Kontinuasjonseksamen, MEDSEM2/ODSEM2/ERNSEM2 høst 2007 Onsdag 20. februar 2008 kl. 09:00-15:00

Transkript

1 Kontinuasjonseksamen, MEDSEM2/ODSEM2/ERNSEM2 høst 2007 Onsdag 20. februar 2008 kl. 09:00-15:00 A. (18) Psoriasis er en sykdom som viser multifaktoriell arv. 1. Forklar hva som menes med begrepet multifaktoriell arv. Hva karakteriserer multifaktoriell arv? Ved multifaktoriell arv bidrar flere gener (med sine alleler) og miljøfaktorer sammen til fenotypen. Ved multifaktoriell arv viser fenotypen (f. eks. en sykdom) opphopning i familier uten Mendelsk (enkel) arvegang. Multifaktoriell arv finnes ofte ved kvantitative egenskaper (som f.eks. blodtrykk, høyde og IQ). 3. Hva menes med uttrykket genetisk kobling, hvordan påvises dette og hvilken måleenhet brukes? Forklar hvorfor to syntene markører ikke nødvendigvis er koblet. To markører/gener er genetisk koblet hvis de sitter så nær hverandre på samme kromosom at de ofte nedarves som en enhet. Kobling påvises ved analyse av nedarving av markører i familier. Avstanden mellom markører angis i Centimorgan(cM): 1% overkrysning mellom to markører tilsvarer 1 cm. To markører/gener er syntene hvis de sitter på samme kromosom. Hvis avstanden mellom dem er så stor at det ofte forekommer overkrysning mellom dem, vil de nedarves uavhengig av hverandre og er ikke koblet. Ordinær eksamen, MEDSEM/ODSEM/ERNSEM2 vår 2007 Torsdag 17. januar 2008 kl. 09:00-15:00 A.(35) Nylig ble assosiasjonen mellom AKT1 alleler og schizofreni undersøkt i familier ved bruk av SNPs (enkelt-nukleotid polymorfismer, single nucleotide polymorphisms ). Det ble funnet statistisk signifikant assosiasjon mellom schizofreni og en bestemt haplotype av AKT 1. Hva er en genetisk markør? Hva er en SNP? Hva er en haplotype? Genetisk markør: et locus som har to eller flere alleler som kan identifiseres. Det kan være et gen, et restriksjonsenzymsete eller karakteristika ved DNA som tillater påvisning ulike versjoner av et locus (eller dets produkt). Nedarvingen av de ulike markørene kan følges i familier. SNP: En enkelt DNA posisjon som viser variasjon i en populasjon. Den sjeldnest forekommende varianten skal finnes i mer enn 1% av populasjonen. Haplotype: En gruppe tett koblede alleler som sitter på samme kromosomstreng og som vanligvis nedarves som en enhet. 2. Genetisk variasjon bidrar til at vi mennesker er forskjellige. a. Beskriv kort hvordan primærstrukturen av et protein kan endres ved genetisk variasjon. SNP kan gjøre at en aminosyre i en posisjon i et protein hos en person er forskjellig fra aminosyren i samme posisjon hos en annen person. SNP kan gi opphav til prematurt stop-kodon, men proteinet kan likevel være funksjonelt. I tillegg kan man tenke seg at SNP kan påvirke spleise-seter slik at det forekommer alternativ eksonbruk fra person til person. b. Beskriv kort to typer genetisk variasjon som kun vil påvirke konsentrasjonen av genproduktet. 1

2 Konsentrasjonen av genproduktet kan påvirkes av en SNP i regulatoriske regioner (F. eks i promoter, enhancere, seter i transkriptet som påvirker stabilitet, mirna bindingsseter osv). Kopitallssvariasjoner, hvor større segmenter opp til flere hundre kilobaser eller mer, varierer i antall mellom individer i populasjonen. Mange slike segmenter inneholder gener, som da vil variere i kopitall fra person til person, og vil kunne gi opphav til variasjon i mengde genprodukt. (Noen vil kanskje også nevne SNP i mirna gener) Kontinuasjonseksamen med sensorveiledning MEDSEM2/ODSEM2/ERNSEM2 vår 2007 Onsdag 15. august 2007 kl. 09:00-15:00 D. (12) Nylig har et gen (golden) som påvirker de melaninrike stripene i skinnet hos sebrafisker blitt karakterisert. Et lignende gen (kalt SLC24A5) er funnet hos menneske. Analyser av sekvenslikhet har ført til forslag om at de to genene kan være evolusjonært beslektet. 14. Hva mener vi med uttrykket genfamilie? Hvordan oppstår en slik familie? En gruppe nær beslektete gener utgjør en genfamilie (med beslektet menes at genenes DNA-sekvens parvis overstiger 25% likhet, som er den teoretiske gjennomsnittlige likhet ved ubeslektede gener. Enkelte definisjoner av genfamilie krever mer enn 50% identitet mellom aminosyresekvenser). For å kunne utvikle nye gener med nye funksjoner på basis av eksisterende gener er det nødvendig med nye kopier som kan mutere mens originalen fortsetter å ivareta funksjonene den er utviklet/selektert for å ivareta. Fire hovedmekanismer er ansvarlige for å danne kopier av gener: - genduplisering ved ulik overkrysning - replikativ transponering - polyploidi - duplikasjoner av kromosomsegmenter (de to første er de kvantitativt viktigste og de som er spesielt forelest). 15. Hvordan går man frem når man analyserer sekvenslikhet? Forklar kort hvordan vi grafisk kan illustrere slektskapsforholdet mellom medlemmene av en genfamilie. Ved analysene legges sekvensene ved siden av hverandre slik at sekvensene i sin helhet viser størst mulig likhet. Grad av ulikhet mellom sekvensene estimeres så gjennom antall forskjeller mellom sekvensene i forhold til total lengde av sekvensene. (Forskjellige typer endringer kan vektes ulikt, f eks at det gis større straff for insersjoner/delesjoner enn for substitusjoner, og ved sammenlikning av proteinsekvens vektes ulike substitusjoner forskjellig. Dette er ikke undervist og forventes ikke i svaret.) Det evolusjonære slektskapet mellom gener eller organismer illustreres vanligvis ved fylogenetiske trær (dendrogrammer, fylogrammer), som består av streker eller grener som knytter sammen knuter eller noder. Hvert knutepunkt representerer en enhet (gen, organisme eller art) og grenene definerer slektskapet mellom enhetene. Man skjelner mellom indre og ytre knuter. Indre knuter er enheter som eksisterte tidligere i evolusjonen og som har gitt opphav til senere enheter, mens ytre knuter (endene av strekene), er enheter som fortsatt eksisterer eller som er utdødde uten å gi opphav til senere enheter ("dead ends"). 2

3 Studier av humane haplotypekart påviste en polymorfisme i SLC24A5-genet som førte til at aminosyren alanin ble byttet ut med en threonin i posisjon 111 i proteinet. Studier har gitt sterke holdepunkter for at thr-111 varianten er den viktigste faktor som har ført til den lyse hud- og hårfarge som dominerer i vest-europeiske populasjoner. 16. Undersøkelse av polymorfismen i SLC24A5-genet kan gjennomføres ved en PCRbasert analyse. Forklar prinsippene for PCR, og gjør videre rede for hovedtrinnene i metoden du vil benytte for å analysere SLC24A5-polymorfismen. I en kort beskrivelse av PCR ansees følgende å være tilstrekkelig: Polymerase kjedereaksjon (PCR) er en reaksjon som øker mengden av en spesifikk DNA sekvens. For en PCR tilsetter man DNA polymerase, nukleotider og to oligonukleotider (primere), som binder seg på hver sin DNA-tråd (etter denaturering). Fra primerne, som flankerer sekvensen en vil kopiere, initieres DNA-syntese i retning av bindingsstedet til den andre primeren. Produktet som dannes fungerer som templat når syklusen gjentas. Syklusen gjentas mange ganger (25-35). Mange vil sikkert gi en mer detaljert omtale av prinsippene bak PCR. Analysemetoden som vil være nærliggende å forklare er PCR-RFLP, slik den ble gjort på kurset: Restriksjons-endonukleaser er enzymer som gjenkjenner og kutter dobbelttrådig DNA i spesifikke sekvenser. Hvis det forekommer variasjoner i sekvensen som avgjør om en restriksjon-endonuklease vil kutte eller ikke, vil dette kunne påvises som en restriksjons fragment lengde polymorfisme (RFLP). I dette tilfellet vil et område av SLC24A5-genet amplifiseres vha. PCR, og RFLP analyseres ved at man tilsetter restriksjonsendonukleasen til PCR-produktet. Resultatet av reaksjonen kan avleses ved gelelektroforese. Polymorfismen kan også påvises for eksempel ved sekvensering av PCR-produktet. 17. Enzymet tyrosinase er sentralt i produksjonen av melanin fra tyrosin. Mange ulike mutasjoner i genet som koder for tyrosinase er funnet å føre til albinisme. De fleste av disse mutasjonene er missense-, men det er også vist nonsense- og rammeskiftmutasjoner. Forklar hvordan de ulike mutasjonene kan påvirke genproduktet. Missense-mutasjon gir utskiftning av én aminosyre med en annen; ellers uendret aminosyresammensetning. Endret primærsekvens vil kunne påvirke proteinets funksjon. Nonsense-mutasjon kan gi introduksjon av prematurt stoppkodon, som resulterer i et kortere protein. Rammeskiftmutasjon vil gi endret primærsekvens fra det punktet mutasjonen er lokalisert og vil ofte i tillegg innføre et stoppkodon i den nye leserammen. Ordinær eksamen, MEDSEM2/ODSEM2/ERNSEM2 vår 2007 Torsdag 21. juni 2007 kl. 09:00-15:00 Ingen relevante oppgaver, så vidt jeg kunne se Kontinuasjonseksamen i Medisin, Odontologi og Ernæring Andre semester (cellebiologi) kull V06 Onsdag 21/2-2007, Kl

4 Det ble gjennomført en RFLP analyse av et PCR-produkt fra GJB6 genet hvor man brukte restriksjonsenzymet HgaI. Resultatet av denne PCR-RFLP undersøkelsen er skjematisk vist i figuren under. Det ble gjennomført en RFLP analyse av et PCR-produkt fra GJB6 genet hvor man brukte restriksjonsenzymet HgaI. Resultatet av denne PCR-RFLP undersøkelsen er skjematisk vist i figuren under. 3. Redegjør for prinsippene ved en PCR-RFLP undersøkelse. Restriksjons-endonukleaser er enzymer som gjenkjenner og kutter dobbelttrådig DNA i spesifikke sekvenser. Det er vist at enkelte steder i genomet vil det forekomme variasjoner i sekvensen som avgjør om en restriksjon-endonuklease vil kutte eller ikke. Dette kaller vi en restriksjons fragment lengde polymorfisme (RFLP). Når en RFLP analyseres ved at man tilsetter restriksjonsendonukleasen til et PCR produkt (i motsetning til f.eks. vanlig genomisk DNA) kalles det PCR-RFLP. Studentene forventes å også gi en kort beskrivelse av hva PCR er uten at det forventes at de gir en detaljert gjennomgang av dette. Følgende definisjon anses tilstrekkelig. Polymerase kjede reaksjon (PCR) er en reaksjon som øker mengden av en spesifikk del av DNA. For en PCR tilsetter man DNA polymerase, nukleotider og to oligonukleotider (primere), som binder seg på hver sin DNA-tråd (etter denaturering). Primerene initierer syntese i retning av den andres bindingssted. Derfor må bindingsstedene for de to primerene være lokalisert i nærheten av hverandre. Produktet som dannes kan fungere som templat når man gjentar syklusen. Syklusen gjentas mange ganger (25-35). Oligonukleotidene bestemmer hvilken spesifikk del av DNA som øker i mengde. Mange vil sikkert gi en mer detaljert omtale av prinsippene bak PCR. 4. Hvilken informasjon kan du få fra figuren? Hvilken konklusjon kan du trekke ut fra resultatet vist i figuren? PCR-fragmentet på 266bp lar seg kutte i de tre prøvene til høyre på figuren. Disse individene er heterozygote for allelet som har restriksjonssetet siden både ukuttet og kuttet PCR produkt er tilstede på gelen. Prøven til venstre på figuren er homozygot for allelet som ikke har restriksjonssetet. 5. En C til T punktmutasjon kan også påvises ved DNA sekvensering. Gjør rede for hovedtrinnene i en DNA sekvenseringsanalyse. Det forventes at studentene beskriver hovedtrinnene i Sanger dideoxy-metoden. Metoden benytter: 4

5 Enkelttrådig DNA (templat) Primer Deoxyribonukleosid-trifosfater Dideoxyribonukleosid-trifosfater (ddntp); mangler hydroxyl-gruppe på 3 -C-atom. DNA polymerase Buffer Reaksjonen settes opp i 4 rør med henholdsvis ddgtp, ddatp, ddttp, ddctp. Forlengelsen av den nysyntetiserte DNA-tråden stopper når en ddntp inkorporeres. Produktene fra de 4 reaksjonene separeres ved elektroforese. Fragmentene kan påvises ved hjelp av radioaktiv eller fluorescence-merking av en av deoxyribonukleosid-trifosfatene. I hver enkelt rad ( lane ) har vi bånd som slutter på en bestemt nukleotid. Ved å lese båndene fra bunnen av gelen og oppover vil man kunne bestemme DNA-sekvensen i den nylagde DNA-tråden. DNA-sekvensering gjøres i dag automatisk i DNA-sekvenserings-maskiner. Hovedprinsippet er fortsatt bruk av dideoxy-metoden Andre semester (cellebiologi) kull V06 Torsdag 18/1-2007, kl Ingen oppgaver. Ingen oppgaver Kontinuasjonseksamen i Medisin, Odontologi og Ernæring Andre semester (cellebiologi) kull H05 Onsdag 16/8-2006, Kl Embedseksamen i Medisin, Odontologi og Ernæring Andre semester (cellebiologi) kull H05 Torsdag 15/6-2006, Kl B (21) Hos en pasient med kreft i bukspyttkjertelen gjorde man en RFLP analyse av et PCR-produkt fra et Ras-gen hvor man brukte restriksjonsenzymet PstI. Resultatet av denne PCR-RFLP undersøkelsen analysert på DNA isolert fra henholdsvis blod og svulstvev er skjematisk vist i figuren. Firkantene øverst viser brønnene i agarosegelen og elektroforeseretningen er fra topp mot bunn. Bp=basepar. 9. Redegjør for prinsippene ved en PCR-RFLP undersøkelse og hva en slik undersøkelse kan brukes til. Hvilken informasjon får du fra gelbildet? Hva er PCR-RFLP? 1. Hva er PCR-RFLP? Restriksjons-endonukleaser er enzymer som gjenkjenner og kutter dobbelttrådig DNA i spesifikke sekvenser. Det er vist at enkelte steder i genomet vil det forekomme variasjoner i sekvensen som avgjør om en restriksjonendonuklease 5

6 vil kutte eller ikke. Dette kaller vi en restriksjons fragment lengde polymorfisme (RFLP). Når en RFLP analyseres ved at man tilsetter restriksjonsendonukleasen til et PCR produkt (i motsetning til f.eks. vanlig genomisk DNA) kalles det PCR-RFLP. Studentene forventes å også gi en kort beskrivelse av hva PCR er uten at det forventes at de gir en detaljert gjennomgang av dette. Følgende definisjon anses tilstrekkelig. Polymerase kjede reaksjon (PCR) er en reaksjon som øker mengden av en spesifikk del av DNA. For en PCR tilsetter man to oligonukleotider (primere), som binder seg på hver sin DNA-tråd (etter denaturering), sammen med DNA polymerase og nukleotider. Primerene initierer syntese i retning av den andres bindingssted. Derfor må bindingsstedene for de to primerene være lokalisert i nærheten av hverandre. Produktet som dannes kan fungere som templat når man gjentar syklusen. Syklusen gjentas mange ganger. Oligonukleotidene bestemmer hvilken spesifikk del av DNA som øker i mengde. Mange vil sikkert gi en mer detaljert omtale av prinsippene bak PCR. Hva kan metoden brukes til? Metoden kan brukes til å påvise polymorfismer og mutasjoner. Polymorfisme- og mutasjonsbestemmelse kan brukes til bl.a. genetisk diagnostikk, identifisering (rettsmedisin) og til å gentypebestemme genetiske markører i koblingsstudier. Informasjon fra gelbildet: PCR-fragmentet fra svulstvevet inneholder DNA som lar seg kutte med restriksjonsenzymet. Ved sammenligning av de to sporene i gelbildet kan det slås fast at det mutante allelet kun detekteres i svulstvevet. En somatisk mutasjon i svulstvevet kan forklare dette funnet. 10. PCR-RFLP undersøkelsen viste i dette tilfellet at det var en mutasjon i Rasgenet i svulstvevet. Mutasjonen fører til at en G er blitt til en T i en proteinkodende del av Ras-genet. På hvilke måter kan dette påvirke aminosyresammensetningen av Rasproteinet? Mutasjonen kan være uten effekt på genproduktet (et kodon endres til et annet kodon som koder for samme aminosyre) = sense mutasjon. Mutasjonen kan føre til at en aminosyre byttes ut med en annen i proteinet = missense Mutasjon. Mutasjonen kar føre til et prematurt stop-kodon. Nonsense mutasjon I tillegg kan man tenke seg at mutasjonene kan føre til endringer av spleise-seter = Spleisemutasjoner Ingen oppgaver Kontinuasjonseksamen i Medisin, Odontologi og Ernæring Andre semester (cellebiologi) kull V05 Onsdag 15/2-2006, Kl Torsdag 12/1-2006, Kl Hvilken arvegang har FTD3 i denne familien? Begrunn svaret. 6

7 Arvegangen er autosomal dominant. Autosomal fordi genet sitter på kromosom 3. Kriterier for autosomal dominant arv er: Sykdommen finnes i hver generasjon stemmer her En affisert har 50% risiko for å få affisert avkom her: 10 affiserte:16 friske (ikke signifikant forskjellig fra 13:13) Ingen kjønnsforskjell i forekomst av tilstanden - her 6 kvinner og 5 menn 2. Hva er en genetisk markør? Et locus som har alleler som klart kan identifiseres. Det kan være et gen, et restriksjonsenzymsete eller karakteristika ved DNA som tillater ulike versjoner av et locus (eller dets produkt) å bli skilt fra hverandre og som kan følges i familier. 3. Hva er en mikrosatellittmarkør? Et polymorft locus som består av et varierende antall tandemrepeterte bi-, tri- eller tetranukleotideenheter. De forskjellige allelene har ulikt antall repitisjoner av nukleotideenheten. 4. Markørene definerer haplotyper. Hva er en haplotype? En gruppe tett koblede alleler som sitter på samme kromosomstreng og som vanligvis nedarves som en enhet. 2. semester Cellebiologi Kull H-04 Utsatt prøve 17. august 2005 kl Hva menes med uttrykket genetisk kopling, hvordan påvises dette og hvilken måleenhet brukes? Gener på ett kromosom er koplet hvis de segregerer sammen i meiose i mer enn 50% av tilfellene. Dette undersøkes enten ved genetiske analyser av allele varianter av genene i foreldre og avkom, evt hos et individ sammen med enkeltkjønnsceller fra individet. Måleenheten er cm (centimorgan), der 1 cm svarer til 1 % overkrysning. 15. Uttrykket synteni brukes i genetikken på to ulike måter. Angi minst en av disse. Den klassiske genetiske definisjonen av synteni er at to loci ligger på samme kromosom, uansett om de ligger nær hverandre (og er koplet) eller så langt fra hverandre at de ikke er koplet. Begrepet brukes nå også i stor utstrekning ved sammenlikning av genomer mellom ulike arter, og betyr i denne sammenheng at grupper av samsvarende (ortologe) gener ligger samlet i begge artene. 16. Hva betyr i denne forbindelse uttrykkene nedstrøms, genetisk polymorfisme, missense-mutasjon og stille (stum) mutasjon? - Nedstrøms betyr videre i den retning RNA-polymerasen avleser genet. - Genetisk polymorfisme betyr tilstedeværelse av to eller flere alleler av et gen i en populasjon, der minst to alleler har en frekvens på mer enn 1% (påvises ved PCR, southernblotting eller (mikro-)sekvensering. - Missense-mutasjon - mutasjon i kodende region som gir endring av kodet aminosyre. - Stille (stum) mutasjon - mutasjon i kodende region som ikke gir endring av kodet aminosyre. 7

8 17. Hva er koplingsulikevekt? Koplingsulikevekt (linkage disequilibirium - LD) betyr at hyppigheten av kombinasjoner av alleler for koplede loci (haplotyper) avviker fra det man forventer å finne ved tilfeldig (random) assosiering. Dersom vi har locus A og B med allelene A1/A2 og B1/B2, har vi kombinasjonsmulighetene (haplotypene) A1B1, A1B2, A2B1 og A2B2. Dersom hyppigheten av hvert enkelt allel er 0.5, er forventet hyppighet av hver haplotype 0.25, gitt tilfeldig assosiering. (Med hyppigheten p og q for hhv allel 1 og 2, blir generelt forventede hyppigheter pa1 pb1, pa1 qb2, qa2 pb1 og qa2 qb2). Koplingsulikevekt betyr statistisk signifikant avvik fra de forventede verdiene. (Koplingsulikevekt kan skyldes at mutasjonene som gir opphav til allelene er relativt nylige, at individene vi undersøker ikke er et tilfeldig utvalg av populasjonen, eller at det er seleksjon for (eller mot) visse kombinasjoner av alleler.) 18. Angi mulige mekanismer for hvordan mutasjoner i ikke-kodende region av et gen kan påvirke funksjonen av genet. Vanligst er mutasjoner i promotorregion eller mer fjerntliggende cis-regulatorelementer, som påvirker transkripsjonshyppigheten, og mutasjoner i introner som påvirker normal spleising (f eks mutasjoner i spleisesetene på overgangen til eksoner, evt mutasjoner lenger inne i introner som gir opphav til kryptiske spleiseseter). Vi kan også ha mutasjoner i 5 -UTR og 3 - UTR (f eks i polyadenyleringsetet) som påvirker levetiden eller translasjonshyppigheten til mrna. (Vi kan videre ha mutasjoner i DNA langt fra genet som påvirker pakking og utfolding av DNA og dermed tigjengeligheten for RNA-polymeraser, og vi kan ha mutasjoner for transaktiverende regulatorelementer for et gen, men det forventes ikke svart her ettersom oppgaven er begrenset til mutasjoner i delene av DNA definert som tilhørende genet.) 2. semester (Cellebiologi) kull H juni 2005 kl Hva betyr uttrykket 1p36.3? Lokalisering på et kromosom; kromosom 1, korte arm, bånd Gitt opplysningene ovenfor, hvilken type kreftgen er mest sannynlig lokalisert til 1p36.3-p36.2? Siden dette er en delesjon, er det nærliggende tenke seg at kreftgenet er et tumorsuppressorgen. 14. Gi en kort oversikt over de ulike strukturelle kromosomfeil. A. Translokasjon: utbytting av del av et kromosom til et annet (vanligvis) ikke homologt kromosom. To typer: Resiproke - bruddsteder på kromosomarmene, og Robertsonske brudd i (eller nær) sentromerene på to akrosentriske kromosomer med tap av de korte armene. B. Delesjon: tap av deler av kromosomer, enten på enden av en kromosomarm (terminale delesjoner), eller inne i kromosomarmen (interstitielle delesjoner) C. Duplikasjon: et kromosomområde finnes to ganger. D. Inversjon: et segment av et kromosom er snudd. Kalles perisentrisk hvis sentromeren finnes i området, parasentrisk hvis sentromeren ikke er inkludert. 8

9 E. Isokromosom: et kromosom hvor en arm er duplisert slik at den danner to armer av like lengde med de samme loci i omvendt rekkefølge. Den andre armen mangler. F. Ringkromosom: et kromosom der telomerene på begge kromosomarmer mangler, og de brukne armene er bundet sammen slik at det dannes en ring. G. Markørkromosom: et veldig lite uidentifisert kromosom, som vanligvis finnes i tillegg til de normale kromosomene. H. Insersjon: Ikke-resiprok translokasjon, der et segment av et kromosom er overført til et ikke-homologt kromosom. Studentene bør som et minimum kjenne til A D. 15. Hvorfor viser nevroblastom autosomal dominant arv med redusert penetrans i slike familier? Ved familiært nevroblastom er delesjonen nedarvet, og man har dermed en predisposisjon for kreft. Dersom det også oppstår en mutasjon i tumor suppressorgenet på det homologe kromosomet, vil personen få nevroblastom. Sykdommen vil derfor oppfattes som autosomal dominant, fordi 50% av barna til en syk person arver delesjonen. Vi får redusert penetrans fordi ikke alle som har arvet delesjonen også får en mutasjon i tumor suppressorgenet på det homologe kromosomet. 16. En vanlig brukt teknikk i denne forbindelsen er undersøkelse av svulstens mrnaekspresjonsmønster ved mikromatriser. Gjør rede for hva denne metoden går ut på og hva som skiller den fra northern-blott (det forventes ikke detaljer om northern-blottteknikken). Ved northern-blott blottes mrna over til membran etter separering ved elektroforese og mrna påvises ved hybridisering med merket probe. Ved mikromatriser er det derimot probene som festes til den faste overflaten (membran eller dekkglass). Probene festes punktvis (dots) i et rutenett, derav uttrykket matrise. Man kan så få et bilde av mrnaekspresjonsmønsteret i en celle ved å se hvilke ruter mrna fester seg til (det er da ikke noe steg med elektroforese av mrna). Vanligvis undersøker man ikke mrna direkte, men reverstranskriberer det til cdna, som blir merket radioaktivt eller med fluoresecerende markør. Man gjennomfører så hybridisering (prinsipielt på tilsvarende måte som ved northern- (og Southern-) blott). I motsetning til northern-blott kan man med dott-blott få undersøkt ekspresjon av flere gener samtidig, og med mikromatriser et meget stort antall gener (ofte mange tusen). Embedseksamen i Medisin, Odontologi og Ernæring Andre semester (cellebiologi) kull V04 Onsdag 16/2-2005, Kl Beskriv prinsippet for PCR (polymerase kjedereaksjonen). PCR-analyse innebærer mangfoldiggjøring av en DNA-streng slik at man kan identifisere størrelsen av DNA-strengen og basesekvensen i den. Ved å konstruere (syntetisere) oppstrøms og nedstrøms "primere" (små DNA-biter) inneholdende baser, vil man kunne oppnå spesifisitet for mangfoldiggjøring av en enkelt DNA-streng (genomisk DNA eller cdna). Reaksjonen innebærer at man tilsetter primerne i overskudd slik at de plasserer seg på steder i DNA-strengen med komplementære sekvenser. Dette foregår ved ca 60 C (annealing) og danner utgangspunktet for start og stopp for en varmestabil DNA polymerase. Polymeriseringen foregår gjerne ved 72 C. Smelting av DNA til enkelttrådig produkt foregår ved høy temperatur (94 C) slik at primerne igjen kan binde seg til DNAtråden. Mangfoldiggjøringen av DNA strengen krever fra rundt sykler med annealing, 9

10 polymerisering og smelting. Produktet kan deretter identifiseres på gel og/eller sekvenseres. PCR-reaksjonen krever også tilstedeværelse av Mg eller Mn for at polymerasen skal være aktiv. 8. Forklar prinsippet bak DNA-sekvensering. Det forventes beskrivelse av manuell DNA-sekvensering ved hjelp av Sanger dideoksymetoden. Dette er en enzymatisk basert metode som benytter seg av spesielt modifiserte nukleotider, dideoksynukleotider. Vanlige nukleotider har en OH-gruppe i 3' posisjon på riboseringen. DNA polymeraser syntetiserer DNA i 5' --> 3' retning, d.v.s. at DNA-kjeden vokser ved at DNA polymerasen henger på ett nytt nukleotid ved å danne en fosfodiesterbinding med OH-gruppe i 3' posisjon. Hvis en DNA polymerase inkorporerer et modifisert nukleotid som ikke har OH-gruppe i 3' posisjon, vil DNA-syntesen termineres. Sanger-metoden for sekvensering av DNA benytter seg av 4 ulike dideoksy-nukleotider, ddatp, ddctp, ddgtp, ddttp, videre standard deoksynukleotider, en DNA polymerase samt en liten enkeltrådet DNA-primer som fungerer som initieringspunkt for DNA-syntesen. Ved å lage en definert nukleotidmiks som inneholder alle de fire vanlige nukleotidene pluss et dideoksynukleotid, vil en DNA polymerase produsere DNA-fragmenter av ulik lengde, avhengig om DNA polymerasen inkorporerte ddntp-nukleotidet sent eller tidlig i syntesen. Alle DNA-molekylene vil imidlertid ha det spesifikke dideoksynukleotidet inkorporert helt i 3' enden. Sekvenseringen deles vanligvis opp i 4 reaksjoner (G, A, T og C). Rør merket med G har fått tilsatt ddgtp, rør A er tilsatt ddatp osv. Prøvene kjøres på en polyakrylamidgel, hvor den syntetiserte DNA-tråden blir separert på basis av størrelse. Visualisering av DNA kan bl. annet gjøres ved hjelp av radioaktivt merket datp. Prinsippene ved automatisert DNA sekvensering ble ikke forelest, men en beskrivelse av den vil være like tilfredsstillende som den manuelle metoden. Embedseksamen i Medisin, Odontologi og Ernæring Andre semester (cellebiologi) kull V04 Torsdag 13/1-2005, Kl Ingen relevante oppgaver. 2. semester Cellebiologi Kull H-03 Utsatt prøve 11. august 2004 kl Hva er forskjellene på et cdna-bibliotek og et genomisk bibliotek? Hvordan kan et cdna-bibliotek lages? Det er to hovedtyper av DNA bibliotek, genomiske bibliotek og cdna-bibliotek. cdnabiblioteket gjenspeiler mrna-populasjonen i cellen man renset RNA fra. Dette innebærer at cdna-bibliotek kun inneholder exon-sekvenser fra aktive gener. Genomiske bibliotek inneholder alle genene, exoner, introner, promotere, regulatoriske sekvenser, og DNA fra områdene mellom genene. Konstruksjonen av et cdna-bibliotek kan deles inn i følgende trinn: Isolering av mrna, reverstranskribering av mrna til første tråd cdna ved bruk av enzymet reverstranskriptase og oligo dt primer, behandling med RNaseH (kutter RNA), og syntese av annentråd cdna med DNA polymerase. Så ligering av linker med spesifikt kuttesete på 10

11 endene av cdna, kutting med restriksjonsenzym som kutter i linker, og ligering av cdna over i vektor. Overføre cdna /vektoren til E. coli-celler. SENSORVEILEDNING 2. semester (Cellebiologi) kull H juni 2004 kl OPPGAVE A. De vanlige former for hjerneslag har multifaktoriell arv. 1. Hva menes med at en sykdom har multifaktoriell arv? Ikke-mendelsk arv. Fenotypen bestemmes av flere gener med sine alleler og miljøfaktorer. 2. Hvordan skiller multifaktoriell arv seg fra enkel arv når det gjelder risiko for at slektninger skal få samme sykdom? Ved enkel arv er risikoen for at slektninger skal få en sykdom bare avhengig av allelene i ett gen, slik at risiko for at f.eks barn skal få en tilstand er lik for alle barna i søskenflokken, uavhengig av hvor mange andre i familien som er affisert. Ved multifaktoriell arv vil risikoen for at et individ skal få en tilstand blant annet være avhengig av: antall affiserte slektninger, grad av slektskap til den affiserte og alvorlighetsgraden av sykdommen. Det benyttes empiriske risikotall. I jakten på assosiasjon mellom hjerneslag og PDE4D-genet ble pasienter og friske personer testet for mange forskjellige mikrosatellitter (SSR-er, STR-er) og SNP-er. Det ble funnet koblingsulikevekt (linkage disequilibrium) mellom seks av de testede SNP-ene og forekomst av hjerneslag. 3. Hva er en mikrosatellitt og hva er en SNP? Mikrosatellitt (SSR, STR): Et polymorft locus som har et varierende antall bi-, tri-, eller tetranukleotidenheter. Ulike antall av disse enhetene utgjør de forskjellige allelene. SNP ( Single nucleotide polymorphism ): Polymorfisme som består av variasjon i en base i en DNA sekvens. 4. Hva er sammenhengen mellom genetisk kobling, haplotyper og overkryssing? Genetisk kobling: Gener på ett kromosom er koblet hvis de segregerer sammen i meiose i mer enn 50% av tilfellene. Haplotype: En gruppe alleler på et kromosom som er så tett koblet at de vanligvis nedarves som en enhet. Overkryssing: Resiprokt utbytte av segmenter mellom kromatider av homologe kromosomer i profasen av meiose I. Overkryssing gir rekombinasjon mellom alleler på de homologe kromosomene. En haplotype består derfor av alleler fra gener som er så tett koblet at det ikke (eller svært sjelden) forekommer overkryssing mellom genene. 2. semester Cellebiologi Kull V-03 Utsatt prøve 25. februar 2004 kl , 11

12 Oppgave D Sykdommen diabetes mellitus, type I, der det er mangel på insulin, er forårsaket av degenerasjon av beta-cellene i pankreas. Denne sykdommen viser multifaktoriell (polygen) arv. 15. Hva menes med begrepet multifaktoriell arv? Flere gener med sine alleler samt miljøfaktorer bidrar til fenotypen. 16. Skissér en forklaringsmodell for multifaktoriell arv. Man tenker seg at antall sykdomsdisposisjoner til enkeltindivider er normalfordelt i populasjonen (gjelder dersom det er mange alleler som påvirker fenotypen og ingen av disse dominerer sterkt i forhold til de andre). Bare de personer som har et relativt høyt antall sykdomsdisponerende alleler (over en terskel) får sykdom som skyldes multifaktoriell arv. Miljøfaktorer kan modifisere den rene genetiske predisposisjonen. 12

13 17. Nevn tre faktorer som påvirker risikoen for å få en sykdom som skyldes multifaktoriell arv. Ved multifaktoriell arv benyttes empiriske risikotall. Risiko øker først og fremst med tre faktorer: a) Antall affiserte personer i familien b) Graden av slektskap til en affisert person c) Alvorlighetsgraden av sykdom hos den affiserte. (Dette er forelest det finnes også andre faktorer, som høy heritabilitet av sykdommen, og slektskap med en som er affisert av det kjønn som mest sjelden har sykdommen, dersom sykdommen viser kjønnsforskjell i populasjonen). 2. semester (Cellebiologi) kull V januar 2004 kl Hvordan kan man skille mellom autosomal dominant arv og autosomal recessiv arv ved å studere slektstrær? Man skiller mellom de ulike arveformer ved å studere hvordan en tilstand forekommer i familier. Dette forutsetter at man studerer familier med flere affiserte personer. Ved autosomal dominant arv vil tilstanden finnes i alle generasjoner, 50% av søsken vil være affisert og en uaffisert person får ikke affisert avkom (unntatt i de tilfellene der tilstanden viser redusert penetrans). Ved autosomal recessiv arv vil tilstanden finnes i søskenflokker, 25% av søsken vil være affisert og det er ofte inngifte i familien (spesielt dersom tilstanden er sjelden). Det er ingen kjønnsforskjell i opptreden av tilstanden ved disse arveformene. 3. Beskriv minst tre typer mutasjoner som kan føre til unormal funksjon av et gen. Man kan få unormal funksjon av et gen ved missense-, nonsense - og rammeskiftemutasjoner og spleisemutasjoner. Ved missense mutasjoner er en aminosyre byttet ut med en annen på grunn av en basesubstitusjon. Ved nonsense mutasjoner blir en triplett i DNA som skulle kode for en aminosyre byttet ut med en triplett som fører til stopp i translasjonen. Ved rammeskiftemutasjoner får man en addisjon eller delesjon av et lite antall baser i DNA som fører til at leserammen ved transkripsjonen av genet endres. Spleisemutasjoner er basesubstitusjoner i de deler av genet som er essensielle for korrekt fjerning av introner i mrna. 4. Hva er en genetisk polymorfisme? En genetisk polymorfisme er normal genetisk variasjon. Minst to alleler i et locus forkommer med en hyppighet på mer enn 1% i populasjonen. (Vil ikke gi enkeltgen sykdom (unntak finnes), men kan bidra til sykdomsdisposisjon ved tilstander som har multifaktoriell arv.) 5. Du har funnet en mutasjon som du tror kan gi en sykdom. Hvordan vil du forsikre deg om at denne mutasjonen ikke representerer en polymorfisme? Man ville undersøke frekvensen av mutasjonen i populasjonen. Dersom frekvensen er større enn 1% er dette en polymorfisme. Man ville også undersøke om mutasjonen følger tilstanden i familier der sykdommen opptrer. 13

14 2. Semester - Cellebiologi - Kull H-02 Utsatt prøve 13. august 2003 kl Beskriv prinsippene for to metoder som kan anvendes for å påvise mutasjoner i humane gener. Det forventes her at studentene kan angi grunntrinnene i de best kjente fremgangsmåter for mutasjonsanalyse (her beskrives Southern blotting og polymerase kjedereaksjonen (PCR)). Detaljert beskrivelse av DNA-sekvensering ligger utenfor oppgaven. Ved Southern blotting isoleres cellulært DNA, separeres etter størrelse ved gelelektroforese og overføres til DNAbindende membraner. Analysen foregår ved tilsetting av en probe (merket med for eksempel radioaktivitet) som spesifikt vil gjenkjenne og bindes til det genet man studerer. Fremkalling av merkingen (for eksempel ved autoradiografi), evt. etterfulgt av DNAsekvensering, vil gi informasjon om genets egenskaper. Ved PCR, som er en fremgangsmåte for å oppkonsentrere nukleinsyrefragmenter som deretter evt. kan karakteriseres, anvendes såkalte primere, korte nukleotidsekvenser som er komplementære til begynnelsen og slutten av det genområdet man vil studere. Tilsetning av slike primere sammen med en varmestabil DNA-polymerase til isolert DNA vil gi nysyntese av genområdet som ligger mellom de to primeres bindingsseter. Denne syntesen gjentaes en rekke ganger (antallet kontrolleres vha. temperatursykluser), PCR-produktene blir så separert og isolert ved elektroforese, og evt. sekvensert for å verifisere genets egenskaper. 2. semester (Cellebiologi) kull H juni 2003 kl Ingen relevante oppgaver 2. semester, Cellebiologi kull V januar 2003 kl Hva er en genetisk polymorfisme? Tilstedeværelse av to eller flere alleler av et gen i en populasjon, der minst to alleler har en frekvens på mer enn 1%. 2. Hvordan kan man påvise en DNA-polymorfisme? DNA polymorfismer kan påvises enten ved PCR eller Southern blotting. 2. semester - Cellebiologi kull H-01 Utsatt prøve 14. august 2002 kl Ingen oppgaver. SENSORVEILEDNING 14

15 2. semester (Cellebiologi) Kull H juni 2002 kl Oppgave B. Det gjøres store anstrengelser for å finne gener som disponerer for schizofreni. Man har laget genetiske kart ved å undersøke store slekter med mange tilfeller av schizofreni. I en slik slekt fantes mange tilfeller av psykiske lidelser. Slektstreet nedenfor viser et utsnitt av slekten. 15

16 3. Anta at den familiære opptreden av schizofreni i denne slekten skyldes autosomal dominant arvegang. Hvordan kan du forklare dette? At en av foreldrene (I-1 eller I-2) har en nyoppstått dominant gonademutasjon er en rimelig forklaring. En annen rimelig forklaring er at genet har redusert penetrans og at en av foreldrene i generasjon I har genet uten å ha symptomer. En av disse forklaringer er nødvendig for å bestå oppgaven. Svar som multifaktoriell (polygen) arv eller inngifte og lignende kan ikke godtas. 4. Anta at den familiære opptreden av schizofreni i denne slekten skyldes autosomal recessiv arvegang. Hvordan kan du forklare dette? Den rimeligste forklaring er at de syke er homozygote for det recessive allelet og at begge foreldrene (I-1 og I-2) samt II-4 er heterozygote bærere av det recessive allelet. I denne (publiserte) slekten fantes også en balansert translokasjon 1;11. Beskrivelsen er: t(1;11)(q42;q14.3). Følgende personer på figuren var balanserte translokasjonsbærere: I-2, II-2, II-3, III-1 og III-2. De øvrige hadde normalt kromosommønster. Blant annet basert på disse funnene foreslo forfatterne at det var et gen for schizofreni-disposisjon lokalisert til 1q Hva betyr denne translokasjonsbeskrivelsen: t(1;11)(q42;q14.3)? Det foreligger en translokasjon (t) mellom kromosom 1 og kromosom 11 (innholdet i første parentes). Bruddstedene er i kromosom 1 lange arm (q) i bånd 42 og i kromosom 11 lange arm i bånd 14.3 (innholdet i annen parentes). 16

17 6. Hvorfor tror du forfatterne foreslo at det var et gen for schizofreni-disposisjon lokalisert til 1q42? Alle pasientene samt to friske familiemedlemmer er translokasjonsbærere. At ikke alle translokasjonsbærere er affisert, kan forklares ved redusert penetrans og/eller den varierende debutalder for schizofreni. I utgangspunktet kan brudd i kromosomer ødelegge gener eller endre genfunksjon, eventuelt på grunn av posisjonseffekter. Et gen for schizofreni i 1q42 eller 11q14.3 kunne derfor være involvert. (Dette er minstekrav for å bestå oppgaven.) Et gen for schizofreni kan ligge nær bruddstedene, men ikke være involvert, og andre studier kan ha sannsynliggjort at den genetiske koblingen er til 1q42 og ikke 11q14.3. Translokasjonen kan også være et tilfeldig funn i denne slekten. 7. Hva er et genetisk kart, og hva er forskjellen på genetisk og fysisk kartlegging av genomet? Et genetisk kart er et kart basert på frekvens av rekombinasjon i meiosen (koblingskart) mellom informative markører målt i cm (centimorgan). Derfor er genetisk kartlegging basert på familiestudier. Et fysisk kart er direkte basesekvens i genomet (avstander angitt i basepar). Fysisk kartlegging er basert på molekylærgenetiske metoder, særlig kloning av DNA og sekvensering. Embedseksamen i Medisin, Odontologi og Ernæring Cellebiologi, 2. semester kull V februar 2002, kl Kontinuasjonseksamen 14. Forklar prinsippet for Northern blotting, og beskriv forskjellen mellom Northern og Southern blotting. SVAR: Følgende bør kunnes: Northern blotting er et RNA blott, der man ønsker å studere ekspresjon av et gen, evt. se på transkriptenes lengde. Foregår ved å isolere RNA fra celler, separere RNAmolekyler etter størrelse ved geleelektroforese, overføre (blotte) RNA fra gelen til en membran som binder RNA, oppvarme membranen i egen buffer for å bryte sekundærstrukturer, og tilsetting av en probe (merket med for eksempel radioaktivitet) fra det gen man studerer. Siden proben vil binde de RNA som er komplementære, vil fremkalling av filmen (for eksempel med autoradiografi på røntgenfilm) gi informasjon (vha. grad av sverting av film og plassering av bånd) om transkriptets mengde og størrelse. Southern blott er et DNA blott, som altså utføres på DNA, med fremgangsmåter som ellers likner på Northern-blotting. Det gir signal fra alle celler (Northern gir bare signal fra celler som uttrykker genet). Anvendelse av Southern er mangfoldig, for eksempel studier av polymorfismer, om et gen finnes i en eller flere utgaver, i en eller flere arter, etc. Men metoden kan ikke brukes for å studere ekspresjon av gen. Embedseksamen i Medisin, Odontologi og Ernæring, 2. semester (Cellebiologi) Kull V01 17

18 Torsdag 24. januar 2002 kl Ingen oppgaver. Og vi gir oss der. 18