Beskrivelse. Teknisk område

Transkript

1 1 Beskrivelse Teknisk område [0001] Foreliggende oppfinnelse omhandler en enkelt-kjede sirkulær RNA, en fremgangsmåte for fremstilling av RNAet, og en farmasøytisk sammensetning som omfatter RNAet. Bakgrunnsteknikk [0002] Konvensjonelle RNA interferensmetoder blir generelt klassifisert til to grupper: en fremgangsmåte som anvender kjemisk syntetiserte dobbel-trådede RNAer og en fremgangsmåte som anvender plasmidvektorer. RNA interferensmetoden som anvender plasmidvektorer blir vidt anvendt innen feltet bioteknologi, hovedsakelig i grunnleggende biologieksperimenter. Imidlertid, når RNA interferensmetoden blir anvendt for å utvikle farmasøytiske preparater, har fremgangsmåten som anvender plasmidvektorer et problem med sikkerhet til en menneskekropp. Det er følgelig sannsynlig å være mer foretrukket å anvende de kjemisk syntetiserte dobbel-trådede RNAer. [0003] Det er imidlertid det problem at kjemisk syntetiserte dobbel-trådede RNAer er ustabile in vivo, nemlig, følsomme for nedbrytning med enzymer (nukleaser) i celler. For å løse dette problemet, har det blitt utviklet RNA tråder med ikke-naturlige nukleinsyrer for å øke stabilitet av dobbel-trådede RNAer i celler; det eksisterer imidlertid et annet problem at dets biologiske aktivitet reduseres mens stabiliteten blir forbedret. I tillegg, er toksisitet forårsaket ved ikke-naturlige nukleinsyrer ukjent. Det forblir derfor vanskelig å oppnå anvendelsen til farmasøytiske preparater. [0004] Formene av en dobbel-trådet RNA som er anvendbar for RNA interferensmetoden inkluderer en dobbel-trådet RNA som har butte ender eller fremstikkende ender, et RNA som har en hårnålstruktur med en løkke ved den ene eller andre enden av det dobbel-trådede RNA (JP03-012A), en sirkulær nukleinsyre som inneholder omtrent 19 basepar, to løkker, og eventuelt kjemisk modifiserte polynukleotider (JP A) og lignende. Denne sirkulære nukleinsyren er imidlertid ikke utsatt for testing for RNA interferensvirkning. [000] I tillegg, er det vist en RNA-DNA kimær dumbbell-formet nukleinsyre (JP A(1999)). Denne nukleinsyren er ikke for anvendelse i RNA interferens. RNAandelen av den dumbbell-formede nukleinsyren blir spaltet ved et enzym i celler, og den resulterende antisense DNA andelen binder til et mrna i celler for å inhibere det. JP A(1999) viser at en nukleinsyre innehar en høy motstand mot at nukleinsyre bryter ned enzymer i celler og forblir stabil i celler inntil ribonuklease H virker, på grunn av dens dumbbell-formede struktur. Det viser videre at, fordi et enkelt-kjede oligonukleotid som inneholder antisense DNA andelen kan bli frigitt til cellers cytoplasma bare etter spalting av den komplementære RNA andelen med virkningen av ribonuklease H, blir det antatt at antisense virkningen per dose blir øket. [0006] Dessuten, angående fremgangsmåten for å syntetisere en sirkulær nukleinsyre som har en dumbbellformet struktur er det, for eksempel, vist at lineære oligonukleotider blir syntetisert, en stammeregion og en hårnål løkkeregion blir dannet for å oppnå et "nick" dumbbell-formet oligonukleotid, hvori ett sete på det målsøkte sirkulære dumbbell-formede oligonukleotidet (den motsatte enden av hårnål løkkeregionen over) er ubundet, og ' enden blir ligert med en ligase for å fremstille en sirkulær dumbbell-formet sirkulær nukleinsyre (JP (1999)). [0007] Det er et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et enkelt-kjede sirkulært RNA og en fremgangsmåte for fremstilling av dette.

2 2 Fremleggelse av oppfinnelsen [0008] Foreliggende oppfinnere har nå funnet at, overraskende, kan en enkelt-kjede sirkulær RNA bli oppnådd med et høyt utbytte ved separat å syntetisere en sense-tråd og en antisense-tråd, begge omfatter en nukleotidsekvens med uparede nukleotider ved hver ende, og tillate ligase å virke på nukleotidene ved begge ender samtidig, og at det oppnådde enkelt-kjede sirkulære RNA utøver en vedvarende eller langsomtfrigivende RNA interferensvirkning. Basert på disse vitenskapelige funnene, har foreliggende oppfinnere fullbyrdet foreliggende oppfinnelse. [0009] Mer spesifikt, inkluderer foreliggende oppfinnelse det følgende (1) Et enkelt-kjede sirkulært RNA som har en vedvarende eller langsomt-frigivende RNA interferensvirkning, kjennetegnet ved at det enkelt-kjede sirkulære RNAet omfatter en sense-trådsekvens, en antisense-tråd-sekvens komplementær til sense-tråd-sekvensen, identiske eller forskjellige to løkkesekvenser mellom sense-tråden og antisense-tråden, som forbinder begge tråder, hvori sense-tråden og antisense-tråden er paret for å danne en stamme, og hvori hver av de to løkkesekvensene har 6 til 9 nukleotider lengde. (2) Det enkelt-kjede sirkulære RNAet i henhold til (1) over, hvori ekspresjonen av et mål-rna er 0,4 eller mindre 24 timer etter introduksjon av det enkelt-kjede sirkulære RNAet til eukaryotiske celler, sammenlignet med kontrollceller som har ekspresjonsnivå av mål-rnaet satt til 1. (3) Det enkelt-kjede sirkulære RNAet i henhold til (1) eller (2) over, hvori 70 % eller mer derav er bevart etter 8 timer i humant serum. (4) En fremgangsmåte for fremstilling av det enkelt-kjede sirkulære RNAet i henhold til en hvilken som helst av (1) til (3) over, som omfatter å syntetisere en sense-tråd og en antisense-tråd, begge omfatter en nukleotidsekvens med uparede nukleotider ved ' enden og 3' enden, og samtidig ligere nukleotidet ved ' enden av nukleotidsekvensen med uparede nukleotider i sense-tråden, med nukleotidet ved 3' enden av nukleotidsekvensen med uparede nukleotider i antisense-tråden, og vice versa, ved anvendelse av en ligase, hvori nukleotidsekvensen med uparede nukleotider ved ' enden av sense-tråden og nukleotidsekvensen med uparede nukleotider ved 3' enden av antisense-tråden er bundet til hverandre for å danne en løkke, nukleotidsekvensen med uparede nukleotider ved 3' enden av sense-tråden og nukleotidsekvensen med uparede nukleotider ved ' enden av antisense-tråden er bundet til hverandre for å danne en løkke, og sense-tråden og antisense-tråden er paret for å danne en stamme. () Fremgangsmåten i henhold til (4) over, som videre omfatter å fosforylere hver ' ende av nukleotidsekvensen med uparede nukleotider i sense-tråden og nukleotidsekvensen med uparede nukleotider i antisense-tråden. (6) Fremgangsmåten i henhold til (4) eller () over, hvori løkkesekvensene er identiske med eller forskjellige fra hverandre. (7) Fremgangsmåten i henhold til en hvilken som helst av (4) til (6) over, hvori stammelengden er 19 til 31 nukleotider. (8) En fremgangsmåte for å undertrykke ekspresjon av et gen som koder for et protein in vitro, som omfatter å introdusere det enkelt-kjede sirkulære RNAet i henhold til en hvilken som helst av (1) til (3)

3 3 over til humant-avledede celler, og svekke et mål-rna ved det enkelt-kjede sirkulære RNAet for å inhibere translasjon av mål-rnaet til proteinet på en vedvarende måte (9) En fremgangsmåte for å undertrykke ekspresjon av et gen som koder for et protein, som omfatter å introdusere in vitro det enkelt-kjede sirkulære RNAet i henhold til en hvilken som helst av (1) til (3) over til celler av et ikke-humant dyr eller plante, og svekke et mål-rna ved det enkelt-kjede sirkulære RNAet for å inhibere translasjon av mål-rnaet til proteinet på en vedvarende måte. () En farmasøytisk sammensetning som omfatter det enkelt-kjede sirkulære RNAet i henhold til en hvilken som helst av (1) til (3) over som en aktiv ingrediens. [00] Som anvendt heri, kan ha begrepet "enkelt-kjede sirkulær RNA" bli referert til som dumbbell-formet RNA. Et dumbbell-formet RNA refererer til et enkelt-kjede sirkulært RNA, hvori en sense-tråd og en antisensetråd er komplementært paret for å danne en stamme, løkker blir dannet ved begge sider av stammen ved en nukleotidsekvens med uparede nukleotider, og hele fasongen av det enkelt-kjede sirkulære RNAet er i en dumbbell. [0011] I henhold til foreliggende oppfinnelse, kan det dumbbell-formede syntetiske RNA, som har utmerket stabilitet, holdbarhet og langsomt-frigivende egenskap, bli effektivt produsert. [0012] Spesielt kan det dumbbell-formede RNA for anvendelse i RNA interferensmetoden bli produsert ved å cyklisere to RNA tråder. Fordi begge ender er lukket i en løkkefasong, har det ingen RNA-ende og det er derfor ikke sannsynlig at det tjener som et substrat for enzymer, eksonuklease (RNase) og lignende, unntatt for spesifikke enzymer så som Dicer i celler. Det er således mindre følsomt for enzymatisk nedbrytning og har signifikant øket stabilitet i cellen. Som et resultat, er det ikke nødvendig å anvende ikke-naturlige nukleinsyrer for å øke stabilitet. [0013] Det dumbbell-formede RNA blir dessuten spesifikt gjenkjent ved in vivo enzymer så som Dicer i celler, og løkkeregionene ved begge sider blir spaltet for å danne et naturlig forekommende type dobbel-trådet RNA (Figur 1). Som et resultat kan det ha aktivitet ekvivalent med den for et dobbel-trådet RNA, og utøver en mer holdbar eller langsomt-frigivende virkning enn RNA interferensvirkning ved konvensjonelle dobbel-trådede RNAer. [0014] Det dumbbell-formede RNA ifølge foreliggende oppfinnelse er også mer stabilt enn konvensjonelle dobbel-trådede RNAer i humant serum. Kort beskrivelse av tegningene [001] Figur 1 er et skjematisk riss av det dumbbell-formede RNAet ifølge foreliggende oppfinnelse. Figur 2 viser strukturen av RNAer og en elektroforeseavbildning av hvert RNA. Figur 3 viser strukturen av sirna og dumbbell-formede RNAer. Figur 4 viser elektroforeseavbildninger av dumbbell-formede RNAer og "liner" dobbel-trådede RNAer spaltet ved Dicer. Figur viser en interferensvirkning av hvert dumbbell-formede RNA 24 timer etter transfeksjon. Figur 6 viser en holdbar RNA interferensvirkning av det dumbbell-formede RNAet. Figur 7 viser stabilitet av det dumbbell-formede RNAet i humant serum. Beste modus for å utføre oppfinnelsen [0016] Det enkelt-kjede sirkulære RNAet ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer en sense-tråd-sekvens homolog til nukleotidsekvensen av et mål-rna eller del derav, en antisense-tråd-sekvens som er

4 4 komplementær til sense-tråd-sekvensen og er i stand til å pares med den, og løkkesekvenser som ikke kan danne paring mellom trådene [0017] Sense-tråden og antisense-tråden blir paret for å danne en stamme. Lengden av stammen, ikke spesifikt begrenset, kan bli bestemt avhengig av typen, strukturen eller lignende av et mål-rna. For eksempel, er stammen satt sammen av 19 til 31 basepar, fortrinnsvis 21 til 2 basepar, mer foretrukket 22 til 24 basepar, og enda mer foretrukket 23 basepar. [0018] Nukleotidsekvensene med uparede nukleotider foreligger ved ' enden og 3' enden av både sensetråden og antisense-tråden. Nukleotidet ved ' enden av nukleotidsekvensen med uparede nukleotider i sensetråden og nukleotidet ved 3' enden av nukleotidsekvensen med uparede nukleotider i antisense-tråden er ligert sammen for å danne en løkke. Nukleotidet ved 3' enden av nukleotidsekvensen med uparede nukleotider i sense-tråden og nukleotidet ved ' enden av nukleotidsekvensen med uparede nukleotider i antisense-tråden er ligert sammen for å danne en løkke. Løkkelengden er 6 til 9 baser. Derfor er hele det enkelt-kjede sirkulære RNAet fortrinnsvis satt sammen av 42 til 80 baser. [0019] Hvor nukleotidsekvensen med uparede nukleotider ved ' enden av sense-tråden er representert som A, nukleotidsekvensen med uparede nukleotider ved 3' enden av antisense-tråden er representert som B, nukleotidsekvensen med uparede nukleotider ved 3' enden av sense-tråden er representert som C og nukleotidsekvensen med uparede nukleotider ved ' enden av antisense-tråden er representert som D, for eksempel, hvis løkkelengden er baser, så er A 1 til 19 baser i lengde, B er 19 til 1 baser i lengde, C er 19 til 1 baser i lengde og D er 1 til 19 baser i lengde. Derfor er nukleotidet ved ' enden av A og nukleotidet ved 3' enden av B ligert sammen for å danne en -base løkke, og nukleotidet ved 3' enden av C og nukleotidet ved ' enden av D er ligert sammen for å danne en -base løkke. Selv om løkker av baser ikke er del av foreliggende oppfinnelse, gjelder det samme prinsippet for løkker med 6 til 9 baser. [00] Det er foretrukket at sekvensene, som ikke kan danne paring med hverandre, varierer i lengde mellom A og B, og mellom C og D, for eksempel, ved 1 base, 2 baser eller 3 baser eller, alternativt, at sekvensene er av den samme lengden. Derfor, for eksempel, hvor løkkelengden er 8 baser, er det foretrukket at A er 3 til baser i lengde, B er til 3 baser i lengde, C er til 3 baser i lengde og D er 3 til baser i lengde. Hvor løkkelengden er 9 baser, er det foretrukket at A er 3 til 6 baser i lengde, B er 6 til 3 baser i lengde, C er 6 til 3 baser i lengde og D er 3 til 6 baser i lengde. [0021] I tillegg kan nukleotidsekvensene av løkken dannet ved A og B og løkken dannet ved C og D være identiske eller forskjellige. [0022] Det enkelt-kjede sirkulære RNAet ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli anvendt for RNA interferensmetoden. 4 0 [0023] RNA interferens er også kjent som RNAi, og er et fenomen hvor et lite RNA molekyl som har en sekvens komplementær til et mål-rna binder til mål-rnaet, og derved bryter ned mål-rnaet eller undertrykker translasjonenav mål-rnaet. [0024] Antisense-tråden av det dumbbell-formede RNAet har en sekvens komplementær til et mål-rna (for eksempel, mrna eller forstadium RNAet derav). Dessuten inkluderer nukleotidsekvensene med uparede nukleotider, men er ikke begrenset til, UUCAAGAGA og UGUGCUGUC (M. Miyagishi et al., Oligonucleotides 03, bind 13: pp. 1-7). [002] Dernest kan løkken i det dumbbell-formede RNAet bli kjemisk modifisert. For eksempel kan in vivo stabiliteten av det dumbbell-formede RNAet bli forbedret ved å modifisere med polyetylenglykol som har

5 molekylvekt som er omtrent 00 til 000. Løkken av det dumbbell-formede RNAet blir spaltet ved et enzym så som Dicer i celler som skal bli fjernet. Det blir derfor antatt at polyetylenglykol har liten virkning når stammen utøver sin RNA interferensvirkning som en sirna eller mirna [0026] Med det dumbbell-formede RNAet ifølge foreliggende oppfinnelse, er ekspresjonen av et mål-rna i celler, som det dumbbell-formede RNAet har blitt introdusert i, fortrinnsvis 0,4 eller mindre 24 timer etter introduksjon av det dumbbell-formede RNAet til cellene, sammenlignet med kontrollceller (uten at det dumbbell-formede RNAet er introdusert) som har ekspresjonsnivå for mål-rnaet satt til 1. [0027] I henhold til foreliggende oppfinnelse, er cellene eukaryotiske celler, fortrinnsvis dyreceller og planteceller. [0028] Ekspresjonen av et mål-rna kan bli bekreftet ved, for eksempel, transformering av celler med et reportergen (f.eks., luciferase, β-galaktosidase, β-glukuronidase eller grønt fluorescerende protein (GFP) gen), og måle fargingen eller fluorescensen av det reporter-gen-avledede proteinet for å undersøke nivået av inhibering av en mål-rna ekspresjon ved det dumbbell-formede RNAet, hvori mrna for reportergenet kan bli anvendt som mål-rnaet. [0029] Dessuten er det dumbbell-formede RNAet ifølge foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved at 70 % eller mer derav er bevart uten å bli brutt ned etter 8 timer i humant serum. Dette kan for eksempel bli bekreftet ved å inkubere det dumbbell-formede RNAet i humant serum og måle molekylvekten ved anvendelse av elektroforese eller lignende for å teste om det er brutt ned over tid. [00] Fremgangsmåten for fremstilling av det dumbbell-formede enkelt-kjede sirkulære RNAet ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer å syntetisere en sense-tråd og en antisense-tråd, begge omfatter en nukleotidsekvens med uparede nukleotider ved ' enden og 3' enden, og samtidig ligere nukleotidet ved ' enden av nukleotidsekvensen med uparede nukleotider i sense-tråden, med nukleotidet ved 3' enden av nukleotidsekvensen med uparede nukleotider i antisense-tråden, og vice versa, ved anvendelse av en ligase. [0031] Sense-tråden og antisense-tråden kan bli designet for å undertrykke funksjonen av et målgen, basert på nukleotidsekvensen av målgenet. Designene kan bli bekreftet ved å produsere flere sense og antisense-tråder og teste for hver undertrykkelseseffektivitet. For eksempel, kan det bli anvendt design ved anvendelse av en algoritme for sirna design eller lignende (Referanser: J. A. Jaeger et al., Methods in Enzymology (1989) 183: 281-6; D. H. Mathews et al., J. Mol. Biol. (1999) 288: 911-9). Når en designer, er det foretrukket at trådene ikke undertrykker ekspresjonen av gener andre enn et målgen, genene som har sekvenser lignende målgenet (som er kjent som "off target" virkning). Lengdene av sense og antisense-trådene er fortrinnsvis designet i området, for eksempel, 19 til 31 baser, fortrinnsvis 21 til 2 baser, mer foretrukket 22 til 24 baser, og enda mer foretrukket 23 baser. [0032] Målgenet inkluderer, men er ikke begrenset til, abl/bcr gen for leukemi, VEGF gen for aldersrelatert makuladegenerasjon og HCV gen for hepatitt. [0033] En sekvens som påfølgende danner en løkke, for eksempel sekvensen UUCAAGAGA over, blir delt inn i to fragmenter ved en vilkårlig posisjon for å danne en nukleotidsekvens med uparede nukleotider (hvori sekvensen er 9 baser, og når delt inn i to fragmenter, som beskrevet over, er forskjellen i lengde fortrinnsvis i området 1 til 3 baser). En sekvens er designet, slik at ett fragment er ligert til 3' enden av antisense-tråden, og det andre er ligert til ' enden av sense-tråden. Ved den samme fremgangsmåten, blir det designet en annen sekvens slik at ett fragment er ligert til 3' enden av sense-tråden, den andre er ligert til ' enden av antisensetråden. Enkelt-kjede nukleinsyrer som har disse to designede sekvensene blir syntetisert separat. Ved å gjøre dette, er det foretrukket å utføre '-ende fosforyleringen ved anvendelse av en kjemisk fosforyleringsreagens.

6 6 Dessuten krever fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen designen av en sekvens for å danne en løkke, som har lengde på 6 til 9 baser [0034] Det er ulike fremgangsmåter for å syntetisere nukleinsyrer så som in vitro transkripsjons syntesefremgangsmåte, fremgangsmåter som anvender plasmider eller virale vektorer, og fremgangsmåter som anvender PCR kassetter. Selv om en fremgangsmåte for å syntetisere nukleinsyrer ikke er spesifikt begrenset, er en kjemisk syntese fremgangsmåte foretrukket når det gjelder høy renhet, evne til å produsere i store kvantum, sikkerhet for anvendelse in vivo, evne til kjemisk modifisering, og lignende. Eksempler på kjemisk syntese fremgangsmåte inkluderer, men er ikke begrenset til, H-fosfonat fremgangsmåte og fosforoamiditt fremgangsmåte. For dette formålet, kan det bli anvendt kommersielt tilgjengelige automatiske nukleinsyresyntetiserere. [003] Endene av nukleotidsekvensene med uparede nukleotider ved begge ender av sense-tråden og antisense-tråden blir ligert med en ligase (for eksempel, T4 RNA ligase eller T4 DNA ligase) for å danne to løkker samtidig. Reaksjonsbetingelsene inkluderer, for eksempel, inkubering i en buffer som inneholder polyetylenglykol (PEG), BSA og lignende i timer ved en lav temperatur. Det syntetiserte dumbbell-formede enkelt-kjede sirkulære RNA kan bli samlet og renset ved ordinære fremgangsmåter (for eksempel, høy-ytelse væskekromatografi og PAGE fremgangsmåte). [0036] Dessuten kan det enkelt-kjede sirkulære RNAet bli kjemisk modifisert med polyetylenglykol (PEG) eller lignende, hvori den kjemiske modifiseringen fortrinnsvis blir utført ved løkkeregionen. For binding, blir begge ender av PEG modifisert for å introdusere en funksjonell gruppe som er reaktiv med aminogruppene i baser, så som en formylgruppe eller en N-hydroksysuccinimid estergruppe. [0037] RNA interferensmetoden ved anvendelse av det dumbbell-formede RNAet produsert ved fremgangsmåten over er beskrevet senere heri. [0038] I henhold til foreliggende oppfinnelse, kan det enkelt-kjede sirkulære RNAet ifølge foreliggende oppfinnelse bli introdusert til celler in vitro og svekke et mål-rna for å inhibere translasjonen av mål-rnaet til et protein på en vedvarende måte, hvori humane celler eller ikke-humane dyre- eller planteceller kan bli anvendt som cellene. [0039] Når RNA interferensmetoden blir utført in vitro, blir det dumbbell-formede RNAet introdusert til celler ved, for eksempel, elektroporeringsmetode, mikroinjeksjonsmetode, lipofeksjonsmetode eller kalsiumfosfattransfeksjon. [00] Det dumbbell-formede RNAet introdusert til celler blir spaltet ved Dicer i cellene for å generere en dobbel-trådet RNA (sirna) som har en RNA interferensvirkning (Figur 1). Endene av sirnaet kan være enten butte ender eller fremstikkende ender. sirnaet blir til en enkelt kjede for å danne et RNA-nukleasekompleks (RNA indusert slukkende kompleks (RISC)), som gjenkjenner et mål-mrna som har en sekvens komplementær til sirnaet, og bryter ned mål-mrnaet, og derved undertrykker ekspresjonen av det tilsvarende målgenet. [0041] Det enkelt-kjede sirkulære RNAet ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli anvendt i en hvilken som helst av planteceller og dyre- (for eksempel, mennesker, kjæledyr, pattedyr inkludert husdyr) celler. Vide anvendelser innen feltene medisin og landbruk vil bli forventet. For eksempel kan det enkelt-kjede sirkulære RNAet ifølge foreliggende oppfinnelse bli anvendt for ulike formål inkludert belysning av funksjonen av et spesifikt gen eller protein i planter eller dyr, eller ved plante- eller dyrecellulært nivå, ved anvendelse av for eksempel "knockout" fremgangsmåter.

7 7 [0042] I tillegg inkluderer foreliggende oppfinnelse en farmasøytisk sammensetning som omfatter det enkeltkjede sirkulære RNAet som en aktiv ingrediens. 1 2 [0043] Mengden av det enkelt-kjede sirkulære RNAet formulert i den farmasøytiske sammensetningen kan bli justert i samsvar med typen og formålet av sammensetningen. For eksempel, inkluderer mengden av RNAet, men er ikke begrenset til, 1 vekt-%, 3 vekt-%, vekt-%, vekt-%, vekt-%, vekt-%, vekt-%, 0 vekt-%, 60 vekt-%, 70 vekt-%, 80 vekt-%, 90 vekt-% eller 0 vekt-% i forhold til totalmengden av sammensetningen. [0044] Eksempler på den farmasøytiske sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer flytende preparater (så som løsning, suspensjon, emulsjon), faste preparater (så som frysetørket preparat som er i stand til å bli rekonstituert før bruk), liposom (fortrinnsvis, kationisk liposom)-innkapslede preparater. I tillegg er foretrukket administrasjonrute en parenteral administrasjon, som inkluderer, for eksempel, lokal administrasjon ved å påføre preparatet direkte på et rammet sted, pulmonal administrasjon, transmukosal administrasjon så som nasal administrasjon og intravenøs administrasjon. [004] Den farmasøytiske sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse kan inkludere eksipienser (saltløsning, sterilisert vann, Ringers løsning og lignende), bufrende midler, tonisitetsmidler, stabiliseringsmidler og lignende, avhengig av formuleringer eller doseringsformer. [0046] Dessuten kan doseringen av den farmasøytiske sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse variere avhengig av kjønn, vekt, alder, alvorlighetsgrad, symptomer, eller lignende, for en pasient. [0047] Den farmasøytiske sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for, for eksempel, behandling av sykdommer så som kreft (f.eks. undertrykkelse av funksjoner av gener eller proteiner som blir spesifikt uttrykt i kreftceller). [0048] Foreliggende oppfinnelse vil senere heri bli beskrevet videre spesifikt ved de følgende eksemplene. Det skulle imidlertid bli forstått at omfanget av foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset til de spesifikke eksemplene. Eksempler Eksempel 1: Fremstilling av et dumbbell-formet RNA [0049] '-fosforylerte RNAer som tjener som råmaterialer for dumbbell-formede RNAer ble alle syntetisert på DNA syntetiserer (GeneWorld H8-SE) i samsvar med fosforoamidittmetoden. Beskyttede TBDMS (Proligo Corp.) ble anvendt for RNA amiditter, og kjemisk fosforyleringsreagens (Glen Research Corp.) ble anvendt for '- fosforylering. Avbeskyttelse ble utført ved den ordinære fremgangsmåten, fulgt av PAGE-rensing. Sekvensene av det syntetiserte RNAet er vist i SEKV ID NR: 1 (sense-tråd, 28 mer), SEKV ID NR: 2 (antisense-tråd, 28 mer), SEKV ID NR: 3 (6 mer), og i Figur 2. Dessuten, i RNA-sekvensene vist i Figur 2, er de understrekede sekvensene sekvenser som danner løkkeregionen av et dumbbell-formet RNA. [000] Påfølgende ble enzymatisk reaksjon utført i blandingen av 2 µm RNA dobbeltråd, 2,0 enheter/µl T4 RNA ligase, 0,006 % BSA, 2 % PEG6000, 0 mm Tris-HCl (ph 7,), mm MgCl 2, mm DTT og 1 mm ATP i et totalt volum på 2 µl. [001] Mer spesifikt, ble først, '-fosforylert dobbel-trådet RNA oppløst til 12, µl av en buffer (2 x buffer) som inneholder 0 mm Tris-HCl (ph 7,), mm MgCl 2, mm DTT og 2 mm ATP, ved en konsentrasjon på 4 µm. Løsningen ble varmet ved 6 C i minutter, og så langsomt kjølt til romtemperatur. Påfølgende ble BSA løsning, PEG6000 løsning og T4 RNA ligase (Takara Bio Inc.) tilsatt for å danne sammensetningen og

8 8 reaksjonsvolumet over. Løsningen ble så inkubert ved 11 C i timer. RNA ble samlet ved etanolutfelling og analysert ved PAGE [002] Prøvene ved hver bane av PAGE i Figur 2 er som følger. Bane 1: blanding av 28-base sense-tråden og 28-base antisense-tråden (markør) Bane 2: 7-base RNA (markør) Bane 3: dumbbell-formet RNA dannet fra 28-base sense-tråden og 28-base antisense-tråden Bane 4: dumbbell-formet RNA dannet fra 6 baser (enkelt-kjede) Bane : 28-base sense-tråd behandlet med RNA ligase (referanse) Bane 6: 28-base antisense-tråd behandlet med RNA ligase (referanse) [003] Det dumbbell-formede RNAet ved Bane 4 ble produsert ved å syntetisere en enkelt kjede som har 6 baser (SEKV ID NR: 3), som danner en stammeregion og hårnål løkkeregion, og ligere det første nukleotidet og siste nukleotidet med T4 ligase. [004] Båndet omgitt av en sirkel på Bane 3 representerer det dumbbell-formede RNAet produsert ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, og utbyttet var omtrent 80 %. Det dumbbell-formede RNAet ved Bane 4 hadde et utbytte på omtrent % eller mindre. Eksempel 2: Undersøkelse av stammelengden av det dumbbell-formede RNAet [00] RNAer representert ved SEKV IDer NR: 4 til 13 ble syntetisert ved DNA syntetisereren over. SEKV IDer NR: 4 og danner et dobbel-trådet RNA som danner 18 basepar (sirna-1), SEKV IDer NR: 6 og 7 danner et dumbbell-formet RNA som har stammelengde på 19 baser (Db-19), SEKV IDer NR: 8 og 9 danner et dumbbellformet RNA som har stammelengde på 23 baser (Db-23), SEKV IDer NR: og 11 danner et dumbbell-formet RNA som har stammelengde på 27 baser (Db-27) og SEKV IDer NR: 12 og 13 danner et dumbbell-formet RNA som har stammelengde på 31 baser (Db-31) (Figur 3). [006] En enzymatisk reaksjon ble utført i sammensetningen av 2 µm RNA dobbeltråd, 1,0 enheter/µl T4 RNA ligase, 0,006 % BSA, 2 % PEG6000, 0 mm Tris-HCl (ph 7,), mm MgCl 2, mm DTT og 1 mm ATP i et reaksjonsvolum som spenner fra 1, til 2, ml. [007] Mer spesifikt ble '-fosforylert dobbel-trådet RNA oppløst i en buffer (2 x buffer, halve mengden av endelig reaksjonsløsning) som inneholder 0 mm Tris-HCl (ph 7,), mm MgCl 2, mm DTT og 2 mm ATP, ved en konsentrasjon på 4 µm. Løsningen ble varmet ved 6 C i minutter og så langsomt kjølt til romtemperatur. Påfølgende ble BSA løsning, PEG6000 løsning og T4 RNA ligase (Takara Bio Inc.) tilsatt for å danne sammensetningen og reaksjonsvolumet over. Løsningen ble så inkubert ved 11 C i timer. [008] RNA ble samlet ved alkoholutfelling fra reaksjonsløsningen, og de cykliserte produktene ble isolert ved anvendelse av PAGE. Bånd som inneholder målene ble visualisert ved UV skyggeleggingsmetoden, skåret ut, knust til små biter, og ekstrahert 3 ganger med 4 ml av en elueringsbuffer (0,2 M NaCl, 1 mm EDTA (ph 8,0)). Ekstrakten ble avsaltet med en Sep-Pak patron (eluert med 6 ml 0 % acetonitril i vann), kondensert med en sentrifugalfordamper, og videre underkastet alkoholutfelling i nærværet av ammoniumacetat. Målene ble kvantifisert ved å måle UV spektra. [009] To enheter av ColdShock-DICER (Takara Bio Inc.) ble tilsatt til 2 µg av hver av de dumbbell-formede RNAene over i en buffer som inneholder mm Tris-HCl (ph 8,), mm NaCl og 2, mm MgCl 2 (reaksjonsvolum: µl), og den resulterende løsningen ble så inkubert ved 37 C. Etter 1, 6 og 18 timer, ble 3 µl av reaksjonsløsningen samlet som en prøve. Hver prøve ble blandet med 2 µl 1 mm EDTA løsning for å

9 9 terminere den enzymatiske reaksjonen. Disse ble så analysert ved nativ PAGE ( % PAGE, 1 x TBE) (etter å ha blitt farget med 1 x SYBR Green I, prøvene ble avbildet og kvantifisert på en BioRad Molecular Imager FX). 1 [0060] Figur 4 viser PAGE av hvert dumbbell-formede RNA. Som en kontroll, ble en spaltingsreaksjon ved anvendelse av det dobbel-trådede RNA før en "dumbbelling"-reaksjon som et substrat undersøkt ved den samme fremgangsmåten. Som et resultat, forløp spaltingsreaksjonen av Db-19 omtrent % etter 1 time, og produksjonen av dobbel-trådede RNAer med baser lengde ble bekreftet. Spaltingsfragmentene av Db-19 i området på baser opprettholdt nesten det samme konsentrasjonsnivået etter 6 og 18 timer. I motsetning, var nesten 0 % av kontrollen som inkluderer 19-basepar lineær kjede ("Liner") spaltet etter 1 time, og dobbel-trådede RNAer med baser lengde ble observert. Påfølgende ble dobbel-trådede RNAer av produktet brutt ned og forsvant over tid. Med Db-23, var omtrent 8 % spaltet etter 1 time, og dobbel-trådede RNAer med baser lengde ble produsert. Det ble bekreftet at ettersom stammelengden øker, øker spaltingshastigheten etter 1 time til % og % i henholdsvis Db-27 og Db-31. Etter 18 timer, forblir omtrent 7 % av Db-19 intakt mens Db-31 forsvant fullstendig. Fra disse resultatene, ble det avslørt at de dumbbell-formede RNAene med kortere stammelengde er mer stabile overfor et enzym. Eksempel 3: RNA interferensvirkning av det dumbbell-formede RNAet 2 [0061] RNA interferensvirkning av de dumbbell-formede RNAene over (Db-19, Db-23, Db-27 og Db-31) ble evaluert ved et inhiberingseksperiment av ekspresjonen av ildflueluciferase reportergen pgl3. [0062] NIH 3T3 celler (Riken Cell Bank) ble dyrket i DMEM (GIBCO) medium som inneholder % FCS ved 37 C i % CO 2, og en 0 µl alikvot av kulturen ble inokulert til hver brønn av en 96-brønnplate ved en konsentrasjon på 1,6 x 4 celler/brønn. Prøven ble videre dyrket ved 37 C i % CO 2 i 39 timer for å gi omtrent 70 % konfluens. Cellene ble så kotransfektert med 2 typer plasmidvektorer (pgl3-kontroll og prl-tk (for intern standard), fra Promega Corp.) og hver type av RNAer, ved anvendelse av transfeksjonsreagensen GeneSilencer (Genlantis Inc.) i samsvar med protokollen vedlagt transfeksjonsreagensen. Konsentrasjonsbetingelsene på tidspunktet for transfeksjon er som følger. [0063] 0,2 µg pgl3-kontroll/ 0,02 µg prl-tk/ 2 nm RNA (sluttvolum 0 µl) GeneSilencer 1 µl DMEM medium 2 µl sirna fortynnet løsning 2, µl DMEM medium 1 µl RNA ( pmol/µl) 0, µl pgl3-kontroll (1 µg/µl) 0,2 µl prl-tk (0,1 µg/µl) 0,2 µl 44,4 µl 3 [0064] Etter transfeksjon, ble kulturen inkubert ved 37 C i % CO 2 i 4 timer. Ett hundre µl DMEM medium som inneholder % serum ble så tilsatt til hver brønn. Etter videre inkubering ved 37 C i timer, ble cellene solubilisert for å kvantifisere ekspresjonsnivået av luciferase ved anvendelse av Dual-luciferase Reporter Assay System (Promega Corp.) i samsvar med den vedlagte protokollen (betingelser: mengden reagens µl, forsinkelsestid 2 sekunder, avlesingstid sekunder. Utstyr: Wallac ARVO SX 14 Multilabel teller). [006] For sammenligning, ble det evaluert en kontroll (bare buffer) ved den samme fremgangsmåten. Fluorescensintensiteten av ildflue luciferase ble korrigert for fluorescensintensiteten av renilla luciferase som

10 en intern standard. Resultatene er vist i Figur. Etter 24 timer, blant de dumbbell-formede RNAene, viste Db- 23 den høyeste aktiviteten, og utviste en inhiberingsvirkning så lav som 0,24. Fra disse resultatene ble den mest foretrukne dobbel-tråd lengden satt til 23 baser. Eksempel 4: Holdbarhet av RNA interferensvirkning [0066] Holdbarhet av RNA interferensvirkning av Db-23 og sirna-1 ble sammenlignet [0067] NIH 3T3 celler ble dyrket i Dulbeco's modifiserte Eagles medium (DMEM, Gibco) supplementert med % føtalt kalveserum (FCS, Invitro/Gibco) i et % CO 2 -fuktet kammer. timer før transfeksjon ved omkring 70 % konfluent, ble celler sådd i 96-brønnplater ved en tetthet på 1,6 x 4 celler per brønn (0 µl). Kotransfeksjon av reporterplasmider og RNA ble utført med GeneSilencer (Gen Therapy systems, Inc.) som beskrevet ved produsenten for sammenhengende cellelinjer. Per brønn ble det påført 16 ng/µl eller 1,6 ng/µl pgl3-kontroll (Promega Corp.), 1,6 ng/µl prl-tk (Promega Corp.) og 2 nm RNA formulert med transfeksjonsreagensen (0 µl). Etter 4 h inkubering, ble 0 µl % FCS i DMEM tilsatt. For en vedvarende inkubering lenger enn 3 dager, ble mediet erstattet etter behov. Luciferaseekspresjon ble overvåket etter 24 timer, 72 timer, og 1 timer med Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega Corp.) i henhold til instruksjonene tilveiebrakt på Wallac ARVO SX 14 Multilabel Counter (Perkin-Elmer, Inc.) (Fig. 6). En prøve uten RNA ble anvendt som en kontroll. [0068] Db-23 og sirna-1 viste begge nesten likt nivå av luciferaseaktivitet etter 24 timer. Etter 1 timer, viste imidlertid Db-23 en høyere genekspresjon undertrykningsvirkning. Fra disse resultatene, ble det vist både den langsomt-frigivende virkningen og langtids aktiveringsvirkningen av det dumbbell-formede RNAet. Eksempel : Stabilitet av det dumbbell-formede RNAet i humant serum [0069] Stabilitet av Db-23 og sirna i humant serum ble sammenlignet. 4 µl pre-annealed dsrna (sirna-1, µm) eller dumbbell RNA (Db-23, µm) i annealingbuffer (0 mm kaliumacetat, mm HEPES-KOH (ph 7,4), 2 mm magnesiumacetat) ble blandet med 32 µl PBS, 4 µl normalt humant serum (Chemicon International, Inc.), inkubert ved 37 C. Alikvot ( µl) ble tatt etter 0,, 1, 1,, 3, 8 og timer. Reaksjonen ble analysert ved 1 % naturlig PAGE, farget med SYBR Green I og visualisert med Molecularlmager FX (BioRad Laboratories, Inc.). [0070] Som et resultat, var opp til 0 % av sirna brutt ned etter 3 timer, mens 80 % eller mer av Db-23 fremdeles var tilbake etter 3 timer, og 70 % eller mer enda etter 8 timer. Derfor kunne høy stabilitet av Db-23 in vivo bli forventet. Industriell anvendbarhet [0071] Foreliggende oppfinnelse kan bli anvendt som et nukleinsyremolekyl som kan anvendes til levende organismer og kan produsere molekyletmedethøyt utbytte. SEKVENSLISTER 4 0 [0072] <1> RIKEN Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Hayashi Kasei Co., Ltd. <1> Et enkelt-kjede sirkulært RNA og fremgangsmåte for fremstilling av dette <1> PH-342PCT <> JP 07-14

11 <> <160> 13 <170> PatentIn version 3.4 <2> 1 <211> 28 <2> <0> 1 gagacuuacg cugaguacuu cgauucaa 28 <2> 2 <211> 28 <2> <0> 2 gagaucgaag uacucagcgu aaguucaa 28 <2> 3 <211> 6 <2> <0> 3 gagacuuacg cugaguacuu cgauucaaga gaucgaagua cucagcguaa guucaa 6 <2> 4 <211> 21 <2> <0> 4 gugcgcugcu ggugccaacu u 21 <2> <211> 21 <2> <0> guuggcacca gcagcgcacu u 21 <2> 6 <211> 28 <2> <0> 6 28

12 gagagugcgc ugcuggugcc aacuucaa 28 <2> 7 <211> 28 <2> <0> 7 28 gagaguuggc accagcagcg cacuucaa 28 <2> 8 <211> 32 <2> <0> 8 32 gagaagugcg cugcuggugc caacccuuuc aa 32 <2> 9 <211> 32 <2> <0> 9 gagaagggug ggcaccagca gcgcacuuuc aa 32 <2> <211> 36 <2> <0> gagaaaagug cgcugcuggu gccaacccua uuucaa 36 <2> 11 <211> 36 <2> <0> 11 gagaauaggg uuggcaccag cagcgcacuu uuucaa 36 <2> 12 <211> <2> <0> 12 gagaucaaag ugcgcugcug gugccaaccc uauucuucaa <2> 13

13 13 <211> <2> <0> 13 gagagaauag gguuggcacc agcagcgcac uuugauucaa

14 14 P a t e n t k r a v Enkelt-kjede sirkulært RNA som har en vedvarende eller langsomt-frigivende RNA interferensvirkning, karakterisert ved at det enkelt-kjede sirkulære RNAet omfatter en sense-tråd-sekvens, en antisense-trådsekvens komplementær til sense-tråd-sekvensen, identiske eller forskjellige to løkkesekvenser mellom sensetråden og antisense-tråden, som forbinder begge trådene, hvori sense-tråden og antisense-tråden er paret for å danne en stamme, og hvori hver av de to løkkesekvensene er 6 til 9 nukleotider i lengde. 2. Enkelt-kjede sirkulært RNA ifølge krav 1, hvori ekspresjonen av et mål-rna er 0,4 eller mindre 24 timer etter introduksjon av det enkelt-kjede sirkulære RNAet til eukaryotiske celler, sammenlignet med kontrollceller som har ekspresjonsnivå av mål-rnaet satt til Enkelt-kjede sirkulært RNA ifølge krav 1 eller 2, hvori 70 % eller mer derav er bevart etter 8 timer i humant serum. 4. Fremgangsmåte for fremstilling av det enkelt-kjede sirkulære RNAet ifølge ett av kravene 1 til 3, som omfatter å syntetisere en sense-tråd og en antisense-tråd, begge omfatter en nukleotidsekvens med uparede nukleotider ved ' enden og 3' ende, og samtidig ligere nukleotidet ved ' enden av nukleotidsekvensen med uparede nukleotider i sense-tråden, med nukleotidet ved 3' enden av nukleotidsekvensen med uparede nukleotider i antisense-tråden, og vice versa, ved anvendelse av en ligase, hvori nukleotidsekvensen med uparede nukleotider ved ' enden av sense-tråden og nukleotidsekvensen med uparede nukleotider ved 3' enden av antisense-tråden er bundet til hverandre for å danne en løkke, nukleotidsekvensen med uparede nukleotider ved 3' enden av sense-tråden og nukleotidsekvensen med uparede nukleotider ved ' enden av antisense-tråden er bundet til hverandre for å danne en løkke, og sensetråden og antisense-tråden er paret for å danne en stamme.. Fremgangsmåte ifølge krav 4, som videre omfatter å fosforylere hver ' ende av nukleotidsekvensen med uparede nukleotider i sense-tråden og nukleotidsekvensen med uparede nukleotider i antisense-tråden. 6. Fremgangsmåte ifølge krav 4 eller, hvori løkkesekvensene er identiske med eller forskjellige fra hverandre. 7. Fremgangsmåten ifølge ett av kravene 4 til 6, hvori stammelengden er 19 til 31 nukleotider Fremgangsmåte for å undertrykke ekspresjon av et gen som koder for et protein in vitro, som omfatter å introdusere det enkelt-kjede sirkulære RNAet ifølge ett av kravene 1 til 3 til humant-avledede celler, og svekke et mål-rna ved det enkelt-kjede sirkulære RNAet for å inhibere translasjon av mål-rnaet til proteinet på en vedvarende måte. 9. Fremgangsmåte for å undertrykke ekspresjon av et gen som koder for et protein, som omfatter å introdusere in vitro det enkelt-kjede sirkulære RNAet ifølge ett av kravene 1 til 3 til celler av et ikke-humant dyr eller plante, og svekke et mål-rna ved det enkelt-kjede sirkulære RNAet for å inhibere translasjon av mål- RNAet til proteinet på en vedvarende måte.. Farmasøytisk sammensetning som omfatter det enkelt-kjede sirkulære RNAet ifølge ett av kravene 1 til 3 som en aktiv ingrediens.

15 1 Tegning Fig. 1

16 16

17 17

18 18

19 19

20

21 21