Natriumbikarbonat injeksjon i fersk laks pakket i redusert frivolum av modifisert atmosfære

Transkript

1 Natriumbikarbonat injeksjon i fersk laks pakket i redusert frivolum av modifisert atmosfære Sodium bicarbonate injection in fresh salmon packed in reduced headspace of modified atmosphere Av Lars Erik Pettersen Hovedfagsoppgave ved Institutt for Næringsmiddelfag ved Norges Landbrukshøgskole 2002

2 Forord Denne hovedoppgaven er gjennomført i samarbeid med MATFORSK, og går inn under forskningsprosjektet, Marinepack, som skal rette fokus på optimal, trygg og kvalitetsbevarende emballering av sjømat og andre næringsmidler. Marinepackprosjektet blir gjennomført i samarbeid med Fiskeri- og Havbruksnæringens Landsforening og de store norske emballasjeleverandørene. Forskningsinstitusjonene som deltar i prosjektet er Fiskeriforskning, Norconserv, Stiftelsen Østfoldforskning (STØ), Institutt for Produkt Design (NTNU/IPD) og MATFORSK. Prosjektet er delt opp i to hovedområder: Optimal emballering og distribusjon. Trygg og kvalitetsbevarende emballering. Min hovedoppgave kommer inn under trygg og kvalitetsbevarende emballering. Oppgaven inngår som det avsluttende arbeidet i mitt studie ved Institutt for Næringsmiddelfag, Norges Landbrukshøgskole (NLH). Jeg vil takke min veileder ved MATFORSK, forsker Thomas Eie for god hjelp underveis. Dessuten vil jeg takke stipendiat Anlaug Ådland Hansen for hjelp med statistikken. I tillegg ønsker jeg å takke Taran Olaug Skjerdal ved Fiskeriforskning, Morten Sivertsvik ved Norconserv og forsker Hilde Nissen ved MATFORSK for nyttige tips underveis. Til slutt vil jeg rette en stor takk til min veileder ved NLH, Professor Bjørg Egelandsdal, for hennes hjelpsomhet og engasjement. Ås, 16. desember 2002 Lars Erik Pettersen (Bildet på forsiden er hentet fra Eksportutvalget for fisk)

3 Sammendrag I denne hovedoppgaven ble ulike mengder med NaHCO 3 injisert i ferske laksebiter. Laksebitene ble deretter pakket i modifisert atmosfære med 70 % karbondioksidgass (CO 2 ) og 30 % nitrogengass (N 2 ) i en skål med et volum på 127 cm 3. Frivolumet i de små begrene varierte fra 43 cm 3 og 72 cm 3 på grunn av at fiskebitene varierte i vekt. Det ble injisert et volum av NaHCO 3 -løsning, tilsvarende 3,5 % av laksebitenes vekt, med konsentrasjoner på 0,23 mol/l, 0,46 mol/l og 0,69 mol/l. Det ble også pakket laksebiter i 70 % CO 2 -gass og 30 % N 2 -gass i en skål med et volum på 283 cm 3. Frivolumet i de store begrene varierte mellom 202 cm 3 og 230 cm 3. Det ble ikke injisert NaHCO 3 i laksefiletene som ble pakket i de store skålene. I tillegg ble laksebiter pakket i vakuum og luft. Halvparten av de vakuumpakkede og de luftpakkede prøvene ble injisert med destillert vann. Forsøket viste at det var svært små forskjeller i farge, ph og tekstur mellom de NaHCO 3 -injiserte prøvene, de vakuumpakkede prøvene, de luftpakkede prøvene og prøven som var pakket i et stort frivolum av MAP. Det var heller ingen større forskjeller innad mellom de NaHCO 3 -injiserte prøvene for de målte parameterne. Injisering av destillert vann ga heller ingen forskjeller innad mellom de vakuumpakkede og innad mellom de luftpakkede prøvene. Mikrobiologisk viste det seg at de pakkene som ble pakket i et stort gassvolum hadde det laveste bakterieantallet. De NaHCO 3 -injiserte prøvene hadde en høyere bakterievekst sammenlignet med pakkene som ble pakket i et stort gassvolum. Pakkene som var pakket i luft hadde i regelen det høyeste bakterieantallet sammenlignet med alle de andre prøvene. De vakuumpakkede prøvene hadde et noe lavere bakterieantall enn de luftpakkede prøvene. De sensoriske analysene viste at luftprøvene ble avvist etter 14 dager. Det var ellers ingen signifikante forskjeller mellom de ulike gruppene. Drypptapet i de NaHCO 3 -injiserte prøvene viste seg å være svært høye. De hadde et signifikant høyere drypptap sammenlignet med de andre prøvene etter 14 dager og

4 ut resten av forsøket. Modifisert atmosfærepakking forventes å øke drypptapet, men ingen av de etablerte forklaringen synes gyldige i dette forsøket. Andre forklaringer belyses derfor. Drypptapet kan komme av at det ble felt ut frie Ca 2+ -ioner i fiskekjøttet. NaHCO 3 -injiseringen ble utført mens laksen var in-rigor og det kan også tenkes å ha betydning for væsketapet. Når HCO - 3 dissosierer i vann dannes CO 2-3. Dermed kan Ca 2+ -avhengige proteaser bli inhibert dersom det isteden blir dannet CaCO 3(s). Proteasene bryter ned aktomyosin-komplekset i Z-linjene i muskelfibrillene, og åpner myofibrillene slik at vann, som er presset ut av myofibrillene under rigor, kan gå inn i aktomyosin-komplekset. Hvis Ca 2+ -ionene felles, kan ikke vannet gå tilbake til aktomyosinkomplekset og vannet går ut av laksebiten. Det var vanskelig å kunne påvise om det ble dannet CO 2 -gass i frivolumet eller fiskekjøttet da det ikke var gasspakket noen lignende prøve som ikke var injisert med NaHCO 3 og pakket i en tilsvarende liten skål (127 cm 3 ). Teoretiske overslag med likevektsberegninger tilsier at det ikke skulle dannes CO 2 -gass ved de injiserte - mengdene. Det finnes imidlertid ingen likevektskonstanter K a for CO 2 og HCO 3 i laks. I dette forsøket ble det derfor benyttet en ekstrapolert likevektskonstant K a for sjøvann og destillert vann for å gjøre overslag.

5 Abstract In this study different amounts of NaHCO 3 were injected into fresh pieces of salmon fillets. The salmon were packed in modified atmosphere with 70 % carbon dioxide gas (CO 2 ) and 30 % nitrogen gas (N 2 ) in a tray with a volume of 127 cm 3. The headspace in the trays varied in volume between 43 cm 3 and 72 cm 3 because of different weights between the fish fillets. The amount of NaHCO 3 -solutions injected, was 3,5 % of the salmon pieces weights. The concentrations of the NaHCO 3 - solutions were 0,23 mol/l, 0,46 mol/l and 0,69 mol/l. In addition, salmon pieces were packed in a tray with a volume of 283 cm 3 and consisted of 70 % CO 2 and 30 % N 2. The headspace of these trays had a volume between 202 cm 3 and 230 cm 3. The salmon pieces packed with the larger headspace was not injected with NaHCO 3. Salmon pieces were also packed in air and in vacuum. Half of the air- and vacuumed packed fillets were injected with distilled water. The experiment showed few differences in colour, ph, and texture between the NaHCO 3 -injected samples, the vacuumed packed samples, the air packed samples and the sample which was packed in a large headspace in MAP. No larger differences were detected inward the NaHCO 3 -injected samples for any of the measured parameters. No differences were detected inward the samples which were injected with distilled water. The microbiologically results showed that the pieces of salmon which were packed in the large headspace had the lowest bacterial count. The NaHCO 3 -injected samples had a higher bacterial count compared with the samples which were packed in the large headspace. The samples which were packed in air had the highest bacterial growth compared to all the other samples. The vacuumed packed samples had a bit lower bacterial growth than the air packed samples. The sensory analyses showed that the air packed samples were rejected after 14 days. It was not detected any other significant differences between the other groups.

6 The drip loss in the NaHCO 3 -injected samples were very high. They had a significant higher drip loss compared with all the other samples after 14 days and throughout the rest of the experiment. A higher drip loss in modified atmosphere technology is expected but none of the explanations seems to be valid in this experiment. Other explanations will therefore be discussed. The drip loss can be explained with the theory that Ca 2+ -ions will precipitate out of the fish. The salmon was in-rigor when the NaHCO 3 -injection was done and this could affect the drip loss. HCO - 3 dissociate in water and give CO 2-3. Ca 2+ -dependent proteases could then be inhibited if the ions precipitate CaCO 3(s). The proteases break down the actomyosin-complex in the Z- lines in the myofibrils, and open up the myofibrils so that water, which are forced out of the myofibrils during rigor, again can go back into the actomyosin-complex. If the Ca 2+ -ions in the fish tissue precipitate, the water can not go back to the actomyosincomplex. It was hard to prove if CO 2 was formed in the headspace or in the fish tissue. No samples which not were injected with NaHCO 3 were packed in the same trays (127 cm 3 ) in modified atmosphere. However theoretically estimates by equilibrium calculations order to attend that no CO 2(aq) or CO 2(g) was formed in the NaHCO 3 - injected samples. No equilibrium constants, K a, exists for CO 2 and HCO - 3 in salmon. In this study an extrapolated equilibrium constant, K a, for sea water and distilled water was used to do the estimates.

7 Innholdsfortegnelse 1 Innledning med problemstilling Teori...3 Kvalitetsforringelse av fisk... 3 Mikrobiologi... 3 Poikilotherme natur... 5 De ulike bakteriene funnet på MAP-laks... 5 Kontaminering... 9 Muskelfysiologi... 9 ph... 9 Dødsreaksjoner... 9 Muskelkontraksjoner...10 Non Protein Nitrogen (NPN)...11 Endogene enzymer...11 Vannbindingsevne...12 Andre egenskaper...12 Bufferkapasitet...12 Tekstur...12 Farge...13 CO 2(aq) fra CO 2(g)...13 Bakgrunn for MAP (Modifisert Atmosfære Pakking)...16 CO 2 -gassens virkning...16 O 2 -gass...17 N 2 Nitrogengass...18 Barrieremateriale...18 Temperatur...18 Direkte injisering av bikarbonat...19 Natriumbikarbonat NaHCO CO 2(aq) fra HCO - 3 -injiseringen...20 Lakeinjisering i fiskekjøtt...20

8 3 Materialer og Metoder...22 Forforsøk...22 Hovedforsøk...22 Råvarer...22 Beregning av Natriumbikarbonat-konsentrasjoner...25 Uttak...25 Statistikk...26 Gassmåling...26 ph-måling...27 Mikrobiologiske analyser...27 Forbehandling...27 Fortynningsrekker...27 Utplating på agarer...28 Inkubering...28 Avlesning...28 Beregning av antall kolonidannede enheter (CFU) per cm Lukt...29 Tekstur...30 Drypptap...30 Fargemåling...30 Barriæreegenskap Resultater og Diskusjon...32 CO 2 og O 2 -konsentrasjonene...32 ph-måling...34 Gassutvikling...35 Barriereegenskaper...40 Mikrobiologiske analyser...41 Totalantall bakterier (Long & Hammer)...41 H 2 S-produserende bakterier (Jernagar)...42 Melkesyrebakterier (MRS-agar)...43 Lukt...47 Drypptap...48

9 Tekstur...51 Farge...53 Kommentarer til oppbygningen av selve forsøket Konklusjon Referanseliste...59 Vedlegg Resept Long & Hammer (per liter)...65 Resept Jernagar (per liter)...65 Vedlegg Resultatark...66 Vedlegg Statistikk...70

10 Innledning med problemstilling 1 Innledning med problemstilling Denne hovedoppgaven går ut på å injisere Natriumbikarbonat (NaHCO 3 ) inn i laksekjøtt. Det skal i denne hovedoppgaven undersøkes hvordan injisering av NaHCO 3 vil kunne påvirke mikrobiell vekst, lukt, smak, ph, drypptap, tekstur og farge på laksekjøtt. CO 2(aq) dannes fra NaHCO 3 i sure løsninger, og når løsningen er eksponert mot vanlig atmosfære. CO 2(aq) kan virke mikrobiologisk hemmende. Laksekjøtt har en ph-verdi under 7,0 og er dermed sur nok til å gi utvikling av CO 2(aq) og frivolumet i MAP kan reduseres. Oppløsning av CO 2 -gass i fiskekjøtt er prinsippet bak MAP-pakking. I dag pakkes laks i CO 2 - og N 2 -atmosfære og CO 2 -gassen løser seg i vannfasen og fettfasen i laksen. CO 2 -gassen som løser seg i fiskekjøttet gir en bakteriologisk effekt. Den bakteriologiske effekten er avhengig av frivolumet i pakken og partialtrykket av CO 2. Et større frivolum gir en bedre bakteriologisk effekt fordi partialtrykket til CO 2 ikke reduseres mye i omsetningsperioden når Gassvolum/Produktvolum-forholdet (G/P) er høyt. Pakking av fisk i modifisert atmosfære er blitt en vanlig konserveringsmetode i flere land i Europa. De største brukerne av pakkemetoden er England og Frankrike, og her foregår også størstedelen av produktutvikling innenfor området. Også i Sverige, Danmark og Finland tilbys atmosfærepakket fersk fisk i dagligvarehandelen. Modifisert atmosfærepakking (MAP) av næringsmidler er vel utbredt også i Norge og da særlig i kjøttbransjen. Modifisert atmosfærepakking av fisk har ennå ikke slått helt an her i Norge, men det finnes to aktører på markedet; Fjord Norsk Sjømat og Marian Seafood. Imidlertid vil distribusjon og frakt av fisk pakket i modifisert atmosfære (MAP) krever mye plass under transport. Hver pakke bør ha et G/P-forhold på 3:1. Transportkostnadene av disse MAP-pakkene er høy per kilo fisk, da transporten betales i volum og ikke antall kilo transportert. I følge Linjegods vil en halvering av MAP-pakken bety en halvering av transportkostnadene. En semitrailer kan ta med Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

11 Innledning med problemstilling seg 33 paller og koster i dag mellom 8000 og 9000 kroner for strekningen mellom Bergen og Oslo. Dessuten vil det kreves mindre emballasje dersom frivolumet minsker og dette vil også bidra til å redusere kostnadene. Konsekvensene av HCO 3 -injiseringen for kvalitetsparametere er ikke tidligere undersøkt, og det er derfor av interesse å se på dette. Arbeidshypotesene i denne hovedoppgaven er derfor: - Kan HCO 3 -injisering i laks gi samme mikrobiell kvalitet som vanlig MAP (stort frivolum) gir? - Vil HCO 3 -injisering påvirke sensorisk kvalitet eller teknologiske egenskaper hos laksefisk? Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

12 Teori 2 Teori Grunnen til at en ønsker å bruke HCO - 3 -injisering i fiskekjøtt er primært motivert av muligheter for å få dannet CO 2(aq) i fisken, noe som i dag oppnås ved CO 2(g) i lukket pakning. Derfor fokuserer teoridelen mest på forhold rundt etablert teknologi for å få dannet CO 2(aq) i kjøttet fra CO 2(g). Generell teori rundt dette med lakeinjisering i muskelmat taes likevel med. Kvalitetsforringelse av fisk Fisk er et lett bedervelig næringsmiddel på grunn av dets høye a w, nøytrale ph og tilstedeværelse av autolytiske enzymer som kan føre til rask utvikling av uønsket lukt og smak. Dessuten inneholder fisk mye Non Protein Nitrogen (NPN) som kan brytes ned av forringelsesbakterier. Etter fiskens død gjennomgår fiskemuskelen i stort sett samme forløp som en varmblodig muskel. Det skjer autolytiske prosesser hvor cellene omsetter sitt glykogenforråd til energi og melkesyre (Molin, 60:1998). Disse autolytiske reaksjonene påvirker konsistensen ved at fisken gjennomløper rigor. Samtidig vil det skje et tap av frisk smak og aroma. På slutten i lagringen vil bakterieveksten sette inn og føre til spalting av TMAO og ekstraktivstoffer til illeluktende nedbrytningsprodukter (Lynum, 1997:86). Mikrobiologi I følge Gram & Huss (1996) er forringelse av fisk først og fremst knyttet til mikrobiell vekst av noen spesielle bakterier. Disse bakteriene forkortes ofte SSO (Specific spoilage organisms). I den samme artikkelen beskriver også Gram & Huss hvordan forringelsen vil arte seg (Tabell 1). Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

13 Teori Tabell 1: Mikrobiologisk forringelse av næringsmidler (Gram & Huss,1996) Mikrobiologisk aktivitet Sensorisk utslag Nedbrytning av komponenter i næringsmiddelet Produksjon av dårlig lukt og smak Produksjon av ekstracellulære polysakkarider Slimdannelse Vekst av mugg, bakterier og gjær Store synlige kolonier CO 2 -fra karbohydrater eller aminosyrer Produksjon av gass Produksjon av uønskede pigmenter Misfarging Ut fra tabell 1 gir forringelsen seg utslag i synlige endringer i farge og slimdannelse, men ofte er forringelsen sterkt knyttet opp mot dårlig lukt og smak. Videre viser Gram & Huss at et høyt totalantall ikke nødvendigvis bør gi en sensorisk avvisning, men at antallet av SSO er det mest interessante. Figur 1: Figuren viser at den sensoriske avvisningen skjer ca 10 dager etter at en stasjonær fase av totalantall bakterier er nådd. Figuren er hentet fra Gram & Huss, Figur 1 viser at det er dårlig korrelasjon mellom totalantall og sensorisk avvisning helt til SSO er like høyt som totalantall bakterier. Det er derimot antallet av de spesifikke bedervelsesbakteriene som er bestemmende for sensorisk avvisning. På tross av dette, setter kontrollverket inn en grense på 10 7 bakterier/cm 2 som akseptabel grense (Lynum, 1997:251). På fersk fiskekjøtt vil SSO finnes i svært lave konsentrasjoner og bare utgjøre en mindre del av den totale mikrofloraen. Under lagring vil SSO ofte gro raskere enn Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

14 Teori den resterende mikrofloraen og produsere metabolitter som gir dårlig smak og lukt (Gram, 1995:54; Dainty & Mackey, 1992). Molin (1998:61) angir mikrobielt produserte komponenter som gir opphav til frastøtende lukt (Tabell 2) i fisk. Tabell 2: Komponenter med opphav til frastøtende lukt. Komponenter Lukt Trimetylamin Påtrengende fiskelukt Estere Søtaktig fruktig lukt Merkaptaner Skjemt sjølukt Skatol Skjemt sjølukt Indol Skjemt sjølukt H 2 S Skjemt sjølukt Poikilotherme natur Bakteriefloraen hos fisk blir assosiert med bakteriefloraen som finnes i det akvatiske miljøet som fisken lever i. I kjølige farvann er det psykrotrofe, aerobe, stavformede bakterier som dominerer. Bakteriefloraen vil derfor endre seg lite ved islagring. Etter en ukes kjølelagring vil floraen domineres av slekter og familier av: Pseudomonas spp., Moraxella, Acinetobacter, Shewanella putrefaciens, Flavobacterium, Vibrionaceae og Aeroemonadaceae. Gram-positive bakterier som melkesyrebakterier, Brochothrix thermosphacta, Micrococcus, Clostridium og Enterobacteriaceae kan også bli funnet i ulike mengder (Gram & Huss, 1996). De ulike bakteriene funnet på MAP-laks Shewanella putrefaciens Shewanella putrefaciens er en obligat aerob gram-negativ stavformet og oksidase positiv bakterie (Molin 1998:64). Bakterien krever natrium for å formere seg og den er derfor utpreget i saltvannsfisk, men den har også blitt isolert fra ferskvannsfisk (Gram 1995:51). Organismen har kort generasjonstid ved lav temperatur og har en høy aktivitet. I fisk som er fanget i kalde farvann og deretter lagret aerobt på is, vil bakteriefloraen til slutt domineres av Sh. putrefaciens uansett sammensetning av begynnelsesfloraen. Dette kommer trolig av den korte generasjonstiden bakterien har (Lynum 1997:161). Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

15 Teori En meget spesiell egenskap hos Sh. putrefaciens er at den i fravær av O 2 kan respirere ved å redusere TMAO til TMA (Molin, 1998:64). For å unngå dette er det derfor anbefalt en konsentrasjon på rundt 10 % O 2 i en MAP-forpakning av fisker som inneholder TMAO. I tillegg kan organismen bryte ned aminosyrer og danne H 2 S-gass og andre flyktige illeluktende svovelforbindelser ved høyere ph-verdier (Lynum, 1997:163) Photobacterium phosphoreum I følge Hendrie & Shewan (1975: ) defineres Photobacterium-slekten som gram-negativ, fakultativ anaerob og har en optimumstemperatur mellom 20 og 30 C. Slekten er helt avhengig av natrium for å vokse og den vokser i ph-området mellom 6 og 9. Photobacterium phosphoreum finnes naturlig i sjøvann og i tarmen på marine fiskearter. Ph. phosphoreum vokser bra i CO 2 -atmosfære og dette kan forklare at Ph. phosphoreum er antatt ansvarlig for det meste av forringelsen av fisk pakket i modifisert atmosfære (Dalgaard, 1995; Emborg et al. 2002). Ph. phosphoreum har evnen til å redusere TMAO (Gram, 1995:59). I tillegg kan organismen produsere biogene aminer som agmatine, cadaverine, histamin og tyramin. Emborg et al. (2002) har senere gjort et forsøk på fersk MAP-pakket laks pakket ved 2 C. Her viste det seg at Ph. phosphoreum dominerte mikrofloraen i laksen etter 10 dager, og produserte biogene aminer i produktet. Dessuten ble det i det samme forsøket påvist at Ph. phosphoreum var den spesifikke forringelsesbakterien. Dette ble gjort ved å sammenligne ferskpakket laks med fryst og deretter tint laks. Den tinte laksen ble så opptint og MAP-pakket. Emborg et al. (2002) viste at nedfrysing av laks med påfølgende opptining og MAP-pakking eliminerte Ph. phosphoreum og økte holdbarheten med 1 2 uker. I ikke frosne prøver ble det funnet signifikant større mengder av agmatine, cadaverine, histamin og tyramin etter 12 til 14 dager sammenlignet med stykker som var tint og deretter MAP-pakket. Etter 10 dagers lagring var det mer enn 1000 ganger så mange bakterier per gram av Ph. Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

16 Teori phosphoreum sammenlignet med H 2 S-produserende bakterier i den ferskpakkede MAP-laksen. Pseudomonas spp. Slekten Pseudomonas spp. er stavformede gram-negative, kjemoorganotrofe, oksidase positive og obligate aerobe (Molin 1998:20). Slekten finnes i jord, ferskvann og saltvann (Doudoroff & Palleroni, 1975:217). På kjøtt utnytter de først og fremst frie aminosyrer, melkesyre og glukose for sin vekst. I tillegg kan de produsere lipaser og proteaser og det blir dannet dårlig lukt på grunn av dannelse av etyl- og metylestere (Molin 1998:21-22). De dominerende artene som finnes på fisk er i følge Molin (1998:63) P.fragi og P.fluorescens. Disse to artene forårsaker for eksempel at: Aminosyrer omdannes til Svovelholdiger aminosyrer Sukker og laktat (Molin 1998:65) ammoniakk og aminer merkaptaner korte fettsyrer Pseudomonas spp. vil ikke vokse i CO 2 -atmosfære. Gasspakking av fisk burde derfor i teorien forhindre Pseudomonas spp. å vokse, men det viser seg at slekten har en meget høy affinitet for O 2, og kan vokse ved O 2 -konsentrasjoner helt ned til 0,05 % i gassfasen. Slike lave konsentrasjoner av O 2 er vanskelig å få til under MAP-pakking på grunn av O 2 -lekkasje inn i forpakningen. Om veksten av Pseudomonas spp. bremses på grunn av O 2 -mangel, vil det bare innebære at andre arter av familien Enterobacteriaceae og slekten Aeromonas erstatter Pseudomonas spp. (Molin 1998:21). Brochothrix thermosphacta Brochothrix thermosphacta er en stavformet, gram-positiv, katalasepositiv og fakultativ anaerob bakterie. Under aerobe forhold vokser Br. thermosphacta meget raskt. I tillegg kan bakterien produsere illeluktende stoffer som smør- og valerinsyre. For at Br. thermosphacta skal forringe et produkt må bakteriantallet opp i 10 7 Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

17 Teori CFU/cm 2 (Molin, 1998:30-31). Øvregård (2002) undersøkte MAP-laks ved 2 C, og det viste seg at ved dag 13 inneholdt laksen 10 7 CFU/cm 2 av Br. thermosphacta. Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae er gram-negative staver, fakultativt anaerobe, kjemoorganotrofe og vokser best ved 37 C. Enterobacteriaceae består av ca 20 slekter og opptil 60 ulike arter. Enterobacteriaceae finnes i jord og vann og på planter og dyr. Noen arter innenfor familien Enterobacteriaceae vokser ved kjøletemperaturer. På kjøtt kan Enterobacteriaceae danne illeluktende avfallsprodukter som produserer ammoniakk, dimetylsulfid, indol, skatol, metylmerkaptan og H 2 S-gass (Molin, 1998:21). Øvregård (2002) fant verdier som lå over 10 6 CFU/cm 2 allerede etter 14 dager på MAP-pakket laks ved 2 C. Også de la Hoz et al. (2000) har utført et forsøk hvor laks ble pakket i 40 % CO 2 og 60 % luft. Her viste det seg at Enterobacteriaceae-antallet var en logenhet under totalantallet på 10 9 CFU/cm 2. Melkesyrebakterier (MRS) Melkesyrebakterier defineres som gram-positive, ikke-sporulerende og ikkerespirerende kokker og staver, som produserer melkesyre som hovedprodukt under fermentering av karbohydrater (Axelsson, 1998:1). Melkesyrebakteriene kan videre deles inn i homofermentative og hetrofermentative. Homofermentative betyr at sluttproduktet hovedsakelig er melkesyre. hetrofermentative betyr at sluttproduktene i tillegg er etanol og CO 2 -gass (Madigan et al., 2000:504). Emborg et al. (2002) fant at melkesyrebakterier i gasspakket laks ble utkonkurrert av Photobacterium phosphoreum når fersk laks ble gasspakket. Derimot når laksefileter var fryst og deretter tint og gasspakket, dominerte melkesyrebakteriene forringelsesfloraen med bakterien Carnobacterium piscicola. Også Lactobacillus sakei og andre arter av slekten Carnobacterium spp. er som oftest ansvarlige for forringelse i laks. Forringelsen gir seg utslag i slimdannelse og dannelse av melkesyre (Nissen, pers med. 2002). Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

18 Teori Kontaminering Det sterile vevet i fisken blir tilført mikroorganismer ved lagring og viderebehandling. Usløyet fisk vil ofte utsettes for trykk som presser ut tarminnhold slik at hudoverflaten kontamineres. Ved bløgging og utblødning vil blod også kunne komme i kontakt med fiskekjøttet. Det samme gjelder for sløying hvor indre organer kan punkteres og for eksempel tarminnhold kan overføres til fiskekjøttet. Kontaminering vil også forekomme ved for eksempel filetering (Lynum, 1997:154). I tillegg kan også kontaminering skje ved lake-injisering. Muskelfysiologi ph Fiskemuskel inneholder lite glykogen og mesteparten av glykogenet vil omsettes raskt før slakt på grunn av stressing av fisk (aerob omsetting). Etter hvert som glykolysen omsettes anaerobt (etter døden) vil det være lite glykogen igjen i fiskemuskelen. Ved anaerob omsetting av glykogen blir det dannet melkesyre og muskelen blir sur og ph faller, men siden det meste av glykogenet allerede er brukt opp før fisken er slaktet, vil ph i fiskemuskelen sjelden falle under 6,2 6,5. Tunfisk, uer og kveite har større glykogenreserver og vil få en ph på ned mot 5,5 (Lynum, 1997:94). Utover i lagringen dannes det også NH 3 som vil øke ph. Dødsreaksjoner Hos alle virvelløse dyr skjer det en sammentrekning av muskelene en tid etter døden og musklene blir harde og stive fordi aktin -og myosin filamentene i muskelfibrillene danner komplekset aktomyosin (figur 2). Denne tilstanden kalles rigor mortis. Det antas at rigor mortis skjer fordi ATP-innholdet i muskelen kommer under et visst terskelnivå, og dermed stoppes utpumpingen av Ca 2+ -ioner fra muskelen. Post-rigor, vil fisken gå over i en bløt og myk konsistens forårsaket av proteaser. Temperatur og stressing av fisken før døden, vil bestemme tidspunktet for når muskulaturen vil trekke seg sammen og bli hard og uelastisk. Fisk bør ikke fileteres pre-rigor da musklene kan forkortes og det kan føre til ekstrem filetspalting mellom myotomene i fiskemuskelen (Lynum, 1997:83-85). Derimot har Skjervold et al. (2001) vist det motsatte; gaping er mindre i laks filetert pre-rigor sammenlignet med laks filetert post-rigor. Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

19 Teori Figur 2: Myofibrillene i muskel. Den mørke fargen finnes der aktin og myosinmolekylene overlapper hverandre. Figuren er henter fra Lynum (1997:79). I følge Skjervold et al. (1999) vil laks lagret på is bruke mellom 100 og 125 timer avhengig av stressnivå på fisken før slakting, før full rigor er utviklet. Maksimum hardhet på teksturen oppnås mellom 18 og 24 timer etter slakt. Skjervold et al. (2001) utførte også analyser i pre-, in- og post-rigor laks. Det viste seg at det ikke var signifikante forskjeller mellom de ulike tilstandene når det gjaldt vanntap, men signifikant mer gaping mellom muskelsegmentene for laks in-rigor etter 14 dager sammenlignet med pre-rigor og post-rigor filetert laks. Muskelkontraksjoner Ca 2+ spiller en viktig rolle i levende muskler. Muskelkontraksjoner foregår ved at myosinet i de tykke filamentene tar kontakt med de tynne filamentene i muskelfibrillene som vist i figur 3 A. Ca 2+ starter kontraksjonen ved å binde seg til Troponin C. Troponin C er bundet til aktinmolekylet i muskelfibrene. Når Ca 2+ bindes til Troponin C svekkes bindingene mellom Troponin I og aktin. Dermed kan aktin og myosin bevege seg sidelengs slik at ATP kan spaltes og en kontraksjon skje. Kort tid etter kontraksjon blir Ca 2+ pumpet ut av muskelfibrene og inn i det sarcoplasmatiske Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

20 Teori reticulum ved hjelp av Ca 2+ -pumpen. Dermed slapper muskelen av som i figur 3 B (Numedal & Eggen, 1996:19-23). Figur 3: Muskelkontraksjon. A: sammentrukket, B: hvile. Figuren er hentet fra Numedal & Eggen, 1996:22). Non Protein Nitrogen (NPN) NPN er lavmolekylære, vannoppløselige stoffer som kan nedbrytes til illeluktende flyktige forbindelser. Den viktigste NPN-forbindelsen er TMAO som nedbrytes til TMA. TMA gir en påtrengende skjemt fiskelukt. Hvitt fiskekjøtt inneholder færre NPNforbindelser enn mørkt fiskekjøtt. Laks inneholder lite TMAO og under MAP-pakking kan O 2 utelates. Enzymer som bryter ned TMAO til TMA finnes blant annet hos to typer bedervelsesbakterier, Sh. putrefaciens og Photobacterium phosphoreum. Når alt TMAO er brukt opp, tar de obligat anaerobe bakteriene over og danner NH 3 (Lynum, 1997:67). Endogene enzymer Etter at muskelen har vært i rigor vil muskelen bli mykere på grunn av at enzymer, blant annet katepsiner og calpainer, vil bryte ned myofibrillære proteiner. Aktomyosinkomplekset vil bli brutt opp i Z-linjen. Fra kjøtt vet en at calpainer finnes i to former, den ene formen er svært aktiv ved fysiologiske konsentrasjoner av Ca 2+, mens den andre trenger mer Ca 2+ for å bli aktiv (Erik Slinde, 1996:59). I tillegg finnes det frie aminosyrer som histidin, arginin, glysin og alanin samt dipeptider som anserin og karnosin. Nedbrytning av disse aminosyrene skjer både av bakterieenzymer og vevsenzymer. Dette resulterer i en rekke ubehagelige lukt- og smaksstoffer. I tillegg vil en deaminering av aminosyrer også føre til dannelse av NH 3 (Lynum, 1997:101). Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

21 Teori Bakterieenzymene fører til en opphopning av eddiksyre, og etter hvert også illeluktende smørsyre og propionsyre (Lynum, 1997:167). Vannbindingsevne I en levende muskel (kjøtt) er ca 90 % av alt vannet bundet mellom aktin og myosin i myofibrillen. Resten av vannet, ca 10 %, befinner seg i bindevevet og mellom myofibrillen og celleveggen (Egelandsdal, 1996:47). Når rigor inntreffer, vil aktin og myosin trekke seg sammen. Det blir dannet aktomyosin, og det vil bli plass til mindre vann, og dermed kan drypptapet øke. Proteolyse kan gi opphav til forbedret vannbindingsevne om den er omfattende. Drypptapet kan øke betraktelig når konsentrasjonen av CO 2 øker. Drypptapet kan også øke med lagringstid. I tillegg vil for høye konsentrasjoner av CO 2 også kunne gi en metallisk og en syrlig lukt og smak (Randell et al., 1995). Vannbindingsevnen kan også påvirkes ved tilsetting av salter. Salt ekstraherer kjøttproteiner og får myofibrillene til å svelle. Den beste vannbindingsevnen, i kjøtt, oppnås ved å tilsette mellom 4,6 til 5,8 % NaCl. Ved høyere saltkonsentrasjoner vil det skje en svekking av vannbindingsevnen (Sørheim, 135:1996). Det har også vært forsøk hvor laks har vært tilsatt 1 % og 2 % NaCl. Ved en saltkonsentrasjon på 1 % var drypptapet ved ph 6,0 over 10 %, mens ved ph 7,0 var drypptapet under 5 %. Ved 2 % tilsatt salt, var drypptapet under ca 3 % og uavhengig av ph 7,0 og 6,0 (Ofstad et al., 1995). Andre egenskaper Bufferkapasitet Laksemuskel har i likhet med andre muskler en høy bufferkapasitet. Proteiner har mange sure og basiske grupper som vil bidra til denne bufferkapasiteten. Tekstur Teksturen i laks hevdes å varierer stort med hvor på laksen det måles. I følge Sigurgisladottir et al. (1999) vil teksturen avhenge av hvor på fileten det måles. Fett, pigmenter og collagen er ulikt fordelt fra hode til hale. Variasjoner i fett kan være fra 9,6 til 38 % på en filet av en hel fisk (Aursand et al., 1994). Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

22 Teori Figur 4: Ulike posisjoner på en laksefilet (Sigurgisladottir et al., 1999) I forsøket til Sigurgisladottir et al. ble det målt skjærkraft og hardhet. Skjærkraften var høyere ved punkt 6 og 7 enn ved punkt 1 og 2 (figur 4). Skjærkraften var lik ved punkt 2, 3 og 4. Hardheten var høyest ved punkt 1 og 7. Farge Det dominerende fargepigmentet i laks er astaxanthin. Fargen på en laksefilet vil variere avhengig av hvor på laksefileten fargen måles. Forsøk gjort på både laks og regnbueørret viste at halen skiller seg klart ut fra resten av fileten. Også fordelingen av fett, pigmenter og kollagen er ulikt fordelt i en fiskemuskel, noe som også vil påvirke fargen. Fargen i halen kan også være påvirket av at halen inneholder mer av muskelfargestoffet myoglobin (Fjalestad et al., 1993). CO 2(aq) fra CO 2(g) Når CO 2(g) i en pakke absorberes av matvaren, vil en likevekt innstilles hvor partialtrykket av CO 2(g) faller. Praktisk talt alle studier på MAP viser at effekten av CO 2 på mikrobiologisk vekst er relatert til partialtrykket og/eller prosentandelen av CO 2 i frivolumet (Löwenadler, 1994). Løseligheten av CO 2 -gassen bestemmes av Henry`s lov og vil ved trykk opp til 5 atm samt temperaturene 5 C og 25 C være: CO 2 (aq) = K H P CO2 = 0,064 P CO2 CO 2 (aq) = K H P CO2 = 0,032 P CO2 5 C 25 C Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

23 Teori hvor P er partialtrykket til CO 2 (Lower,1999:3-25). Når CO 2 har løst seg i vannfasen, vil en liten andel av CO 2(aq) reagere med vann og danne karbonsyre (H 2 CO 3 ) etter likevekten: CO 2(aq) = 650 * H 2 CO 3 Uttrykket, 650 * H 2 CO 3, kalles H 2 CO 3 *. Konsentrasjonen av H 2 CO 3 * i vann er det samme som CO 2 i vann, og Henry`s lov kan dermed brukes i syre-base likevekter. H 2 CO 3 * = 0,064 * P CO2 5 C H 2 CO 3 * = 0,032 * P CO2 25 C Det skjer derfor en likevektsreaksjon i destillert vann hvor K (a1) = 10-6,52 ved 5 C og 10-6,35 ved 25 C. H 2 CO 3 * (aq) HCO 3 - (aq) + H + (aq) K (a)1 = 10-6,52 (I) HCO 3 - (aq) CO 3 2- (aq) + H + (aq) K (a)2 = 10-10,56 (II) H + HCO 3 - = K (a1) H 2 CO 3 * HCO 3 - = 10-6,52 * H 2 CO 3 * H + (I) HCO 3 - -konsentrasjonen kan beregnes ved ligning (I) når partialtrykket og H + settes inn i ligningen. Utover likevektskonstanter for destillert vann finnes det også for sjøvann. For andre system er det ikke funnet likevektskonstanter. Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

24 Teori Som følge av at CO 2 -gassen absorberes av produktet vil det skje et fall i ph i MAPprodukter. En viss mengde CO 2 må løses i produktet for å hindre mikrobiologisk vekst (Gill & Penny, 1988). Dannelse av CO 2(aq) forutsetter at ph er lavere enn ca 7. I tillegg må tilstrekkelig CO 2(g) befinne seg i MAP-pakken slik at CO 2(aq) blir så høy som mulig eller høy nok. Gill & Tan (1980) fant at det er en lineær sammenheng mellom økende konsentrasjon av CO 2(g) og inhibering av mikroorganismer opp til %. Ved høyere konsentrasjoner var det ingen eller svært liten ekstra inhiberende effekt for de vanligste forringelsesbakteriene i fisk. Prytz og Østli (1997) anbefalte i en rapport fra Fiskeriforskning gassammensetningen for MAP-fisk som gitt i tabell 3. Tabell 3: Anbefalt gasskonsentrasjon for fet og mager fisk. Fiskeslag Oksygen Karbondioksid Nitrogen Mager fisk % % 0-30 % Fet fisk % % G/P-forholdet vil også ha mye å si for hvor mye CO 2 -gass som kan løses i et fiskestykke. G/P-forholdet er vanligvis 2:1 eller 3:1. Et slikt G/P-forhold er også nødvendig for å hindre at pakken kollapser grunnet overgang CO 2(g) til CO 2(aq) og det blir dannet et undertrykk i pakken (Sivertsvik et. al, 2001). En undersøkelse utført av Randell et al. (1995) med ørret og sild, viste at en MAPpakke med G/P-forholdet 1:1 var like effektivt som en vakuumpakket med hensyn på mikrobiologisk kvalitet. For sensorisk kvalitet var et G/P-forhold på 0,4 like effektivt som vakuumpakket. Dette skyldes at partialtrykket av CO 2(g) faller så mye ved små G/P og dermed blir CO 2(aq) også lav og mindre effektiv enn ved høye G/P. Devlieghere et al. (1998) gjorde et forsøk hvor G/P-forholdet ble økt fra 0,3 til 2,0 (50 % CO 2(aq) ved 8 C). Dette resulterte i en økning av CO 2(aq) løst i BHI-buljong med hele 145 %. Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

25 Teori Bakgrunn for MAP (Modifisert Atmosfære Pakking) Luft inneholder 78,08 % N 2, 20,85 % O 2 og 0,035 % CO 2. Modifisert atmosfære (MAP) betyr utskifting av luft med en enkel gass eller en blanding av gasser. De mest vanlige gassene som er brukt innenfor MAP-pakking av fisk, og også kjøtt, er N 2, O 2, CO 2 og CO, men det er bare O 2, CO 2 og CO som påvirker kvaliteten. I gasspakking av fisk brukes O 2, CO 2 og N 2. MAP-laks har vært utprøvd i mange ulike CO 2 -konsentrasjoner og holdbarhetsgevinstene er fra en svak økning til en dobling av holdbarhetstiden (Sørheim et al., 2001). CO 2 -gassens virkning Hovedfunksjonen til CO 2 i MAP er å hemme veksten av mikroorganismer, og da spesielt de aerobe Gram-negative organismene (Dainty & Mackey, 1992). CO 2 -behandling av næringsmidler er ingen ny teknologi. Holdbarhetsforlengende effekter ble påvist allerede av Grossmann & Mayerhausen i 1887 da oksekjøtt ble lagret i en sylinder med CO 2 -gass. I følge Daniels et al. (1985) kan CO 2 -gassens hemningseffekter på mikroorganismer hovedsakelig deles i fire. Fortrengningen av O 2 -gass ved utskiftning med CO 2 -gass vil gi en antimikrobiell effekt ved å hemme aerobe forringelsesbakterier. Direkte inhibering av enzymer eller minsking i farten på enzymreaksjoner. Gjennomtrengning av bakteriemembraner som fører til intracellulære phendringer. CO 2 kan påvirke permeabiliteten av cellemembraner. Mikroogranismene får forlenget nølefasen og en redusert vekst under den logaritmiske fasen. Löwenadler (1994) fant at løsligheten av CO 2(g) i MAP-systemer øker med økende ph (CO 2(aq) dissosierer til CO 2-3 som har relativ høy løslighet), økende a w, økende bufferkapasitet og økende frivolum i forhold til produktvolum. Forholdet mellom gassvolum og produktvolum og bufferkapasiteten viste seg å være den viktigste Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

26 Teori årsaken som påvirket løsligheten til CO 2. Det er viktig å være klar over at det er CO 2(aq) som gir den bakteriologiske effekten. Forsøket ble utført ved 8 C og 22 C. CO 2 -gass er løselig i vann og fett som CO 2(aq). Løsligheten øker med minkende temperatur. Ved 0 C og 1 atm trykk løses 3,38 g CO 2 /kg H 2 O, men ved 20 C vil løsligheten bli redusert til 1,73 g CO 2 /kg H 2 O (Knoche, 1980:3-11). Gill (1988) viste at ved ph 5,5 og 0 C kunne det løses 1,98 gram CO 2 per kg kjøtt (storfe, svin og lam). O 2 -gass O 2 som er i kontakt med næringsmidler kan gi mange negative effekter som oksidasjon av fett, vekst av aerobe mikroorganismer, respirasjon og fargeforandringer. O 2 kan også gi positive effekter i MAP-fiskeprodukter. For eksempel kan tilstedeværelse av O 2 hindre reduksjon av TMAO (trimetylaminoksyd) til TMA (trimetylamin) som gir den typiske lukten av gammel bedervet fisk. Innholdet av TMA er svært forskjellig i ulike fiskeslag. Boskou & Debevere (1997) fant at reduksjon av TMAO kunne hemmes dersom den modifiserte atmosfæren bestod av 50 % CO 2 og 10 % O 2. I følge Lynum (1997:193) kan en del bakterier som Shewanella putrefaciens utnytte fiskekjøttets TMAO-innhold som oksygenkilde og reduserer da TMAO til TMA. Av den grunn tilsettes det ofte noe O 2 i MAP slik at bakteriene kan bruke O 2 som oksygenkilde i stedet for TMAO. Photobacterium phoshoreum kan også redusere TMAO til TMA (Gram, 1995:63). O 2 blir også brukt i rødt kjøtt og til rødt fiskekjøtt som inneholder mye myoglobin (tunfisk) for å bevare den røde fargen i kjøttet og for å redusere og hindre bruning som skyldes dannelse av metmyoglobin (Oka, 1989). O 2 har også en positiv effekt ovenfor patogene anaerobe bakterier, og da særlig Cl. botulinum som kan danne toksin i kjølelagret MAP-fisk. Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

27 Teori N 2 Nitrogengass N 2 er en inert gass med lav løsningsevne i muskelvev. Gassen har ingen innvirkning på næringsmiddelet og brukes som en fyllgass som hindrer at MAP-pakkene kollapser når CO 2 løses i produktene. Barrieremateriale Ved MAP-pakking forutsettes gode barriereegenskaper på pakkemateriell, for ellers vil CO 2(g) utjevnes mot CO 2(g) utenfor pakkeområdet og CO 2(aq) blir lav. Ved dagens pakketeknikk brukes ikke helt tette filmer (pers med. Eie & Larsen, 2002), men filmer som er tette nok i den relevante omsetningsperioden. Pakkematerialets permeabilitet påvirker gasskonsentrasjonen i pakken over tid. Ulike plastmaterialer vil ha ulik permeabilitet ovenfor ulike gasser. Barriereegenskapene i kommersiell MAP-pakking referer til et tall som er mellom 0,1 og 100 cm 3 /ml/døgn/atm (tabell 4) Gassgjennomgang i plane filmer er i tillegg avhengig av filmens tykkelse, filmens areal, lagringstid, partialtrykkforskjell, temperatur og plastmaterialets evne til å tiltrekke seg fuktighet. Tabell 4: Grenser for barriereegenskaper (Løkkeberg & Svendsen, 1994) Gassgjennomgang cm 3 /m 2 /døgn/atm. Barriereegenskap 0,1 1,0 Særdeles gode 1,0 10 Meget gode Gode Temperatur Effekten av temperatur på holdbarhet, er meget stor for MAP. Gasspakking av fisk gir derfor liten utnyttbar effekt ved høyere temperaturer enn 0 C 4 C siden den enzymatiske og mikrobiologiske kvalitetsforringelsen vil bli sterkt påvirket ved høyere temperaturer. Löwenadler (1994) viste at Pseudomonas fragi var totalt inhibert ved 50 mol CO 2 /ml ved 8 C, men bare delvis ved 22 C. 50 mol CO 2 /ml tilsvarer 2,2 gram CO 2 per kg H 2 O. Molin (1998:71) fant at sildefilet pakket i 100 % CO 2 - atmosfære ved 2 C brukte opp til 30 dager før et totalantall på 10 7 CFU/g var oppnådd. Ved 15 C, under de samme betingelsene, tok det under 5 dager før det samme totalantallet var oppnådd. Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

28 Teori Direkte injisering av bikarbonat Det er godtgjort gjennom ligningene (I) og (II) og figur 5 at det er en teoretisk mulighet for å danne CO 2(aq) i fisk fra HCO - 3 -injiseringen da krav til ph er oppfylt. Derimot er det uklart om det kan tilsettes CO 2(aq) like effektivt fra HCO - 3 -injiseringen som via CO 2(g) i MAP. Tilsetning av væske vil stresse vannbindingsevnen og NaHCO 3 har begrenset løslighet. Det er imidlertid svært lite litteratur om injisering av NaHCO 3 i laks eller annen fiskemuskel. Det finnes derfor ikke noe dokumentasjon på mikrobiell forbedringseffekt av HCO - 3 -injisering i fisk eller kjøtt. Natriumbikarbonat NaHCO 3 Natriumbikarbonat er en uorganisk forbindelse med en løslighet på 1,2 mol/l H 2 O ved 25 C og 1,4 mol/l H 2 O ved 18 C. I en nylaget 0,1 molar vandig løsning ved 25 C vil ph ligge på 8,3 (Budavari et al., 1996). % FRIE MOLEKYLER CO 2(aq) H 2 CO 3(aq) - CO2- HCO 3(aq) 3(aq) ph Figur 5: CO 2 -likevekt som funksjon av ph i destillert vann. (Anonym 1981, Orion Research Incorporated). Figur 5 viser at konsentrasjonen av CO 2-3 vil være forsvinnende liten allerede ved ph 6,0. Fersk laks har en ph på litt over 6,0. Ved ph litt under 6,0 vil CO 2(aq) være den dominerende formen i vandig løsninger og det er det som gjør at en kan tenke seg effekt av HCO - 3 -injisering. Det er viktig å huske på at fisk har høy bufferkapasitet, så det er vanskelig å titrere fisken bort fra dens egen ph. Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

29 Teori I dag brukes NaHCO 3 som ingrediens i blant annet bakepulver og i kullsyreholdige drikkevarer. Selve bruken av NaHCO 3 reguleres i Norge av forskrift fra 21. desember 1993 nr 1378 om tilsetningsstoffer til næringsmidler. NaHCO 3 har eget E-nummer, E- 500, og skal tilsettes etter quantum satis-prinsippet. Quantum satis-prinsippet betyr, i følge forskriften, at det ikke er noe tallfestet begrensning for bruk av tilsetningsstoffet, men at tilsetting skal skje i samsvar med god framstillingspraksis og i mengder som ikke er større enn nødvendig for å oppnå det ønskede resultat. CO 2(aq) fra HCO - 3 -injiseringen CO 2(aq) og CO 2(g) står i likevekt med bikarbonat og karbonat. CO 2(aq) står i likevekt med H 2 CO 3(aq) som finnes i små mengder som vist under avsnittet, CO 2(aq fra CO 2(g). Derfor kan det brukes vanlige syre-base likevekter for beregninger av CO 2(aq). CO 2(aq) er som tidligere nevnt styrt fra Henry`s lov. Lakeinjisering i fiskekjøtt Lakeinjisering er en mye brukt metode innen muskelmatteknologi. Det meste av det ferske svinekjøttet i USA, injiseres med fosfatløsninger for å bedre vannbindingsevnen. I Norge brukes ikke lake-injisering på ferske produkter da det er betenkelig med hensyn på mikrobiologi. Muskelmat er steril innvendig og injisering åpner for kontaminering inne i muskelen. Imidlertid brukes teknikker på frossen muskelmat for å bedre vannbinding (fosfat), redusere harskning (antioksidanter) og forbedre bruningsevnen. Det er betydlig interesse for lakeinjisering som kan sikre - mikrobiologi for ferske muskelprodukter (pers med. Egelandsdal, 2002). HCO 3 - injisering kan enten være en ingrediens som er interessant alene eller eventuelt i kombinasjon med andre ingredienser. Det har blitt injisert NaHCO 3 pre-rigor i svin for å bedre farge og minske drypptap (Wynveen et al., 2001). Wynveen fant signifikant forbedring i drypptap. Det ble heller ikke funnet annen litteratur om injisering av NaHCO 3 i næringsmidler for å få CO 2 - utvikling. Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

30 Teori Bjerkeng et al. (1995) har derimot injisert Na 2 CO 3 (Natriumkarbonat) og sitronsyre til en absorber og deretter vakuumpakket en torskefilet med absorberen. Når Na 2 CO 3 ble surgjort av sitronsyren ble det dannet CO 2 -gass, og CO 2(g) -konsentrasjonen var stabil hele lagringsperioden på (50 % og 60 %). Totalantall bakterier var i en 15 dagersperiode mellom 10 3 og 10 4 CFU/gram. Som en kontrollprøve hadde Bjerkeng et al. en MAP-pakke som var pakket med 68,8 % CO 2, 29,4 % N 2 og 1,8 % O 2. For kontrollprøven var totalantall bakterier mellom 10 3 og 10 5 CFU/gram i en 15 dagers periode. Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

31 Materialer og metoder 3 Materialer og Metoder Forforsøk Det ble foretatt forforsøk med injisering av NaHCO 3 i laks 3. september Laksen ble kjøpt samme dag i butikken MEGA i Ås. Alle laksebitene ble vakuumpakket. Hensikten med forforsøket var å finne ut hvilke konsentrasjoner med NaHCO 3 som skulle injiseres og om eventuell gassutvikling kunne observeres som bobler i vakuumpakken. Det ble også målt ph i laksebitene. Hovedforsøk Råvarer Det ble mottatt 12 stk sløyet laks med hode, på MATFORSK i Ås 19. september fra Maritime Produkter i Oslo. Fiskene var fra et oppdrettsanlegg i Ålesund, Ålesund Fisk AS, og ble slaktet dagen før, 18. september. Fiskene ble fraktet på is fra Ålesund til Oslo og videre til Ås, også på is. Filetering og oppstykking fant sted på MATFORSK samme dag. Hver fisk ble delt i to fileter og ut fra hver fiskefilet ble det stanset ut fire fiskebiter med et spesialverktøy som var 6 cm x 6 cm (figur 6). Figur 6: Spesiallaget verktøy 6 x 6 cm. Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

32 Materialer og metoder Høyden på fiskebitene var mellom 2,0 og 3,0 cm. Mellom hver filetering ble kniver og fjeler desinfisert med 70 % etanol. Fiskebit nr 1 var nærmest nakkepartiet og de tre andre bitene fulgte deretter videre ned mot halepartiet. Før forsøket ble det foretatt en randomisering ved hjelp av tilfeldig-funksjonen i dataprogrammet Excel. Første fisk som ble filetert ble kalt fisk A, andre fisk ble kalt fisk B osv. I tillegg ble fiskefiletene delt inn i høyre (H) og venstre (V) fileter. Fiskebiten som var stanset ut nærmest nakkepartiet fra fisk nr 2 og høyre filet fikk dermed navnet BH1. Deretter ble skinnet skåret av fiskefileten. Fiskebitene ble så lagt på fat med merkede mellomleggspapir i henhold til randomiseringsrekkefølgen. Fatene var merket slik at alle fiskebiter som lå på fat skulle ha den samme behandlingen. Når et fat var fylt opp med fiskebiter, ble det lagt på kjølerom i påvente av eventuell behandling. Det ble foretatt 8 ulike kombinasjoner og pakking av fiskestykkene (tabell 5). Det ble pakket paralleller slik at det var 16 prøver ved hvert uttak. Tabell 5: De ulike behandlingene. Fire av behandlingene er mulige kommersielle løsninger hvorav tre (Ordinær MAP, vakuum og vanlig kjølelagring) er i bruk. Behandling Atmosfære Injisering Vekt (g) (maks/min) Emballasje Gassvolum/ Produktvolum (maks/min) Ordinær MAP 70 % CO 2 Ingen 55,53 85,63 2,8-4,4 Stor skål % N % 70 % CO 2 73,91 85,88 0,6-1,3 Liten skål % N NaHCO NaHCO (0,69 M) NaHCO % 70% 2 CO 2 60,24 81,80 0,5-1,2 Liten skål % N 2 3 (0,46 M) 50 % 70% CO 2 58,54 77,72 0,6-0,8 Liten skål % N 2 3 (0,23 M) Ingen Luft Ingen 61,72 80,86 - Stor skål 283 Injisering Luft Dest. Vann (referanse) 63,35 93,07 - Stor skål 283 Ingen Vakuum Ingen 57,63 73,83 - Vakuum - Injisering Vakuum Dest. Vann (referanse) 62,06 91,44 - Vakuum - Volum cm 3 Skålene som det ble pakket i var levert av Polimoon i Kristiansand og var av plastmaterialet HDPE. Overbanens film var levert av Südpack og av typen PETXL/PE 12/16 med O 2 -gjennomgang på 5 ml/m 2 /24 timer ved 23 C og 50 % RF. Pakkemaskinen som ble brukt var en Dynopack skålpakkemaskin av type 462-VGA (Polimoon). Overbanen ble sveiset med en sveisetemperatur på 190 C. Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen

33 Materialer og metoder Vakuumposene var levert av S-Gruppen ASA, SR 150 x 250 mm PA/PE 20/70 m. Vakuumkammermaskinen som ble brukt var produsert av Intervac i Tyskland. Det ble pakket paralleller av alle behandlingene, og nok til fire uttak. Gassen som det ble pakket i, var CO 2 -gass og N 2 -gass levert av Hydrogas Norge AS. All emballasje unntatt de store skålene ble gamma-sterilisert ved Institutt for Energiteknikk (IFE) på Kjeller. Også fuktabsorberne ble sterilisert. De store skålene ble ikke sterilisert, men ble tatt fra en uåpnet forpakning direkte fra fabrikk. Injiseringen skjedde manuelt med en sprøyte, og det ble brukt et sterilfilter på 0,22 m som var produsert av Millipore Corporation i Frankrike. Kanylen var 0,6 mm i diameter og 25 mm lang og levert av Terumo Corporation. Injiseringen skjedde gjennom en mal av en stålplate som var hullet i et rutenett, slik at det var et hull i hvert hjørne ved hver cm 2. Det ble injisert over hele fileten. Denne malen ble flambert mellom hver injisering. Sprøytespissene var sterile og det ble tatt nye mellom hver injisering. Det ble inijsert løsning til 3,5 % av fiskebitenes vekt. Injiseringen foregikk ved at kanylen ble stukket halvveis ned i fiskebiten og injisert forsiktig inn, se figur 7. Figur 7: Injisering av NaHCO 3 i laksefilet gjennom sterilfilter. Stålplaten er injiseringsmalen. Hovedfagsoppgave ved Institutt for næringsmiddelfag av Lars Erik Pettersen