Histology FISH Accessory Kit Kode K5799

Transkript

1 Histology FISH Accessory Kit Kode K utgave For fluorescens in situ hybridisering (FISH) på formalinfikserte, parafininnstøpte vevssnitt. Settet inneholder nok reagenser til 20 tester. ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 1/26

2 Innholdsfortegnelse Tiltenkt bruk... 3 Innledning... 3 Reagenser... 3 Materialer som følger med... 3 Materialer som er nødvendige, men som ikke medfølger... 4 Forholdsregler... 5 Oppbevaring... 6 Klargjøring av prøver... 6 Parafininnstøpte vevssnitt... 6 BRUKSANVISNING... 7 A. Tilberedning av reagenser... 7 A.1 Pre-Treatment Solution... 7 A.2 Stringent Wash Buffer... 7 A.3 Wash Buffer... 7 A.4 Etanolserie... 7 A.5 Pepsinløsning... 7 B. Fargingsprosedyre... 8 B.1 Merknader... 8 B.2 Behandling av vev før farging... 8 B.3 Fargingsprotokoll... 9 B.3.a. Fargingsprotokoll for FISH-prober fortynnet i hybridiseringsbuffer basert på etylenkarbonat... 9 B.3.b. Fargingsprotokoll for FISH-prober fortynnet i hybridiseringsbuffer basert på formamid Kvalitetskontroll Tolking av resultatene Feilsøking Tillegg Tillegg Referanser Symbolforklaring ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 2/26

3 NORSK Tiltenkt bruk Til in vitro-diagnostisk bruk. Histology FISH Accessory Kit tiltenkt for bruk i fluorescens in situ hybridiserings (FISH)-teknikk på formalinfikserte, parafininnstøpte vevssnittprøver. Reagensen som følger med i Histology FISH Accessory Kit kan også brukes sammen med HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix (kode K5731, flaske 3). Hvis reagenser fra Dako Histology FISH Accessory Kit, kode K5799, brukes sammen med reagenser fra kode K5731, må prosedyren angitt i pakningsvedlegget for kode K5731, følges. Innledning Histology FISH Accessory Kit inneholder alle nøkkelreagensene, unntatt proben, som er nødvendig for å fullføre en FISH-prosedyre for formalinfikserte, parafininnstøpte vevssnittprøver. Etter avparafinisering og rehydrering varmes prøvene opp i Pre-Treatment Solution etterfulgt av proteolytisk forbrenning ved bruk av pepsin. Etter oppvarming og proteolytiske forbehandlingstrinn, anvendes de brukergitte FISH-probene og prøvene forsegles med Coverslip Sealant før denaturering og hybridisering over natten. Etter hybridisering utføres en stringent vask, som sikrer fjerning av ubundet og uspesifikt bundne FISH-prober før dehydrering med etanol. Til slutt monteres prøvene med Fluorescence Mounting Medium som inneholder en blå fluorescerende kontrastfarge. Resultatene tolkes ved hjelp av et fluorescensmikroskop utstyrt med egnede filtre (se vedlegg 1). Reagenser Materialer som følger med Materialene som er opplistet nedenfor er tilstrekkelig til 20 tester (en test er definert som et målområde på 22 mm x 22 mm). Settet inneholder materiale tilstrekkelig for inntil 10 individuelle FISH-kjøringer (fire separate kjøringer ved bruk av pepsinneddykkingsmetoden). Histology FISH Accessory Kit leveres på tørris. For å sikre at settets komponenter ikke har blitt utsatt for høye temperaturer under transport, skal det fortsatt være igjen tørris ved mottak. Vær oppmerksom på at noen settkomponenter kan være ufrosne, dette vil ikke påvirke ytelsen til Histology FISH Accessory Kit. Flaske 1 Flaske 2A Flaske 2B Flaske 4 Pre-Treatment Solution (20x) 150 ml, konsentrert 20x MES-buffer (2-[N-morfolino]etansulfosyre). Pepsin 4 x 6,0 ml, klar til bruk Pepsinløsning, ph 2,0; inneholder stabiliseringsmiddel og et antimikrobielt middel. Pepsin Diluent (10x) 24 ml, konsentrert 10x Fortynningsløsning, ph 2,0; inneholder et antimikrobielt middel. Stringent Wash Buffer (20x) 150 ml, konsentrert 20x SSC-buffer (saltløsningsnatriumcitrat) med rengjøringsmiddelet Tween-20. ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 3/26

4 Flaske 5 Flaske 6 Element 7 Fluorescence Mounting Medium 0,4 ml Bruksklar fluorescerende monteringsmedium med 500 µg/l DAPI (4,6-diamidin-2-fenylindol). Wash Buffer (20x) 500 ml, konsentrert 20x Tris/HCl-buffer. Coverslip Sealant 1 rør Klar til bruk løsning for avtakbar forsegling av dekkglass. MERKNAD: Alle reagenser kan byttes ut med tilsvarende reagenser i Dako HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731). Hvis reagenser fra Dako Histology FISH Accessory Kit, kode K5799, brukes sammen med reagenser fra kode K5731, må prosedyren angitt i pakningsvedlegget for kode K5731, følges. Materialer som er nødvendige, men som ikke medfølger Laboratoriereagenser Destillert eller avionisert vann Etanol, 96 % Xylen eller xylensubstitutter Laboratorieutstyr Absorberende kluter Regulerbare pipetter Delvis kalibrert nedsenkningstermometer (område C) Dekkglass (18 mm x 18 mm eller 22 mm x 22 mm og 24 mm x 50 mm eller 24 mm x 60 mm) Tang Avtrekkshette Dako Hybridizer (kode S2450/S2451)* Oppvarmingsblokk eller hybridiseringsovn* Fuktig hybridiseringskammer* Mikrosentrifuge Objektglass, Dako Silanized Slides, kode S3003, poly-l-lysin-belagte objektglass, eller superfrost Plus objektglass Fargekar eller -bad Metall- eller plastvugger Stoppeklokke (som kan måle 0 60 minutters intervaller) Vannbad med lokk (som kan opprettholde 37 (± 2) C, 63 (± 2) C, 65 (± 2) C og fra 95 C til 99 C Mikrobølgeovn med sensorevne hvis forbehandling utføres ved bruk av mikrobølgeovn** (se trinn 1 i avsnitt B.3.a eller B.3.b. Fargingsprotokoll, metode B) Motstandsdyktig mikrobølgeovn med lokk som har hull med en diameter på f.eks en cm * Oppvarmingsblokk for fordøyelse (37 (±2) C), varmeblokk eller hybridiseringsovn for denaturering (66 (±2) C (B.3.a) eller 82 (±2) C) (B.3.b.) og fuktighetshybridiseringskammer for hybridisering (45 (±2) C) kan brukes, men vi anbefaler Dako Hybridizer, kode S2450/S2451. ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 4/26

5 * Varmeblokk for fordøyelse (37 (± 2) C), varmeblokk eller hybridiseringsovn for denaturering (66 (± 2) C (B.3.a) eller 82 (± 2) C) (B.3.b) og fuktig hybridiseringskammer for hybridisering (45 (± 2) C) kan brukes, men vi anbefaler Dako Hybridizer, kode S2450/S2451. Vannbad med lokk (som kan opprettholde C) eller et mikroprosessorkontrollert trykkammer som Dako Pascal, kode S2800, kan brukes i stedet for en mikrobølgeovn. Mikroskoputstyr og -tilbehør Filtre for fluorescerende mikroskop: DAPI-filter og passende filtre for den brukte fluorokrom, f.eks. FITC / Texas Red dobbelt filter, FITC og Texas Red monofiltre for Dako FISH Probes du finner mer informasjon i vedlegg 1. Fluorescerende mikroskop med en 100 watts kvikksølvlampe som lyskilde bør brukes for Dako FISH Probes. Andre lyskilder anbefales ikke med disse filtrene Objektglassmappe på mikroskopet (pappbrett for 20 objektglass med hengslet deksel eller lignende) Forholdsregler 1. For profesjonelle brukere. 2. Flaske 1, Pre-Treatment Solution (20x), inneholder 1-<20 % 2-morfolinoetansulfonsyre; flaske 2A, Pepsin, inneholder 5 10 % propan-2-ol; og flaske 6, Wash Buffer (20x), inneholder 1-<20 % trometamol. Ved ulike produktkonsentrasjoner krever ikke disse substansene faremerking. HMS-datablader er tilgjengelige for profesjonelle brukere på forespørsel. 3. Flaske 2A, Pepsin, inneholder pepsin A som kan forårsake en allergisk reaksjon. 4. Flaske 2B, Pepsin Diluent (10x) inneholder 60 % propan-2-ol og er merket: Meget brannfarlig. Irriterende. R11 Meget brannfarlig. R36 Irriterer øynene. R67 Damper kan forårsake sløvhet og svimmelhet. S9 Emballasjen oppbevares på et godt ventilert sted. S16 Oppbevares på avstand fra tenningskilder røyking forbudt. S26 Får man stoffet i øynene, skyll straks grundig med store mengder vann og kontakt lege. S60 Dette materialet og beholderen må avhendes som farlig avfall. 5. Element 7, Coverslip Sealant inneholder % nafta (petroleum), hydrobehandlet lys, og er merket: Ekstremt antennelig. Farlig for miljøet. R11 Meget brannfarlig. R51/53 Giftig for vannorganismer, kan ha negative langtidseffekter på vannmiljøet. S16 Oppbevares på avstand fra tenningskilder røyking forbudt. S35 Dette materialet og beholderen skal avhendes på sikker måte. S57 Bruk egnet beholder for å unngå miljøforurensning. S61 Unngå utslipp i miljøet. Se spesielle instruksjoner/hms-datablader. S9 Emballasjen oppbevares på et godt ventilert sted. 6. Se databladet for materialsikkerhet (MSDS) for ytterligere informasjon. 7. Andre vevfikseringsmetoder og tykkelse på prøver enn de som er spesifisert, kan påvirke vevmorfologi og/eller signalintensitet. 8. Andre inkubasjonstider og temperaturer, eller andre metoder enn de som er spesifisert, vil kunne gi feilaktige resultater. 9. Reagenser har blitt optimalt fortynnet. Ytterligere fortynning kan forårsake dårlig ytelse. 10. Kun rene fargekar skal brukes til pepsinneddykkingsmetoden (trinn 2, metode C). ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 5/26

6 Oppbevaring Oppbevares mørkt ved 2-8 C. Alternativt kan alle r eagenser oppbevares frosset. Pepsin (flaske 2A) kan påvirkes negativt hvis den utsettes for varme. Ikke la denne komponenten oppbevares i romtemperatur. Fluorescence Mounting Medium (flaske 5) kan påvirkes negativt hvis den utsettes for sterke lysnivåer. Ikke oppbevar denne komponenten i lyset. Ikke bruk settet etter utløpsdatoen som er stemplet på settets eske. Hvis reagenser oppbevares under andre forhold enn spesifisert, må brukeren validere reagensytelsen (1). Det er ingen tydelige tegn som indikerer at dette produktet er ustabilt. Derfor er det viktig å evaluere normalt vev som tidligere viste FISH well som kontroll på den kjørte analysen. Hvis det observeres uventet fluorescerende mønster som ikke kan forklares med variasjoner i laboratorieprosedyrer, og det er mistanke om at det er et problem med Histology FISH Accessory Kit, ta kontakt med Dakos tekniske avdeling. Klargjøring av prøver Prøver fra biopsier, eksisjoner eller reseksjoner må håndteres slik at vevet bevares til FISHanalyse. Følg den anbefalte metoden for vevbehandling for immunocytokjemisk farging beskrevet nedenfor. For ytterligere informasjon, se referanse (2). Bruk av vev utsatt for syreavkalking for FISH anbefales ikke (3-6). EDTA som avkalker har blitt rapportert å bevare DNA bedre (6) for (F)ISH (3, 4, 7) teknikker. MERKNAD: Ytelsen til Dako Histology FISH Accessory Kit har ikke blitt validert på avkalket vev. Parafininnstøpte vevssnitt Kun vev som er preservert i nøytralbufret formalin og parafininnstøpt, egner seg for bruk. Prøver skal f.eks. være blokket i en tykkelse på 3 eller 4 mm og fiksert i timer i nøytralbufret formalin. Vevene dehydreres i gradert serie av etanol og xylen, fulgt av infiltrering av smeltet parafin som ikke holder mer enn 60 C. Riktig fikserte og innstøpte vev får uendelig holdbarhet før snitt og objektglassmontering ved lagring på kjølig sted (15 25 C) (2, 8). Andre fiksativer egner seg ikke. Utvidet fikseringstid kan øke inkubasjonstiden som kreves på pepsinnedbrytingstrinnet. Vevsprøver skal skjæres i snitt på 2 6 µm, samlet på objektglass fra et vannbad, og deretter lufttørkes. Den optimale tykkelsen på vevssnittene er 2 3 µm for Dako Split Signal FISH Probes. Snitt på 4 6 µm kan brukes til andre FISH-applikasjoner. Parafinen skal smeltes ved 60 C i minutter. Seksjonene skal så avkjøles til romtemperatur (20 25 C) og oppbevares ved 2 8 C. Det anbefales at vevssnitt monteres på Dako Silanized Slides, kode S-3003, eller poly-l-lysinbelagte objektglass eller Superfrost Plus objektglass. Generelt skal prøvene analyseres innen 6 måneder etter snitting når de lagres ved 2 8 C. Hvis vevssnitt oppbevares under andre betingelser enn spesifisert, må brukeren verifisere betingelsene. ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 6/26

7 BRUKSANVISNING A. Tilberedning av reagenser Det er praktisk å klargjøre følgende reagenser før farging: A.1 Pre-Treatment Solution Det kan oppstå krystaller i flaske 1, men de løser seg opp ved romtemperatur. Se til at det ikke finnes noen krystaller før klargjøring av reagensen. Fortynn en tilstrekkelig mengde flaske 1 (Pre- Treatment Solution 20x) ved å fortynne konsentratet 1:20 i destillert eller avionisert vann. Ubrukt fortynnet løsning kan oppbevares ved 2-8 C i én må ned. Kast fortynnet løsning hvis den får et tåkete utseende. A.2 Stringent Wash Buffer Fortynn en tilstrekkelig mengde fra flaske 4 (Stringent Wash Buffer 20x) ved å fortynne konsentratet 1:20 i destillert eller avionisert vann. Ubrukt fortynnet buffer kan oppbevares ved 2-8 C i én måned. Kast fortynnet buffer hvis den f år et tåkete utseende. A.3 Wash Buffer Fortynn en tilstrekkelig mengde av flaske 6 (Wash Buffer 20x) ved å fortynne konsentratet 1:20 i destillert eller avionisert vann. Ubrukt fortynnet buffer kan oppbevares ved 2 8 C i én måned. Kast fortynnet buffer hvis den får et tåkete utseende. A.4 Etanolserie Klargjør 3 kar med henholdsvis 70 %, 85 % og 96 % etanol fra en 96 % etanolløsning. Oppbevar de tildekkede karene ved romtemperatur eller ved 2 8 C, og bruk til maksimalt 200 objektglass. Kast løsningene hvis de får et tåkete utseende. A.5 Pepsinløsning En pepsinløsning er kun nødvendig ved bruk av pepsinneddykkingsmetoden (B.3.a og B.3.b, trinn 2, metode C). Klargjør pepsinløsningen som følger: Til en beholder med kapasitet til seks snitt klargjøres 60 ml pepsinløsning: Tilsett 48 ml romtemperert (20 25 C) destillert eller deionisert vann til beholderen. Tilsett 6 ml kald (2 8 C) Pepsin Diluent (10x) (flaske 2B) til beholderen. Tilsett 6 ml kald (2 8 C) Pepsin (flaske 2A) til beholderen. Sett lokk på beholderen, og ekvilibrer pepsinløsningen til 37 (±2) C i ett vannbad. Til en beholder med kapasitet til 24 snitt klargjøres 240 ml pepsinløsning: Tilsett 192 ml romtemperert (20 25 C) destillert eller avionisert vann til beholderen. Tilsett 24 ml kald (2 8 C) Pepsin Diluent (10x) (flaske 2B) til beholderen. Tilsett 24 ml kald (2 8 C) Pepsin (flaske 2A) til beholderen. Sett lokk på beholderen, og ekvilibrer pepsinløsningen til 37 (± 2) C i et vannbad. Den balanserte pepsinløsningen må brukes innen 5 timer. ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 7/26

8 B. Fargingsprosedyre B.1 Merknader Brukeren skal lese disse instruksjonene nøye og gjøre seg kjent med alle komponentene før bruk (se Forholdsregler). Hvis settets komponenter lagres frosne, anbefales det å flytte reagensene til 2 8 C dagen før analysen skal gjennomføres slik at de kan temperaturutjevnes. Alle reagenser skal balanseres til relevant temperatur før bruk. Flaske 1: Den fortynnede Pre-Treatment Solution skal balanseres til C hvis vannbad brukes (avsnitt B.3.a eller B.3.b Fargingsprotokoll, trinn 1: Forhåndsbehandling, Metode A). Hvis det brukes mikrobølgeovn med sensorevne til forbehandlingen (avsnitt B.3.a eller B.3.b. Fargingsprotokoll, trinn 1: Forbehandling, metode B), skal den fortynnede Pre-Treatment Solution balanseres til romtemperatur på C. Flaske 2A: Pepsin bør påføres ved 2 8 C (avsnitt B.3.a eller B.3.b, Fargingsprotokoll, trinn 2: metode A og B) og holdes kald kontinuerlig. Flaske 2B: Pepsin Diluent (10x) bør påføres ved 2 8 C (avsnitt B.3.a eller B.3.b, Fargingsprotokoll, trinn 2: metode C). Flaske 4: Ett kar med den fortynnede Stringent Wash Buffer skal balanseres til romtemperatur og et annet kar skal balanseres til 63 (±2) C (avsnitt B.3.a) eller 65 (±2) C (avsnitt B.3.b) før bruk. Flaske 5: Fluorescence Mounting Medium kan påføres ved hvilken som helst temperatur fra 2 25 C. Flaske 6: Fortynnet Wash Buffer skal balanseres til romtemperatur (20 25 C). Element 7: Coverslip Sealant kan påføres ved romtemperatur (20 25 C). Alle trinnene skal utføres ved angitt temperatur. Forhåndsfargingsprosedyren omfatter dehydreringer etterfulgt av tørking av prøvene. Sørg for at prøvene er helt tørre før du fortsetter til neste trinn. Ikke la prøver tørke i løpet av de andre prosedyretrinnene. Hvis fargingsprosedyren skal avbrytes, kan objektglassene oppbevares i Wash Buffer etter avparafiniseringstrinnet i inntil 1 time ved romtemperatur (20 25 C). B.2 Behandling av vev før farging Avparafinisering og rehydrering: Før prosedyren utføres, skal vevssnittene avparafiniseres for å fjerne parafin, og rehydreres. Unngå ufullstendig fjerning av parafin. Restparafin vil føre til økt ikkespesifikk farging. Dette trinnet skal utføres ved romtemperatur (20 25 C). 1. Plasser objektglassene i et xylenbad og inkuber i 5 (±1) minutter. Skift bad og gjenta én gang. 2. Bank forsiktig av overflødig væske og plasser objektglassene i 96 % etanol i 2 (±1) minutter. Skift bad og gjenta én gang. 3. Bank forsiktig av overflødig væske og plasser objektglassene i 70 % etanol i 2 (±1) minutter. Skift bad og gjenta én gang. 4. Bank forsiktig av overflødig væske og plasser objektglassene i fortynnet Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.2) i minst 2 minutter. Begynn fargingsprosedyren slik som skissert i avsnitt B.3.a, trinn 1, Forbehandling. Ferske xylen- og alkoholløsninger skal tilberedes etter at 200 objektglass er behandlet. Det kan benyttes xylensubstitutter. ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 8/26

9 MERKNAD: Reagenser og instruksjoner som medfølger i dette settet, er utformet for optimal ytelse. Ytterligere fortynning av reagenser eller endring av inkubasjonstemperaturer kan gi feilaktige eller ikke-samsvarende resultater. Forskjeller i vevbehandling og tekniske prosedyrer i brukerens laboratorium kan gjøre analyseresultatene ugyldige. Valgfri modning av prøver: Før avparafinisering og rehydrering må objektglass inkuberes ved 60 C i f.eks. 1 time på en varmeblokk, en blokk i en hybridiseringsovn eller på Dako Hybridizer. Alternativt inkuberes objektglass ved 37 C i 1 2 dager etterfulgt av 1 time ved 60 C. Fortsett med avparafinisering og rehydrering. MERKNAD: Dette trinnet er valgfritt. Modne prøver kan redusere potensiell bakgrunnsstøy. B.3 Fargingsprotokoll Følg én av de to fargingsprotokollvariantene, B.3.a eller B.3.b. Du må ikke forveksle trinn mellom de to prosedyrene: Fargingsprotokoll B.3.a beskriver prosedyren som varer en halv dag, som bør anvendes for FISHprober fortynnet i hybridiseringsbuffer basert på etylenkarbonat. Fargingsprotokoll B.3.b beskriver prosedyren som varer i to dager, som bør anvendes for FISHprober fortynnet i hybridiseringsbuffer basert på formamid. B.3.a. Fargingsprotokoll for FISH-prober fortynnet i hybridiseringsbuffer basert på etylenkarbonat Trinn 1: Forbehandling (mikrobølgeovn, vannbad, Pascal) Forbehandlingen kan utføres enten ved bruk av vannbad, slik som beskrevet i metode A), ved bruk av mikrobølgeovn med sensorevne, slik som beskrevet i metode B) eller ved bruk av en Pascal trykkoker, slik som beskrevet i metode C). Metode A: Forbehandling ved bruk av vannbad Fyll fargekarene, f.eks. Coplin-glass, med fortynnet Pre-Treatment Solution (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.1). Plasser fargekarene som inneholder fortynnet Pre-Treatment Solution i vannbad. Varm opp vannbadet og Pre-Treatment Solution til C. Mål temperaturen på innsiden av karet med et kalibrert termometer for å sikre riktig temperatur. Dekk til karene med lokk for å stabilisere temperaturen og unngå fordampning. Neddykk de romtempererte deparafiniserte snittene i den forhåndsoppvarmede Pre-Treatment Solution i fargekarene. Kontroller temperaturen på nytt, og inkuber i 10 (± 1) minutter ved C. Fjern hele karet med objektglass fra vannbadet. Fjern lokket og la objektglassene kjøle seg ned i Pre-Treatment Solution i 15 minutter ved romtemperatur. Overfør objektglassene til et kar med fortynnet Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Skift Wash Buffer og nedsenk snittene i ytterligere 3 minutter. MERKNAD: Pre-Treatment Solution er utformet kun til engangsbruk. Skal ikke gjenbrukes. Metode B: Forbehandling ved bruk av mikrobølgeovn med sensorevne (anbefalt) Fyll en plastbeholder med fortynnet Pre-Treatment Solution ved romtemperatur (20 25 C). Senk ned de avparafiniserte snittene i Pre-Treatment Solution, dekk til beholderen med et gjennomhullet lokk og plasser den i mikrobølgeovnen. Velg kokesensorfunksjonen og et program som går i 10 minutter etter at koketemperaturen er oppnådd*. Ta beholderen med objektglassene ut av ovnen etter 10 minutters inkubasjonstid, fjern lokket og kjøl ned i 15 minutter ved romtemperatur. Overfør objektglassene til et kar med fortynnet Wash Buffer, og senk ned glassene i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Skift Wash Buffer og nedsenk snittene i ytterligere 3 minutter. ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 9/26

10 * Bruk av en mikrobølgeovn med sensorevne betyr at ovnen må ha en sensor og programmer som innledningsvis varmer opp Pre-Treatment Solution til kokepunktet, og deretter opprettholder nødvendig forhåndsbehandlingstemperatur (over 95 C) mens for håndsinnstilt tid telles ned (10 (±1) minutter). Noen mikrobølgeovnsmodeller med sensorevne har kanskje ikke noe alternativ for å fritt stille inn en nedtellingstid. Hvis modellen kun inkluderer forhåndsinnstilte programmer, se til å velge et program som opprettholder den nødvendige forhåndsbehandlingstemperaturen (over 95 C) i mins t 10 (±1) minutter, og stopp programmet manuelt etter 10 (±1) minutter. MERKNAD: Pre-Treatment Solution er utformet kun til engangsbruk. Skal ikke gjenbrukes. Metode C: Forbehandling ved bruk av Pascal-trykkammer Sett 500 ml med avionisert vann inn i Pascal-beholderen. Fyll en plastbeholder med 250 ml Pre- Treatment Solution. Senk ned de avparafinerte snittene i Pre-Treatment Solution, og sett karet i Pascal-beholderen. Inkuber ved 121 C i 1 minutt. F rigi trykket etter avkjøling til 90 C. Les Pascalhåndboken nøye for å få informasjon om riktig håndtering av Pascal-trykkammeret. Fjern beholderen etter at trykket er borte. Fjern lokkene, og la objektglassene kjøle seg ned i Pre- Treatment Solution i 15 minutter til ved romtemperatur. Overfør objektglassene til et kar med fortynnet Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.2). Neddykk snittene i 3 minutter ved romtemperatur. Skift Wash Buffer og nedsenk snittene i ytterligere 3 minutter. Gå videre til trinn 2. MERKNAD: Pre-Treatment Solution er utformet kun til engangsbruk. Skal ikke gjenbrukes. Ikke bruk en forseglet, lufttett beholder når du utfører forhåndsbehandling i en mikrobølgeovn. Trykket på innsiden av beholderen vil øke og kan eksplodere eller forårsake skade under åpning. Det er mulig å bruke en objektglassholder av metall i mikrobølgeovnen hvis metallholderen er nedsenket i Pre-Treatment Solution under hele mikrobølgebehandlingen. Du skal ellers ikke bruke metall i en mikrobølgeovn. Følg instruksjonene til produsenten av mikrobølgeovnen. Unngå kontinuerlig koking av Pre-Treatment Solution i løpet av inkuberingen på 10 minutter. Utfør regelmessige temperaturkontroller med et kalibrert termometer for å verifisere riktige temperaturforhold. Trinn 2: Pepsin, klar til bruk (RTU) eller pepsinløsning Pepsininkubasjon kan utføres ved direkte påførsel av pepsindråper (som er klare til bruk) på objektglassene enten ved romtemperatur (20 25 C) (metode A) eller ved 37 C (metode B). Alternativt kan objektglassene legges i en pepsinløsning og inkuberes ved 37 (± 2) C (metode C). Metode A og metode B: Bank forsiktig bort ekstra buffer. Ved bruk av en lofri klut (slik som en absorberende wipe eller gas) tørkes det forsiktig rundt prøven for å fjerne resterende væske og holde reagensene innen det foreskrevne området. Påfør 5 8 dråper (250 µl) av kald (2 8 C) Pepsin (flaske 2A) for å dekke prøven. Pepsin skal alltid oppbevares ved 2 8 C. Metode A: Pepsin, RTU inkubasjon ved C Inkuber i 5 15 minutter ved romtemperatur (20 25 C). En inkubasjonstid på 5 15 minutter vil være tilstrekkelig for de fleste prøver, men den optimale inkubasjonstiden kan avhenge av vevsfiksering og/eller tykkelse på prøven og skal bestemmes av brukeren. Bank forsiktig av overflødig pepsin, og nedsenk snittene i fortynnet Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Erstatt fortynnet Wash Buffer, og neddykk snittene i enda 3 minutter. Fortsett til dehydrering. Metode B: Pepsin, RTU inkubasjon ved 37 C Plasser prøven med Pepsin på en varmeblokk ved 37 C f.eks. Dako Hybridizer og inkuber i 3-5 minutter. En inkubasjonstid på 3-5 minutter vil være tilstrekkelig for de fleste prøver, men den optimale inkubasjonstiden kan avhenge av vevsfiksering og/eller tykkelse på prøven og skal bestemmes av brukeren. Bank forsiktig av overflødig Pepsin, og senk ned snittene i fortynnet Wash Buffer i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Skift Wash Buffer og nedsenk snittene i ytterligere 3 minutter. Fortsett til dehydrering. ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 10/26

11 Dehydrer vevssnittene gjennom en gradert serie etanol: 2 minutter i 70 % etanol, 2 minutter i 85 % etanol og 2 minutter i 96 % etanol. La vevssnitt lufttørke fullstendig. Metode C: Pepsinløsning nedsenking av snitt i pepsinløsning på 37 C Settet inneholder nok reagenser til fire separate kjøringer (60 ml pepsinløsning, liten beholder for seks objektglass) eller én enkeltkjøring (240 ml pepsinløsning, stor beholder for 24 objektglass). Klargjør pepsinløsningen slik som beskrevet i avsnitt A.5. Sett lokk på beholderen, og ekvilibrer pepsinløsningen til 37 (± 2) C i et vannbad. Se til at temperaturen har stabilisert seg. Mål temperaturen inne i beholderen med et kalibrert termometer for å sikre at det holder riktig temperatur. Bank forsiktig av overflødig Wash Buffer. Legg objektglassene i pepsinløsningen på 37 (± 2) C, og inkuber i minutter. En inkubasjonstid på minutter vil være tilstrekkelig for de fleste prøver, men den optimale inkubasjonstiden kan avhenge av vevsfiksering og/eller tykkelse på prøven og skal bestemmes av brukeren. Bank forsiktig av overflødig pepsinløsning, og senk ned snittene i fortynnet Wash Buffer i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Skift Wash Buffer og nedsenk snittene i ytterligere 3 minutter. Fortsett til dehydrering. Dehydrer vevssnittene gjennom en gradert serie etanol: 2 minutter i 70 % etanol, 2 minutter i 85 % etanol og 2 minutter i 96 % etanol. La vevssnitt lufttørke fullstendig. Trinn: 3 FISH-prober fortynnet i hybridiseringsbuffer basert på etylenkarbonat (gitt av brukeren) MERKNAD: FISH-probemikser fortynnet i hybridiseringsbuffer basert på etylenkarbonat må lagres ved 18 C mellom bruk. Lagring ved 18 C fører ti l at bufferen separeres i to faser. Før bruk må man sikre seg at bare én fase er til stede, ved å ekvilibrere probemiksen til romtemperatur, (20 25 C) etterfulgt av miksing. Tin FISH-probemiksen ved romtemperatur (20 25 C) i maksimalt 30 minutter (beskytt mot sterkt lys), og drei flasken hurtig i 15 sekunder ved 2500 rpm ved bruk av en vortex-blander. Påfør en passende mengde probemiks, f.eks. 10 µl på midten av vevssnittet. Plasser umiddelbart et 22 mm x 22 mm dekkglass over probemiksen, og la den spre seg jevnt under dekkglasset. Unngå luftbobler. Hvis det observeres luftbobler, bank dem forsiktig bort fra vevet ved bruk av pinsett. Forsegle dekkglassene med Coverslip Sealant ved å støte ut limet rundt kanten av dekkglasset. La Coverslip Sealant overlappe dekkglasset og objektglasset, slik at det dannes en forsegling rundt dekkglasset. Se til at Coverslip Sealant dekker hele kanten av dekkglasset. Klargjør Dako Hybridizer* (kode S2450 eller S2451) for en hybridiseringskjøring. Se til at Humidity Control Strips (kode S2452) er mettet og optimale for bruk. Start Hybridizer, og velg et program som vil: Denaturere ved 66 C i 10 minutter fulgt av hybridisering ved 45 C i minutter. Plasser objektglassene i Hybridizer. Se til at lokket er godt lukket, og start programmet. Du finner detaljer i bruksanvisningen for Dako Hybridizer. * Instrumentering som tillater forhold som er identiske med de som beskrives ovenfor, kan brukes til denaturering og hybridisering: Plasser objektglass på en flat metall- eller steinoverflate (varmeblokk eller på en blokk i en hybridiseringsovn) foroppvarmet til 66 (± 1) C. Denaturer i nøyaktig 10 minutter. Plasser objektglassene i et forhåndsoppvarmet fuktig hybridiseringskammer. Dekk til kammeret med et lokk, og inkuber ved 45 (± 2) C i minutter. Trinn 4: Stringent Wash Fyll to fargekar, f.eks. Coplin-glass, med fortynnet Stringent Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.2). Det anbefales et minstevolum på 100 ml eller 15 ml per objektglass i hvert kar. ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 11/26

12 Plasser ett av fargekarene som inneholder fortynnet Stringent Wash Buffer, i romtemperatur i en avtrekksskap og det andre i et vannbad. Varm opp vannbadet og fortynnet Stringent Wash Buffer til 63 C. Se til at temperaturen har stabilisert seg. Dekk til karet med lokk for å stabilisere temperaturen og unngå fordampning. Mål temperaturen inne i vannbadkaret med et kalibrert termometer for å sikre at det holder riktig temperatur. Stringent Wash Buffer inneholder rengjøringsmiddel og kan bli turbide ved 63 C; det te vil ikke påvirke ytelsen. Ta objektglassene ut fra hybridiseringskammeret ved bruk av pinsett eller hansker, og fjern Coverslip Sealant og dekkglasset forsiktig, og plasser objektglassene i det romtempererte forvaskkaret, ett om gangen. Så snart alle dekkglassene er fjernet, overføres objektglassene fra det romtempererte forvaskkaret til karet på 63 (± 2) C i vannbadet. Timeren bør startes straks etter at objektglassene er overført til den fortynnede Stringent Wash Buffer på 63 (±2) C i vannbadet. Utfør stringent vask i nøyaktig 10 minutter. Fjern objektglassene fra fortynnet Stringent Wash Buffer, og senk ned snittene i fortynnet Wash Buffer i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Skift ut fortynnet Wash Buffer, og neddykk snittene i enda 3 minutter. Dehydrer vevssnittene gjennom en gradert serie etanol: 2 minutter i 70 % etanol, 2 minutter i 85 % etanol og 2 minutter i 96 % etanol. La vevssnitt tørke fullstendig. Trinn 5: Montering Påfør 15 µl Fluorescence Mounting Medium som inneholder DAPI (flaske 5), på målområdet av objektglasset, og legg på et dekkglass. MERKNAD: Objektglassene kan avleses etter 15 minutter eller innen 7 dager etter montering. Men det oppstår blekning hvis objektglassene utsettes for lys eller høye temperaturer. For å minimere blekning skal objektglassene oppbevares på et mørkt sted ved 18 8 C. B.3.b. Fargingsprotokoll for FISH-prober fortynnet i hybridiseringsbuffer basert på formamid DAG 1 Trinn 1: Forbehandling (mikrobølgeovn, vannbad, Pascal) Forbehandlingen kan utføres enten ved bruk av vannbad, slik som beskrevet i metode A), ved bruk av mikrobølgeovn med sensorevne, slik som beskrevet i metode B) eller ved bruk av et Pascaltrykkammer, slik som beskrevet i metode C). Metode A: Forbehandling ved bruk av vannbad Fyll fargekar med fortynnet Pre-Treatment Solution (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.1). Plasser fargekarene som inneholder fortynnet Pre-Treatment Solution i vannbad. Varm opp vannbadet og Pre-Treatment Solution til C. Mål temperaturen på innsiden av karet med et kalibrert termometer for å sikre riktig temperatur. Dekk til karene med lokk (uten hull) for å stabilisere temperaturen og unngå fordampning. Senk ned de avparafiniserte snittene i den forvarmede Pre-Treatment Solution. Kontroller temperaturen på nytt, lukk vannbadlokket, og inkuber i 10 (± 1) minutter ved C. Fjern hele karet med objektglass fra vannbadet. Fjern lokk (ikke fjern objektglassene). La objektglassene avkjøles i Pre-Treatment Solution i 15 minutter ved romtemperatur. Overfør objektglassene til et kar med fortynnet Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.2) i 3 minutter ved romtemperatur. Skift Wash Buffer og nedsenk snittene i ytterligere 3 minutter. Gå videre til trinn 2. ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 12/26

13 Metode B: Forbehandling ved bruk av mikrobølgeovn med sensorevne (anbefalt) Fyll en beholder med fortynnet romtemperert (20 25 C) Pre-Treatment Solution. Senk avparafiniserte snitt ned i løsningen og lukk lokket. Lokket skal ha hull slik at trykket kan unnslippe. Plasser beholderen med objektglass inn i mikrobølgeovnen og varm opp. Sørg for at utsiden på beholderen og mikrobølgeovnens rom er tørt før oppvarming. Inkuber like under kokepunktet (ikke lavere enn 95 C) i 10 minutter. Fjern lokket etter innkubering (ikke fjern objektglass). La objektglassene avkjøles i Pre-Treatment Solution i 15 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Objektglassene skal dekkes med buffer under hele forbehandlingsprosedyren. Overfør objektglassene til et kar med fortynnet Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.2) i 3 minutter ved romtemperatur. Skift Wash Buffer og nedsenk snittene i ytterligere 3 minutter. Gå videre til trinn 2. Metode C: Forbehandling ved bruk av Pascal-trykkammer Sett 500 ml med avionisert vann inn i Pascal-beholderen. Fyll en plastbeholder med 250 ml Pre- Treatment Solution. Senk ned de avparafinerte snittene i Pre-Treatment Solution, og sett karet i Pascal-beholderen. Inkuber ved 121 C i 1 minutt. F rigi trykket etter avkjøling til 90 C. Les Pascalhåndboken nøye for å få informasjon om riktig håndtering av Pascal-trykkammeret. Fjern beholderen etter at trykket er borte. Fjern lokkene, og la objektglassene kjøle seg ned i Pre- Treatment Solution i 15 minutter til ved romtemperatur. Overfør objektglassene til et kar med fortynnet Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.2). Nedsenk snittene i 3 minutter ved romtemperatur. Skift Wash Buffer og nedsenk snittene i ytterligere 3 minutter. Gå videre til trinn 2. MERKNAD: Pre-Treatment Solution er utformet kun til engangsbruk. Skal ikke gjenbrukes. Ikke bruk en forseglet, lufttett beholder når du utfører forhåndsbehandling i en mikrobølgeovn. Trykket på innsiden av beholderen vil øke, og kan eksplodere eller forårsake skade under åpning. Det er mulig å bruke en objektglassholder av metall i mikrobølgeovnen hvis metallholderen er nedsenket i Pre-Treatment Solution under hele mikrobølgebehandlingen. Du skal ellers ikke bruke metall i en mikrobølgeovn. Følg instruksjonene til produsenten av mikrobølgeovnen. Unngå kontinuerlig koking av Pre-Treatment Solution i løpet av inkuberingen på 10 minutter. Utfør regelmessige temperaturkontroller med et kalibrert termometer for å verifisere riktige temperaturforhold. Trinn 2: Pepsin, klar til bruk (RTU) eller pepsinløsning Pepsininkubasjon kan utføres ved direkte påføring av RTU-pepsindråper på snittene enten ved romtemperatur (20 25 C) (metode A) eller ved 37 C (metode B). Alternativt kan snitt nedsenkes i en pepsinløsning og inkuberes ved 37 (± 2) C (metode C) Metode A og metode B: Bank forsiktig bort ekstra buffer. Bruk en lofri klut (for eksempel en absorberende serviett eller gas) og tørk forsiktig rundt prøven for å fjerne resterende væske og holde reagensene innen det foreskrevne området. Tilfør 5 8 dråper (250 µl) med kald (2 8 C) Pepsin (flaske 2A), slik at du sikrer at prøven er dekket. Pepsin skal alltid oppbevares ved 2 8 C. Metode A: Pepsin, RTU inkubasjon ved C Inkuber i 5 50 minutter ved romtemperatur (20 25 C). En inkubasjonstid på minutter ved romtemperatur, vil være tilstrekkelig for de fleste prøver, men brukeren skal bestemme den optimale inkubasjonstiden. Bank forsiktig av overflødig Pepsin, og nedsenk snittene i fortynnet Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Erstatt fortynnet Wash Buffer, og nedsenk snittene i enda 3 minutter. Fortsett til trinn 3, FISH-probe eller se vedlegg 2 for optimalisering av nedbrytningstid (frivillig). ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 13/26

14 Metode B: Pepsin, RTU inkubasjon ved 37 C Plasser prøvene med Pepsin ved 37 C på Dako Hybridizer eller på en forvarmet oppvarmingsblokk. Inkuber i 2 6 minutter ved 37 C.Dette vil være tilstrekkelig for de fleste prøvene som forberedes som beskrevet i avsnittet Prøveklargjøring. Den optimale inkubasjonstiden avhenger av vevstypen, vevsfikseringen, tykkelsen på prøven, prøvens modning og skal bestemmes av brukeren. Disse faktorene kan øke den nødvendige nedbrytingstiden til 7-15 minutter eller enda lenger. Førstegangsbrukere skal finne optimal nedbrytingstid ved å teste et representativt vev i 1, 3, 6, 12 og 18 minutter. Bank forsiktig av Pepsin, og nedsenk snittene i fortynnet Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Erstatt fortynnet Wash Buffer, og neddykk snittene i enda 3 minutter. Fortsett til trinn 3, FISH-probe eller se vedlegg 2 for optimalisering av nedbrytningstid (frivillig). Metode C: Pepsinløsning nedsenking av snitt i pepsinløsning på 37 C Settet inneholder tilstrekkelig med reagenser til fire separate kjøringer (60 ml pepsinløsning, liten beholder for seks objektglass) eller en enkelt kjøring ( 240 ml pepsinløsning, stor beholder for 24 objektglass). Klargjør pepsinløsningen slik som beskrevet i avsnitt A.5. Sett lokk på beholderen, og ekvilibrer pepsinløsningen til 37 (± 2) C i et vannbad. Se til at temperaturen har stabilisert seg. Mål temperaturen inne i beholderen med et kalibrert termometer for å sikre at det holder riktig temperatur. Bank forsiktig av overflødig Wash Buffer. Legg objektglassene i pepsinløsningen på 37 (± 2) C, og inkuber i minutter. En inkubasjonstid på minutter vil være tilstrekkelig for de fleste prøver, men den optimale inkubasjonstiden kan avhenge av vevsfiksering og/eller tykkelse på prøven og skal bestemmes av brukeren. Bank av overflødig pepsinløsning, og nedsenk snittene i fortynnet Wash Buffer i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Skift Wash Buffer og nedsenk snittene i ytterligere 3 minutter. Fortsett til trinn 3, FISH-probe eller se vedlegg 2 for optimalisering av nedbrytningstid (frivillig). MERKNAD: Det anbefales å følge prosedyren i avsnittet Prøveklargjøring. Under-nedbrutt vev kan resultere i ingen signaler eller bare uklare signaler ofte med et høyt nivå av grønn cytosolisk bakgrunn. Trinn 3: FISH-probe (gitt av brukeren) MERKNAD: Hvis reagenser fra Dako Histology FISH Accessory Kit, kode K5799, brukes sammen med reagenser fra kode K5731, må prosedyren angitt i pakningsvedlegget for kode K5731, følges. Følgende trinn skal utføres i en avtrekkshette. Fluorkrommerkede prøver kan påvirkes negativt hvis de utsettes for sterke lysnivåer. Ikke utfør det resterende av denne prosedyren i sterkt lys, slik som direkte sollys. Dehydrer vevssnittene gjennom en gradert serie etanol: 2 minutter i 70 % etanol, 2 minutter i 85 % etanol og 2 minutter i 96 % etanol (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.4). La vevssnitt lufttørke fullstendig. Påfør en passende mengde fluorkrommerket prøve, f.eks. 10 µl av en Dako FISH-prøve til midten av vevssnittet. Plasser umiddelbart et 18 mm x 18 mm (eller f.eks. 22 mm x 22 mm) dekkglass over prøven og la den fordele seg jevnt under dekkglasset. Unngå luftbobler. Hvis luftbobler oppdages, bank forsiktig på dem ved å bruke en bomullstang. Forsegl dekkglass ved å bruke Coverslip Sealant rundt periferien av dekkglasset. La Coverslip Sealant overlappe dekkglasset og objektglasset, slik at det dannes en forsegling rundt dekkglasset. Se til at Coverslip Sealant dekker hele kanten av dekkglasset. Plasser objektglassene i Dako Hybridizer (kode S2450/S2451), og sett denatureringen på 82 C i 5 min og hybridiseringen på 45 C over natten (14 20 timer) ved bruk av Dako FISH-prober. Fortsett til dag 2, trinn 4, Stringent Wash. Se Hybridizer-håndboken for å få videre instruksjoner. MERKNAD: En varmeblokk, hybridiseringsovn og hybridiseringskammer kan alternativt brukes, se nedenfor. ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 14/26

15 Plasser objektglasset på en flat metall- eller steinoverflate (varmeblokk eller på en blokk i en hybridiseringsovn) forhåndsoppvarmet til 82 (± 2) C. Denaturer i 5 minutter, og sørg for at temperaturen til blokken ikke faller under 80 C på noe tidspunkt. Plasser objektglassene i et forhåndsoppvarmet fuktig hybridiseringskammer. Dekk til kammeret med et lokk, og inkuber over natten (14 20 timer) ved 45 (± 2) C ved bruk av Dako FISH-prober. DAG 2 Trinn 4: Stringent Wash Fyll to fargekar med fortynnet Stringent Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.2). Et minimumsvolum på 100 m fortynnet Stringent Wash Buffer er nødvendig til 1 6 objektglass i et kar. For mer enn 6 objektglass, bruk minst 15 ml buffer per objektglass. Plasser ett av fargekarene som inneholder fortynnet Stringent Wash Buffer, i romtemperatur i en avtrekksskap og det andre i et vannbad. Varm opp vannbadet og fortynnet Stringent Wash Buffer til 65 (± 2) C. Se til at temperaturen har stabilisert seg. Dekk til karet med lokk for å stabilisere temperaturen og unngå fordampning. Mål temperaturen i karet med et kalibrert termometer for å sikre at det holder riktig temperatur. Ta objektglass fra hybridiseringskammeret. Fjern Coverslip Sealant og dekkglasset forsiktig med pinsett og overfør objektglasset til det romtempererte forvaskkaret. Så snart alle dekkglassene er fjernet, overføres objektglassene fra det romtempererte forvaskkaret til glasset på 65 (± 2) C i vannbadet. Lukk karlokket, og deretter vannbadlokket. Utfør stringent vask i nøyaktig 10 minutter ved 65 (± 2) C. Fjern objektglassene fra den fortynnede Stringent Wash Buffer, og nedsenk snittene i fortynnet Wash Buffer i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Skift ut fortynnet Wash Buffer, og neddykk snittene i enda 3 minutter. Dehydrer vevssnittene gjennom en gradert serie etanol: 2 minutter i 70 % etanol, 2 minutter i 85 % etanol og 2 minutter i 96 % etanol (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.4). La objektglass lufttørke helt. Trinn 5: Montering Påfør 15 µl med Fluorescence Mounting Medium (flaske 5), som inneholder blå fluorescerende kontrastfarge, på målområdet på objektglasset, og legg på et dekkglass (f.eks. 24 mm x 50 mm eller 24 mm x 60 mm). La mediet fordele seg jevnt over prøven. MERKNAD: Objektglassene kan avleses etter 15 minutter eller innen 7 dager etter montering. Blekning oppstår hvis objektglassene utsettes for lys eller høye temperaturer. Objektglass skal oppbevares mørkt ved 18 8 C. Kvalitetskontroll 1. Signalene skal være lyse, tydelige og lette å evaluere. 2. Normalt vev som tidligere har vist FISH well skal brukes til kontroll av den kjørte analysen. 3. Normale vevsceller skal ha tydelige fluorescenssignaler, noe som indikerer at FISH-prøvene har vellykket hybridisert til målområdene. 4. Hvis signaler ikke påvises i normale vevsceller, indikerer dette at analysen var mislykket, og resultatene skal betraktes som ugyldige. 5. På grunn av vevssnitt vil noen normale celler ha mindre enn de forventede antall signaler. 6. Nukleærmorfologi skal være intakt og homogent farget ved evaluering ved bruk av DAPI-filter. Mange skyggeceller, smultringformede celler og generelt dårlig nukleærmorfologi indikerer overnedbryting eller overdenaturering av prøven, noe som kan føre til tap eller fragmentering av signaler. Perifer farging, hull i celler (DAPI-filter) og/eller sterk grønn cytosolisk bakgrunnsfarging under observasjon med et Texas Red/FITC dobbeltfilter, kan indikere undernedbryting, noe som kan føre til tap av signal. Slike prøver skal betraktes som ugyldige. 7. Forskjeller i vevsfiksering, prosessering og innstøpning i brukerlaboratoriet kan frembringe variasjon i resultatene og gjør det påkrevd med regelmessig evaluering av interne kontroller. ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 15/26

16 Tolking av resultatene Skann flere celleområder for å ta beregning for mulig heterogenitet. Velg et område som har god nukleinfordeling. Begynn analysen i øvre venstre kvadrant av det valgte området, skann fra venstre til høyre, tell antall signaler innen den nukleære grensen for hver evaluerte nukleus ifølge retningslinjene nedenfor. Fokuser opp og ned for å finne alle signalene i den enkelte nukleus. Nukleiner uten signaler skal ikke skåres. Ikke inkluder nuklein som krever subjektiv bedømmelse. Hopp over nukleuser med svak signalintensitet og ikke-spesifikk eller høy bakgrunn. Brukeren skal bestemme antall nukleiner som skal regnes med for hver prøve. Unngå områder hvor de nukleine grensene er tvetydige. ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 16/26

17 Feilsøking Problem Mulig årsak Foreslått løsning 1. Ingen signaler eller svake signaler 1a. Uegnet nedbrytingstid. 1a. Se til at kun formalinfikserte, parafininnstøpte vevssnitt brukes. En forlenget nedbrytingstid på f.eks minutter eller enda lenger ved 37 C kan hjelpe. Se avsnitt B.3.a eller B.3.b, trinn 2, Feilsøkingspunkt 4d, 4e og vedlegg 2. 1b. Settet er utsatt for høye temperaturer i løpet av transport eller lagring. 1b. Kontroller oppbevaringsbetingelser. Se til at tørris finnes når leveringen mottas. Se til at flaskene 2A og 5 har vært lagret ved 2 8 C, og at flaske 5 har blitt lagret mørkt. 1c. Forbehandlingsbetingelser feil. 1c. Se til at den anbefalte forbehandlingstemperaturen og -tiden brukes. Videre at nedbrytingsinkubasjonstiden har blitt optimalisert ved behov, se avsnitt B.3.a eller B.3.b, trinn 2. Jo nærmere forbehandlingstemperaturen kommer kokepunktet, desto sterkere signaler. Sørg for at pepsin håndteres ved riktig temperatur. Se avsnitt B.1. 1d. Feil denatureringsforhold. 1d. Se til at den anbefalte denatureringstemperaturen og -tiden brukes. 1e. Feil hybridiseringstemperatur. 1e. Hybridiser ved 45 (± 2) C ved bruk av Dako FISHprober. 1f. Fordampning av prøvebufferen under hybridiseringen. 1f. Sikre tilstrekkelig fuktighet i hybridiseringskammeret. Bruk Dako Hybridizer (kode S2450/S2451) og Hybridizer Humidity Control Strips (kode S2452). Bruk Coverslip Sealant. Se feilsøkingspunkt 5a og 5b. ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 17/26

18 1g. Stringensvaskforhold feil. 1g. Sikre at anbefalt stringensvaskvolum, - temperatur og -tid brukes, og at dekkglass fjernes før utføring av stringensvask. 1h. Mikroskopet fungerer ikke skikkelig - Feil filtersett - Feil lampe - Kvikksølvlampen for gammel - Utbrente filtre - Skitne og/eller sprukne samlelinser - Uegnet neddykkingsolje 1h. Kontroller mikroskopet og se til at de brukte filtrene egner seg til bruk med fluorokromene, at de ikke er utslitt og at kvikksølvlampen er riktig og at den ikke har blitt brukt lenger enn forventet levetid (se vedlegg 1). Bruk passende neddyppingsolje for fluorescens. I tvilstilfeller, ta kontakt med den lokale mikroskopleverandøren. 1i. Blekede signaler. 1i. Unngå utvidet mikroskopisk undersøkelse og minimer eksponeringen for sterke lyskilder. 2. Områder uten signal 2a. Prøvevolum for lite. 2a. Påse at prøvevolumet er stort nok til å dekke området under dekkglasset. 2b. Luftbobler fanget ved prøvepåføring eller montering. 2b. Unngå luftbobler. Hvis disse oppdages, bank dem forsiktig bort ved bruk av pinsett. 2c. Dårlig avparafinisering. 2c. Påse at parafinen er fullstendig fjernet fra snittene. Se avsnitt B Overflødig bakgrunnsfarging 3a. Uegnet nedbrytingstid. Sterk grønn cytosolisk bakgrunn kan tyde på undernedbryting. 3a. Se til at kun formalinfikserte, parafininnstøpte vevssnitt brukes. En forlenget nedbrytingstid på f.eks minutter ved 37 C kan hjelpe. Se avsnitt B.3.a eller B.3.b. Trinn 2, Feilsøkingspunkt 4e og vedlegg 2. 3b. Snitt har tørket i B.3. 3b. Følg instruksjonene og unngå tørking av objektglass med mindre dette er spesifisert. 3c. Parafin ikke fullstendig fjernet. 3c. Følg prosedyrene for avparafinering og rehydrering som er beskrevet i avsnitt B.2. ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 18/26

19 4. Dårlig nukleinmorfologi eller svak nukleinfarging 3d. Stringensvasketemperatur for lav. 3e. Forlenget eksponering av hybridisert snitt i sterkt lys. 3f. Utgåtte objektglass eller ikkeegnede objektglass kan forårsake for mye rød stjernehimmel -farging. 3g. Ikke-fluorescerende neddyppingsolje blandet med fluorescerende monteringsmedium. 4a. Feil forhåndsbehandlingsbetingelser kan føre til uklart eller tåkete utseende. 4b. Koking under forbehandling kan resultere i morfologisk skade og mangel på signaler. 3d. Se til at den anbefalte stringensvasketemperaturen brukes. 3e. Unngå utvidet mikroskopisk undersøkelse og minimer eksponeringen for sterkt lys. 3f. Bruk de anbefalte objektglasstypene og påse at de ikke er utløpt. Se avsnittet Parafininnstøpte vevssnitt. 3g. Bruk store glass dekkglass ved montering som anbefalt. Se avsnitt B.3.a eller B.3.b, trinn 5. Dette forhindrer neddyppingsolje fra å blandes med monteringsmediet, unngår auto-fluorescens og utilsiktet fjerning av dekkglass av mikroskopobjektivet. 4a. Se til at den anbefalte forbehandlingstemperaturen og -tiden brukes. Se også feilsøkingspunkt 4b-e. 4b. Unngå koking. Se avsnitt B.3, trinn 1. Se også feilsøkingspunkt 4d. 4c. Feil pepsinbehandling. 4c. Overhold de anbefalte pepsininkubasjonstidene. Se avsnitt B.3, trinn 2 og vedlegg 2. Se også feilsøkingspunkt 1a, 1c 3a, 4d og 4e. 4d. For lang pepsinbehandling vil oppløse vevet og resultere i mangel på signaler. Overnedbryting kan føre til skyggeceller eller smultringskjerne og at kjerne med en generell dårlig nuklein morfologi fremkommer. 4e. For kortvarig pepsinbehandling kan resultere i mangel på signaler. Undernedbrutt vev kan forårsake periferisk nukleinfarging og hull i nuklein (DAPI-filter); høy grønn bakgrunn i cytosol (Texas Red/FITC dobbeltfilter). Merk at nuklein i undernedbrutt vev har fin morfologi i motsetning til overnedbrutt vev. 4d. Forkort pepsininkubasjonstiden. Se avsnitt B.3.a eller B.3.b, trinn 2 og vedlegg 2. Sørg for at snittykkelsen er 2 6 µm. Se også feilsøkingspunkt 1a, 1c, 4b og 4e. 4e. Forleng pepsininkuberingstiden til f.eks. 2-3 ganger den anvendte nedbrytingstiden. Se også feilsøkingspunkt 1a, 1c, 3a, 4a og 4d. ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 19/26

20 5. Dekkglass kleber sterkt til glassobjektglass etter hybridisering og er dermed vanskelig å fjerne. 4f. Denatureringstemperatur er for høy. 4f. Se til at den anbefalte denatureringstemperaturen brukes. 4g. Feil hybridiseringsforhold. 4g. Se feilsøkingspunkt 1f og 5b. 5a. Dekkglass utilstrekkelig forseglet til glassobjektglass. 5a. Ikke bryt av dekkglasset hvis dekkglasset kleber sterkt til glassobjektglass. Senk ned objektglasset i karet som inneholder fortynnet Stringent Wash Buffer ved romtemperatur i fem minutter og fjern deretter dekkglasset. Følg anbefalingene for dekkglassforsegling i avsnitt B.3.a eller B.3.b, trinn 3. Se også feilsøkingspunkt 1f og 5b. 6. Høyt nivå av grønn autofluorescens på objektglass, inkludert områder uten FFPE-vev 5b. Feil hybridiseringsforhold. Kan medføre reduserte eller ingen signaler, vevskade og bakgrunnsfarging. 6. Bruk av utløpt eller ikke anbefalte objektglass i glass 5b. Sikre tilstrekkelig fuktighet i hybridiseringskammeret. Bruk Dako Hybridizer (kode S2450/S2451) og Hybridizer Humidity Control Strips (kode S2452). Følg instruksjonene i pakningsvedlegget for Hybridizer Humidity Control Strips. Se anbefalinger for hybridiseringsforhold i avsnitt B.3.a eller B.3.b, trinn 3. Se også feilsøkingspunkt 1f og 5a. 6. Se til at det belagte objektglasset i glass (Dako Silanized Slides, kode S3003, eller poly-llysin-belagte objektglass) ikke har utløpt utløpsdato. MERKNAD: Dersom problemet ikke er noen av de nevnte tilfellene ovenfor, eller dersom den foreslåtte løsningen ikke utbedrer problemet, må du ringe Dakos tekniske avdeling for å få ytterligere hjelp. ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 20/26

21 Tillegg 1 Histology FISH Accessory Kit, kode K5799 Fluorescerende mikroskopspesifikasjoner Dako anbefaler følgende utstyr til bruk med Histology FISH Accessory Kit ved bruk av Dako FISH-prober: 1. Mikroskoptype Epifluorescerende mikroskop. 2. Lampe 100 watt kvikksølvlampe (skal normalt skiftes etter 200 timer). 3. Objektiver For skanning av vev brukes fluorescerende tørr 10x eller fluorescerende oljenedsenkning 16x objektiver. For høy strømforsterkning og signalskåring anbefales kun fluorescerende oljeneddykkingsobjektiver, f.eks. 63x eller 100x. 4. Filtre Filtrene er utformet enkeltvis for spesifikke fluorokromer og skal velges deretter. Dako anbefaler bruk av et spesifikt DAPI-filter i kombinasjon med et høykvalitets Texas Red/FITC-dobbeltfilter ved bruk av Dako Fish-prober. DAPI filter, f.eks. Omega Optical filter nr. XF06 eller Chroma filter nr. Texas Red/FITC dobbeltfilter, f.eks. Omega Optical filter nr. XF53 eller Chroma-filter nr. Texas Red og FITC-singelfiltre kan brukes til bekreftelse, f.eks. henholdsvis Omega Opticalfilter nr. XF102-2 og XF202. Fluorokrom Magnetiseringsbølgelengde Utslippsbølgelengde FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filtre er spesifikke for hver mikroskoptype, og bruken av egnede filtre er avgjørende for tolkningen. Ytterligere detaljert informasjon kan fås av din mikroskopprodusent eller din Dako-representant eller på nettsiden til Dako. 5. Olje Ikke-fluorescerende nedsenkingsolje. Forholdsregler Spesielle fluorokrom krever forskjellig utstyr. For Dako FISH-prøver anbefales ikke en 50 watt kvikksølvlampe, rodaminfiltre kan ikke brukes, og tredoble filtre er generelt ikke anbefalt. Et ikke-optimert mikroskop kan forårsake problemer ved lesing av de fluorescerende signalene. Det er viktig at lyskilden ikke har utgått og at den er riktig innrettet og fokusert. Kunder skal overvåke og følge produsentens anbefalinger for kvikksølvlampen, og mikroskopet skal vedlikeholdes. Det skal gjøres en innsats for å utsette prøven for så lite magnetiseringslys som mulig for å kunne minimere blekningen av det fluorescerende lyset. Vi anbefaler at du diskuterer oppsettet av det bestemte mikroskopet med produsenten før den fluorescerende in situ-hybridiseringen startes, eller se relevant litteratur. ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 21/26

22 Tillegg 2 Alternativt trinn for optimalisering av fordøyelsestiden til pepsin Dette alternative trinnet kan brukes til å evaluere effekten av pepsinfordøyelsen og bidra til å optimalisere fordøyelsestid brukt i trinn 2, Pepsin. For å kontrollere om den brukte pepsinfordøyelsestiden er tilstrekkelig, farg det vaskede pepsinfordøyde vevssnittet med medfølgende 10 µl propidiumiodid (400 ng/ml). Plasser et 22 mm x 22 mm dekkglass over propidiumiodiden og la den spre seg jevnt under dekkglasset. Inkuber i 1 minutt. Bruk et fluorescerende mikroskop med Texas Red/FITC dobbeltfilter (se vedlegg 1) for å evaluere rødfargingen av nuklein med propidiumiodid. Hvis vevsfordøyelsen er akseptabel skal det være rød nuklein med veldefinert omkrets. Fjern propidiumiodid ved å nedsenke snitt i fortynnet Wash Buffer to ganger i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C), og fortsett til avsnitt B3, Fargingsprotokoll, trinn 3, FISH-probe. Hvis nukleinen fortsatt er grønn ved autofluorescens og ikke farget rød av propidiumiodid, er det nødvendig å gjenta nedbrytingssyklusen: Dypp snitt i fortynnet Wash Buffer to ganger i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C) for å fjerne propidiumiodid. Påfør 5 8 dråper (250 µl) med kald (2 8 C) Pepsin (flaske 2) for å dekke prøven. Pepsin skal alltid oppbevares ved 2 8 C. Plasser objektglass med 37 C på en forvarmet varmeblokk eller på Dako Hybridizer. Inkuber i 10 minutter hvis ingen eller lite nedbryting har forekommet. De 10 minuttene er bare veiledende, brukeren skal bestemme den optimale tiden. Nedsenk igjen i fortynnet Wash Buffer to ganger i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C) for å fjerne Pepsin. Bruk en gang til 10 µl propidiumiodid (400 ng/ml) i 1 minutt. Evaluer farging og nedsenk snittene i fortynnet Wash Buffer to ganger i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Gjenta syklusen om nødvendig, eller fortsett til avsnitt B.3.a eller B.3.b, Fargingsprotokoll, trinn 3, FISH-probe. MERKNAD: Settet inneholder nok reagenser til 20 tester. Bruken av Wash Buffer og Pepsin i dette valgfrie trinnet vil redusere det totale antall mulige tester med settet. ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 22/26

23 Referanser 1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 CFR 7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company; Brown RSD, Edwards J, Bartlet JW, Jones C, Dogan A. Routine acid decalcification of bone marrow samples can preserve DNA for FISH and CGH studies in metastatic prostate cancer. J Histochem Cytochem : Alers JC, Krijtenberg P-J, Visser KJ, van Dekken H. Effect of bone decalcification procedures on DNA in situ hybridization and comparative genomic hybridization: EDTA is highly preferable to a routinely used acid decalcifier. J Histochem Cytochem : Provan AB, Hodges E, Smith AG, Smith JL. Use of paraffin wax embedded bone marrow trepine biopsy specimens as a source of archival DNA. J Clin Pathol : Sarsfield P, Wickham CL, Joyner MV, Ellard S, Jones DB, Wilkins BS. Formic acid decalcification of bone marrow trephines degrades DNA: alternative use of EDTA allows the amplification and sequencing of relatively long PCR products. Mol Pathol : Reineke T, Jenni B, Abdou MT, Frigerio S, Zubler P, Moch H, Tinguely M. Ultrasonic decalcification offers new perspectives for rapid FISH, DNA, and RT-PCR analysis in bone marrow trephines. Am J Surg Pathol : Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press; Symbolforklaring Katalognummer Temperaturbegrensning Lotnummer Skadelig In vitro diagnostisk medisinsk utstyr Skal ikke oppbevares i sollys (se avsnittet om oppbevaring) Brukes innen Ekstremt antennelig Se bruksanvisningen Inneholder tilstrekkelig Produsent Farlig for miljøet ( ) SSK5799CE_003/NO/SVM/ s. 23/26