HER2 CISH pharmdx Kit Kode SK109

Transkript

1 HER2 CISH pharmdx Kit Kode SK utgave HER2 CISH pharmdx sett er en direkte tofarget kromogen in situ-hybridiseringsanalyse (CISH) for kvantitativ påvisning av HER2-genamplifikasjon i formalinfikserte, parafininnstøpte (FFPE) brystkreftvevsprøver. HER2 CISH pharmdx -settet genererer røde (HER2) og blå (CEN-17) kromogene signaler på samme vevssnitt, slik at disse kan vurderes med mikroskopering under kraftig lys. Settet inneholder nok reagenser til 20 tester. ( ) P04131NO_01_SK / p. 1/33

2 Innhold Tiltenkt bruk... 3 Sammendrag og forklaring... 3 Arbeidsprinsipp... 3 Reagenser... 4 Materiale som følger med... 4 Materiale som er nødvendig, men som ikke medfølger... 5 Forholdsregler... 7 Oppbevaring Klargjøring av prøver Parafininnstøpte vevssnitt BRUKSANVISNING A. Tilberedning av reagenser A.1 Forbehandlingsløsning A.2 Stringensvaskebuffer A.3 Vaskebuffer A.4 Etanolserie A.5 Vaskebuffer A.6 Rød kromogenløsning A.7 Blå kromogenløsning A.8 Kontrastfarge B. Fargingsprosedyre B.1 Merknader B.2 Avparafinisering B.3 Fargingsprotokoll B.3.1 Manuell immunokjemisk fargingsprotokoll B.3.2 Automatisk immunokjemisk fargingsprotokoll (Dako Autostainer-instrumenter) Bruk av et feltmikroskop med kraftig lys Kvalitetskontroll Tolkning av farging Begrensninger Utførelsesegenskaper Feilsøking Tillegg Tillegg Referanser Symbolforklaring ( ) P04131NO_01_SK / p. 2/33

3 Tiltenkt bruk Til in vitro-diagnostisk bruk HER2 CISH pharmdx -settet er beregnet for tofarget kromogen påvisning av signaler som oppnås ved direkte merkede in situ-hybridiseringsprøver rettet mot HER2-genet og den centromeriske regionen på kromosom 17. Settet er utviklet for kvalitativ påvisning av HER2- genstatusen i formalinfikserte, parafininnstøpte brystkreftvevsprøver. Røde og blå kromogene signaler genereres på samme vevssnitt, slik at disse kan vurderes med mikroskopering under kraftig lys. CISH-prosedyren kan utføres manuelt eller automatisk ved å bruke Dako Autostainer-instrumenter. HER2 CISH pharmdx -settet er beregnet brukt som et hjelpemiddel i bedømmingen av pasienter der behandling med Herceptin (trastuzumab) overveies. Resultater fra HER2 CISH pharmdx -settet er ment for bruk som supplement til den klinikopatologiske informasjonen som for tiden brukes til å beregne prognose i fase II hos nodepositive brystkreftpasienter. Sammendrag og forklaring Humant HER2-gen (også kjent som ERBB2 eller NEU) befinner seg på kromosom 17 og koder HER2-proteinet eller p185 HER2. HER2-proteinet er en membranreseptortyrosinkinase med homologi til den epidermiske vekstfaktorreseptoren (EGFR eller HER1) (1 2). HER2-genet finnes i 2 kopier i alle normale diploide celler. I en fraksjon av pasienter med brystkreft amplifiseres HER2-genet som en del av prosessen ved malign transformasjon og tumorprogresjon (3 8). HER2-genamplifikasjonen fører generelt sett til overuttrykk av HER2-proteinet på overflaten av brystkreftceller (9). Amplifisering av HER2-genet og/eller overuttrykk av dets protein har blitt demonstrert i % av brystkrefttilfellene. Denne oppreguleringen er forbundet med dårlig prognose, økt risiko for tilbakekomst samt lavere samlet overlevelse. Flere studier har vist at HER2-status korrelerer med sensitivitet eller resistens overfor bestemte kjemoterapiregimer (10). Demonstrasjon av høyt HER2-proteinoveruttrykk eller HER2-genamplifikasjon er avgjørende for å begynne terapi med Herceptin, et monoklonalt antistoff for HER2-protein. Kliniske undersøkelser har vist at pasienter med tumorer som har høyt overuttrykk av HER2-protein og/eller amplifikasjon av HER2-genet, har størst fordel ved Herceptin (11). Arbeidsprinsipp HER2 CISH pharmdx -settet inneholder alle reagensene som er nødvendig for å fullføre en CISH-prosedyre for formalinfikserte, parafininnstøpte (FFPE) vevssnittprøver (unntatt hematoksylin for kontrastfarging). Etter avparafinisering og rehydrering varmes prøvene opp i forbehandlingsløsning i 10 minutter. Det neste trinnet innbefatter en proteolytisk nedbrytning ved bruk av bruksklar Pepsin, enten ved romtemperatur eller ved 37 C. Op timal inkubasjonstid for Pepsin avhenger av fikseringshistorikken til vevet og skal bestemmes av brukeren, men 8 minutter ved romtemperatur eller 2 minutter ved 37 C passer for de fleste prøver. Ved å følge fremgangsmåtene for oppvarming og proteolytisk forbehandling, bruker dette settet en bruksklar FISH-prøveblanding basert på en kombinasjon av PNA- (peptidnukleinsyre)(12) og DNA-teknologi. Prøveblandingen består av en blanding av Texas Red-merkede DNA-prøver som dekker en 218 kb region inkludert HER2-genet på kromosom 17, samt en blanding av fluorescein-merkede PNA-prøver rettet mot den centromeriske regionen av kromosom 17 (CEN-17). Den spesifikke hybridiseringen til de to målene resulterer i dannelse av et tydelig rødt fluorescerende signal ved hver HER2-genlokus og et tydelig grønt fluorescerende signal ved alle kromosom 17-centromere. For å forminske bakgrunnsfarging, inneholder prøveblandingen også umerkede PNA-blokkerende prøver. Etter stringensvask og skylling i to forskjellige vaskebuffere, omdannes de fluorescerende prøvesignalene til kromogene signaler ved hjelp av en immunhistokjemisk fargingsprosedyre. Det første trinnet er å blokkere endogen peroksidase med ferdiglaget peroksidaseblokk, etterfulgt av inkubasjon med ferdiglaget CISHantistoffblanding som består av anti-fitc som er konjugert med pepperrot-peroksidase (HRP) ( ) P04131NO_01_SK / p. 3/33

4 og anti-texas Red som er konjugert med alkalisk fosfatase (AP). Deretter blir vevsprøvene inkubert med rød kromogenløsning, etterfulgt av inkubering med blå kromogenløsning. Den enzymatiske forandringen etter tilsetningen av kromogenene resulterer i at det dannes synlige røde og blå sluttprodukter på antigenstedet (FISH-prøver). På den måten blir de røde fluorescerende signalene konvertert til røde kromogene signaler, og de grønne fluorescerende signalene blir konvertert til blå kromogene signaler. Prøvene blir deretter kontrastfarget og lagt under dekkglass. Resultatene vurderes ved hjelp av et feltmikroskop med kraftig lys. Ved bruk av et feltmikroskop med kraftig lys, lokaliseres tumorceller, og opptellingen av de røde (HER2) og blå (CEN-17) signalene gjennomføres. Deretter beregnes HER2/CEN-17-forholdet. Normale celler i de analyserte vevssnittene fungerer som en intern positiv kontroll for forbehandling og hybridiseringseffektivitet. Se avsnittet Tolkning av farging for flere opplysninger. Reagenser Materiale som følger med Materialene som er opplistet nedenfor er tilstrekkelig til 20 tester (en test er definert som et målområde på 22 mm x 22 mm). Antallet tester er basert på bruk av 5 8 dråper (250 µl per objektglass) fra flaske 2, 10 µl per objektglass fra flaske 3, 400 µl per objektglass fra flaske 7 og 8 og 400 µl rød kromogen (flaske 11) og blå kromogen (flaske 12) fortynnet i deres respektive substratbuffere (flaske 9 og 10). Settet inneholder tilstrekkelig materiale for 20 tester i 10 individuelle fargekjøringer. Settet inneholder tilstrekkelig materiale for 20 tester i 5 individuelle fargekjøringer for farging på Dako Autostainer Link-plattformen. Settet HER2 CISH pharmdx leveres som to separate elementer: SK109 flaske 2 (Pepsin) leveres i en separat eske og resten av reagensene i settets eske. SK109 flaske 2 (Pepsin) leveres på tørris og settets eske leveres på kjølepakker. For å sikre at flaske 2 (Pepsin) ikke har blitt utsatt for høye temperaturer under transport, skal det fortsatt være igjen tørris ved mottak. Flaske 1 Flaske 2 Flaske 3 Flaske 4 Flaske 5 Forbehandlingsløsning (20x) 150 ml, konsentrert 20x MES (2-[N-morfolino]etansulfosyre) buffer. Pepsin 7,5 ml, klar til bruk Pepsinløsning, ph 2,0; inneholder stabiliseringsmiddel og et antimikrobielt middel. HER2/CEN-17 prøveblanding 200 µl, klar til bruk Blanding av Texas Red-merkede HER2 DNA-prøver og fluorescein-merkede CEN-17 PNA-prøver; leveres i hybridiseringsbuffer med 45 % formamid, stabiliseringsmiddel samt umerkede PNA-blokkerende prøver. Stringensvaskebuffer (20x) 150 ml, konsentrert 20x SSC (saltløsningsnatriumsitrat) buffer med rengjøringsmiddel. Vaskebuffer 1 (20x) 500 ml, konsentrert 20x Tris/HCl-buffer. ( ) P04131NO_01_SK / p. 4/33

5 Flaske 6 Flaske 7 Flaske 8 Flaske 9 Flaske 10 Flaske 11 Flaske 12 Flaske 13 Vaskebuffer 2 (10x) 1 l, konsentrert 10x Tris-bufret saltvannsløsning med 0,05 % Tween 20. Peroksidaseblokk 9 ml, klar til bruk. 3 % hydrogen-peroksidase som inneholder 15 mmol/l natriumazid (NaN 3 ). CISH-antistoffblanding 9 ml, klar til bruk. Blanding av antistoff som er konjugert i pepperrot-peroksidase med fluorescein, og antistoff som er konjugert i alkalisk fosfatase med Texas Red. Leveres i 50 mmol/l Tris-buffer med stabiliseringsmiddel, konserveringsmiddel, ph 7,5. Rød substratbuffer 12 ml, substratbuffer for fortynning av rødt kromogen. Blå substratbuffer 12 ml, substratbuffer for fortynning av blått kromogen. Rødt kromogen 120 µl, skal fortynnes med rød substratbuffer (flaske 9). Blått kromogen 2 x 550 µl, skal fortynnes med blå substratbuffer (flaske 10). CISH-monteringsmiddel 5 ml, permanent monteringsmiddel uten alkohol eller xylen Dekkglassforsegling 1 tube, klar til bruk Løsning for avtakbar forsegling av dekkglass. Reagensflasker som kan fylles av bruker 5 ml, 6 flasker* 12 ml, 2 flasker** For bruk på Dako Autostainer Link-plattform * Ved kjøring av mer enn 4 separate farginger, er det behov for flere flasker. ** Bruk 12 ml-flaskene hvis alle 20 tester skal behandles i én fargekjøring. Materiale som er nødvendig, men som ikke medfølger Laboratoriereagenser: ( ) P04131NO_01_SK / p. 5/33

6 Destillert eller avionisert vann Etanol, 96 % Xylen eller xylensubstitutter Dako Hematoxylin, kode S3301 Reagensflasker som kan fylles av bruker: 12 ml (kode SK201) eller 5 ml (kode SK200) for fortynnet hematoksylin) Laboratorieutstyr: Lofritt papirhåndkle Regulerbare pipetter Kalibrert delvis neddykkingstermometer (område C) Kalibrert overflatetermometer (område C)*** Dekkglass (22 mm x 22 mm for 10 µl hybridisering og eks. 50 mm x 24 mm for montering) Tang Avtrekkshette Dako Hybridizer (kode S2450 eller S2451)* + Humidity Control Strips (kode S2452)* Fuktighetskammer Objektglass, Dako Silanized Slides, kode S3003, eller poly-l-lysin-belagte objektglass (se Klargjøring av prøver) Fargekolber eller -bad. Virvelblander (eller tilsvarende) og bordsentrifuge Stoppeklokke (som kan måle 2 30 minutters intervaller) Vannbad med lokk (som kan opprettholde 65 (±2) C til 99 C) Mikrobølgeovn med sensorevne hvis forbehandling utføres ved bruk av mikrobølgeovn (se B3. Fargingsprotokoll, Trinn 1: Forbehandling, metode B) Feltmikroskop med kraftig lys *** Oppvarmingsblokk eller hybridiseringsovn for denaturering (82 (±2) C) og hybridisering (45 (±2) C) sammen med et fuktighetskammer kan brukes som et alternativ til Dako Hybridizer. Ytterligere materiale som kreves for å kunne utføre automatisk farging med Dako Autostainer/Autostainer Plus, inkluderer følgende: Autostainer Reagent Vials (kode S3425) ( ) P04131NO_01_SK / p. 6/33

7 Forholdsregler 1. Til in vitro-diagnostisk bruk. 2. For profesjonelle brukere. 3. Faremerking er ikke påkrevd for flaske 1, forbehandlingsløsning (20x). Sikkerhetsdatablad er tilgjengelig for profesjonelle brukere på forespørsel. 4. Flaske 2, Pepsin, inneholder 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepsin A og <0.1% 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one og 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. Flaske 2 er merket: Fare H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Gir alvorlige etseskader på hud og øyne. Kan utløse en allergisk hudreaksjon. Bruk vernehansker. Bruk vernebriller eller ansiktsvern. Bruk verneklær. VED INNÅNDING: Flytt personen til frisk luft og sørg for at vedkommende har en stilling som letter åndedrettet. Kontakt umiddelbart et GIFTINFORMASJONSSENTER/en lege. VED SVELGING: Kontakt umiddelbart et GIFTINFORMA- SJONS-SENTER/en lege. IKKE framkall brekning. VED HUDKONTAKT (eller håret): Tilsølte klær må fjernes straks. Skyll/dusj huden med vann. Kontakt umiddelbart et GIFTINFORMASJONSSENTER/en lege. VED KONTAKT MED ØYNENE: Kontakt umiddelbart et GIFTINFORMASJONSSENTER/en lege. Oppbevares innelåst. Disponer innholdet og emballasje i henhold til lokale, regionale, nasjonale og internasjonale forskrifter. 5. Flaske 3, HER2/CEN-17 prøveblanding inneholder 25-<50% formamid og 1-<3% natriumklorid. Flaske 3 er merket: H360D P201 P280 Fare P308 + P313 P405 P501 Kan gi fosterskader. Innhent særskilt instruks før bruk. Bruk vernehansker. Bruk vernebriller eller ansiktsvern. Bruk verneklær. Ved eksponering eller mistanke om eksponering: Søk legehjelp. Oppbevares innelåst. Disponer innholdet og emballasje i henhold til lokale, regionale, nasjonale og internasjonale forskrifter. 6. Flaske 4, stringensvaskebuffer (20x), inneholder 10-<25% natriumklorid og 10-<20% 2- amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Flaske 4 er merket: H319 H315 P280 P264 Advarsel Gir alvorlig øyeirritasjon. Irriterer huden. Bruk vernehansker. Bruk vernebriller eller ansiktsvern. Bruk verneklær. Vask hendene grundig etter håndtering. ( ) P04131NO_01_SK / p. 7/33

8 P305 + P351 + P338 VED KONTAKT MED ØYNENE: Skyll forsiktig med vann i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser dersom dette enkelt lar seg gjøre. Fortsett skyllingen. 7. Flaske 5, vaskebuffer 1 (20x), inneholder 10-<25% natriumklorid og 10-<20% trometamol. Flakse 5 er merket: Advarsel H319 H315 P280 P264 P305 + P351 + P338 Gir alvorlig øyeirritasjon. Irriterer huden. Bruk vernehansker. Bruk vernebriller eller ansiktsvern. Vask hendene grundig etter håndtering. VED KONTAKT MED ØYNENE: Skyll forsiktig med vann i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser dersom dette enkelt lar seg gjøre. Fortsett skyllingen. 8. Flaske 6, Vaskebuffer 2 (10x), inneholder 6-<10% natriumklorid, 5-<10% 2-amino-2- (hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride og 0.1-<0.2% 5-bromo-5-nitro-1, 3- dioxane. Flaske 6 er merket: Advarsel H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Gir alvorlig øyeirritasjon. Bruk vernebriller eller ansiktsvern. Vask hendene grundig etter håndtering. VED KONTAKT MED ØYNENE: Skyll forsiktig med vann i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser dersom dette enkelt lar seg gjøre. Fortsett skyllingen. 9. Dekkglassforsegling inneholder 100 % nafta (petroleum), hydrobehandlet lys, og er merket: Fare H225 H304 H411 P280 P210 P241 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P235 P501 Meget brannfarlig væske og damp. Kan være dødelig ved svelging om det kommer ned i luftveiene. Giftig, med langtidsvirkning, for liv i vann. Benytt vernehansker /verneklær/vernebriller/ansiktsskjerm. Holdes borte fra varme, varme overflater, gnister, åpen flamme og andre antenningskilder. Røyking forbudt. Bruk elektrisk materiell /ventilasjonsmateriell/belysningsmateriell som er eksplosjonssikkert. Unngå utslipp til miljøet. VED SVELGING: Kontakt umiddelbart et GIFTINFORMASJONSSENTER/en lege. IKKE framkall brekning. VED HUDKONTAKT (eller håret): Tilsølte klær må fjernes straks. Skyll/dusj huden med vann. Oppbevares kjølig. Disponer innholdet og emballasje i henhold til lokale, regionale, nasjonale og internasjonale forskrifter. ( ) P04131NO_01_SK / p. 8/33

9 10. Flaske 7, peroksidaseblokk, inneholder natriumazid (NaN 3 ), et svært giftig kjemikalie i ren form. Selv om NaN 3 ikke klassifiseres som farlig ved produktets konsentrasjoner, kan stoffet reagere med bly- og kopperrør og danne svært eksplosive metallazider. Ved kassering må det skylles rikelig med vann for å forhindre ansamling av azid i rørene. 11. Faremerking er ikke påkrevd for flaske 11, rødt kromogen. Sikkerhetsdatablad er tilgjengelig for profesjonelle brukere på forespørsel. 12. Flaske 12, blått kromogen, inneholder 0.1-<0.3% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride og er merket: H350 P201 P280 Fare P308 + P313 P405 P501 Kan forårsake kreft. Innhent særskilt instruks før bruk. Bruk vernehansker. Bruk vernebriller eller ansiktsvern. Bruk verneklær. Ved eksponering eller mistanke om eksponering: Søk legehjelp. Oppbevares innelåst. Disponer innholdet og emballasje i henhold til lokale, regionale, nasjonale og internasjonale forskrifter. 13. Flaske 13, CISH-monteringsmiddel, inneholder 50-<75% nafta (petroleum), hydrogenbehandlet tung og er merket: Fare H304 H336 P271 P261 P304 + P340 P301 + P310 + P331 P405 P501 Kan være dødelig ved svelging om det kommer ned i luftveiene. Kan forårsake døsighet eller svimmelhet. Brukes bare utendørs eller i et godt ventilert område. Unngå innånding av støv/røyk/gass/tåke/damp/aerosoler. VED INNÅNDING: Flytt personen til frisk luft og sørg for at vedkommende har en stilling som letter åndedrettet. VED SVELGING: Kontakt umiddelbart et GIFTINFORMASJONS-SENTER/en lege. IKKE framkall brekning. Oppbevares innelåst. Disponer innholdet og emballasje i henhold til lokale, regionale, nasjonale og internasjonale forskrifter. 14. Pasientprøver, før og etter fiksering, og alle materialer som er utsatt for slike, skal håndteres som om de har evne til å overføre infeksjon og avhendes under iakttakelse av relevante forholdsregler (13). Pipetter aldri reagenser med munnen, og unngå at reagenser og prøver kommer i kontakt med hud og slimhinner. Hvis reagens kommer i kontakt med følsomme områder, må det skylles med rikelige mengder vann. 15. Minimer mikrobiell kontaminering av reagenser for å unngå feilaktige resultater. 16. Andre inkubasjonstider og temperaturer, eller andre metoder enn de som er spesifisert, vil kunne gi feilaktige resultater. 17. Andre vevsfikseringsmetoder og prøvertykkelser enn de som er spesifisert, kan påvirke vevsmorfologi og/eller signalintensitet. 18. Unngå fordampning av HER2/CEN-17 prøveblanding i løpet av hybridisering ved å sørge for tilstrekkelig fuktighet i hybridiseringskammeret. 19. Reagenser har blitt optimalt fortynnet. Ytterligere fortynning kan forårsake tap av ytelse. 20. Ubrukt løsning skal avhendes i henhold til lokale og nasjonale forskrifter. ( ) P04131NO_01_SK / p. 9/33

10 21. Bruk egnet personlig verneutstyr for å unngå kontakt med øyne og hud. HMS-datablad er tilgjengelig på forespørsel. 22. Det anbefales å følge standard prosedyre når det gjelder service og vedlikehold av Dako Autostainer-instrumentet. 23. Personer som lider av fargeblindhet må utvise varsomhet ved scoring av prøver. 24. Riktige håndteringsprosedyrer bør brukes med dette produktet, i likhet med alle andre produkter som er utvunnet fra biologiske kilder. 25. Før klaring av blå kromogenløsning, skal blått kromogen (flaske 12) blandes grundig for å sikre at kromogenet er fullstendig oppløst. 26. Det anbefales å bruke to dryppsoner med 200 µl i hver (1 og 3) på Dako Autostainerinstrumentet for å dekke hele objektglassområdet og forhindre uttørking av store vevssnitt Oppbevaring Settet HER2 CISH pharmdx leveres som to separate elementer: SK109 flaske 2 (Pepsin) leveres i en separat eske og resten av reagensene i settets eske. SK109 flaske 2 (Pepsin) leveres på tørris og settets eske leveres på kjølepakker. For å sikre at flaske 2 (Pepsin) ikke har blitt utsatt for høye temperaturer under transport, skal det fortsatt være igjen tørris ved mottak. Alle reagensene i settet skal oppbevares ved 2 8 C, unntatt flaske 13 (CISHmonteringsmedium). Flaske 13 (CISH-monteringsmedium) skal oppbevares i romtemperatur. Flaske 3, 7 og 8 skal oppbevares mørkt ved 2 8 C. Pepsin og rødt kromogen (flaske 2 og 11) kan påvirkes negativt hvis de utsettes for varme. Ikke la disse komponentene oppbevares i romtemperatur. Ikke bruk settet etter utløpsdatoen som er stemplet på settets eske. Hvis reagensene oppbevares under andre forhold enn de som er spesifisert i dette pakningsvedlegget, må reagensytelsen valideres av brukeren (14). Det er ingen tydelige tegn som indikerer at dette produktet er ustabilt. Derfor er det viktig å evaluere normale celler i det analyserte vevssnittet. Hvis det observeres uventet fargingsmønster som ikke kan forklares med variasjoner i laboratorieprosedyrer, og det er mistanke om at det er et problem med HER2 CISH pharmdx -settet, ta kontakt med vår tekniske avdeling. Klargjøring av prøver Prøver fra biopsier, eksisjoner eller reseksjoner må håndteres slik at vevet bevares til CISHanalyse. Standardmetoder for vevsbehandling ved immunhistokjemisk farging skal brukes på alle prøver (15). Parafininnstøpte vevssnitt Kun vevssnitt som er preservert i nøytralt bufret formalin og parafininnstøpt egner seg for bruk. Prøver skal f.eks. være blokkert i en tykkelse på 3 eller 4 mm og fiksert i timer i nøytral bufret formalin. Vevene dehydreres i gradert serie av etanol og xylen, etterfulgt av infiltrering av smeltet parafin som ikke holder mer enn 60 C. Korr ekt fikserte og innstøpte vev vil holde seg ubegrenset før snitt og objektglassmontering ved lagring på kjølig sted (15 25 C) (15 16). Andre fiksativer egner seg ikke. Vevsprøver skal skjæres i snitt på 4 6 µm. Det anbefales at vevssnitt monteres på Dako Silanized Slides, kode S3003, eller poly-l-lysinbelagte objektglass. Prøver skal analyseres innen 4 6 måneder etter snitt ved lagring i romtemperatur (20 25 C). ( ) P04131NO_01_SK / p. 10/33

11 BRUKSANVISNING A. Tilberedning av reagenser Det er praktisk å klargjøre følgende reagenser før farging: Dag 1, prøvehybridisering: A.1 Forbehandlingsløsning Det kan oppstå krystaller i flaske 1, men de løser seg opp ved romtemperatur. Se til at det ikke finnes noen krystaller før klargjøring av reagensen. Fortynn en tilstrekkelig mengde fra flaske 1 (forbehandlingsløsning 20x) ved å fortynne konsentratet 1:20 i destillert eller avionisert vann. Ubrukt fortynnet løsning kan oppbevares ved 2 8 C i én måned. Kast fortynnet løsning hvis den får et tåkete utseende. A.2 Stringensvaskebuffer Fortynn en tilstrekkelig mengde fra flaske 4 (stringensvaskebuffer 20x) ved å fortynne konsentratet 1:20 i destillert eller avionisert vann. Ubrukt fortynnet buffer kan oppbevares ved 2 8 C i én måned. Kast fortynnet buffer hvis den f år et tåkete utseende. A.3 Vaskebuffer 1 Fortynn en tilstrekkelig mengde fra flaske 5 (vaskebuffer 1 20x) ved å fortynne konsentratet 1:20 i destillert eller avionisert vann. Ubrukt fortynnet buffer kan oppbevares ved 2 8 C i én måned. Kast fortynnet buffer hvis den får et tåkete utseende. A.4 Etanolserie Klargjør 3 glass med respektivt 70 %, 85 % og 96 % etanol fra en 96 % etanolløsning. Oppbevar de tildekkede glassene ved romtemperatur eller ved 2 8 C, og bruk til maksimalt 200 objektglass. Kast løsningene hvis de får et tåkete utseende. Dag 2, immunhistokjemisk farging: Alle reagensene forbundet med den immunohistokjemiske fargingen (flaske 6 13), unntatt rødt kromogen (flaske 11), skal stabiliseres ved romtemperatur (20 25 C) før reagensene tilberedes. Reagensene må beskyttes mot lys under stabiliseringen. A.5 Vaskebuffer 2 Fortynn tilstrekkelig mengde vaskebuffer 2 (flaske 6) (1:10) i destillert eller avionisert vann for fargingsprosedyren som er planlagt. Ubrukt fortynnet løsning kan oppbevares ved 2 8 C i én måned. Kast løsningen hvis den får et tåkete utseende. Vaskebuffer 2 kan byttes ut med Dako Wash Buffer, kode S3006. A.6 Rød kromogenløsning Før du fjerner en alikvot rødt kromogen fra flaske 11, vipp eller bland løsningen og sentrifuger kort. Tilbered tilstrekkelig rød kromogenløsning, men ikke mindre enn 1 ml. Forholdet er 10 µl per 1 ml og følgende prosedyre gir 1,01 ml rød kromogenløsning: Overfør 1 ml rød kromogenbuffer fra flaske 9 til en passende tomflaske. Tilsett 10 µl rødt kromogen fra flaske 11 og bland godt. Merk: Tilberedt rød kromogenløsning må brukes innen 20 minutter. For best resultat bør rød kromogenløsning tilberedes umiddelbart før bruk. A.7 Blå kromogenløsning Før du fjerner en alikvot blått kromogen fra flaske 12, bland kromogenløsningen grundig og sentrifuger kort for å fjerne væsken fra lokket. Fortsett umiddelbart med klargjøringen av blå kromogenløsning. Tilbered tilstrekkelig blå kromogenløsning til at det holder til hele kjøringen. ( ) P04131NO_01_SK / p. 11/33

12 For å klargjøre 1,075 ml blå kromogenløsning: Overfør 1 ml blå substratbuffer fra flaske 10 til en passende tomflaske. Tilfør 75 µl av det godt blandede blå kromogenet fra flaske 12 og bland godt. Hvis det er tilstrekkelig med en mindre mengde blå kromogenløsning, kan skalaen reduseres tilsvarende f.eks. for klargjøring av 430 µl blå kromogenløsning, tilsett 30 µl godt blandet blått kromogen fra flaske 12 til 400 µl blå substratbuffer fra flaske 10. Merk:Det anbefales at blå kromogenløsning tilberedes minst 30 minutter før bruk. Den blå kromogenløsningen må brukes innen 8 dager ved oppbevaring i 2 8 C på et mørkt sted. A.8 Kontrastfarge Fortynn tilstrekkelig mengde Dako Hematoxylin (kode S3301), 1:5 i destillert eller avionisert vann for fargingsprosedyren som er planlagt. Ubrukt fortynnet hematoksylin kan lagres ved C i én dag. ( ) P04131NO_01_SK / p. 12/33

13 B. Fargingsprosedyre B.1 Merknader Brukeren skal lese disse instruksjonene nøye og gjøre seg kjent med alle komponentene før bruk (se Forholdsregler). Alle reagenser skal stabiliseres ved relevant temperatur før bruk på følgende måte: Flaske 1: Den fortynnede forbehandlingsløsningen skal stabiliseres ved C hvis vannbad brukes til forbehandlingen (B3. Fargingsprotokoll, Trinn 1: Forbehandling, Metode A). Hvis mikrobølgeovn med sensorevne brukes til forbehandlingen (B3. Fargingsprotokoll, Trinn 1: Forbehandling, Metode B), skal den fortynnede forbehandlingsløsningen stabiliseres ved romtemperatur C. Flaske 2: Pepsin skal oppbevares kontinuerlig kjølig ved 2 8 C. Flaske 3: HER2/CEN-17 prøveblanding kan påføres ved hvilken som helst temperatur fra 2 25 C. Flaske 4: Fortynnet stringensvaskebuffer skal stabiliseres ved henholdsvis romtemperatur og 65 (±2) C før bruk. Flaske 5: Fortynnet vaskebuffer 1 skal stabiliseres ved romtemperatur C. Flaske 6: Vaskebuffer 2 (10x) skal stabiliseres ved romtemperatur C før fortynning i romtemperert destillert eller avionisert vann. Flaske 7: Peroksidaseblokk skal stabiliseres ved romtemperatur C. Flaske 8: CISH-antistoffblanding skal stabiliseres ved romtemperatur C. Flaske 9: Rød substratbuffer skal stabiliseres ved romtemperatur C. Flaske 10: Blå substratbuffer skal stabiliseres ved romtemperatur C. Flaske 11: Rødt kromogen skal oppbevares kontinuerlig kjølig ved 2 8 C. Flaske 12: Blått kromogen skal stabiliseres ved romtemperatur C. Flaske 13: Monteringsmedium skal stabiliseres ved romtemperatur C. Dekkglassforsegling: Dekkglassforsegling kan påføres ved hvilken som helst temperatur fra 2 25 C. Alle trinnene skal utføres ved angitt temperatur. Prosedyren inkluderer et antall dehydreringer fulgt av tørking av vevssnittene. Sørg for at vevssnittene er helt tørre før du fortsetter til neste trinn. Ikke la vevssnitt tørke i løpet av de andre prosedyretrinnene. Hvis fargeprosedyren må avbrytes, kan objektglassene oppbevares i vaskebuffer 1 etter avparafiniseringstrinnet i inntil 1 time ved romtemperatur (20 25 C) uten at resultatene påvirkes. Manuell immunhistokjemisk farging: Alle inkubasjonstrinnene skal utføres ved romtemperatur (20 25 C). Automatisk immunhistokjemisk farging: Dako Autostainer/Autostainer Plus-instrumenter: Alle inkubasjonstrinnene skal utføres ved romtemperatur (20 25 C). De relevante mengdene fra flaske 7 (peroksidaseblokk) og flaske 8 (CISH-antistoffblanding) skal overføres til Dako Autostainer Reagent Vials (kode S3425) og de resterende reagensene (rød og blå kromogenløsning, fortynnet hematoksylin og vaskebuffer 2 for 5 minutters inkubasjon etter kontrastfarging) skal tilberedes direkte i Autostainer Reagent Vials (kode S3425). Velg to dryppsoner (1 og 3) med 200 µl i hver for å forhindre ujevn farging og tørking av objektglassene. Dako Autostainer Link-instrumenter: Alle inkubasjonstrinnene skal utføres ved romtemperatur (20 25 C). Flaske 7 (peroksidaseblokk) og flaske 8 (CISH-antistoffblanding) kan lastes direkte på instrumentet, mens rød og blå kromogenløsninger og hematoksylinløsningen skal tilberedes i flasker som kan fylles av brukeren. Reagensene som følger med settet er tilstrekkelig for 20 tester i 5 individuelle ( ) P04131NO_01_SK / p. 13/33

14 kjøringer. Standardinnstilling er én dryppsone med 200 µl reagens. Velg manuelt to dryppsoner (1 og 3) med 200 µl i hver for å forhindre ujevn farging og tørking av objektglassene. Ved kjøring av 20 prøver i én fargekjøring, bruk 12 ml flasker som kan fylles av brukeren til klargjøring av rød og blå kromogenløsning. Vær oppmerksom på inkompatibilitet med andre protokoller i samme Autostainer-kjøring på grunn av stabiliteten til rød kromogenløsning etter tilberedning. For å utnytte den kortvarige stabiliteten til rød kromogenløsning, kan maksimalt 30 objektglass farges på instrumentet i én fargekjøring. B.2 Avparafinisering Avparafinisering og rehydrering: Før analysen utføres, må vevssnittene avparafiniseres for å fjerne innstøpningsmedium og rehydreres. Unngå ufullstendig fjerning av parafin. Resterende innstøpningsmedium vil føre til økt ikke-spesifikk farging. Dette trinnet skal utføres ved romtemperatur (20 25 C). 1. Plasser objektglassene i et xylenbad og inkuber i 5 (±1) minutter. Skift bad og gjenta én gang. 2. Bank forsiktig av overflødig væske og plasser objektglassene i 96 % etanol i 2 (±1) minutter. Skift bad og gjenta én gang. 3. Bank forsiktig av overflødig væske og plasser objektglassene i 70 % etanol i 2 (±1) minutter. Skift bad og gjenta én gang. 4. Bank forsiktig av overflødig væske og plasser objektglassene i fortynnet vaskebuffer 1 (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i minst 2 minutter. Begynn fargeprosedyren slik som beskrevet i avsnitt B.3, trinn 1, Forbehandling. Hvis fargeprosedyren må avbrytes, kan objektglassene oppbevares i vaskebuffer 1 etter avparafiniseringstrinnet i inntil 1 time ved romtemperatur (20 25 C) uten at resultatene påvirkes. Xylen- og alkoholløsningene skal skiftes etter 200 objektglass eller mindre. Det kan benyttes xylensubstitutter. MERK: Reagenser og instruksjoner som medfølger i dette settet er utviklet for optimal ytelse. Ytterligere fortynning av reagenser eller endring av inkubasjonstemperaturer kan gi feilaktige eller ikke-samsvarende resultater. Forskjeller i vevsbehandling og tekniske prosedyrer i brukerens laboratorium kan gjøre analyseresultatene ugyldige. Det anbefales regelmessig bruk av interne kontrollobjektglass for ekstern kvalitetskontroll. B.3 Fargingsprotokoll DAG 1 Trinn 1: Forbehandling Forbehandlingen kan utføres enten ved bruk av vannbad, slik som beskrevet i metode A) eller alternativt ved bruk av mikrobølgeovn med sensorevne, slik som beskrevet under i metode B). Metode A) Forbehandling ved bruk av vannbad: Fyll fargingsglassene, f.eks. Coplin-glass, med fortynnet forbehandlingsløsning (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.1). Plasser fargingsglassene som inneholder forbehandlingsløsning i vannbad. Varm opp vannbadet og forbehandlingsløsningen til C. Mål temperaturen på innsiden av glasset med et kalibrert termometer for å sikre riktig temperatur. Dekk til glassene med lokk for å stabilisere temperaturen og unngå fordampning. Senk ned de romtempererte avparafiniserte snittene i den forvarmede forbehandlingsløsningen i fargingsglassene. Kontroller temperaturen på nytt og inkuber i 10 (±1) minutter ved C. Fjern hele glasset med objektglassene fra vannbadet. Fjern lokket og la objektglassene kjøle seg ned i forbehandlingsløsning i 15 minutter ved romtemperatur. Overfør objektglassene til et glass med fortynnet vaskebuffer 1 (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Skift vaskebuffer 1 og senk ned snittene i ytterligere 3 minutter. ( ) P04131NO_01_SK / p. 14/33

15 Metode B) Forbehandling ved bruk av mikrobølgeovn med sensorevne: Fyll en plastbeholder med fortynnet, romtemperert (20 25 C) forbehandlingsløsning. Senk ned de avparafinerte snittene i forbehandlingsløsningen, dekk til beholderen med et gjennomhullet lokk og plasser den i mikrobølgeovnen. Velg kokesensorfunksjonen og et program som går i 10 minutter etter at koketemperaturen er oppnådd*. Etter 10 minutters inkubasjonstid, ta beholderen med snitt ut av ovnen, fjern lokket og kjøl ned i 15 minutter ved romtemperatur. Overfør objektglassene til en beholder med fortynnet vaskebuffer 1 og senk ned glassene i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Skift vaskebuffer 1 og senk ned snittene i ytterligere 3 minutter. *Bruk av en mikrobølgeovn med sensorevne betyr at ovnen må inkludere en sensor og programmer som innledningsvis varmer opp forbehandlingsløsningen til kokepunktet og deretter opprettholder nødvendig forbehandlingstemperatur (over 95 C) mens forhånds innstilt tid nedtelles (10 (±1) minutter). Noen mikrobølgeovnsmodeller med sensorevne har kanskje ikke noe alternativ for å fritt stille inn en nedtellingstid. Hvis modellen kun inkluderer forhåndsinnstilte programmer, se til å velge et program som opprettholder den nødvendige forbehandlingstemperaturen (over 95 C) i minst 10 (±1) minutter, og stopp programmet manuelt etter 10 (±1) minutter. MERK: Forbehandlingsløsningen er utviklet kun til engangsbruk. Skal ikke brukes på nytt. Trinn 2: Pepsin, klar til bruk Pepsininkubasjon kan utføres enten ved romtemperatur (20 25 C), som beskrevet i metode A) eller alternativt ved 37 C, som beskreve t i metode B). Bank forsiktig av vaskebuffer 1. Bruk en lofri klut (som en absorberende serviett eller gas) og tørk forsiktig rundt prøven for å fjerne resterende væske og holde reagensene innen det foreskrevne området. Påfør 5 8 dråper (250 µl) kald (2 8 C) Pepsin (fla ske 2) for å dekke prøven. Pepsin skal alltid oppbevares ved 2 8 C. Metode A) Inkubasjon ved romtemperatur: Inkuber i 8 minutter ved romtemperatur (20 25 C). En inkubasjonstid på 8 minutter vil være tilstrekkelig for de fleste prøvene, men den optimale inkubasjonstiden kan avhenge av vevsfikseringshistorikken og/eller tykkelse på prøven, og skal bestemmes av brukeren. Bank forsiktig av Pepsin, og senk ned snittene i fortynnet vaskebuffer 1 (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Erstatt fortynnet vaskebuffer 1 og senk ned snittene i ytterligere 3 minutter. Fortsett til dehydrering. Metode B) Inkubasjon ved 37 C: Plasser prøven med Pepsin på en varmeblokk ved 37 C f.eks. Dako Hybridizer og inkuber i 2 minutter. En inkubasjonstid på 2 minutter vil være tilstrekkelig for de fleste prøvene, men den optimale inkubasjonstiden kan avhenge av vevsfiksering og/eller tykkelse på prøven, og skal bestemmes av brukeren. Bank forsiktig av Pepsin, og senk ned snittene i fortynnet vaskebuffer 1 i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Skift vaskebuffer 1 og senk ned snittene i ytterligere 3 minutter. Fortsett til dehydrering. Dehydrer vevssnittene gjennom en gradert serie etanol (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.4): 2 minutter i 70 % etanol, 2 minutter i 85 % etanol og 2 minutter i 96 % etanol. La vevssnitt lufttørke fullstendig. Trinn 3: HER2/CEN-17-prøveblanding, klar til bruk Følgende trinn skal utføres i en avtrekkshette. Påfør 10 µl HER2/CEN-17-prøveblanding (flaske 3) på midten av vevssnittet. Plasser umiddelbart et 22 mm x 22 mm dekkglass over prøveblandingen, og la den spre seg jevnt under dekkglasset. Unngå luftbobler. Hvis det observeres luftbobler, bank dem forsiktig bort fra vevet ved bruk av tang. ( ) P04131NO_01_SK / p. 15/33

16 Forsegle dekkglassene med dekkglassforsegling ved å støte ut forseglingen rundt kanten av dekkglasset. La dekkglassforseglingen overlappe dekkglasset og objektglasset, slik at det dannes en forsegling rundt dekkglasset. Se til at dekkglassforseglingen dekker hele kanten av dekkglasset. Klargjør Dako Hybridizer* (kode S2450 eller S2451) for en hybridiseringskjøring. Start Hybridizer og velg et program som vil denaturere ved 82 C i 5 minutter og hybridisere over natten (14 20 timer) ved 45 C (se bruksanvisn ingen for Dako Hybridizer for detaljer). Plasser objektglassene i Hybridizeren. Se til at Humidity Control Strips (kode S2452) er mettet og optimale for bruk. Se til at lokket er godt lukket, og start programmet. *Instrumentering som tillater lignende forhold som de som beskrives ovenfor, kan brukes til denaturering og hybridisering. DAG 2 Trinn 4: Stringensvask Fyll to fargingsglass, f.eks. Coplin-glass, med fortynnet stringensvaskebuffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.2). Det anbefales et minstevolum på 100 ml eller 15 ml per objektglass i hvert glass. Plasser ett av fargingsglassene som inneholder fortynnet stringensvaskebuffer i romtemperatur i en avtrekkshette og det andre i et vannbad. Varm opp vannbadet og den fortynnede stringensvaskebufferen til 65 (±2) C. Se til at te mperaturen har stabilisert seg. Dekk til glasset med lokk for å stabilisere temperaturen og unngå fordampning. Mål temperaturen inne i vannbadglasset med et kalibrert termometer for å sikre at det holder riktig temperatur. Stringensvaskebufferen inneholder rengjøringsmiddel og kan bli uklar ved 65 C. Dette vil ikke påvirke ytelsen. Ved bruk av tang eller hansker, ta objektglassene ut fra hybridiseringskammeret og fjern forsiktig dekkglassforseglingen og dekkglasset, og plasser objektglassene i det romtempererte forvaskglasset, ett om gangen. Så snart alle dekkglassene er fjernet, overføres objektglassene fra det romtempererte forvaskglasset til glasset på 65 (±2) C i vannbade t. Utfør stringensvask i nøyaktig 10 minutter (IKKE vent på at temperaturen er tilbake på 65 (±2) C før inkubasjonstiden startes). Fjern objektglassene fra den fortynnede stringensvaskebufferen, og senk ned snittene i fortynnet vaskebuffer 1 i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Skift ut fortynnet vaskebuffer 1 og senk ned snittene i ytterligere 3 minutter. B.3.1 Manuell immunokjemisk fargingsprotokoll Utfør alle trinnene, unntatt tørkingen, ved romtemperatur (20 25 C). Trinn 5: Vask Fjern objektglassene fra fortynnet vaskebuffer 1 og senk ned snittene i fortynnet vaskebuffer 2 (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.5) i 3 minutter. Trinn 6: Peroksidaseblokk Bank forsiktig bort overflødig buffer. Bruk et lofritt papirhåndkle og tørk forsiktig rundt prøven for å fjerne gjenværende væske og holde reagensene innenfor det bestemte området. Dekk prøven med 400 µl peroksidaseblokk. Inkuber i 5 (±1) minutter. Senk ned i fortynnet vaskebuffer 2 i 3 minutter. Gjenta én gang i ny vaskebuffer 2. Trinn 7: CISH-antistoffblanding Bank forsiktig bort overflødig buffer og tørk av objektglassene som forklart tidligere. Dekk prøven med 400 µl CISH-antistoffblanding. Inkuber i 30 (±1) minutter i et fuktighetskammer. Senk ned i fortynnet vaskebuffer 2 i 3 minutter. Gjenta én gang i ny vaskebuffer 2. ( ) P04131NO_01_SK / p. 16/33

17 Trinn 8: Rød kromogenløsning (tilberedes umiddelbart før bruk, se BRUKSANVISNING, avsnitt A.6) Bank forsiktig bort overflødig buffer og tørk av objektglassene som forklart tidligere. Dekk prøven med 400 µl rød kromogenløsning. Inkuber i 10 minutter i et fuktighetskammer. Senk ned i fortynnet vaskebuffer 2 i 3 minutter. Gjenta én gang i ny vaskebuffer 2. Trinn 9: Blå kromogenløsning (tilberedes 30 i minutter 8 dager før bruk, se BRUKSANVISNING, avsnitt A.7) Bank forsiktig bort overflødig buffer og tørk av objektglassene som forklart tidligere. Dekk prøven med 400 µl blå kromogenløsning. Inkuber i 10 minutter i et fuktighetskammer. Senk ned i fortynnet vaskebuffer 2 i 3 minutter. Gjenta én gang i ny vaskebuffer 2. Trinn 10: Kontrastfarging Dekk prøven med 400 µl fortynnet hematoksylin (Dako Hematoxylin, kode S3301 fortynnet 1:5, se BRUKSANVISNING, avsnitt A.8) i 5 minutter. Skyll med vaskebuffer 2 og legg vevssnittene i bad med ny vaskebuffer 2 i minimum 5 minutter til det oppnås blå hematoksylin-kontrastfarge. Skyll grundig med destillert eller avionisert vann. Tørk snittene i 30 minutter ved 37 C på Dako Hybridizer med åpent lokk. La snittene kjøles ned til romtemperatur før de monteres. Trinn 11: Montering Dekk med CISH-monteringsmedium (flaske 13) og la monteringsmediet herde ved romtemperatur (20 25 C) i minst 30 minutter, fortr innsvis 60 minutter, før inspeksjon. Merk: Det må unngås at prøvene utsettes for alkohol eller xylen før de monteres. Det kan redusere reaksjonens sensitivitet og ha en negativ virkning på fargingen. B.3.2 Automatisk immunokjemisk fargingsprotokoll (Dako Autostainer-instrumenter) Automatisk fargingsprotokoll Trinn 1: Velg HER2CISH-protokollen under pharmdx i protokollvelgeren. For nye brukere skal protokollen installeres før fargingen. På andre Dako Autostainer-plattformer skal protokollen settes opp i henhold til programmet i figur 1. Ta alternativt kontakt med Dako teknisk service for hjelp til å installere protokollen på de automatiske plattformene. Trinn 2: Last reagenser. Trinn 3: Last objektglassene. La ikke vevssnittene tørke ut mens objektglassene lastes på Dako Autostainer-instrumentet eller mens fargeprosedyren pågår. Tørkede vevssnitt kan vise økt bakgrunnsfarging og svake signaler. Trinn 4: Start kjøringen. For Automated Link-plattformer, velg luftblåsing for å fullføre Hvis HER2/CISH -protokollen ikke er tilgjengelig på Autostainer Link-plattformen, ta kontakt med Dakos tekniske avdeling. ( ) P04131NO_01_SK / p. 17/33

18 Figur 1. Generisk program for Dako Autostainer-instrumenter Merk: Velg to dryppsoner (1 og 3) med 200 µl i hver. Trinn 5: Ta ut objektglassene fra Dako Autostainer-instrumentet etter at programmet er fullført. Tørk snittene i 30 minutter ved 37 C på Dako Hybri dizer med åpent lokk. La snittene kjøles ned til romtemperatur før de monteres. Trinn 6: Montering Dekk med CISH-monteringsmedium (flaske 13) og la monteringsmediet herde ved romtemperatur (20 25 C) i minst 30 minutter, fortr innsvis 60 minutter, før inspeksjon. Merk: Det må unngås at prøvene utsettes for alkohol eller xylen før de monteres. Det kan redusere reaksjonens sensitivitet og ha en negativ virkning på fargingen. Bruk av et feltmikroskop med kraftig lys Bruk et mikroskopobjektiv med tilstrekkelig kvalitet og forstørrelse til å gi optimal scoring av prøvene. Juster lysstyrken for å få en god separasjon av blå og rød farge. Fokuser opp og ned for å finne alle signalene i den enkelte nukleus. Kvalitetskontroll 1. Signalene må være klare, ha god intensitetsbalanse, være tydelige og lette å vurdere. 2. Normale celler i prøven gjør det mulig med en intern kontroll av fargingskjøringen. Normale celler skal ha 1 2 klart synlige blå signaler som indikerer at hybridiseringen av CEN-17 PNA-prøven til den centromeriske regionen på kromosom 17 var vellykket. Normale celler skal ha 1 2 klart synlige røde signaler som indikerer at hybridiseringen av HER2 DNA-prøven til HER2-amplikonet var vellykket. Der vevet kan ha delt seg, vil enkelte normale celler ha mindre enn de forventede 2 signalene av hver farge. Hvis signaler ikke påvises i normale celler, indikerer dette at analysen var mislykket, og resultatene må betraktes som ugyldige. Numerisk vurdering av normale celler bør gi et resultat som tilsvarer den forventede verdien. ( ) P04131NO_01_SK / p. 18/33

19 3. Nukleær morfologi må være uskadd. Mange skyggeceller og generelt dårlig nukleærmorfologi indikerer overnedbrytning av prøven, noe som fører til tap eller fragmentering av signalene. Slike prøver skal betraktes som ugyldige. 4. Forskjeller i vevsfiksering, prosessering og innstøpning i brukerlaboratoriet kan frembringe variasjon i resultatene og gjør det påkrevd med regelmessig evaluering av interne kontrollobjektglass. Tolkning av farging Vev som kan vurderes Kun prøver fra pasienter med invasivt karsinom skal testes. I tilfeller med karsinom in situ og invasivt karsinom i samme prøve, skal kun den invasive komponenten scores. Unngå områder med nekrose og områder der de nukleære grensene er tvetydige. Ikke inkluder nukleuser som krever subjektiv bedømmelse. Hopp over nukleuser med svak signalintensitet og ikke-spesifikk eller høy bakgrunn. Vurdering av HER2 CISH Vurdering av objektglass: Skann objektglasset for å ta høyde for mulig heterogenitet mellom tumorområder. Vurderingen av objektglasset skal utføres i henhold til retningslinjene under: Signalopptelling: Skann flere områder på tumorceller for å ta høyde for mulig heterogenitet. Velg et område som har god nukleinfordeling. Begynn analysen i øvre venstre kvadrant av det valgte området, skann fra venstre til høyre, tell antall signaler innen den nukleære grensen for hver evaluerte nukleus ifølge retningslinjene nedenfor. - Fokuser opp og ned for å finne alle signalene i den enkelte nukleus. - Dersom et signal virker som om det har mer enn ett opprinnelsespunkt, og derfor har en form som er vesentlig forskjellig fra et rundt punkt, skal det telles som to signaler (se retningslinjene for telling av signalene nedenfor). - I nukleuser med høye nivåer av HER2-genamplifikasjon kan HER2-signalene være posisjonert svært nært hverandre og danne en signalgruppe. I disse tilfellene kan antallet HER2-signaler ikke telles, men må beregnes. De blå signalene krever spesiell oppmerksomhet, fordi HER2- signalene kan dekke de blå signalene og gjøre det vanskelig å se dem. - I tvilstilfeller skal ikke disse nukleusene inkluderes i analysen. Ikke score nukleuser uten signaler eller med signaler med kun én farge. Score kun nukleusene med ett eller flere signaler av hver farge. Retningslinjer for telling av signaler 1 Skal ikke telles. Nukleuser overlapper. Ikke alle nukleusområdene er synlige. 2 To blå signaler, ikke score nukleuser med signaler i kun én farge. 3 Telles som 3 blå og 12 røde signaler (gruppeberegning) 4 Telles som 2 blå og 1 rødt signal. Signaler som virker som de har mer enn ett opprinnelsespunkt, skal telles som to signaler ( ) P04131NO_01_SK / p. 19/33

20 5 Skal ikke telles (for lav eller for høy nedbrytning) Manglende signaler i midten av nukleus 6 Telles som 2 blå og 5 røde signaler. Signaler som virker som de har mer enn ett opprinnelsespunkt, skal telles som to signaler 7 Telles som 1 blått og 5 røde signaler 8 Telles som 3 blå (1 blått ute av fokus) og 3 røde signaler 9 Grupper med røde signaler skjuler blå signaler. Skift til en kraftigere forsterkning for å bekrefte om blå signaler er til stede eller ikke. Skal ikke telles i tvilstilfeller Registrer opptellingene Tell 20 nukleuser per vevsprøve, om mulig, fra tydelige tumorområder (17). Beregn HER2/CEN-17-forholdet ved å dele totalt antall røde HER2-signaler med totalt antall blå CEN-17 signaler. Prøver med et HER2/CEN-17-forhold over eller lik 2 skal betraktes som HER2-genamplifisert (18-19). Resultater ved eller i nærheten av cut-off (1,8 2,2) skal tolkes med forsiktighet. Hvis forholdet ligger i grenseområdet (1,8 2,2), tell ytterligere 20 nukleuser, og beregn forholdet for 40 nukleuser på nytt. I tvilstilfeller skal objektglassprøven scores på nytt. For grenseområdetilfeller er det nødvendig med en konsultasjon mellom patologen og den behandlende legen. Begrensninger 1. HER2 CISH pharmdxtm er en prosess i flere trinn som krever spesialisert opplæring i valg av egnede reagenser og vev, fiksering, prosessering, preparering av CISH-objektglasset samt tolking av fargeresultatene. 2. CISH-resultatene er avhengig av håndteringen og prosesseringen av vevet før det farges. Uriktig fiksering, vask, tørking, oppvarming, snitting eller kontaminasjon med annet vev eller væsker kan påvirke prøvehybridiseringen. Inkonsekvente resultater vil kunne være en konsekvens av variasjoner i fikserings- og innstøpingsmetoder, eller uregelmessigheter i vevet. 3. For optimale og reproduserbare resultater, må vevsobjektglassene avparafiniseres fullstendig. Parafinfjerningen må fullføres ved begynnelsen av fargeprosessen. (Se BRUKSANVISNING, avsnitt B.2.) 4. Det skal kun brukes temperaturkalibrert vannbad. Dako Hybridizer (kode S2450 eller S2451) anbefales for denaturering og hybridisering, men hvis det brukes varmeblokk og hybridiseringsovn, må disse være temperaturkalibrerte. Bruk av andre typer utstyr kan føre til fordampning av HER2/CEN-17-prøveblandingen under hybridiseringen og må valideres av brukeren. 5. Overflødig eller ufullstendig kontrastfarging kan kompromittere riktig tolkning av resultatene. 6. Den immunhistokjemiske fargingsprosedyren skal utføres ved en omgivelsestemperatur på C. 7. Ikke erstatt reagensene med reagenser med andre lotnumre eller med reagenser fra andre produsenter. ( ) P04131NO_01_SK / p. 20/33

21 Utførelsesegenskaper Analytisk sensitivitet HER2 DNA-prøvene i HER2/CEN-17 prøveblandingen har blitt sluttsekvensert og kartlagt for å bekrefte en total dekning på 218 kb inkludert HER2-genet. CEN-17 PNA-prøvene i HER2/CEN- 17 prøveblandingen har blitt testet enkeltvis og i kombinasjon for å bekrefte den spesifikke hybridiseringen til den centromeriske regionen på kromosom 17. For å utelukke kryss-hybridisering til andre kromosomer enn kromosom 17, ble det gjennomført studier om metafasespredninger ifølge standard Dako kvalitetskontrollprosedyrer. Hele 250 metafasespredninger ble evaluert for spesifikk hybridisering av HER2 DNA- og CEN-17 PNAprøveblandinger. I alle 250 tilfellene var hybridiseringen spesifikk for kromosom 17. Ingen kryss-hybridisering til loci på andre kromosomer ble observert i noen av de 250 tilfellene. I tillegg ble sensitiviteten testet på 18 normale prøver av humant brystepitel for å bekrefte at HER2 CISH pharmdx -settet påviser målstoffene (HER2 og CEN-17). HER2/CEN-17- forholdet var på mellom 0,97 1,09, dvs. i det forventede intervallet til normale diploide celler. Analytisk spesifisitet Analytisk spesifisitet ble testet for å måle analysens evne til utelukkende å identifisere målstoffer HER2/CEN-17 uten innblanding fra andre stoffer. Fargede objektglass ble evaluert for nærvær av signaler i fravær av HER2/CEN-17 prøveblanding eller CISH-antistoffblanding. Det ble ikke observert uspesifisert binding av CISH-antistoffblandingen eller kromogenene som resulterte i synlige signaler i FISH eller CISH. Robusthetsstudier Robustheten til HER2 CISH pharmdx -settets analyse ble testet ved varierende tid og temperatur for inkubasjon med CISH-antistoffblanding, rød kromogenløsning, blå kromogenløsning og kontrastfarging. Alle andre parametre i prosedyren er testet som en del av robusthetsstudiene for HER2 FISH pharmdx -settet. Forbehandling i 7, 10 og 13 minutter ved C. Forbehandling ved 89, 92 og C i 10 minutter. Pepsininkubasjonstider på 2, 5, 10, 15 og 18 minutter ved romtemperatur. Denatureringstemperaturer på 72, 77, 82, 87 og 92 C. Hybridiseringstid på 17 timer ved 40, 45 og 50 C. Hybridiseringstid på 10, 12 og 14 timer ved 45 C. Stringensvasken ble testet i 10 minutter ved 60, 65 og 70 C. Stringensvasken ble testet i 5, 10 og 15 minutter ved 65 C. Stringensvask i 10 minutter ved 70 C og stringensvask i 15 minutter ved 65 C resulterte i signaltap, mens det ikke ble observert noen betydelig forskjell i resultatene ved andre tids- /temperaturkombinasjoner. Fortynninger av stringensvaskebuffer ble testet: 1:10, 1:15, 1:20, 1:30 og 1:40. Fortynningen 1:40 med stringensvaskebuffer resulterte i signaltap, mens det ikke ble observert noen betydelig forskjell i signaltap ved andre fortynninger. Inkubasjonstid for antistoff: 25, 27, 30, 33 og 35 minutter. 25 minutters inkubasjonstid med antistoffblanding ga et tap i intensiteten til røde signaler, mens det ikke ble observert noen betydelige forskjeller på andre tidspunkter. Inkubasjonstid for rød kromogenløsning på 8, 9, 10, 11 og 12 minutter Inkubasjonstid for blå kromogenløsning på 8, 9, 10, 11 og 12 minutter Inkubasjonstid for kontrastfarging på 4, 5 og 6 minutter Kontrastfargekonsentrasjon ved en fortynning på 1:4, 1:5 og 1:6 Merk: For robusthetsstudiene ble kun én parameter i fargingsprosedyren endret om gangen, mens alle de andre parametrene ble holdt konstante. Det anbefales å oppfylle tiden og temperaturene som er indikert i fargingsprosedyren. ( ) P04131NO_01_SK / p. 21/33

22 Reproduserbarhet Reproduserbarheten til HER2/CEN-17-forholdet ble undersøkt med HER2 CISH pharmdx settet ved bruk av tre kontinuerlige snitt fra ni ulike brystkreftprøver. Variasjonskoeffisienten var 1 7 % med høyere forhold som fører til høyere CV. Repeterbarhet på kontinuerlige snitt av brystkreftprøver med ulik tykkelse (3 7 µm) ble testet med HER2 CISH pharmdxtm-settet. Variasjonskoeffisienten til HER2/CEN-17-forholdet i denne studien ble bestemt til 3 6 %, dvs. i det samme området som for vev med lik tykkelse. Reproduserbarhet Reproduserbarhet for HER2 CISH pharmdx -settet ble testet for reproduserbarhet dag-til-dag og sted-til-sted / observatør-til-observatør. Snitt fra 9 forskjellige brystkreftprøver ble farget og analysert på tre dager på tre steder. I reproduserbarhetsstudien har analysen av brystkreftprøver ved bruk av HER2 CISH pharmdx -settet vist reproduserbare resultater mellom ulike dager og laboratorier. I henhold til en variansekomponentmodell, skilte målinger gjort på forskjellige steder og forskjellige dager seg bare litt fra antatte målinger gjort på samme dag på samme sted (restfeil) (Tabell 1). Tabell 1. Variansekomponent, CV-estimater Amplifisert IHC 2+ Ikkeamplifisert Sted-til-sted 15,8 % 12,2 % 9,0 % Dag-til-dag 13,6 % 12,2 % 8,4 % Restfeil 13,1 % 12,2 % 8,4 % Komparativ studie Den kliniske nytten av HER2 CISH pharmdx -settet ble undersøkt i en klinisk studie med 365 invasive brystkreftprøver som ble analysert med HER2 CISH pharmdx -settet og PathVysion HER-2 DNA Probe-settet (FISH). Prøver ble deretter innsamlet og prøvepool ble anriket med prøver på 60 IHC 2+ som påvist av HercepTest og analysert ved et amerikansk referanselaboratorium. Testresultater fra 350 prøver var egnet for statistisk analyse, og HercepTest IHC-scoringene i tillegg til deres CISH HER2-genstatus vises nedenfor i Tabell 2. Et HER2/CEN-17-forhold under 2,0 indikerer et ikke-amplifisert tilfelle og et HER2/CEN-17- forhold over eller lik 2,0 indikerer et amplifisert tilfelle. Tabell 2. krysstabulering av HercepTest IHC-scoringer og CISH HER2-genstatus HercepTest IHC-scoring Sum CISH HER2- ikke-amplifisert genstatus amplifisert Sum Den generelle overensstemmelsen mellom HER2-status oppnådd med HER2 CISH pharmdx -settet og PathVysion HER-2 DNA Probe-settet (FISH) var 97,7 % som vist i Tabell 3. Den positive og negative overensstemmelsen var henholdsvis 90,9 % og 98,7 %. McNemars test for systematisk avvik mellom de to testene var ikke betydelig (p=1,00). ( ) P04131NO_01_SK / p. 22/33

23 Tabell 3. Krysstabulering av CISH HER2-genstatus kontra PathVysion FISH HER2-genstatus PathVysion FISH HER2-genstatus ikke-amplifisert amplifisert Sum CISH HER2- ikke-amplifisert genstatus amplifisert Sum Generell overensstemmelse: (342/350 x 100) = 97,7 %; (CI95 nedre 95,7 %; CI95 øvre 98,9 %) Positiv overensstemmelse: (40/44 x 100) = 90,9 %; (CI95 nedre 79,8 %; CI95 øvre 96,9 %) Negativ overensstemmelse: (302/306 x 100) = 98,7 %; (CI95 nedre 96,9 %; CI95 øvre 99,6 %) Kappa: 0,90 (standardavvik 0,04) I en eksplorativ analyse av HER2/CEN-17-forholdene oppnådd med de metodene, har de to forholdene blitt plottet (Figur 1). CISH HER2/CEN-17-forhold PathVysion HER2/CEN-17-forhold Figur 1. Punktdiagram av HER2/CEN-17-forhold for Dako HER2 CISH pharmdx -settet og PathVysion HER-2 DNA Probe-settet (FISH) Lineær regresjon av logaritmisk transformerte HER2/CEN-17-forhold påviste en korrelasjonskoeffisient på 0,90 og en retningskoeffisient på 0,71. Tid for evaluering av objektglass Gjennomsnittlig tid for evaluering av objektglass for HER2 CISH pharmdx var 3:13 (min:sek) og for PathVysion HER2 DNA Probe-settet (FISH) var det 4:02 (min:sek). I en paret, tohalet t-test var gjennomsnittlig differanse i tid for evaluering av objektglass 0:49 (min:sek), som er signifikant ulikt null (p<0,001). CISH-suksessrate Fra totalt 364 CISH-tester som ble utført, ble 352 (96,7 %) gjennomført. Prognoseverdien av HER2 CISH pharmdx -settet For å knytte prognoseverdien for HER2 FISH pharmdx -settet til HER2 CISH pharmdx -settet, ble samsvaret mellom testresultatene undersøkt. Prognoseverdien for HER2 FISH pharmdx settet ble tidligere vist basert på dataene fra DBCG-studie 89D (Danish Breast Cancer Cooperative Group) som analyserte HER2-status ved bruk av Dako HER2 FISH pharmdx settet. I DBCG 89D-studien var testresultater fra 649 pasientprøver tilgjengelige for multivariat analyse, 417 hadde HER2/CEN-17-forhold under 2,0 (normal eller ikke-amplifisert HER2- genstatus) og 232 hadde HER2/CEN-17-forhold over eller lik 2,0 (amplifisert HER2-genstatus). ( ) P04131NO_01_SK / p. 23/33

24 Fra univariat analyse av prognoseverdien av HER2-amplifikasjon i nodepositive pasienter (n=423) ble det påvist at HER2-genamplifikasjon som bestemt av HER2 FISH pharmdx settet hadde en betydelig prognoseverdi for helhetlig overlevelse (Figur 2). P=0,0002 Utsatte pasienter: År Figur 2. Kaplan Meier-kurve viser helhetlig overlevelse (OS) avhengig av HER2 FISH-amplifikasjon i nodepositive pasienter (n=423). Ytterligere multivariat analyse påviste at HER2 FISH-amplifikasjon hadde en uavhengig prognoseverdi i nodepositive pasienter med fareforhold tilsvarende HER2-amplifikasjon for helhetlig overlevelse på 1,40 (fareforhold CI95-grenser: 1,07 1,85), p=0,015. Samsvaret mellom analyser med HER2 FISH pharmdx -settet og HER2 CISH pharmdx settet ble undersøkt i en klinisk studie med 200 invasive brystkreftprøver. Testresultater fra 189 prøver var egnet for statistisk analyse av HER2-status, og krysstabulering av HER2-status oppnådd fra de to analysene presenteres nedenfor i Tabell 4. Samsvarsdataene viser en generell overensstemmelse mellom analyser med Dako FISH og CISH pharmdx -sett på 97,9 %, med positive og negative overensstemmelser på henholdsvis 92,6 % og 98,8 %. Derfor viser data at prognoseverdien for resultater fra analyser med HER2 FISH pharmdx settet kan innhentes ved bruk av analyse med HER2 CISH pharmdx -settet. Tabell 4. Krysstabulering av HER2-genstatus oppnådd med HER2 CISH pharmdx -settet og HER2 FISH pharmdx -settet. Dako FISH HER2-status ikke-amplifisert amplifisert Sum Dako CISH ikke-amplifisert HER2-status amplifisert Sum Generell overensstemmelse: (185/189 x 100) = 97,9 %; (CI95 nedre 95,0 %; CI95 øvre 99,3 %) Positiv overensstemmelse: (25/27 x 100) = 92,6 %; (CI95 nedre 78,3 %; CI95 øvre 98,4 %) Negativ overensstemmelse: (160/162 x 100) = 98,8 %; (CI95 nedre 96,1 %; CI95 øvre 99,7 %) Kappa: 0,91 (standardavvik 0,04) ( ) P04131NO_01_SK / p. 24/33

25 Feilsøking Problem Sannsynlig årsak Foreslått løsning 1. Ingen eller svake signaler 1a. Settet har vært utsatt for høye temperaturer i løpet av transport eller lagring 1b. Betingelsene for forbehandling var feil 1c. Fordampning av prøveblandingen under hybridiseringen 1d. Mikroskopets innstillinger er ikke optimale - Utilstrekkelig lysstyrke - Kraftigere forstørrelse (40x eller 60x objektiver) 1e. Rød og/eller blå kromogenløsning er ikke brukt innen foreskrevet tid 1f. Automatisk farging - Reagenser er ikke brukt i riktig rekkefølge - Utilstrekkelig reagensmengde - For korte inkubasjonstider - Feil dryppsone 1g. Tørking av objektglass 1a. Kontroller oppbevaringsbetingelser. Kontroller at flaske 2 (Pepsin) ble levert på tørris. Kontroller at kjølepakkene var kalde da settet ble mottatt. Kontroller om det komplette settet har vært oppbevart ved høyst 2 8 C på et mørkt sted. Monteringsmediet (flaske 13) skal oppbevares ved romtemperatur. 1b. Sørg for å bruke anbefalt forbehandlingstemp. og -tid. 1c. Sikre tilstrekkelig fuktighet i hybridiseringskammeret 1d. Prøv ulike mikroskopinnstillinger. I tvilstilfeller, ta kontakt med den lokale mikroskopleverandøren. 1e. Den tilberedte røde kromogenløsningen må brukes innen 20 minutter. Den blå kromogenløsningen skal tilberedes 30 minutter før bruk og må brukes innen 8 dager (ved oppbevaring i 2 8 C på et mørkt sted). 1f. Se over programmeringsnettet, objektglassutformingen og reagenskartet før kjøringen påbegynnes. 1g. La ikke vevssnittene tørke ut under fargingsprosedyren ( ) P04131NO_01_SK / p. 25/33

26 2. Ingen blå signaler 2a. Betingelsene for stringensvask var feil 2b. Feil fortynning av blått kromogen 2c. Problemer med tilberedning av blå kromogenløsning 3. Ingen røde signaler 3a. Betingelsene for forbehandling var feil 3b. Feil bruk av rød kromogenløsning 3c. Feil fortynning av rødt kromogen 4. Områder uten signal 4a. Prøvevolum for lite 5. Overflødig bakgrunnsfarging 4b. Luftbobler fanget ved prøveblandingspåføring eller -montering 4c. For liten reagensmengde 4d. Luftbobler er oppfanget under monteringen 4e. Dryppsone 5a. Feil vevsfiksering 5b. Parafin ikke fullstendig fjernet 2a. Kontroller at anbefalt stringensvasketemp. og tid brukes, og at dekkglass fjernes før utføring av stringensvask 2b. Klargjør blå kromogenløsning ved å blande 75 µl blått kromogen (flaske 12) i 1 ml blå substratbuffer (flaske 10) 2c. Blått kromogen (flaske 12) ble ikke blandet før tilberedningen av blå kromogenløsning 3a. Sørg for å bruke anbefalt forbehandlingstemp. og -tid 3b. Den tilberedte røde kromogenløsningen skal brukes innen 20 minutter (inkludert inkubasjonstid) 3c. Klargjør rød kromogenløsning ved å blande 10 µl rødt kromogen (flaske 11) i 1 ml rød substratbuffer (flaske 9) 4a. Sikre at prøvevolumet er stort nok til å dekke området under dekkglasset 4b. Unngå luftbobler. Hvis disse oppdages, bank forsiktig på dem ved bruk av tang 4c. Se etter at reagensvolumet er stort nok til å dekke vevsområdet 4d. Unngå luftbobler. Bruk monteringsmediet som fulgte med settet. 4e. Kontroller at dryppsonen er innrettet med vevssnittet. Bruk to dryppsoner (1 og 3) 5a Se til at kun formalinfikserte, parafininnstøpte vevssnitt brukes 5b. Følg prosedyrene for avparafinering og rehydrering som er beskrevet i avsnitt B.2. ( ) P04131NO_01_SK / p. 26/33

27 5c. Stringensvaskektemp. for lav 5d. Fordampning av prøveblandingen under hybridiseringen 5e. Objektglassene er ikke godt nok skyllet 5f. Vevssnittene tørket inn under manuell fargingsprosedyre 5g. Snittene tørket mens Autostainer ble lastet 5h. Vevssnittene tørket inn under automatisk fargingsprosedyre 6. Dårlig vevsmorfologi 6a. Feil pepsinbehandling 6b. Kraftig nedbrytning av vev 5c. Se til at stringensvasketemp. er 65 (±2) C 5d. Sikre tilstrekkelig fuktighet i hybridiseringskammeret. Bruk strips for fuktighetskontroll 5e. Bruk ny vaskebuffer. Kontroller at Autostainer er riktig primet før kjøringen. Kontroller at det finnes nok buffer for hele kjøringen 5f. Bruk fuktighetskammer. Tørk av bare tre til fire glass om gangen før påføring av reagens 5g. Se til at snittene holdes våte med buffer under lasting og før kjøringen startes 5h. Kontroller at riktig volum av reagensen påføres objektglassene. Se etter at Autostainer kjøres med dekslet lukket og ikke er utsatt for sterk varme 6a. Overhold de anbefalte pepsininkubasjonstidene. Se avsnitt B.3, trinn 2. Sørg for at pepsinet håndteres ved riktig temperatur. Se avsnitt B.1. 6b. Gjør inkubasjonstiden for pepsin i Dako FISHfargingsprosedyren kortere. For nøytralt bufret formalin (24 timer) og parafininnstøpt vev, vil 2 minutters pepsininkubasjon ved 37 C være et bra utgangspunkt. Det er en balanse mellom vevsmorfologi og signalenes intensitet/ kvalitet som brukeren bør være klar over når det lages en pepsingradient med FISH-prosedyren, fordi både for mye og lite nedbrytning av vevsprøvene har en virkning på signalenes intensitet/kvalitet. ( ) P04131NO_01_SK / p. 27/33

28 7. Kontrastfarging med hematoksylin gjør det vanskelig å se de spesifikke HER2- og CEN-17-signalene 8. For sterk spesifikk farging 6c. Feil forbehandlingsbetingelser kan gi uklart eller tåkete utseende 6d. For lang pepsinbehandling eller svært tynn snittykkelse kan forårsake at skyggeceller eller smultringformede celler ( donut cells ) vises. 7a. Kontrastfargingen med hematoksylin er for sterk 8a. For lang reagensinkubasjonstid 8b. Bruk av feil vaskeløsning 6c. Sørg for å bruke anbefalt forbehandlingstemp. og -tid 6d. Forkort pepsininkubasjonstiden. Se avsnitt B.3, trinn 2. Se til at snittykkelsen er 4 6 µm. 7a. Det er nødvendig med ytterligere fortynning av hematoksylin eller kortere inkubasjonstid 8a. Gå gjennom instruksjonene for fargingsprosedyre 8b. Bruk kun vaskebuffer som ble anbefalt med settet (vaskebuffer 2, som fulgte med settet eller Dako Wash Buffer, kode S3006) ( ) P04131NO_01_SK / p. 28/33

29 Tillegg 1 HER2 CISH pharmdx TM -sett, kode SK109 Protokollkontrolliste Fargekjøringslogg-ID: Dato (dag 1) for kjøringen: HER2 CISH pharmdx -sett, SK109 Lot: Prøve-ID(-er): Utstyrs-ID(-er): Vev fiksert i nøytralt bufret formalin Ja Nei Fortynnings-/utløpsdato for 1 x vaskebuffer 1 (flaske 5 fortynnet 1:20) / Fortynnings-/utløpsdato for 1 x vaskebuffer 2 (flaske 6 fortynnet 1:10) / DAG 1 Trinn 1: Forbehandling Fortynnings-/utløpsdato for forbehandlingsløsning (flaske 1 fortynnet 1:20) Målt temperatur på forbehandlingsløsning (95 99 C) hvis vannbad (metode A) brukes til oppvarming Merk av med en strek hvis det brukes mikrobølgeovn (metode B) Forbehandling (10 minutter) og nedkjøling (15 minutter) Vask i vaskebuffer 1 (flaske 5 fortynnet 1:20) (2 x 3 minutter) Trinn 2: Pepsin Varighet på Pepsin-behandling (flaske 2) ved 37 C eller Varighet på Pepsin-behandling (flaske 2) ved romtemperatur Vask i vaskebuffer 1 (flaske 5 fortynnet 1:20) (2 x 3 minutter) Dehydrer objektglass (3 x 2 minutter) i gradert serie med etanol og lufttørk Trinn 3: HER2/CEN-17-prøveblanding Påfør prøveblanding (flaske 3), dekkglass og forsegle med dekkglassforsegling Målt denatureringstemperatur (82 C) ved bruk av an net utstyr enn Dako Hybridizer Denaturering i 5 minutter Målt hybridiseringstemperatur (45 C) ved bruk av a nnet utstyr enn Dako Hybridizer Hybridisering over natten (beskytt mot lys) / C Minutter Minutter C C Timer ( ) P04131NO_01_SK / p. 29/33

30 DAG 2 Trinn 4: Stringensvask Dato for fortynning/utløpsdato for stringensvaskebuffer (flaske 4 fortynnet 1:20) Målt temperatur på stringensvaskebuffer (65 C) C Stringensvask (10 minutter) etter fjerning av dekkglasset Vask i vaskebuffer 1 (flaske 5 fortynnet 1:20) (2 x 3 minutter) Trinn 5: Peroksidaseblokk Vask i vaskebuffer 2 (flaske 6 fortynnet 1:10) (3 minutter) Peroksidaseblokk (flaske 7) i 5 minutter Vask i vaskebuffer 2 (flaske 6 fortynnet 1:10) (2 x 3 minutter) Trinn 6: CISH-antistoffblanding CISH-antistoffblanding (flaske 8) i 30 minutter Vask i vaskebuffer 2 (flaske 6 fortynnet 1:10) (2 x 3 minutter) Trinn 7: Rød kromogenløsning Bland rød kromogenløsning av rød substratbuffer (flaske 9) og rødt kromogen (flaske 11). Skal brukes innen 20 minutter Rød kromogenløsning i 10 minutter Vask i vaskebuffer 2 (flaske 6 fortynnet 1:10) (2 x 3 minutter) Trinn 8: Blå kromogenløsning Bland blå kromogenløsning av blå substratbuffer (flaske 10) og blått kromogen (flaske 12). Skal tilberedes 30 minutter før bruk og brukes innen 8 dager (ved oppbevaring i 2 8 C på et mørkt sted) Blå kromogenløsning i 10 minutter Vask i vaskebuffer 2 (flaske 6 fortynnet 1:10) (2 x 3 minutter) Trinn 9: Kontrastfarging Hematoksylin-kontrastfarging i 5 min. (følger ikke med settet. Fortynning på 1:5 av Dako Hematoxylin, kode S3301 i avionisert vann) Skyll i vaskebuffer 2 (flaske 6 fortynnet 1:10) Vask i vaskebuffer 2 (flaske 6 fortynnet 1:10) (5 minutter) Skyll grundig med avionisert vann Trinn 10: Montering Tørkes i 30 minutter ved 37 C, avkjøles til romte mperatur. Påfør monteringsmedium (flaske 13) og dekkglass Vent minst minutter før inspeksjon / Kommentarer: Dato og signatur, tekniker: ( ) P04131NO_01_SK / p. 30/33

31 Tillegg 2 HER2 CISH pharmdx -sett, kode SK109 Scoringsskjema Dato (dag 1) for kjøringen: HER2 CISH pharmdx -sett, SK109 Lot: Fargekjøringslogg-ID: Prøve-ID(-er): Nukleus nr. HER2 score (rød) Signaltelling i 20 nukleuser CEN-17 score (blå) Nukleus nr Sum (1-10) Sum (11-20) HER2 score (rød) CEN-17 score (blå) For bestemmelse av HER2/CEN-17-forhold, tell antallet HER2-signaler og antallet CEN-17- signaler i de samme 20 nukleusene og del det totale antallet HER2-signaler med det totale antallet CEN-17-signaler. Hvis HER2/CEN-17-forholdet ligger i grenseområdet (1,8 2,2), skal det telles ytterligere 20 nukleuser og forholdet skal beregnes på nytt. Resultater ved eller i nærheten av cut-off (1,8 2,2) skal tolkes med forsiktighet (se opptellingsveiledningen). Total score (1 20) HER2 CEN-17 HER2/CEN-17-forhold Forhold < 2: HER2-genamplifikasjon ble ikke observert Forhold 2: HER2-genamplifikasjon ble observert Dato og signatur, tekniker: Dato og signatur, patolog: For Retningslinjer for scoring: Se Tolkning av farging ( ) P04131NO_01_SK / p. 31/33

32 Referanser 1. Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet. 1997;76: Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science. 1985;230: King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science. 1985;229: Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol. 1999;9: Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, Thor A, Chen LC, Smith HS, et al. ERBB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89: Persons DL, Bui MM, Lowery MC, Mark HF, Yung JF, Birkmeier JM, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of HER-2/neu amplification in breast cancer: a multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci. 2000;30: Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 1987;235: Rennstam K, Baldetorp B, Kytola S, Tanner M, Isola J. Chromosomal rearrangements and oncogene amplification precede aneuploidization in the genetic evolution of breast cancer. Cancer Res. 2001;61: Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, Clark GM, Ferno M, Fuqua SA, et al. HER-2/neu amplification predicts poor survival in node-positive breast cancer. Cancer Res. 1990;50: Nichols DW, Wolff DJ, Self S, Metcalf JS, Jacobs D, Kneuper-Hall R, et al. A testing algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer. Ann Clin Lab Sci. 2002;32: Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol. 2003;16: Nielsen PE, Egholm M, editors. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Norfolk NR18 0EH, England: Horizon Scientific Press Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of laboratory workers from instrument biohazards and infectious disease transmitted by blood, body fluids, and tissue; Approved guideline. NCCLS document M29-A. 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA: NCCLS Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, FR 7163, February Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer. 2001;92: Ellis IO, Bartlett J, Dowsett M, Humphreys S, Jasani B, Miller K, et al. Best Practice No 176: Updated recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol. 2004;57: Wolff AC, Hammond ME, Schwartz JN, Hagerty KL, Allred DC, Cote RJ, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. J Clin Oncol. 2007;25: ( ) P04131NO_01_SK / p. 32/33

33 Symbolforklaring Каталожен номер Съдържанието е достатъчно за извършване на <n> теста GHS-faresymbol (se avsnittet om forholdsregler) Медицинско изделие за ин-витро диагностика Код на партидата GHS-faresymbol (se avsnittet om forholdsregler) Медицинско изделие за ин-витро диагностика Използвайте до GHS-faresymbol (se avsnittet om forholdsregler) Temperaturbegrensning GHS-faresymbol (se avsnittet om forholdsregler) Производител Oppbevares mørkt GHS-faresymbol (se avsnittet om forholdsregler) Produsert av: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Danmark Tlf Faks ( ) P04131NO_01_SK / p. 33/33