsstatus, og det skal ikke utføres ytterligere testing. Tabellen fortsetter på neste side. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

48 Tabell 9. Forts. Flagg Betydning Tiltak SAMPLE_POSITIVE _AND_INVALID En eller flere mutasjoner Ingen. for en prøve er gyldig(e) og positiv(e), samtidig som en eller flere mutasjoner for samme prøve er ugyldig(e) (advarsel, ikke en feil). Kvalitetskontroll I henhold til QIAGENs ISO-sertifiserte kvalitetsstyringssystem testes hvert parti (lot) med therascreen KRAS RGQ PCR Kit opp mot forhåndsbestemte spesifikasjoner for å sikre konsekvent produktkvalitet. Begrensninger Testen er utformet for å detektere 7 mutasjoner i kodon 12 og 13 i KRAS-genet. Prøver med resultater rapportert som "no mutation detected" (ingen mutasjon detektert), kan inneholde KRAS-mutasjoner som ikke ble detektert av analysen (f.eks. 13CYS). Deteksjon av mutasjoner avhenger av prøvens integritet og mengden amplifiserbart DNA til stede i prøven. Prosedyren skal gjentas hvis den innledende vurderingen av DNA i prøven indikerer at kvantiteten er enten utilstrekkelig eller for høy for mutasjonsanalyse. therascreen KRAS RGQ PCR Kit brukes i en polymerasekjedereaksjon (PCR)- prosedyre. Som med alle PCR-prosedyrer kan prøver kontamineres av eksterne DNA-kilder i testmiljøet og DNA-et i den positive kontrollen. Utvis aktsomhet for å unngå kontaminering av prøver og reaksjonsblandingsreagenser. therascreen KRAS RGQ PCR Kit skal ikke brukes til diagnostikk. therascreen KRAS RGQ PCR Kit er kun beregnet på å skille mellom villtype og mutant. Testen er utformet slik at hver mutasjonsreaksjon er mest sensitiv overfor den spesifikke mutasjonen som måles. I prøver der det detekteres en mutasjon, kan det imidlertid forekomme kryssreaktivitet med andre mutasjonsreaksjoner. Hvis mer enn én mutasjonsreaksjon er positiv, er resultatet den med den laveste C T -verdien. therascreen KRAS RGQ PCR Kit er kun validert for formalinfiksert, parafininnstøpt kolorektalt kreftvev. 48 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

49 therascreen KRAS RGQ PCR Kit er kun validert for bruk med QIAamp DNA FFPE Tissue Kit. Det er kun Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM- eller Rotor-Gene Q 5plex HRM-instrumentet som er validert for bruk med therascreen KRAS RGQ PCR Kit. Forventede resultater therascreen KRAS RGQ PCR Kit gir en kvalitativ indikasjon på tilstedeværelsen av sju mutasjoner i kodon 12 og 13 i KRAS-onkogenet. Analyseresultatene vises som "Mutation Positive" (mutasjonspositiv), "No Mutation Detected" (ingen mutasjon detektert), "Invalid" (ugyldig) for hver mutasjon eller, hvis en analysekontroll mislykkes, "Run Control Failed" (analysekontroll mislyktes). Når et resultat er "Mutation Positive" (mutasjonspositivt), vises også den spesifikke KRAS-mutasjonen som ble detektert. Ytelseskarakteristikker Analytisk ytelse De spesifikke ytelseskarakteristikkene til therascreen KRAS RGQ PCR Kit ble fastsatt av studier som omfattet formalinfikserte, parafininnstøpte (FFPE) vevsprøver fra pasienter med kolorektal kreft (CRC) og 8 formalinfikserte, parafininnstøpte humane cellelinjer (FFPE-cellelinjer), hvorav 7 inneholder kjente KRAS-mutasjoner detektert av analysen, og en KRAS villtype (dvs. ingen mutasjoner i kodon 12 og 13). Mutasjonsstatus for prøver ble bekreftet av bidireksjonell Sanger-sekvensering. Cutoff To hundre og tjue FFPE-prøver ble testet ved hjelp av en metode beskrevet i NCCLS EP17-A (2004) for å fastsette analysens cutoff-verdier. Kontrollreaksjon- C T -området ble satt til 21,92 til 32,00. Cutoff-verdiene, som er basert på C T for kontrollreaksjon minus C T for mutasjonsreaksjoner ( C T ), vises i tabell 10. Tabell 10. Fastsatte cutoff-verdier for hver mutasjonsanalyse Mutasjonsanalyse ( C T ) 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP Cutoff ( C T ) 8,0 6,6 8,0 8,0 8,0 7,5 7,5 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

50 Grense for blank prøve For å vurdere ytelsen til therascreen KRAS RGQ PCR Kit i fravær av mutasjonspositivt templat, og for å sikre at en blank prøve ikke genererer et analytisk signal som kan indikere en lav mutasjonskonsentrasjon, ble prøver med ikketemplat evaluert. Resultatene viste ingen kontroll- eller mutasjon-c T -verdier i noen av mutasjons- eller kontrollreaksjonsrørene (alle internkontroll-c T -verdier var gyldige). Sammenligning med analytisk referansemetode To studier ble gjennomført for å finne konkordansen i mutasjonsstatus for CRCprøver testet med therascreen KRAS RGQ PCR Kit i forhold til bidireksjonell sekvensering. I den første studien ble 350 tumorprøver fra CRC-pasienter valgt basert på et sett med kliniske, demografiske og tumorvevsspesifikke baselinekarakteristikker. Ved hjelp av en statistisk vilkårlig prøveutvelgelsesteknikk ble 150 prøver med ukjent mutasjonsstatus valgt for evaluering. Disse (150) FFPEprøvene ble testet og deretter analysert i denne studien ved hjelp av statistiske målinger av samsvar/ikke-samsvar angitt i veiledningen for CLSI EP12-A2 (2008). Totalt 137 av FFPE-prøvene ga gyldige resultater for både therascreen KRAS RGQ PCR Kit og bidireksjonell sekvensering. Resultatene viste at therascreen KRAS RGQ PCR Kit rapporterte to prøver som negative, mens bidireksjonell sekvensering indikerte at den ene var positiv for 12ASP og den andre for 13ASP. Motsatt ble tre prøver rapportert å ha en KRAS-mutasjon med therascreen KRAS RGQ PCR Kit, som ikke ble rapportert som positive med bidireksjonell sekvensering. I tillegg ble en prøve identifisert som 12ARG med therascreen KRAS RGQ PCR Kit, bestemt til å være 12ASP med bidireksjonell sekvensering. Totalt 5 prøver ble bestemt til å være mutasjonsnegative med bidireksjonell sekvensering som ble rapportert som enten ubestemt (3 prøver) eller ugyldig (2 prøver) med therascreen KRAS RGQ PCR Kit (data ikke vist). En prøve som var ubestemt med bidireksjonell Sanger-sekvensering ble bestemt til å være 12SER med therascreen KRAS RGQ PCR Kit (data ikke vist). Tabell 11 på neste side viser samsvarsanalysen mellom therascreen KRAS RGQ PCR Kit og bidireksjonell sekvensering. 50 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

51 Tabell 11. therascreen KRAS RGQ PCR Kit vs. bidireksjonell Sanger-sekvensering Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

52 Resultatene viser et positivt prosentvis samsvar (PPA) på 96,3 %, et negativt prosentvis samsvar (NPA) på 96,3 %, og et samlet prosentvis samsvar (OPA) på 96,4 %. De samlede resultatene, med unntak av 6 mislykkede Sanger-prøver, vises i tabell 12 nedenfor. Tabell 12. Samsvarsanalyse Måling av samsvar Frekvens (%) 95 % konfidensintervall (CI) Samlet prosentvis samsvar 132/137 (96,35) 92,69 98,21 Positivt prosentvis samsvar 52/54 (96,30) 89,41 98,77 Negativt prosentvis samsvar 80/83 (96,39) 91,30 98,55 Et nytt unikt sett med prøver ble evaluert for å supplere dataene fra den første studien. Et sett med 271 CRC FFPE-prøver ble innhentet; 250 prøver med ukjent mutasjonsstatus og 21 prøver med kjent mutasjonsstatus for å ta høyde for sjeldne mutasjoner ble sammenlignet med bidireksjonell Sanger-sekvensering som beskrevet ovenfor. Totalt 13 (~5 %) prøver krevde makrodisseksjon for evaluering med therascreen KRAS RGQ PCR Kit. Av de 271 prøvene med bidireksjonelle sekvenseringsresultater ble 24 rapportert som ubestemt med therascreen KRAS RGQ PCR Kit (utenfor kontroll-c T -område; data ikke vist). Konkordansanalyse ble utført på 247 prøver med gyldige resultater fra både bidireksjonell sekvensering og therascreen KRAS RGQ PCR Kit. Det var 9 diskordante prøver. En av de 247 prøvene hadde et mutasjonspositivt resultat med bidireksjonell sekvensering, men et "no mutation detected" (ingen mutasjon detektert)-resultat med therascreen KRAS RGQ PCR Kit. Åtte prøver viste seg å ha et positivt resultat med therascreen KRAS RGQ PCR Kit, men et negativt resultat med bidireksjonell sekvensering. Samlet var samsvaret 96,4 %. Dataene støtter den nøyaktige ytelsen til therascreen KRAS RGQ PCR Kit (se tabell 13 og tabell 14). Tabell 13. Samsvarsanalyse (studie nr. 2) Måling av samsvar Frekvens (%) 95 % CI Samlet prosentvis samsvar 238/247 (96,36) 93,73 98,09 Positivt prosentvis samsvar 106/107 (99,07) 95,64 99,95 Negativt prosentvis samsvar 132/140 (94,29) 89,93 97,13 52 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

53 Tabell 14. therascreen KRAS RGQ PCR Kit vs. bidireksjonell Sanger-sekvensering (studie nr. 2) Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

54 Deteksjonsgrense (LOD) Arbeidsområdet for therascreen KRAS RGQ PCR Kit er basert på mengden amplifiserbart DNA i prøven som bestemt av C T -verdien for kontrollreaksjon. Det fastsatte input-området for analysen er definert av det forhåndsspesifiserte kontroll-c T -området på 21,92 til 32,00. LOD er minste prosentandel mutant DNA som kan detekteres i en bakgrunn av villtype-dna når totalt amplifiserbart DNA er innenfor det angitte input-området og samtidig under C T -verdien for cutoff. Det ble utført en studie for å bestemme LOD for hver av de sju mutasjonsspesifikke reaksjonene inkludert i therascreen KRAS RGQ PCR Kit. For therascreen KRAS RGQ PCR Kit ble grensen for deteksjon av mutant DNA i en bakgrunn av villtype-dna definert som den laveste fortynningsfaktoren der 95 % av testreplikatene for hver mutasjonspositiv prøve ble bestemt til å være positive. Åtte FFPE-cellelinjer sju med kjent mutant DNA-innhold og én villtype ble brukt til denne evalueringen. Andelen mutant i totalt amplifiserbart DNA (prosent mutant DNA) ble bestemt innledningsvis ved hjelp av en bidireksjonell Sanger-sekvenseringsmetode fra ufikserte celler, etterfulgt av relativ toppanalyse. Når det gjaldt tre av cellelinjene, var mutantinnholdet 100 % (dvs. at cellelinje-dna-et var homozygot mutant). De andre cellelinjene var av blandet zygositet. Flere DNA-ekstraksjoner fra hver prøve ble slått sammen (poolet) for å generere DNA-utgangsmateriale (stamme). DNA-stammene ble deretter normalisert for å oppnå C T -verdier for målkontrollreaksjon. Normalisert mutant DNA-ekstraksjoner ble fortynnet med normalisert villtype-dnaekstraksjon for å opprette en fortynningsserie av ekstraksjoner som inneholdt det samme nivået av totalt amplifiserbart DNA, men forskjellige nivåer av mutant DNA. Det ble deretter generert seriefortynninger fra disse prøvene, som ble analysert i flere replikater. Den første fortynningsserien ble opprettet for kontrollreaksjon-c T -verdien for mellområdet (ca. 26). Ni replikater per fortynning ble testet. Prosentandelen korrekte funn som en funksjon av fortynningen for hver mutasjonsreaksjon vises i tabell 15. Uthevede felt indikerer prosentandelen hvor mer enn 95 % av replikatene produserte korrekte funn. 54 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

55 Tabell 15. Prosentandel korrekte funn % mutasjonsfortynning % korrekte funn 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 0, ,3 55,6 22,2 66,7 0 1, , , , , ,7 6, , , ,0 100* * Mutasjonsfortynning for denne prøven var 40,0 % Resultatene av den første fortynningsserien ble brukt til å generere fortynninger for å bekrefte LOD-verdier ved hjelp av smalere, reaksjonsspesifikke områder av prosentvise mutasjonsfortynninger ved både lave og høye nivåer innenfor analysens input-område. 12 replikater hver ble evaluert for serien med høy fortynning. Prosentandelen korrekte funn som en funksjon av fortynning for serien med høy fortynning (målverdier ca. C T 23 24) vises i tabell 16 nedenfor. Uthevede felter indikerer prosentandelen hvor mer enn 95 % av replikatene produserte korrekte funn. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

56 Tabell 16. Prosentandel korrekte funn (høy) % mutasjonsfortynning (høy) 12ALA 0,13 0,27 0,54 1,08 2,15 4,30 % korrekte funn , ASP 0,56 1,13 2,25 4,50 9,00 18,00* % korrekte funn 0 8,3 33,3 83, ARG 0,16 0,33 0,65 1,30 2,60 5,20 % korrekte funn 0 0 8, CYS 0,12 0,24 0,49 0,98 1,95 3,90 % korrekte funn 0 0 8,3 83, SER 0,31 0,63 1,25 2,50 5,00 10,00 % korrekte funn ,3 66, VAL 0,17 0,34 0,69 1,38 2,75 5,50 % korrekte funn , ASP 0,63 1,25 2,50 5,0 10,0 20,0 % korrekte funn * 11 gyldige replikater. 24 replikater ble brukt per fortynning for den lave serien, unntatt der det er angitt. Prosentandelen korrekte funn som en funksjon av fortynning for serien med lav fortynning (målverdi ca. C T 31) vises i tabell 17 nedenfor. 56 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

57 Tabell 17. Prosentandel korrekte funn (lav) % mutasjonsfortynning (lav) 12ALA 0,27 0,54 1,08 2,15 4,30 8,60 12,90 % korrekte funn 12,5 20,8 33,3 83, ASP 0,56 1,13 2,25 4,50 9,0 18,0 27,0 % korrekte funn 0 16,7 29,2 58, ARG* 0,33 0,65 1,30 2,60 5,20 10,4 15,6 % korrekte funn 8,3 4,2 29,2 52,2 95, CYS 0,24 0,49 0,98 1,95 3,90 7,80 11,7 % korrekte funn 8,3 4,2 20,9 54,2 83, SER 0,63 1,25 2,50 5,0 10,0 20,0 30,0 % korrekte funn 0 0 8,3 33,3 70,9 83, VAL 0,34 0,69 1,38 2,75 5,50 11,00 16,50 % korrekte funn 4,3 16,7 46,7 75, ASP 0,63 1,25 2,5 5,0 10,0 20,0 30,0 % korrekte funn 0 4,2 8,3 33,3 70, * Ved en fortynning på 2,60 var antall gyldige replikater 23. Antall gyldige replikater i serien var 23, 24, 15, 16, 13, 12 og 19 for 12VAL. Logistiske regresjonsmodeller ble anvendt på hver enkelt analyse for datasettene med lavt og høyt input-dna. I disse modellene var responsvariabelen det binære resultatet av mutasjon detektert (detect = 1) og mutasjon ikke detektert (detect = 0), den kontinuerlige forklaringsvariabelen var log2 % mutasjonsfortynning. LOD-ene ble beregnet som prosentandelen mutasjonsfortynning som ga en predikert deteksjonssannsynlighet på 0,95. LOD-ene bestemt ut fra fortynningsserien som begynner med enten lav eller høy C T -verdi, er angitt i tabell 18 nedenfor. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

58 Tabell 18. Logistiske regresjonsdata for lav og høy C T -fortynningsserie Analyse Lav Høy 12ALA 4,25 0,56 12ASP 10,23 6,43 12ARG 7,27 0,87 12CYS 6,90 1,21 12SER 25,75 4,20 12VAL 5,17 0,90 13ASP 18,83 4,16 Siste LOD krever bruk av FFPE-cellelinjer når input-c T -verdien er mellom ca. 22 og 27 C T, og vises i tabell 19 nedenfor. I nedre del av C T -input-området reduseres analysens sensitivitet, siden mengden input-dna ikke nødvendigvis inneholder nok kopier til å støtte de samme prosentvise forholdene av villtypetil mutant DNA observert innenfor arbeidsområdets høye og midtre punkt. Tabell 19. LOD-verdier for hver mutasjonsanalyse ved bruk av FFPEcellelinjer Analyse LOD C 95 (prosentandel mutant DNA i villtype-dna) 12ALA 0,8 12ARG 2,6 12ASP 6,4 12CYS 1,5 12SER 5,6 12VAL 1,6 13ASP 6,4 58 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

59 Effekt av input-dna Når prøver ved forskjellige totalt DNA-nivåer inneholder samme andel mutant DNA, forventes det at de målte C T -verdiene forblir konsistente. Målet med studien var å vise at ytelsen til therascreen KRAS RGQ PCR Kit er konsistent i hele analysens område for totalt DNA-input (kontroll-c T ). DNA ekstrahert fra 8 FFPE-cellelinjer ble brukt til å klargjøre DNA-pooler med lavest oppnåelig kontrollreaksjon-c T. Konsentrert DNA-stamme ble deretter fortynnet for å generere DNA som dekket hele arbeidsområdet (totalt 5 fortynninger, inklusive det opprinnelig konsentrerte utgangsmaterialet). For hvert punkt innenfor arbeidsområdet ble det klargjort nok materiale til å utføre 6 replikattester. Fortynningsområdet for hver mutasjonsreaksjon og den gjennomsnittlige C T -verdien oppnådd fra resultatene, er angitt i tabell 20 nedenfor. For hver av mutasjonene detektert med therascreen KRAS RGQ PCR Kit, tilfredsstilte C T -verdiene målt ved forskjellige nivåer av totalt DNA-input i hele analysens arbeidsområde, de forhåndsdefinerte akseptkriteriene for studien. Selv om det er en liten økning i C T etter som DNA-input øker, var C T -verdiene generelt konsistente i hele arbeidsområdet til therascreen KRAS RGQ PCR Kit og innenfor de forhåndsspesifiserte akseptkriteriene. Tabell 20. Effekten av DNA-input på C T -verdiene i hele input-området for kontrollreaksjon-c T FFPE-cellelinjer Fortynning 1 ~20 21 C T Fortynning 2 ~23 24 C T Antall replikater Fortynning 3 ~26 27 C T Fortynning 4 ~29 30 C T Fortynning 5 ~32 33 C T Mutasjon C T C T C T C T C T 12ALA 1,56 1,25 1,16 1,14 1,27 12ASP* 2,46 2,18 2,11 2,11 1,75 12ARG 1,18 0,63 1,08 0,94 1,06 12VAL 0,29 0,25 0,15 0,26 0,1 DNA ~22 23 C T ~24 25 C T ~27 28 C T ~29 30 C T ~32 33 C T 12SER 2,91 2,21 2,15 2,15 2,08 12CYS 0,98 0,71 0,58 0,81 0,67 13ASP 3,57 2,84 2,54 2,46 2,62 * Det totale antall replikater for 12ASP var 27. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

60 Linearitet/amplifikasjonseffektivitet som en funksjon av DNA-input Lineariteten og amplifikasjonseffektiviteten til PCR for hver mutasjonsreaksjon i forhold til kontrollreaksjonen, ble funnet i hele arbeidsområdet til therascreen KRAS RGQ PCR Kit. Amplifikasjonseffektiviteten ble beregnet for hver av mutasjonsreaksjonene og kontrollreaksjonen som [2( 1/slope)] 1. Amplifikasjonseffektiviteten til kontrollen sammenlignet med mutasjonsreaksjonen indikerer at C T -verdien, og dermed også mutasjonsfunnet, er konsistent i hele analysens arbeidsområde. Den største forskjellen i amplikasjonseffektiviteter mellom kontrollreaksjonen og en mutasjonsreaksjon ble observert for 13ASP-analysen med en gjennomsnittlig forskjell i effektiviteter på ca. 14,5 %. En oppsummering av dataene vises i tabell 21 nedenfor. 60 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

61 Tabell 21. Amplifikasjonseffektiviteter Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

62 Linearitet/amplifikasjonseffektivitet som en funksjon av mutasjonsprosent Målet med denne studien var å evaluere effekten av seriefortynnet mutasjonspositiv prøve på amplifikasjonseffektiviteten i hele arbeidsområdet til therascreen KRAS RGQ PCR Kit, med utgangspunkt i input-nivåer av C T på ca C T. DNA-ekstraksjoner fra FFPE-cellelinjer ble innledningsvis vurdert via OD-avlesninger før det ble utført PCR med therascreen KRAS RGQ PCR Kit. DNA-stammer ble så klargjort til en kontrollreaksjon-c T tilsvarende ~23 C T. Stammene ble seriefortynnet to ganger hver gang ved hjelp av villtype-dna for å opprettholde den totale villtype-dna-konstanten, mens man varierte prosentandelen mutant DNA i templatet. Hvert av de genererte templatene hadde på den måten den samme absolutte kvantiteten og konsentrasjonen av DNA, men forskjellige forhold av villtype til mutant DNA. Det ble klargjort DNApooler nok til 6 replikater per mutasjon. C T - og C T -data for hver mutasjon ved hvert fortynningspunkt ble beregnet. Mutasjonsreaksjon-C T -verdiene ble plottet og effektivitetene beregnet. Kontrollreaksjon-C T -verdiene var konsistente i hele fortynningsserien for hver mutasjon. For hver prøve hvor kontrollreaksjon-c T - verdien falt innenfor det spesifiserte området (21,92 32,00), ble C T -verdier beregnet. En lineær regresjonsmodell ble matet med mutasjonsreaksjon-c T versus log2 DNA-input-fortynning. Slope og 95 % konfidensintervall ble rapportert. Studien viste at fortynningen av mutasjoner i en bakgrunn av en konstant konsentrasjon av villtype-dna resulterte i amplifikasjonseffektiviteter som ikke varierte signifikant utenfor verdiene bestemt i den ovennevnte linearitetsstudien, med amplifikasjonseffektiviteter som varierte med mindre enn ±10 % (tabell 22). 62 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

63 Tabell 22. Amplifikasjonseffektiviteter Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

64 Interfererende substanser Målet med denne studien var å vurdere virkningen av potensielt interfererende substanser på ytelsen til therascreen KRAS RGQ PCR Kit. Dette ble gjort ved å analysere effekten av hver substans, ved å hjelp av spikeforsøk ved to konsentrasjoner, på C T -verdiene og mutasjonsstatusen til testprøvene. Konsentrasjonene vises i tabell 23. Tabell 23. Mengde interfererende substanser som er testet i hver analyse (dvs. 1x) Interfererende substans Faktisk høy mengde (µl/200 µl eluat) Faktisk lav mengde (µl/200 µl eluat) Parafinvoks (i xylen) 2,00 x ,00 x 10-5 Xylen 2,00 x ,00 x 10-5 Etanol 1,35 x ,38 x 10-4 Buffer ATL 5,40 x ,35 x 10-4 Proteinase K 1,32 x ,30 x 10-6 Buffer AL 1,33 x ,33 x 10-5 Vaskebuffer AW1 0,50 1,25 x 10-1 Vaskebuffer AW2 5,00 1,25 Ingen av de potensielt interfererende substansene som ble vurdert ved konsentrasjoner som forventes å forekomme i normal bruk, virker inn på therascreen KRAS RGQ PCR Kits evne til å skille mellom mutasjonspositive og mutasjonsnegative prøver. I tillegg til studien av interfererende substanser ble den potensielle effekten av nekrose i kliniske prøver vurdert for å bestemme om høye nivåer av nekrotisk vev i tumorprøver virker inn på evnen til å genere gyldige data. Av totalt 421 prøver som ble vurdert som en del av studien "Sammenligning med analytisk referansemetode", hadde 29 prøver nekrose ved et nivå >50 % som fastsatt av patalogisk undersøkelse. Av disse 29 prøvene ga 28 av dem gyldige resultater som stemte overens med bidireksjonell Sanger-sekvensering. En enkelt prøve var ugyldig som følge av utilstrekkelig DNA. 64 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

65 Krysskontaminering Målet med denne studien var å bestemme omfanget av krysskontaminering, som potensielt kan føre til falske positive resultater, mellom DNA-prøver som blir behandlet med therascreen KRAS RGQ PCR Kit. Mulige kilder til krysskontaminering omfatter: Prøveekstraksjon (f.eks. skraping av objektglass) Pipettering av prøver Lukking ("lokkpåsetting") av prøverør Kontaminering av settreagenser under bruk Lasting av analyserør på Rotor-Gene Q-instrumentet Til denne studien ble det brukt FFPE-standarder: villtype-standarden og 12ALAstandarden (siden 12ALA-reaksjonen er reaksjonen med lavest LOD i settet). Studien besto av 10 PCR-analyser som skulle undersøke muligheten for kontaminering både innenfor og mellom analyser på Rotor-Gene Q- instrumentet. I disse testanalysene ble rør som inneholdt villtype-dna brukt til å teste kontaminering fra mutant DNA. Resultatene fra denne studien indikerte ingen detekterbar kontaminering i noen av villtype-dna-ekstraksjonene som skulle detektere krysskontaminering. Eksklusivitet/kryssreaktivitet therascreen KRAS RGQ PCR Kit omfatter 8 separate reaksjoner: én enkelt kontrollreaksjon som detekterer en ikke-polymorf region i KRAS-genet og sju mutasjonsspesifikke reaksjoner. Det er ingen reaksjon som spesifikt måler villtype KRAS-sekvensen i kodon 12 eller 13. KRAS-resultatet "no mutation detected" (ingen mutasjon detektert) (dvs. villtype) blir bestemt ut fra fraværet av enhver av de 7 mutasjonene som resulterer i et positivt mutasjonsresultat. Det er derfor nødvendig å finne mengden ikke-spesifikk amplifikasjon, eller kryssreaktivitet som oppstår i hver reaksjon med overflødige mengder KRAS villtype-dna, for å sikre at det ikke forekommer falske positive resultater. Likeledes evalueres ikke-spesifikk amplifikasjon av KRAS-mutasjoner som reaksjonen ikke er ment å detektere, for å vise at mengden kryssreaktivitet mellom mutasjonsreaksjoner ikke fører til feilaktige mutasjonsfunn i nærvær av overflødige mengder mutant DNA. Siden DNA-input for denne analysen er basert på kontroll-c T -området (21,92 til 32,00), har man tatt utgangspunkt i at den høyeste konsentrasjonen av DNA-input har en kontroll-c T -verdi på ca. 22. Det ble brukt kliniske FFPE-prøver til denne evalueringen, så vel som FFPEcellelinje-DNA. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

66 Ikke-spesifikk amplifikasjon/kryssreaktivitet: Villtype-KRAS-DNA For å behandle mengden ikke-spesifikk amplifikasjon av villtype-dna med reaksjonsblandinger beregnet på å amplifisere spesifikke mutasjoner, ble seksti (60) replikater av villtype FFPE-cellelinje-DNA eller DNA ekstrahert fra CRC-tumorvev ved den høyeste konsentrasjonen av amplifiserbart DNA-input evaluert ved hjelp av therascreen KRAS RGQ PCR Kit. For DNA ekstrahert fra FFPE-cellelinjen var kontroll-c T -verdiene ca Kontroll-C T -verdiene for tre villtype CRC-prøver var mellom 24 og 25. Resultatene viste at C T -verdiene overskred de etablerte cutoff-verdiene. Den gjennomsnittlige og/eller laveste C T -verdien observert for hver reaksjon vises i tabell 24 nedenfor. Tabell 24. Den laveste gjennomsnittlige C T -verdien observert for villtypeprøver i mutasjonsreaksjoner Mutasjonsreaksjon Cutoff Laveste C T observert Prøve 1 C T - gjennomsnitt (lavest) Prøve 2- gjennomsnitt (lavest) Prøve 3- gjennomsnitt (lavest) 12ALA 8 12,76 18,00 (11,40) 18,62 (11,50) 20,03 (19,36) 12ASP 6,6 10,35 10,90 (9,62) 10,34 (8,84) 10,68 (9,01) 12ARG 8 14,26 20,33 (12,94) 20,02 (13,20) 20,03 (19,36) 12CYS 8 13,66 20,62 (17,38) 20,29 (19,62) 20,03 (19,36) 12SER 8 11,97 17,26 (11,14) 17,90 (11,42) 18,05 (10,44) 12VAL 7,5 11,81 14,87 (11,46) 16,27 (11,50) 18,68 (11,36) 13ASP 7,5 10,94 12,35 (9,08) 13,68 (10,69) 14,82 (9,97) Ikke-spesifikk amplifikasjon/kryssreaktivitet/eksklusivitet: Mutasjonspositivt KRAS DNA Mutasjonsprøver som har en høy konsentrasjon av input-dna ble testet mot alle reaksjonsblandinger ved å klargjøre DNA-prøver fra hver FFPE-cellelinje slik at kontrollreaksjon-c T svarte til ca. 23. Seks replikater av hver mutasjonsprøve ble evaluert. Mutasjonsprosenten i prøven ble styrt av prosentandelen mutant i cellelinje-dna-et. Gjennomsnittlig C T er angitt i tabell 25 nedenfor og viser at det er kryssreaktivitet mellom mutasjonsreaksjoner. 12ALAmutasjonen ble amplifisert og genererte C T -verdier under C T -tersklene for reaksjonene 12CYS, 12SER og 12VAL. 12VAL-mutasjonen ble amplifisert og genererte en C T -verdi under C T -terskelen for 12ALA-reaksjonen. I alle tilfellene viste imidlertid resultatene at den korrekte mutasjonen ble funnet med den matchede mutasjonsreaksjonen (dvs. den laveste C T -verdien var det 66 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

67 korrekte mutasjonsfunnet). Alle andre testtilfeller var enten ikke detektert eller utenfor C T -terskelen. Tabell 25. C T -kryssreaktivitet mellom mutasjonsreaksjoner ved hjelp av FFPE-cellelinje-DNA ved høyt input-område* Cutoff 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 12ALA 8 1,42 12,66 5,81 2,78 6,31 13,21 12ASP 6,6 12,56 2,42 13,44 11,21 13,55 Mutant DNA 12ARG 8 13,12 11,56 1,12 11,42 13,43 12,66 12CYS 8 14,2 12,48 9,23 0,98 7,96 12,88 12SER 8 13,39 13,31 3,02 12,99 13,97 12VAL 7,5 6,83 13,38 0,28 13,74 13ASP 7,5 13,29 13,89 14,36 4,5 * C T -verdier fra matchede reaksjoner vises med fet skrift. Blanke celler viser ingen kryssreaksjon. C T fra kryssreaktive reaksjoner under cutoff er uthevet. Repeterbarhet og reproduserbarhet Presisjonen til therascreen KRAS RGQ PCR Kit ble bestemt ved hjelp av en protokoll som også inneholdt aspekter fra CLSI EP12-A og EP5-A2. Det ble brukt kliniske CRC-prøver til denne evalueringen. Én villtype og én prøve for hver mutasjon ble testet med therascreen KRAS RGQ PCR Kit, og to operatører på hvert av de tre stedene testet alle prøver og kontroller på tre partier med therascreen KRAS RGQ PCR Kit hver eneste dag i fem dager, med to analyser hver dag og med to replikater av hver prøve på hver analyse. C T og C T - verdiene som ble oppnådd for hver reaksjon i hver prøve ble også analysert med varianskomponentanalyse. Reproduserbarheten til therascreen KRAS RGQ PCR Kit for mutantprøver med lavt nivå (3 x LOD) og villtypeprøver ble funnet å være minst 39/40 korrekte mutasjonsfunn for alle analyser på tvers av flere partier (lot), plattformer og operatører, både i og mellom laboratorieforsøk. Estimater av varians som ble funnet (en ganger standardavvik) ved hjelp av C50 og 3 x LOD-prøver, er angitt i tabell 26 og tabell 27. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

68 Tabell 26. Presisjonsestimater for reproduserbarhet %CV for C T %CV for mutant C T %CV for kontroll-c T Analyse 3xLOD C50 3xLOD C50 3xLOD C50 WT 12ALA 13,14 8,32 1,87 2,02 0,97 1,12 1,12 12ARG 10,79 8,04 1,59 1,96 1,24 1,51 1,15 12ASP 12,86 5,87 1,11 1,00 0,90 0,90 1,04 12CYS 17,61 10,83 1,86 2,02 1,54 1,22 1,15 12SER 13,97 10,43 1,71 2,11 0,94 1,19 1,15 12VAL 9,66 15,47 1,52 1,65 1,11 3,74 1,26 13ASP 13,73 9,35 1,91 2,08 1,11 1,41 1,19 Tabell 27. Presisjonsestimater for repeterbarhet %CV for C T %CV for mutant C T %CV for kontroll-c T Analyse 3xLOD C50 3xLOD C50 3xLOD C50 WT 12ALA 10,71 7,51 1,69 1,76 0,77 0,90 0,79 12ARG 9,83 8,04 1,21 1,76 0,84 1,33 0,90 12ASP 10,16 4,08 0,93 0,89 0,80 0,76 0,76 12CYS 13,15 8,80 1,31 1,76 1,40 1,01 0,76 12SER 6,76 6,18 1,10 1,48 0,80 0,90 0,90 12VAL 9,21 15,32 1,40 1,42 0,91 3,49 0,94 13ASP 8,67 7,01 1,30 1,65 0,91 1,19 0,97 Den estimerte andelen av 3xLOD-prøver som testet mutantprøver og villtypeprøver, ble rapportert samlet og innenfor hvert av stedene. For alle analyser og prøvekombinasjoner ga minst 79 av 80 replikater det korrekte mutasjonsfunnet. Den samlede andelen av korrekte funn var 99,6 % (1115/1120); 99,6 % (558/560) for mutasjonspositive (3xLOD) prøver og 99,5 % (557/560) for ingen mutasjon detektert (villtype)-prøver (se tabell 28, side 69). 68 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

69 Tabell 28. Samlet andel korrekte funn Mutasjon 12ALA 12ARG 12ASP 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 3xLOD-prøver Samlet 79/80 80/80 80/80 79/80 80/80 80/80 80/80 Villtypeprøver (lav) Samlet 80/80 79/80 80/80 80/80 79/80 79/80 80/80 Variabilitet ved prøvehåndtering For å vurdere prøvehåndteringsvariabilitet som en del av testprosessen med therascreen KRAS RGQ PCR Kit, ble 30 sekvensielle 5 µm-snitt skåret fra hver av 10 FFPE CRC-prøver (3 villtype og 1 per mutasjon). Snittene ble vilkårlig fordelt til et av tre teststeder, slik at hvert sted mottok 10 snitt per FFPE-prøve (100 snitt totalt). Av de 300 DNA-ekstraksjonene som ble testet, var 298 prøver gyldige. Det var en konkordans på 99,33 % når det gjaldt KRAS-mutasjonsfunn mellom de tre stedene. Variansen av C T -verdier for hver analyse ble estimert, og bidraget av kilder mellom og innenfor laboratorier ble estimert ved hjelp av en ANOVA-varianskomponentmodell. Varians innenfor teststeder var høyest for 12ASP (0,30). Varians mellom teststeder var høyest for 12SER (0,05). En sammenligning etter sted av gjennomsnittlige C T -verdier med tilhørende standardavvik for mutantprøver og villtypeprøver viste et svært høyt samsvar for resultatene (se tabell 29 og tabell 30). Resultatene viser samsvaret mellom DNA-ekstraksjonsprosedyren og prøvebehandlingen i sammenheng med therascreen KRAS RGQ PCR Kit. Tabell 29. Sammenligning etter sted av gjennomsnittlige C T (standardavvik)-verdier for mutantprøver Sted 1 12ALA 12ARG 12ASP 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 2,44 (0,1) 2,62 (0,3) 3,03 (0,6) 2,24 (0,1) 2,34 (0,3) 2,51 (0,1) 3,93 (0,4) Sted 2 2,44 (0,2) 2,52 (0,4) 3,01 (0,7) 2,29 (0,2) 2,10 (0,4) 2,44 (0,5) 4,15 (0,7) Sted 3 2,67 (0,6) 2,52 (0,2) 3,07 (0,5) 2,29 (0,2) 2,74 (0,5) 2,56 (0,2) 3,95 (0,3) Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

70 Tabell 30. Sammenligning etter sted av gjennomsnittlige C T (standardavvik)-verdier for villtypeprøver Sted 1 12ALA 12ARG 12ASP 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 12,46 (0,3) 10,37 (0,4) 11,84 (0,4) 12,36 (0,5) 11,11 (0,6) Sted 2 12,09 (0,6) 13,07 (0,2) 10,17 (0,5) 11,71 (0,7) 12,20 (0,6) 11,00 (0,9) Sted 3 12,07 (0,2) 10,61 (0,4) 11,94 (0,3) 12,28 (0,6) 11,82 (0,5) Merk: " " betyr en manglende verdi som følge av at det ikke ble observert gjennombrudd. Variabilitet mellom partier Muligheten for at variabilitet mellom partier påvirket mutasjonsdeteksjonen ble vurdert. I denne studien ble tre partier med QIAamp DNA FFPE Tissue Kit og therascreen KRAS RGQ PCR Kit evaluert med hvert sitt parti med FFPEekstraksjonssett. DNA ble ekstrahert fra formalinfikserte parafininnstøpte cellelinjer med 3 partier med FFPE-ekstraksjonssett for å gi DNA-prøver med målkontroll-c T -verdier på ca. 23, 26 og 31. Disse C T -verdiene ble valgt for å dekke det definerte arbeidsområdet for totalt DNA-input til therascreen KRAS RGQ PCR Kit (kontroll-c T innenfor 21,92 32,00). Seks replikat av ekstraksjoner ved hver mål-c T -verdi ble testet med hver av de 3 uavhengige therascreen KRAS RGQ PCR Kit-partiene. C T -verdiene og mutasjonsfunnene ble samlet inn for alle testprøvene. De forhåndsdefinerte studiemålene ble oppfylt med det korrekte mutasjonsfunnet observert i 100 % av gyldige tester, noe som bekrefter at prøvemutasjonsfunn ikke påvirkes av bruken av forskjellige partier med FFPEekstraksjonssett og/eller therascreen KRAS RGQ PCR Kits. Referanser QIAGEN opprettholder en stor, oppdatert elektronisk database med vitenskapelige publikasjoner som omhandler bruk av QIAGEN-produkter. Omfattende søkealternativer gjør at du kan finne de artiklene du har behov for, enten med et enkelt nøkkelordsøk eller ved å spesifisere applikasjonen, forskningsområdet, tittelen, osv. Du finner en fullstendig liste over referanser i QIAGENs referansedatabase på eller ved å ta kontakt med QIAGENs tekniske avdelinger eller den lokale distributøren. 70 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

71 Angitte referanser 1. Hilger, R.A., Scheulen, M.E., Strumberg, D. (2002) The Ras-Raf-MEK-ERK pathway in the treatment of cancer. Onkologie 25, Bachireddy, P., Bendapudi, P.K., Felsher, D.W. (2005) Getting at MYC through RAS. Clin Cancer Res. 11, Han, S.-W. et al. (2006) Optimization of patient selection for gefitinib in non-small cell lung cancer by combined analysis of epidermal growth factor receptor mutation, K-ras mutation, and AKT phosphorylation. Clin Cancer Res. 12, Pao, W. et al. (2005) KRAS mutations and primary resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib. PloS Medicine 2, Lievre, A. et al. (2006) KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66, Benvenuti, S. et al. (2007) Oncogenic activation of the RAS/RAF signaling pathway impairs the response of metastatic colorectal cancers to anti-epidermal growth factor receptor antibody therapies. Cancer Res. 67, De Roock, W. et al. (2007) KRAS mutations preclude tumor shrinkage of colorectal cancers treated with cetuximab. J Clin Oncol. 25, Finocchiaro, G. et al. (2007) EGFR, HER2, and Kras as predictive factors for cetuximab sensitivity in colorectal cancer. J Clin Oncol. 25, Di Fiore, F. et al. (2007) Clinical relevance of KRAS mutation detection in metastatic colorectal cancer treated by cetuximab plus chemotherapy. British Journal of Cancer 96, Khambata-Ford, S. et al. (2007) Expression of Epiregulin and Amphiregulin and K-ras mutation status predict disease control in metastatic colorectal cancer patients treated with cetuximab. J Clin Oncol. 25, Lièvre A. et al. (2006) KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66, Lièvre A. et al. (2008) KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab. J Clin Oncol. 26, Bokemeyer, C. et al., (2008) K-RAS status and efficacy of first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mcrc) with FOLFOX with or without cetuximab: The OPUS experience. J Clin Oncol. 26 (May 20 suppl; abstr 4000). 14. Van Cutsem, E. et al. (2008) K-RAS status and efficacy in the first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mcrc) treated with FOLFIRI with or without cetuximab: The CRYSTAL experience. J Clin Oncol. 26, (May 20 suppl; abstr 2). 15. Tejpar, S. et al. (2008) Relationship of efficacy with K-RAS status (wild type versus mutant) in patients with irinotecan-refractory metastatic colorectal cancer (mcrc), treated with irinotecan (q2w) and escalating doses of cetuximab (q1w): The EVEREST experience (preliminary data). J Clin Oncol. 26, (May 20 suppl; abstr 4001) th World Congress on Gastrointestinal Cancer: Abstract o-037. Presented June 27, KRAS mutation status is a predictive biomarker for cetuximab benefit in the treatment of advanced colorectal cancer. Results from NCIC CTG CO.17: A phase III trial of cetuximab versus best supportive care. Christos Karapetis et al. 17. Amado, R.G. (2008) Wild-type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol. 26, De Roock, W. et al. (2007) KRAS wild-type state predicts survival and is associated to early radiological response in metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. Ann Oncol. Nov. 12. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

72 19. Thelwell, N. et al. (2000) Mode of action and application of Scorpion primers to mutation detection. Nucleic Acids Res. 28, Newton, C. R. et al. (1989) Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res. 17, Whitcombe, D. et al. (1999) Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence. Nature Biotech 17, Catalog of Somatic Mutations in Cancer ( Symboler <24> Inneholder nok reagenser til 24 reaksjoner Skal brukes innen Katalognummer Partinummer (lot) Materialnummer Komponenter Innhold Nummer Temperaturbegrensninger Produsent Se informasjonen i håndboken Må beskyttes mot sollys 72 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

73 Kontaktinformasjon Hvis du ønsker teknisk assistanse eller mer informasjon, kan du gå til vårt tekniske supportsenter på eller ringe en av QIAGENs tekniske serviceavdelinger eller lokale distributører (se bak på omslaget eller gå inn på Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

74 Vedlegg: Installasjon av therascreen KRAS Assay Package therascreen KRAS RGQ PCR Kit er beregnet for bruk med Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM- eller Rotor-Gene Q 5plex HRM-instrumentet med rotor med 72 brønner. therascreen KRAS Assay Package er tilgjengelig separat på CD (QIAGEN, katalognr ). Pakken inneholder "therascreen KRAS QC Locked Template" (therascreen KRAS QC låst templat) og "therascreen KRAS Locked Template" (therascreen KRAS låst templat). CD-en inneholder også platekart som kan skrives ut og brukes til å registrere forsøkene og kjøre templater som definerer PCR-protokollene for FFPE-prøveklargjøring med QIAamp DNA FFPE Tissue Kit, DNA-prøvevurdering med therascreen KRAS RGQ PCR Kit og deteksjon av KRAS-mutasjoner med therascreen KRAS RGQ PCR Kit. Merk: therascreen KRAS Assay Package fungerer kun med Rotor-Gene Q- programvareversjon (build 9) eller nyere. Kontroller at den riktige versjonen av Rotor-Gene Q-programvaren er installert før du installerer therascreen KRAS Assay Package. Prosedyre 1. Bestill CD-en med therascreen KRAS RGQ Assay Package CE (QIAGEN, katalognr ) som fås separat fra QIAGEN. 2. Sett CD-en inn i CD-stasjonen på datamaskinen som er koblet til Rotor-Gene Q-instrumentet. 3. Start installasjonen ved å dobbeltklikke på filen therascreen_kras_assay_package_ exe. 74 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

75 4. Installasjonsveiviseren vises. Klikk på "Next" (neste) for å fortsette (figur 21). Figur 21. Dialogboksen "Setup" (oppsett). 1 = Knappen "Next" (neste). Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

76 5. Les lisensvilkårene i dialogboksen "License Agreement" (lisensavtale) og godta avtalen ved å huke av ved siden av "I accept the agreement" (jeg godtar avtalen). Klikk på "Next" (neste) for å fortsette (figur 22). Figur 22. Dialogboksen "License Agreement" (lisensavtale). 76 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

77 6. Templatoppsettet starter automatisk. Til slutt vises dialogboksen "Setup" (oppsett). Klikk på "Finish" (avslutt) for å avslutte installasjonsveiviseren (figur 23). Figur 23. Avslutt installasjonsveiviseren. 7. Start datamaskinen på nytt. Snarveier til både "therascreen KRAS QC Locked Template" og "therascreen KRAS Locked Template" genereres automatisk og vises på skrivebordet. Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

78 Bestillingsinformasjon Produkt Innhold Katalognr. therascreen KRAS RGQ PCR Kit (24) Til 24 reaksjoner: 1 kontrollanalyse, 7 mutasjonsanalyser, positiv kontroll, vann, Taq DNA-polymerase therascreen KRAS Assay Package CD Programvarepakke for bruk med therascreen KRAS RGQ PCR Kit og QIAGEN Rotor-Gene Q 5plex HRMeller MDx-instrumentet med rotor med 72 brønner Rotor-Gene Q og tilbehør Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Platform PCR-sentrifuge i sanntid og apparat for HRM-analyser med 5 kanaler (grønn, gul, oransje, rød, karmosinrød) pluss HRM-kanal, bærbar PC, programvare, tilbehør, ett års garanti på deler og arbeid, installasjon og opplæring ikke inkludert Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System Rotor-Gene Q 5plex HRM Platform Rotor-Gene Q 5plex HRM System PCR-sentrifuge i sanntid og apparat for HRM-analyser med 5 kanaler (grønn, gul, oransje, rød, karmosinrød) pluss HRM-kanal, bærbar PC, programvare, tilbehør, ett års garanti på deler og arbeid, installasjon og opplæring. PCR-sentrifuge i sanntid og apparat for HRM-analyser med 5 kanaler (grønn, gul, oransje, rød, karmosinrød) pluss HRM-kanal, bærbar PC, programvare, tilbehør, ett års garanti på deler og arbeid, installasjon og opplæring. PCR-sentrifuge i sanntid og apparat for HRM-analyser med 5 kanaler (grønn, gul, oransje, rød, karmosinrød) pluss HRM-kanal, bærbar PC, programvare, tilbehør, ett års garanti på deler og arbeid, installasjon og opplæring ikke inkludert Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

79 Produkt Innhold Katalognr. Loading Block 72 x 0.1 ml Tubes Aluminiumsblokk til manuelt reaksjonsoppsett med en énkanalspipette i rør på 72 x 0,1 ml Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (2500) 250 remser med 4 rør og lokk til 1000 reaksjoner 10 x 250 remser med 4 rør og lokk til reaksjoner QIAamp DNA FFPE Tissue Kit for rensing av genomisk DNA fra parafininnstøpte vev QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (50) Til 50 DNA-klargjøringer: QIAamp MinElute -kolonner, Proteinase K, buffere og prøverør (2 ml) Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/

80 Varemerker: QIAGEN, QIAamp, HRM, MinElute, Rotor-Gene, Scorpions, therascreen (QIAGEN Group); ARMS (AstraZeneca Ltd.); FAM, HEX (Life Technologies, Inc.). Skal ikke brukes til fecesprøver. Skal ikke brukes til urinprøver. Skal ikke brukes til ekstracellulær nukleinsyre fra blodprøve. Skal ikke brukes til cellefrie beinmargsprøver. Skal ikke brukes til salivaprøver. KJØP AV DETTE PRODUKTET GIR KJØPEREN RETTIGHETER UNDER VISSE ROCHE-PATENTER TIL Å BRUKE PRODUKTET UTELUKKENDE FOR Å UTFØRE HUMAN IN VITRO-DIAGNOSTIKK. DET GIS INGEN GENERELLE PATENT- ELLER ANDRE LISENSRETTIGHETER I FORBINDELSE MED KJØPET, BORTSETT FRA DENNE SPESIFIKKE BRUKSRETTEN. Begrenset lisensavtale Bruk av dette produktet innebærer at enhver kjøper eller bruker av therascreen KRAS RGQ PCR Kit samtykker i følgende vilkår: 1. therascreen KRAS RGQ PCR Kit kan kun brukes i samsvar med håndboken for therascreen KRAS RGQ PCR Kit og kun sammen med komponenter i therascreen KRAS RGQ PCR Kit. QIAGEN gir ingen lisens i forhold til noen av sine åndsprodukter til å bruke eller innlemme komponentene som inngår i dette settet (Kit) med komponenter som ikke inngår i dette therascreen KRAS RGQ PCR Kit, med unntak av det som er beskrevet i håndboken for therascreen KRAS RGQ PCR Kit og ytterligere protokoller som er tilgjengelige på 2. QIAGEN gir ingen garantier for at dette therascreen KRAS RGQ PCR Kit og/eller dets bruk ikke krenker rettighetene til tredjeparter, bortsett fra uttrykkelig angitte lisenser. 3. Dette therascreen KRAS RGQ PCR Kit og dets komponenter er lisensiert for engangsbruk og kan ikke brukes flere ganger, modifiseres eller videreselges. 4. QIAGEN frasier seg spesifikt andre lisenser, uttrykt eller antydet, bortsett fra de som er uttrykkelig oppgitt. 5. Kjøperen og brukeren av therascreen KRAS RGQ PCR Kit samtykker i at de ikke skal gjøre noe eller tillate noen andre å gjøre noe som kan føre til handlinger som er forbudt ovenfor. QIAGEN kan håndheve forbud i denne begrensede lisensavtalen i en hvilken som helst domstol, og skal få tilbake alle sine etterforsknings- og domstolskostnader, inkludert advokathonorarer, i enhver handling for å håndheve denne begrensede lisensavtalen eller noen av sine immaterielle rettigheter i forhold til therascreen KRAS RGQ PCR Kit og/eller dets komponenter. Oppdaterte lisensvilkår er tilgjengelige på QIAGEN. Med enerett. 80 Håndbok for therascreen KRAS RGQ PCR Kit 08/2012

81

82 Australia Austria Belgium Brazil Canada China Denmark Finland France Germany Hong Kong India Ireland Italy Japan Korea (South) Luxembourg Mexico The Netherlands Norway Singapore Sweden Switzerland UK USA NO /2012 Sample & Assay Technologies