HER2 IQFISH pharmdx Kode K5731

Transkript

1 HER2 IQFISH pharmdx Kode K utgave HER2 IQFISH pharmdx en direkte fluorescerende in situ-hybridiseringsanalyse (FISH) for kvantitativ bestemmelse av HER2-genamplifikasjon i formalinfikserte, parafininnstøpte (FFPE) brystkreftvevsprøver og FFPE-prøver fra pasienter med adenokarsinom i magen, inkludert gastro-øsofageal overgang. Analysen indikeres som et hjelpemiddel til HercepTest i bedømmingen av pasienter som Herceptin -behandling vurderes for. Settet inneholder nok reagenser til 20 tester. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 1/58

2 Innhold Side Tiltenkt bruk... 4 Sammendrag og forklaring - Bryst... 5 Prosedyreprinsipp - Bryst... 5 Reagenser - Bryst... 5 Materialer som følger med... 5 Materialer som er nødvendige, men som ikke medfølger... 7 Forholdsregler - Bryst... 7 Lagring - Bryst... 8 Klargjøre prøve - Bryst... 9 Parafininnstøpte vevssnitt... 9 BRUKSANVISNING - Bryst A. Reagenspreparering - Bryst A.1 Pre-Treatment Solution A.2 Stringent Wash Buffer A.3 Wash Buffer A.4 Etanolserie A.5 Pepsinløsning B. Fargeprosedyre - Bryst B.1 Prosedyremerknader B.2 Behandling av vev før farging B.3 Fargingsprotokoll Kvalitetskontroll - Bryst Tolkning av farging - Bryst Begrensninger - Bryst Metodeegenskaper - Bryst Analytisk sensitivitet Analytisk spesifisitet Robusthetsstudier Reproduserbarhet Reproduserbarhet Klinisk nytte Feilsøking - Bryst Vedlegg 1 - Bryst Vedlegg 2 - Bryst Vedlegg 3 - Bryst Sammendrag og forklaring - Gastrisk Prosedyreprinsipp - Gastrisk ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 2/58

3 Reagenser - Gastrisk Materialer som følger med Materialer som er nødvendige, men som ikke medfølger Mikroskoputstyr og tilbehør Forholdsregler - Gastrisk Lagring - Gastrisk Klargjøre prøve - Gastrisk Parafininnstøpte vevssnitt BRUKSANVISNING - Gastrisk A. Reagenspreparering - Gastrisk A.1 Forbehandlingsløsning A.2 Stringent Wash Buffer A.3 Wash Buffer A.4 Etanolserie A.5 Pepsinløsning B. Fargeprosedyre - Gastrisk B.1 Prosedyremerknader B.2 Behandling av vev før farging B.3 Fargingsprotokoll Kvalitetskontroll - Gastrisk Tolkning av farging - Gastrisk Begrensninger - Gastrisk Metodeegenskaper - Gastrisk Analytisk sensitivitet Analytisk spesifisitet Robusthetsstudier Reproduserbarhet Reproduserbarhet Klinisk nytte Feilsøking - Gastrisk Vedlegg 4 - Gastrisk Vedlegg 5 - Gastrisk Vedlegg 6 - Gastrisk Vedlegg 7 - Gastrisk Referanser Forklaring av symboler ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 3/58

4 Tiltenkt bruk Til in vitro-diagnostisk bruk. HER2 IQFISH pharmdx er en direkte fluorescerende in situ-hybridiseringsanalyse (FISH) som er utformet til å kvantitativt bestemme HER2-genamplifisering i formalinfikserte, parafininnstøpte (FFPE) brystkreftvevsprøver og FFPE-prøver fra pasienter med adenokarsinom i magen, inkludert den gastroøsofageale overgangen. HER2 IQFISH pharmdx indikeres som et hjelpemiddel for HercepTest i bedømmingen av pasienter som Herceptin -behandling (transtuzumab) vurderes for (se Herceptin pakningsvedlegg). For brystkreftpasienter er resultater fra HER2 IQFISH pharmdx beregnet for bruk som supplement til den klinikopatologiske informasjonen som for tiden brukes til å beregne prognose i fase II hos nodepositive brystkreftpasienter. Adenokarsinom i magen, inkludert gastroøsofageal overgang, refereres også til som magekreft i dette dokumentet. For bruksområdet brystkreft se side For bruksområdet magekreft se side Viktig: Vennligst merk forskjeller for brystkreftvev og magekreftvev, spesielt i tolkningen av fargingsseksjoner. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 4/58

5 Brystkreft Sammendrag og forklaring - Bryst Humant HER2-gen (også kjent som ERBB2 eller NEU) befinner seg på kromosom 17 og koder HER2-proteinet eller p185 HER2. HER2-proteinet er en membranreseptortyrosinkinase med homologi til den epidermiske vekstfaktorreseptoren (EGFR eller HER1) (1-2). HER2-genet finnes i 2 kopier i alle normale diploide celler. I en fraksjon av pasienter med brystkreft amplifiseres HER2-genet som en del av prosessen ved malign transformasjon og tumorprogresjon (3-8). HER2-genamplifikasjonen fører generelt sett til overuttrykk av HER2-proteinet på overflaten av brystkreftceller (9). Amplifisering av HER2-genet og/eller overuttrykk av dets protein har blitt demonstrert i % av brystkrefttilfellene. Denne oppreguleringen er forbundet med dårlig prognose, økt risiko for tilbakekomst samt forkortet overlevelse. Flere studier har vist at HER2-status korrelerer med sensitivitet eller resistens overfor bestemte kjemoterapiregimer (10). Demonstrasjon av høyt HER2-proteinoveruttrykk eller HER2-genamplifikasjon er avgjørende for å begynne terapi med Herceptin, et monoklonalt antistoff for HER2-protein. Kliniske undersøkelser har vist at pasienter med tumorer som har høyt overuttrykk av HER2-protein og/eller amplifikasjon av HER2-genet, har størst fordel ved Herceptin (11). Prosedyreprinsipp - Bryst HER2 IQFISH pharmdx inneholder alle nøkkelreagenser som er nødvendige for å fullføre en FISH-prosedyre for formalinfikserte, parafininnstøpte vevsnittsprøver. Etter deparafinisering og rehydrering varmes prøver opp i forbehandlingsløsning etterfulgt av proteolytisk forbrenning ved bruk av pepsin. Etter oppvarming og proteolytiske forbehandlingstrinn, bruker dette settet en ikke-giftig, bruksklar IQISH-prøveblanding basert på en kombinasjon av PNA- (peptidnukleinsyre) (12) og DNA-teknologi. Denne prøveblandingen består av en blanding av Texas Red-merkede DNA-prøver som dekker en 218 kb region inkludert HER2-genet på kromosom 17, samt en blanding av fluorescein-merkede PNA-prøver rettet mot den centromeriske regionen av kromosom 17 (CEN-17). Den spesifikke hybridiseringen til de to målene resulterer i dannelse av et tydelig rødt fluorescerende signal ved hver HER2-genlokus og et tydelig grønt fluorescerende signal ved alle kromosom 17-centromere. Etter en streng vask, monteres prøvene med Fluorescence Mounting Medium som inneholder DAPI og dekkglass. Ved bruk av et fluorescerende mikroskop som er utstyrt med riktige filtre (se vedlegg 3), lokaliseres tumorceller, og opptellingen av de røde (HER2) og grønne (CEN-17) signalene gjennomføres. Deretter beregnes HER2/CEN-17- forholdet. Normale celler i de analyserte vevssnittene vil tjene som indre positive kontroll for forhåndsbehandling og hybridiseringseffektivitet. Se avsnittet Tolkning av farging for flere opplysninger. For interaktiv e-learning, vennligst bruk HER2 IQFISH pharmdx e-learning-programmet som er utformet til å gi laboratorieteknikere, patologer og forskere en nøyaktig og hurtig kunnskap om hvordan de oppnår optimale resultater ved bruk av HER2 IQFISH pharmdx : Reagenser - Bryst Materialer som følger med Materialene som er opplistet nedenfor er tilstrekkelig til 20 tester (en test er definert som et målområde på 22 mm x 22 mm). Antallet tester er basert på bruk av 250 µl per objektglass fra flaske 2A (5-8 dråper), 10 µl per objektglass fra flaske 3 og 15 µl per objektglass fra flaske 5. Løsningene i flaske 3 og flaske 5 er viskøse og må kanskje sentrifugeres kort i en mikrosentrifuge for å samle all den medfølgende reagensen. Settet inneholder materialer tilstrekkelig for 10 individuelle fargingskjøringer (fire separate kjøringer ved bruk av pepsinneddykkingsmetoden). HER2 IQFISH pharmdx leveres på tørris. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 5/58

6 Brystkreft For å sikre at settets komponenter ikke har blitt utsatt for høye temperaturer under transport, skal det fortsatt være igjen tørris ved mottak. Vær oppmerksom på at noen settkomponenter fortsatt er frosne, dette vil ikke påvirke ytelsen til HER2 IQFISH pharmdx. Flaske 1 Forbehandlingsløsning (20x) 150 ml, konsentrert 20x MES (2-[N-morfolino]etansulfosyre) buffer. Flaske 2A Flaske 2B Flaske 3 Flaske 4 Pepsin 4 x 6,0 ml, klar til bruk Pepsinløsning, ph 2,0; inneholder stabiliseringsmiddel og et antimikrobielt middel. Pepsin Diluent (10x) 24 ml, konsentrert 10x Fortynningsløsning, ph 2,0; inneholder et antimikrobielt middel. HER2/CEN-17 IQISH-prøveblanding 0,2 ml, klar til bruk Blanding av Texas Red-merkede HER2 DNA-prøver og fluorescein-merkede CEN-17 PNA-prøver; leveres i IQISH-hybridiseringsbuffer. Stringensvaskebuffer (20x) 150 ml, konsentrert 20x SSC (saltløsningsnatriumcitrat) buffer med rengjøringsmiddel (Tween-20). Flaske 5 Flaske 6 Fluorescerende monteringsmiddel 0,4 ml, klar til bruk Fluorescerende monteringsmedium med 500 µg/l DAPI (4,6-diamidin-2-fenylindol). Wash Buffer (20x) 500 ml, konsentrert 20x Tris/HCl-buffer. Dekkglassforsegling 1 tube, klar til bruk Løsning for avtakbar forsegling av dekkglass. MERK: Følgende settreagenser: Forbehandlingsløsning (20x), pepsin, Pepsin Diluent (10x), stringensvaskebuffer (20x), fluorescerende monteringsmedium, vaskebuffer (20x) og objektglassforsegling kan utveksles med tilsvarende reagenser i Dako Histology FISH Accessory Kit, kode K5799. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 6/58

7 Brystkreft Materialer som er nødvendige, men som ikke medfølger Laboratoriereagenser Destillert eller avionisert vann Etanol, 96 % Xylen eller xylensubstitutter Laboratorieutstyr Absorberende kluter Regulerbare pipetter Kalibrert delvis neddykkingstermometer (område C) Kalibrert overflatetermometer (område C) Dekkglass (22 mm x 22 mm) Tang Avtrekkshette Dako Hybridizer (kode S2450 eller S2451)* Oppvarmingsblokk eller hybridisering* Fuktig hybridiseringskammer* Mikrosentrifuge Objektglass, Dako Silanized Slides, kode S 3003, eller poly-l-lysin-belagte objektglass (se Prøveklargjøring) Fargekar eller -bad Stoppeklokke (som kan måle 2 15 minutters intervaller) Vorteksblander Vannbad med lokk (som kan opprettholde 37(±2) C, 6 3 (±2) C og fra 95 C til 99 C) Mikrobølgeovn med sensorevne hvis forhåndsoppvarming utføres ved bruk av mikrobølgeovn (se B3. Fargingsprotokoll. Trinn 1: Forbehandling, metode B) * Oppvarmingsblokk eller hybridiseringsovn for denaturering (66 (±1) C) og hybridisering (45 (±2) C) sammen med et fuktig hybridiseringskammer kan brukes som et alternativ til Dako Hybridizer. Mikroskoputstyr og tilbehør Filtre for fluorescerende mikroskop: DAPI og FITC/Texas Red dobbelt filter, eller FITC og Texas Red monofiltre se vedlegg 3 for detaljer. Fluorescerende mikroskop med en 100 watts kvikksølvlampe som lyskilde bør brukes. Andre lyskilder anbefales ikke med disse filtrene. Objektglassmappe på mikroskopet (pappbrett for 20 objektglass med hengslet deksel eller lignende). Forholdsregler - Bryst 1. Til in vitro-diagnostisk bruk. 2. For profesjonelle brukere. 3. Flaske 1, Pre-Treatment Solution (20x), inneholder 1-<20 % 2-morfolinoetansulfosyre; flaske 2A, Pepsin, inneholder 5 10 % propan-2-ol; og flaske 6, vaskebuffer (20x), inneholder 1-<20 % trometamol. Ved ulike produktkonsentrasjoner krever ikke disse substansene faremerking. HMS-datablader er tilgjengelige for profesjonelle brukere på forespørsel. 4. Flaske 2A, Pepsin, inneholder pepsin A som kan forårsake en allergisk reaksjon. 5. Flaske 2B, Pepsin Diluent (10x) inneholder 60 % propan-2-ol og er merket: Meget brannfarlig. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 7/58

8 Brystkreft Irriterende. R11 Meget brannfarlig. R36 Irriterer øynene. R67 Damper kan forårsake sløvhet og svimmelhet. S9 Emballasjen oppbevares på et godt ventilert sted. S16 Oppbevares på avstand fra tenningskilder røyking forbudt. S26 Får man stoffet i øynene, skyll straks grundig med store mengder vann og kontakt lege. S60 Dette materialet og beholderen må avhendes som farlig avfall. 6. Dekkglassforsegling inneholder % nafta (petroleum), hydrobehandlet lys, og er merket: Ekstremt brannfarlig. Farlig for miljøet. R11 Meget brannfarlig. R51/53 Giftig for vannorganismer, kan ha negative langtidseffekter på vannmiljøet. S9 Emballasjen oppbevares på et godt ventilert sted. S16 Oppbevares på avstand fra tenningskilder røyking forbudt. S35 Dette materialet og beholderen skal avhendes på sikker måte. S57 Bruk egnet beholder for å unngå miljøforurensning. S61 Unngå utslipp i miljøet. Se spesialinstrukser/sikkerhetsdatablader. Se databladet for materialsikkerhet (MSDS) for ytterligere informasjon. 7. Pasientprøver, før og etter fiksering, og alle materialer som er utsatt for slike, skal håndteres som om de har evne til å overføre infeksjon og avhendes under iakttakelse av relevante forholdsregler (13). Pipetter aldri reagenser med munnen, og unngå at reagenser og prøver kommer i kontakt med hud og slimhinner. Hvis reagens kommer i kontakt med følsomme områder, må det skylles med rikelige mengder vann. 8. Minimer mikrobiell kontaminering av reagenser for å unngå feilaktige resultater. 9. Andre inkubasjonstider og temperaturer, eller andre metoder enn de som er spesifisert, vil kunne gi feilaktige resultater. 10. Andre vevsfikseringsmetoder og tykkelse på prøver enn de som er spesifisert, kan påvirke vevsmorfologi og/eller signalintensitet. 11. Unngå fordampning av HER2/CEN-17 prøveblanding i løpet av hybridisering ved å sørge for tilstrekkelig fuktighet i hybridiseringskammeret. 12. Reagenser har blitt optimalt fortynnet. Ytterligere fortynning kan forårsake tap av ytelse. 13. Bruk egnet personlig verneutstyr for å unngå kontakt med øyne og hud. Vennligst se HMSdatabladet for ytterligere informasjon. 14. Kun rene fargingsglass skal brukes til pepsinneddykkingsmetoden (trinn 2, metode C). Lagring - Bryst Oppbevar HER2/CEN-17 IQISH prøveblanding (flaske 3) ved -18 C i mørket. Alle andre reagenser kan oppbevares ved 2 8 C i mørket. Alle reagenser tåler frossen lagring. Frysing og tining av reagensene opptil 10 ganger påvirker ikke ytelsen. Pepsin, HER2/CEN-17 IQISH prøveblanding og fluorescerende monteringsmedium (flaske 2A, 3 og 5) kan bli påvirket negativt ved utsettelse for varme. Ikke la disse komponentene oppbevares i romtemperatur. HER2/CEN-17 IQISH prøveblanding og fluorescerende monteringsmedium (flaske 3 og 5) kan bli påvirket negativt ved utsettelse for unødige lysnivåer. Ikke oppbevar disse komponentene eller utfør analyse i sterkt lys, slik som direkte sollys. Ikke bruk settet etter utløpsdatoen som er stemplet på settets eske. Hvis reagensene oppbevares under andre forhold enn de som er spesifisert i dette pakningsvedlegget, må reagensytelsen valideres av brukeren (14). Det er ingen tydelige tegn som indikerer at dette produktet er ustabilt. Derfor er det viktig å evaluere normale celler i det analyserte vevssnittet. Hvis det observeres uventet fluorescerende mønster ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 8/58

9 Brystkreft som ikke kan forklares med variasjoner i laboratorieprosedyrer, og det er mistanke om at det er et problem med HER2 IQFISH pharmdx mistenkes, ta kontakt med Dakos tekniske avdeling. Klargjøre prøve - Bryst Prøver fra biopsier, eksisjoner eller reseksjoner må håndteres slik at vevet bevares til FISHanalyse. Standardmetoder for vevsbehandling ved immuncytokjemisk farging skal brukes på alle prøver (15). Parafininnstøpte vevssnitt Kun vevssnitt som er preservert i nøytralt bufret formalin og parafininnstøpt egner seg for bruk. Prøver skal f.eks. være blokkert i en tykkelse på 3 eller 4 mm og fiksert i timer i nøytral bufret formalin. Vevene dehydreres i gradert serie av etanol og xylen, etterfulgt av infiltrering av smeltet parafin som ikke holder mer enn 60 C. Korr ekt fikserte og innstøpte vev vil holde seg ubegrenset før snitt og objektglassmontering ved lagring på kjølig sted (15 25 C) (15-16). Andre fiksativer egner seg ikke. Vevsprøver skal skjæres i snitt på 4 6 µm. Objektglassene som kreves for HER2-genamplifikasjonsanalyse og verifisering av tilstedeværelsen av en tumor, skal prepareres samtidig. Minst 2 seriesnitt anbefales, 1 snitt for tilstedeværelse av tumor farget med hematoksylin og eosin (H&E-farging), og 1 snitt for HER2 genamplifikasjonsanalyse. Det anbefales at vevssnitt monteres på Dako Silanized Slides, kode S-3003, eller poly-l-lysin-belagte objektglass. Prøver skal analyseres innen 4 6 måneder etter snitt ved lagring i romtemperatur (20 25 C). ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 9/58

10 Brystkreft BRUKSANVISNING - Bryst A. Reagenspreparering - Bryst Det er praktisk å klargjøre følgende reagenser før farging: A.1 Pre-Treatment Solution Det kan oppstå krystaller i flaske 1, men de løser seg opp ved romtemperatur. Se til at det ikke finnes noen krystaller før klargjøring av reagensen. Fortynn en tilstrekkelig mengde fra flaske 1 (forbehandlingsløsning 20x) ved å fortynne konsentratet 1:20 i destillert eller avionisert vann. Ubrukt fortynnet løsning kan oppbevares ved 2 8 C i én måned. Kast fortynnet løsning hvis den får et tåkete utseende. A.2 Stringent Wash Buffer Fortynn en tilstrekkelig mengde fra flaske 4 (stringensvaskebuffer 20x) ved å fortynne konsentratet 1:20 i destillert eller avionisert vann. Ubrukt fortynnet buffer kan oppbevares ved 2 8 C i én måned. Kast fortynnet buffer hvis den får et tåkete utseende. A.3 Wash Buffer Fortynn en tilstrekkelig mengde av flaske 6 (vaskebuffer 20x) ved å fortynne konsentratet 1:20 i destillert eller avionisert vann. Ubrukt fortynnet buffer kan oppbevares ved 2 8 C i én måned. Kast fortynnet buffer hvis den får et tåkete utseende. A.4 Etanolserie Klargjør 3 glass med respektivt 70 %, 85 % og 96 % etanol fra en 96 % etanolløsning. Oppbevar de tildekkede glassene ved romtemperatur eller ved 2 8 C, og bruk til maksimalt 200 objektglass. Kast løsningene hvis de får et tåkete utseende. A.5 Pepsinløsning En pepsinløsning er kun nødvendig ved bruk av pepsinneddykkingsmetoden (metode C). Klargjør pepsinløsningen som følger: Til en beholder med kapasitet til seks snitt klargjøres 60 ml pepsinløsning: Tilsett 48 ml romtemperert (20 25 C) destillert el ler deionisert vann til beholderen. Tilsett 6 ml kald (2 8 C) Pepsin Diluent (10x) (fl aske 2B) til beholderen. Tilsett 6 ml kald (2 8 C) Pepsin (flaske 2A) til b eholderen. Sett lokk på beholderen og balanser pepsinløsningen til 37 (±2) C i et vannbad. Til en beholder med kapasitet til 24 snitt klargjøres 240 ml pepsinløsning: Tilsett 192 ml romtemperert (20 25 C) destillert e ller deionisert vann til beholderen. Tilsett 24 ml kald (2 8 C) Pepsin Diluent (10x) (f laske 2B) til beholderen. Tilsett 24 ml kald (2 8 C) Pepsin (flaske 2A) til beholderen. Sett lokk på beholderen og balanser pepsinløsningen til 37 (±2) C i et vannbad. Den balanserte pepsinløsningen må brukes innen 5 timer. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 10/58

11 Brystkreft B. Fargeprosedyre - Bryst B.1 Prosedyremerknader Brukeren skal lese disse instruksjonene nøye og gjøre seg kjent med alle komponentene før bruk (se Forholdsregler). Alle reagenser skal stabiliseres ved relevant temperatur før bruk på følgende måte: Flaske 1: Den fortynnede forbehandlingsløsningen skal stabiliseres ved C hvis vannbad brukes til forbehandlingen (B3. Fargingsprotokoll, Trinn 1: Forbehandling, Metode A). Hvis mikrobølgeovn med sensorevne brukes til forhåndsbehandlingen (B3. Fargingsprotokoll, Trinn 1: Forbehandling, Metode B) skal den fortynnede forbehandlingsløsningen stabiliseres ved romtemperatur C. Flaske 2A: Pepsin skal brukes ved 2 8 C (B3, fargingsprotokoll, trinn 2: Metode A og B) og holdes kald kontinuerlig. Flaske 2B: Pepsin Diluent (10x) skal brukes ved 2 8 C (B3, fargingsprotokoll, trinn 2: Metode C). Flaske 3: HER2/CEN-17 IQISH prøveblanding separeres inn i to faser under oppbevaring ved -18 C. Før bruk av flaske 3 må du sikre at kun én fase finnes ved å balansere prøveblandingen til romtemperatur (20 25 C) etterfulgt av blanding. Tin opp flaske 3 ved romtemperatur (20 25 C) i maksimalt 30 minutter (beskyttes mot sterk t lys), roter deretter flasken i 15 sekunder ved 2500 o/min ved bruk av en vorteksblander. Oppbevar flaske 3 ved -18 C umiddelbart etter bruk. Flaske 4: Fortynnet stringensvaskebuffer; ett glass skal balanseres til romtemperatur, det andre skal balanseres til 63 (±2) C før bruk. Flaske 5: Fluorescence Mounting Medium kan påføres ved hvilken som helst temperatur fra 2 25 C. Flaske 6: Den fortynnede vaskebufferen skal balanseres til romtemperatur C. Dekkglassforsegling kan påføres ved hvilken som helst temperatur fra 2 25 C. Alle trinnene skal utføres ved angitt temperatur. Prosedyren inkluderer et antall dehydreringer fulgt av tørking av vevssnittene. Sørg for at vevssnittene er helt tørre før du fortsetter til neste trinn. Ikke la vevssnitt tørke i løpet av de andre prosedyretrinnene. Hvis fargeprosedyren må avbrytes, kan objektglassene oppbevares i vaskebuffer 1 etter avparafiniseringstrinnet i inntil 1 time ved romtemperatur (20 25 C) uten at resultatene påvirkes. B.2 Behandling av vev før farging Avparafinisering og rehydrering: Før analysen utføres, må vevssnittene avparafiniseres for å fjerne innstøpningsmedium og rehydreres. Unngå ufullstendig fjerning av parafin. Resterende innstøpningsmedium vil føre til økt ikke-spesifikk farging. Dette trinnet skal utføres ved romtemperatur (20 25 C). 1. Plasser objektglassene i et xylenbad og inkuber i 5 (±1) minutter. Skift bad og gjenta én gang. 2. Bank forsiktig av overflødig væske og plasser objektglassene i 96 % etanol i 2 (±1) minutter. Skift bad og gjenta én gang. 3. Bank forsiktig av overflødig væske og plasser objektglassene i 70 % etanol i 2 (±1) minutter. Skift bad og gjenta én gang. 4. Bank forsiktig av overflødig væske og plasser objektglassene i fortynnet Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i minst 2 minutter. Begynn fargeprosedyren slik som beskrevet i avsnitt B.3, trinn 1, Forbehandling. Xylen- og alkoholløsningene skal skiftes etter 200 objektglass eller mindre. Det kan benyttes xylensubstitutter. MERK: Reagenser og instruksjoner som medfølger i dette settet er utviklet for optimal ytelse. Ytterligere fortynning av reagenser eller endring av inkubasjonstemperaturer kan gi feilaktige eller ikke-samsvarende resultater. Forskjeller i vevsbehandling og tekniske prosedyrer i brukerens laboratorium kan gjøre analyseresultatene ugyldige. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 11/58

12 Brystkreft B.3 Fargingsprotokoll Trinn 1: Forbehandling Forhåndsbehandlingen kan utføres enten ved bruk av vannbad, slik som beskrevet i metode A) eller alternativt ved bruk av mikrobølgeovn med sensorevne, slik som beskrevet i metode B). Metode A: Forbehandling ved bruk av vannbad Fyll fargingsglassene, f.eks. Coplin-glass, med fortynnet forbehandlingsløsning (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.1). Plasser fargingsglassene som inneholder fortynnet forbehandlingsløsning i vannbad. Varm opp vannbadet og forbehandlingsløsning til C. Mål temperaturen innvendig i karet med et ka librert termometer for å sikre riktig temperatur. Dekk til glassene med lokk for å stabilisere temperaturen og unngå fordampning. Senk ned de romtempererte avparafiniserte snittene i den forvarmede forbehandlingsløsningen i fargingsglassene. Kontroller temperaturen på nytt og inkuber i 10 (±1) minutter ved C. Fjern hele glasset med objektglassene fra vannbadet. Fjern lokket og la objektglassene kjøle seg ned i forbehandlingsløsning i 15 minutter ved romtemperatur. Overfør objektglassene til et glass med fortynnet Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Skift Wash Buffer og nedsenk snittene i enda 3 minutter. MERK: Forbehandlingsløsningen er utviklet kun til engangsbruk. Skal ikke brukes på nytt. Metode B: Forbehandling ved bruk av mikrobølgeovn med sensorevne Fyll en plastbeholder med fortynnet, romtemperert (20 25 C) forbehandlingsløsning. Senk ned de avparafinerte snittene i forbehandlingsløsningen, dekk til beholderen med et gjennomhullet lokk og plasser den i mikrobølgeovnen. Velg kokesensorfunksjonen og et program som går i 10 minutter etter at koketemperaturen er oppnådd*. Etter 10 minutters inkubasjonstid, ta beholderen med snitt ut av ovnen, fjern lokket og kjøl ned i 15 minutter ved romtemperatur. Overfør objektglassene til en beholder med fortynnet Wash Buffer, og neddykk glassene i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Skift Wash Buffer og nedsenk snittene i enda 3 minutter. * Bruk av en mikrobølgeovn med sensorevne betyr at ovnen må inkludere en sensor og programmer som innledningsvis varmer opp forbehandlingsløsningen til kokepunktet og deretter opprettholder nødvendig forbehandlingstemperatur (over 95 C) mens forhåndsinnstilt tid nedtelles (1 0 (±1) minutter). Noen mikrobølgeovnsmodeller med sensorevne har kanskje ikke noe alternativ for å fritt stille inn en nedtellingstid. Hvis modellen kun inkluderer forhåndsinnstilte programmer, se til å velge et program som opprettholder den nødvendige forbehandlingstemperaturen (over 95 C) i minst 10 (±1) minutter, og stopp programmet manuelt etter 10 (±1) minutter. MERK: Forbehandlingsløsningen er utviklet kun til engangsbruk. Skal ikke brukes på nytt. Trinn 2: Pepsin, bruksklar (RTU) eller pepsinløsning Pepsininkubasjon kan utføres enten ved direkte påføring av RTU pepsindråper på snittene enten ved romtemperatur (20 25 C) (metode A) eller ved 3 7 C (metode B). Alternativt kan snitt neddykkes i en pepsinløsning og inkuberes ved 37 (±2) C (metode C). Metode A og metode B: Bank forsiktig bort overskytende buffer. Ved bruk av en lofri klut (slik som en absorberende wipe eller gas) tørkes det forsiktig rundt prøven for å fjerne resterende væske og holde reagensene innen det foreskrevne området. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 12/58

13 Brystkreft Påfør 5 8 dråper (250 µl) kald (2 8 C) Pepsin (fla ske 2A) for å dekke prøven. Pepsin skal alltid oppbevares ved 2 8 C. Metode A: Pepsin, RTU Inkubering ved C Inkuber i 5 15 minutter ved romtemperatur (20 25 C ). En inkubasjonstid på 5 15 minutter vil være tilstrekkelig for de flest prøvene, men den optimale inkubasjonstiden kan avhenge av vevsfiksering og/eller tykkelse på prøven og skal bestemmes av brukeren. Bank forsiktig av overflødig pepsin, og neddykk snittene i fortynnet vaskebuffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Erstatt fortynnet vaskebuffer, og neddykk snittene i enda 3 minutter. Fortsett til dehydrering. Metode B: Pepsin, RTU Inkubering ved 37 C Plasser prøven med Pepsin på en varmeblokk ved 37 C f.eks. Dako Hybridizer og inkuber i 3-5 minutter. En inkubasjonstid på 3-5 minutter vil være tilstrekkelig for de flest prøvene, men den optimale inkubasjonstiden kan avhenge av vevsfiksering og/eller tykkelse på prøven og skal bestemmes av brukeren. Bank av overflødig pepsin og nedsenk snittene i fortynnet vaskebuffer i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Skift vaskebuffer og nedsenk snittene i ytterligere 3 minutter. Fortsett til dehydrering. Dehydrer vevssnittene gjennom en gradert serie med etanol: 2 minutter i 70 % etanol, 2 minutter i 85 % etanol og 2 minutter i 96 % etanol. La vevssnitt lufttørke fullstendig. Metode C: Pepsinløsning - neddykking av snitt i pepsinløsning på 37 C Settet inneholder tilstrekkelig med reagenser til fire separate kjøringer (60 ml pepsinløsning, liten beholder for seks objektglass) eller en enkelt kjøring ( 240 ml pepsinløsning, stor beholder for 24 objektglass). Klargjør pepsinløsningen slik som beskrevet i avsnitt A.5. Sett lokk på beholderen og balanser pepsinløsningen til 37 (±2) C i et vannbad. Se til at temperaturen har stabilisert seg. Mål temperaturen inne i beholderen med et kalibrert termometer for å sikre at det holder riktig temperatur. Bank bort overskytende vaskebuffer. Neddykk objektglass i pepsinløsningen på 37 (±2) C og inkuber i minutter. En inkubasjonstid på minutter vil være tilstrekkelig for de fleste prøvene, men den optimale inkubasjonstiden kan avhenge av vevsfiksering og/eller tykkelse på prøven og skal bestemmes av brukeren. Bank av overflødig pepsinløsning og nedsenk snittene i fortynnet vaskebuffer i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Skift vaskebuffer og nedsenk snittene i ytterligere 3 minutter. Fortsett til dehydrering. Dehydrer vevssnittene gjennom en gradert serie med etanol: 2 minutter i 70 % etanol, 2 minutter i 85 % etanol og 2 minutter i 96 % etanol. La vevssnitt lufttørke fullstendig. Trinn 3: HER2/CEN-17 IQISH-prøveblanding HER2/CEN-17 IQISH prøveblanding separeres inn i to faser under oppbevaring ved -18 C. Før bruk av flaske 3 må du sikre at kun én fase finnes ved å balansere prøveblandingen til romtemperatur (20 25 C) etterfulgt av blanding. Tin opp flaske 3 ved romtemperatur (20 25 C) i maksimalt 30 minutter (beskyttes mot sterkt lys), roter deretter flasken i 15 sekunder ved 2500 o/min ved bruk av en vorteksblander. Oppbevar flaske 3 ved -18 C umiddelbart etter bruk. Påfør 10 µl HER2/CEN-17 IQISH-prøveblanding (flaske 3) på midten av vevssnittet. Plasser umiddelbart et 22 mm x 22 mm dekkglass over prøveblandingen, og la den spre seg jevnt under dekkglasset. Unngå luftbobler. Hvis det observeres luftbobler, bank dem forsiktig bort fra vevet ved bruk av tang. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 13/58

14 Brystkreft Husk å oppbevare flaske 3 ved -18 C umiddelbart etter bruk. Forsegle dekkglassene med dekkglassforsegling ved å støte ut forseglingen rundt kanten av dekkglasset. La dekkglassforseglingen overlappe dekkglasset og objektglasset, slik at det dannes en forsegling rundt dekkglasset. Se til at dekkglassforseglingen dekker hele kanten av dekkglasset. Klargjør Dako Hybridizer* (kode S2450 eller S2451) for en hybridiseringskjøring. Se til at Humidity Control Strips (kode S2452) er mettet og optimale for bruk. Start Hybridizer og velg et program som vil: Denaturer ved 66 C i 10 minutter etterfulgt av hyb ridisering ved 45 C i minutter. Plasser objektglassene i Hybridizer. Se til at lokket er godt lukket, og start programmet. Se brukerhåndboken for Dako Hybridizer for detaljer. * Instrumentering som tillater forhold som er identiske med de som beskrives ovenfor, kan brukes til denaturering og hybridisering: Plasser objektglassene på en flat metall- eller steinoverflate (varmeblokk eller på en blokk i en hybridiseringsovn) forhåndsoppvarmet til 66 (±1) C. Denaturer i nøyaktig 10 minutter. Plasser objektglassene i et forhåndsoppvarmet fuktig hybridiseringskammer. Dekk til kammeret med et lokk og inkuber ved 45 (±2) C i minutter. V ær oppmerksom på at en hybridiseringstemperatur på 37 C ikke egner seg ti l bruk med probene som finnes i dette settet. Trinn 4: Stringensvask Fyll to fargingsglass, f.eks. Coplin-glass, med fortynnet stringensvaskebuffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.2). Det anbefales et minstevolum på 100 ml eller 15 ml per objektglass i hvert glass. Plasser ett av fargingsglassene som inneholder fortynnet stringensvaskebuffer i romtemperatur i en avtrekkshette og det andre i et vannbad. Varm opp vannbadet og den fortynnede stringensvaskebuffer til 63 (±2) C. Se til at temp eraturen har stabilisert seg. Dekk til karet med lokk for å stabilisere temperaturen og unngå fordampning. Mål temperaturen inne i vannbadglasset med et kalibrert termometer for å sikre at det holder riktig temperatur. Stringent Wash Buffer inneholder rengjøringsmiddel og kan bli turbid ved 63 C; dett e vil ikke påvirke ytelsen. Ved bruk av tang eller hansker, ta objektglassene ut fra hybridiseringskammeret og fjern forsiktig dekkglassforseglingen og dekkglasset, og plasser objektglassene i det romtempererte forvaskglasset, ett om gangen. Så snart alle dekkglassene er fjernet, overføres objektglassene fra det romtempererte forvaskglasset til glasset på 63 (±2) C i vannbade t. Umiddelbart etter overføring av snittene til karet på 63 (±2) C fortynnet stringensvaskebuffer i vannbadet skal timeren startes. Utfør stringensvask i nøyaktig 10 minutter. Fjern objektglassene fra den fortynnede stringensvaskebufferen, og neddykk snittene i fortynnet vaskebuffer i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Skift ut fortynnet vaskebuffer, og neddykk snittene i enda 3 minutter. Dehydrer vevssnittene gjennom en gradert serie med etanol: 2 minutter i 70 % etanol, 2 minutter i 85 % etanol og 2 minutter i 96 % etanol. La vevssnitt tørke fullstendig. Trinn 5: Montering Påfør 15 µl fluorescerende monteringsmedium som inneholder DAPI (flaske 5) på målområdet av objektglasset og legg på et dekkglass. MERK: Objektglassene kan avleses etter 15 minutter eller innen 7 dager etter montering. Men det oppstår blekning hvis objektglassene utsettes for lys eller høye temperaturer. For å minimere blekning, skal objektglassene oppbevares på et mørkt sted ved C. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 14/58

15 Brystkreft Kvalitetskontroll - Bryst 1. Signalene må være lyse, tydelige og lette å evaluere. 2. Normale celler gir en intern kontroll av fargingen. Normale celler skal ha 1 2 klart synlige grønne signaler som indikerer at hybridiseringen av CEN-17 PNA-prøven til den centromeriske regionen på kromosom 17 var vellykket. Normale celler skal også ha 1 2 klart synlige røde signaler som indikerer at hybridiseringen av HER2 DNA-prøven til HER2-amplikonet var vellykket. På grunn av vevssnitt vil noen normale celler ha mindre enn de 2 forventede signalene av hver farge. Hvis signaler ikke påvises i normale celler, indikerer dette at analysen var mislykket, og resultatene må betraktes som ugyldige. 3. Nukleærmorfologi må være intakt ved evaluering ved bruk av DAPI-filter. Mange skyggeceller og generelt dårlig nukleærmorfologi indikerer overnedbrytning av prøven, noe som fører til tap eller fragmentering av signalene. Slike prøver skal betraktes som ugyldige. 4. Forskjeller i vevsfiksering, prosessering og innstøpning i brukerlaboratoriet kan frembringe variasjon i resultatene og gjør det påkrevd med regelmessig evaluering av interne kontroller. Tolkning av farging - Bryst Vev som kan vurderes Kun prøver fra pasienter med invasivt karsinom skal testes. I tilfeller med karsinom in situ og invasivt karsinom i samme prøve, skal kun den invasive komponenten scores. Unngå områder med nekrose og områder der de nukleære grensene er tvetydige. Ikke inkluder nuklein som krever subjektiv bedømmelse. Hopp over nuklein med svak signalintensitet og ikke-spesifikk eller høy bakgrunn. Signalopptelling: Lokaliser tumoren innen konteksten til det H&E-fargede objektglasset, og evaluer det samme området på det FISH-fargede objektglasset. Skann flere områder på tumorceller for å ta beregning for mulig heterogenitet. Velg et område som har god nukleinfordeling. Begynn analysen i øvre venstre kvadrant av det valgte området, skann fra venstre til høyre, tell antall signaler innen den nukleære grensen for hver evaluerte nukleus ifølge retningslinjene nedenfor (se også vedlegg 3). - Fokuser opp og ned for å finne alle signalene i den enkelte nukleus. - Tell to signaler som har samme størrelse og er atskilt med en avstand som tilsvarer eller er mindre enn diameteren på signalet som kun ett signal. - I nukleuser med høye nivåer av HER2-genamplifikasjon kan HER2-signalene være posisjonert svært nært hverandre og danne en signalgruppe. I disse tilfellene kan antallet HER2-signaler ikke telles, men må beregnes. Det må vies spesiell oppmerksomhet til de grønne signalene, siden grupper av HER2-signaler kan dekke over de grønne signalene, slik at det blir umulig å se dem. Hvis det er tvil, skal de grønne signalene kontrolleres ved bruk av et spesifikt FITC-filter. Ikke score nukleuser uten signaler eller med signaler med kun én farge. Score kun nuklein med ett eller flere FISH-signaler av hver farge. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 15/58

16 Brystkreft Signalopptellingsveiledning 1 Skal ikke telles. Nukleuser overlapper. Ikke alle nukleusområdene er synlige. 2 To grønne signaler, ikke score nuklein med signaler i kun én farge. 3 Tell som 3 grønne og 12 røde signaler (gruppeberegning). 4 Tell som 1 grønt og 1 rødt signal. To signaler som har samme størrelse og er atskilt med en avstand som tilsvarer eller er mindre enn diameteren på ett signal, telles som ett 5 Ikke tell (over- eller underfordøyd nuklein). eller Manglende signaler i midten av nuklein (smultringformet nuklein). 6 Tell som 2 grønne og 3 røde signaler. To signaler som har samme størrelse og er atskilt med en avstand som tilsvarer eller er mindre enn diameteren på ett signal, telles som ett. 7 Tell som 1 grønt og 5 røde signaler. 8 Tell som 3 grønne (1 grønt ute av fokus) og 3 røde signaler. 9 Gruppe med røde signaler skjuler grønne signaler, kontroller de grønne signalene med et spesifikt FITCfilter, eller ikke tell. Registrer opptellingene i en tabell slik som vist i vedlegg 2. Tell 20 nukleuser per vevsprøve, om mulig, fra tydelige tumorområder (17). Beregn HER2/CEN-17-forholdet ved å dele totalt antall røde HER2-signaler på totalt antall grønne CEN-17-signaler. Prøver med et HER2/CEN-17-forhold over eller lik 2 skal betraktes som HER2- genamplifisert (5, 17-19). Resultater ved eller i nærheten av cut-off (1,8 2,2) skal tolkes med forsiktighet. Hvis forholdet ligger i grenseområdet (1,8 2,2), tell ytterligere 20 nukleuser, og beregn forholdet for 40 nukleuser på nytt. I tvilstilfeller skal objektglassprøven scores på nytt. For grenseområdetilfeller er det nødvendig med en konsultasjon mellom patologen og den behandlende legen. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 16/58

17 Brystkreft Begrensninger - Bryst 1. FISH er en prosess i flere trinn som krever spesialisert opplæring i valg av egnede reagenser og vev, fiksering, prosessering, preparering av FISH-objektglasset samt tolking av fargeresultatene. 2. FISH-resultatene er avhengig av håndteringen og prosesseringen av vevet før det farges. Uriktig fiksering, vask, tørking, oppvarming, snitting eller kontaminasjon med annet vev eller væsker kan påvirke prøvehybridiseringen. Inkonsekvente resultater vil kunne være en konsekvens av variasjoner i fikserings- og innstøpingsmetoder, eller uregelmessigheter i vevet. 3. For optimale og reproduserbare resultater, må vevsobjektglassene avparafiniseres fullstendig. Parafinfjerningen må fullføres ved begynnelsen av fargeprosessen. (Se BRUKSANVISNING, avsnitt B.2.) 4. Det skal kun brukes temperaturkalibrert vannbad, varmeblokk og hybridiseringsovn. Bruk av andre typer utstyr kan føre til fordampning av HER2/CEN-17 IQISH-prøveblandingen under hybridiseringen og må valideres av brukeren. Metodeegenskaper - Bryst Analytisk sensitivitet Følsomheten til HER2/CEN-17 IQISH-prøveblandingen ble undersøkt ved bruk av 18 prøver av normal human brystepitel. Forholdet mellom antall HER2-signaler og CEN-17- signaler ble kalkulert basert på en opptelling av 20 nuklein per prøve. HER2/CEN-17-forholdene for de 18 prøvene av normal human brystepitel var mellom 0,97 1,08. Analytisk spesifisitet HER2 DNA-prober i HER2/CEN-17 IQISH-prøveblandingen har blitt sluttsekvensert og kartlagt for å bekrefte en total dekning på 218 kb inkludert HER2-genet. CEN-17 PNA-prøvene i HER2/CEN-17 IQISH-prøveblandingen har blitt testet enkeltvis og i kombinasjon for å bekrefte den spesifikke hybridiseringen til den centromeriske regionen på kromosom 17. For å måle analysens evne til å bare identifisere målstoffene HER2 og CEN-17 uten interferens fra andre stoffer, ble studier gjennomført på vevsprøver fra normal human brystepitel ved bruk av flaske 3 som inneholder hybridiseringsbufferen,, men uten prøveblandingen. Totalt 18 prøver ble evaluert for tilstedeværelse av signaler som ikke er relatert til prøveblandingen. Ingen påvisning av andre kromosommål eller interferens med nært tilknyttede stoffer ble observert i noen av de 18 prøvene. Robusthetsstudier Robustheten til HER2 IQFISH pharmdx analysen ble testet ved å variere forbehandlingstiden, temperaturen og metodene for oppvarming av forbehandlingsbufferen (mikrobølgeovn eller vannbad), pepsininkuberingstid og metode (RTU pepsin eller neddykking), denatureringstemperatur og -tid, hybridiseringstid og stringensvasketid og temperatur. Ingen betydelig forskjell ble observert i resultatene ved følgende eksperimentelle betingelser: Forbehandlingsmetode A) Vannbad i 10 minutter kombinert med hver av temperaturene 95 C, C og 99 C sammen med 9, 10 og 11 minutter ved C Forbehandlingsmetode B) Mikrobølgeovn i 9, 10 og 11 minutter ved > 95 C. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 17/58

18 Brystkreft Pepsinforbrenningsmetode A) med inkubasjonstider på 5, 10 og 15 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Pepsinforbrenningsmetode B) med inkubasjonstider på 3, 4 og 5 minutter ved 37 C. Pepsinforbrenningsmetode C) med inkubasjonstider på 20, 25 og 30 minutter kombinert med hver av temperaturene 35, 37 og 39 C. Denaturering i 10 minutter kombinert med hver av temperaturene 65, 66 og 67 C sammen med 9, 10 og 11 minutter ved 66 C. Hybridis eringstid på 60, 90 og 120 minutter ved 45 C. Stringensvask i 10 minutter kombinert med hver av temperaturene 61, 63 og 65 C sammen med 9, 10 og 11 minutter ved 63 C. Merk: For robusthetstestene ble kun en parameter i fargingsprosedyren endret om gangen, mens alle de andre parametrene ble holdt konstante. Det anbefales å oppfylle tiden og temperaturene som er indikert i fargingsprosedyren. Hybridisering i 60 minutter ga høy signalintensitet, men likevel lett redusert i sammenligning med 90 og 120 minutters hybridisering. Ingen betydelig forskjell i resultater ble observert ved andre tids-/temperaturkombinasjoner. Fargingsprosedyren for HER2 IQFISH pharmdx tilbyr protokollvariabler for varmeforbehandlingen, pepsinforbrenningen og hybridiseringstiden. Hvert unikt kombinasjonsalternativ har blitt validert med hensyn til HER2-genstatus. Valideringen ble utført på 10 FFPE humane brystkarsinomprøver for hver av de 12 mulige kombinasjonsalternativene. HER2 FISH pharmdx Kit (K5331) ble brukt som referanse. HER2/CEN-17-forholdet for hver enkelt prøve vises i figur 1. Krysstabuleringer mellom de 12 testene og referansefargingen viste helhetlig overensstemmelse i HER2-genstatus på 100 % (10/10) med nedre og øvre to-grenede 95 % sikkerhetsgrenser ved 78,3 % og 100 %, respektivt. Kappaverdien var 1,00 og McNemars test viste fravær av bias (to-grenet p- verdi på 1,00). Figur 1. Individuelle HER2/CEN-17-forhold for 10 humane brystkarsinomprøver farget ved bruk av de 12 kombinasjonsvariasjonene som er mulig med HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731) (test 1-12) og HER2 FISH pharmdx Kit (kode K5331)-referanse (R). Den horisontale linjen illustrerer cut-off-verdien på 2,0. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 18/58

19 Brystkreft Reproduserbarhet Reproduserbarheten til HER2/CEN-17-forholdet ble undersøkt med TOP2A IQFISH pharmdx analyse ved bruk av konsekutive seksjoner av ni humane brystkarsinomprøver med enten ikke-amplifisert eller amplifisert HER2-genstatus. Triplikate seksjoner av hver prøve ble testet i samme kjøring. Gjennomsnittlig variasjonskoeffisient var 5,2 % for ikke-amplifiserte prøver (område fra 1 % til 8 %) og 14 % for amplifiserte prøver (område fra 7 % til 20 %). Totalt fem kontinuerlige snitt av fire humane brystkarsinomprøver med ulik tykkelse (3, 4, 5, 6 og 7 µm) ble testet med HER2 IQFISH pharmdx. Gjennomsnittlig variasjonskoeffisient for HER2/CEN-17-forholdet var 7 % (område fra 6 % til 9 %). ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 19/58

20 Brystkreft Reproduserbarhet HER2 IQFISH pharmdx analysen ble testet for en reproduserbarhet fra lot-til-lot og observatør-til-observatør ved bruk av tre loter HER2 IQFISH pharmdx og tre observatører. Reproduserbarheten ble testet på ni ulike humane brystkarsinomprøver med enten ikke-amplifisert eller amplifisert HER2-genstatus. Gjennomsnittlig variasjonskoeffisient for lot-til-lot reproduserbarhet var 5 % for ikkeamplifiserte prøver (område fra 2 % til 8 %) og 7,8 % for amplifiserte prøver (område fra 5 % til 11 %). Gjennomsnittlig variasjonskoeffisient for observatør-til-observatør reproduserbarhet var 3,2 % for ikke-amplifiserte prøver (område fra 0,2 % til 6 %) og 2,8 % for amplifiserte prøver (område fra 2 % til 4 %). Klinisk nytte Den kliniske nytten av Dako HER2 FISH pharmdx Kit (kode K5331) ble undersøkt i en komparativ studie med Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit. Studien inkluderte 150 arkiverte prøver fra pasienter som hadde enten nodepositiv eller nodenegativ brystkreft type II III. Det primære målet med studien var å undersøke samsvarsgraden mellom HER2/kromosom 17 centromer-forhold for de 150 prøvene som ble testet med Dako- og Vysis-sett, begge med hensyn til den generelle overensstemmelsen av forholdene og samsvaret for de dikotomiserte FISH-resultatene (+/- grupper). Hele 145 prøver hadde vellykket hybridisering og scoring og ble dermed godkjent for statistisk analyse. En 2 x 2 krysstabulering av resultatene fremstilles i tabell 1. Tabell 1. Dikotomiserte resultater fra 145 brystkreftprøver testet med Dako HER2 FISH pharmdx Kit og Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit. 60 nuklein i hver prøve ble scoret med begge de to settene. Vysis Kit (-) amplifisert Vysis Kit (+) amplifisert Dako Kit (-) amplifisert Dako Kit (+) amplifisert Sum Sum Samsvaret mellom Dako- og Vysis-testene var 95 % med et sikkerhetsintervall på %. Kappaverdi var 0,89. McNemars test for systematisk avvik mellom de to testene var ikke betydelig (p=0,22). Figur 2 viser et spredt plott av de parede observasjonene for de 145 prøvene. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 20/58

21 Brystkreft Scatter Spredt plot plott of paired av parede observations observasjoner 12,00 DakoCytomation HER2 FISH pharmdx Kit g Dako HER2 FISH pharmdx Kit 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Vysis PathVysion HER-2 HER-2 DNA DNA Probe Probe Kit Kit Figur brystkreftprøver testet for HER2-genamplifikasjon ved bruk av Dako HER2 FISH pharmdx Kit og Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit. Resultene uttrykkes som HER2/kromosom 17 centromere-forhold. 60 nuklein i hver prøve ble scoret med begge de to settene. Det generelle samsvaret mellom Dako HER2 FISH pharmdx og Vysis PathVysion HER-2 DNA-prøvetestene ble undersøkt ved å bruke analyse av forskjellene mellom de parede observasjonene av logg (forhold) og en lineær regresjonsanalyse av logg (forhold) for de to testene. Det ble konkludert at forskjellen mellom parede observasjoner av logg (forhold) øker systematisk med summen av HER2/kromosom 17 centromere-forhold, og for høyere forhold er forholdet høyere i Dako-testen enn i Vysis-testen. Det høyere HER2/kromosom 17 centromere-forholdet som ble observert med Dako HER2 FISH pharmdx Kit kan relateres til en sann forskjell mellom de to testene, f.eks. at en høyere oppløsning av Dako HER2 FISH pharmdx Kit resulterer i høyere forhold for høyt HER2-genamplifiserte tilfeller. Men testingen av settene ble utført ved 2 ulike sentre, og det forventes variasjon mellom laboratoriene. Videre er en høyere variasjon for høyt amplifiserte tilfeller rapportert i litteraturen, men det betraktes ikke å være klinisk relevant (18). Den aktuelle studien tillater ikke undersøkelse av en systematisk forskjell mellom de to testene på tvers av flere laboratorier. Det må legges til at den observerte variasjonen mellom de to testene er av lignende størrelse som variasjonen mellom sentrene som ble observert i overførbarhetsstudien. Dako HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731) har blitt sammenlignet med Dako HER2 FISH pharmdx Kit (kode K5331) i en sammenligningsstudie på 78 brystvevsprøver av humant brystkarsinom. Krysstabulering av HER2-status oppnådd ved de to analysene ga ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 21/58

22 Brystkreft et helhetlig samsvar på 98,7 % med nedre og øvre grenser for 95 % sikkerhetsintervall ved 94,2 % og 99,9 %. Kappa-verdien var 0,96 med nedre og øvre grenser for 95 % sikkerhetsintervall ved 0,89 og 1,00. P-verdien for McNemars test var 1,00, noe som indikerte fravær av avvik mellom de to analysene. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 22/58

23 Brystkreft Feilsøking - Bryst Problem Mulig årsak Foreslått løsning 1. Ingen eller svake signaler 1a. Settet har vært utsatt for høye temperaturer i løpet av transport eller lagring 1a. Kontroller oppbevaringsbetingelser. Se til at tørris finnes når leveringen mottas. Se etter om flaske 3 har vært oppbevart ved -18 C i mørket. Se etter om flaske 2A og 5 har vært oppbevart ved maksimalt 2 8 C i mørket. 1b. Mikroskopet fungerer ikke skikkelig - Feil filtersett - Feil lampe - Kvikksølvlampen for gammel - Skitne og/eller sprukne samlelinser - Uegnet neddykkingsolje 1b. Kontroller mikroskopet og se til at de brukte filtrene egner seg til bruk med settets fluorokromer og at kvikksølvlampen er riktig og at den ikke har blitt brukt lenger enn forventet levetid. (Se vedlegg 3.) I tvilstilfeller, ta kontakt med den lokale mikroskopleverandøren. 1c. Blekede signaler 1c. Unngå lang mikroskopisk undersøkelse og minimer eksponeringen for sterke lyskilder. 2. Ingen grønne signaler 1d. Betingelsene for forbehandling var feil 1e. Fordampning av prøveblandingen under hybridiseringen 2a. Betingelsene for stringensvask var feil 1d. Sørg for å bruke anbefalt forbehandlingstemperatur og -tid 1e. Sikre tilstrekkelig fuktighet i hybridiseringskammeret 2a. Sikre at anbefalt streng vasketemperatur og tid brukes, og at dekkglass fjernes før utføring av streng vask. 3. Ingen røde signaler 3a. Betingelsene for forbehandling var feil 3a. Sørg for å bruke anbefalt forbehandlingstemperatur og -tid 4. Områder uten signal 4a. Prøvevolum for lite 4a. Sikre at prøvevolumet er stort nok til å dekke området under dekkglasset 4b. Luftbobler fanget ved prøveblandingspåføring eller -montering 4b. Unngå luftbobler. Hvis disse oppdages, bank forsiktig på dem ved bruk av tang ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 23/58

24 Brystkreft Problem Mulig årsak Foreslått løsning 5. Overflødig bakgrunnsfarging 6. Dårlig vevsmorfologi 7. Høyt nivå av grønn autofluorescens på objektglass, inkludert områder uten FFPE-vev 5a. Feil vevsfiksering 5a. Se til at kun formalinfikserte, parafininnstøpte vevssnitt brukes 5b. Parafin ikke fullstendig fjernet 5b. Følg prosedyrene for avparafinering og rehydrering som er beskrevet i avsnitt B.2. 5c. Stringensvasketemp. for lav 5c. Se til at stringensvasketemp. er 63 (±2) C 5d. Forlenget eksponering av hybridisert snitt i sterkt lys 5d. Unngå lang mikroskopisk undersøkelse og minimer eksponeringen for sterke lys 6a. Feil pepsinbehandling 6a. Overhold de anbefalte pepsininkubasjonstidene. Se avsnitt B.3, trinn 2. Sørg for at pepsin håndteres ved riktig temperatur. Se avsnitt B.1. 6b. Feil forbehandlingsbetingelser kan gi uklart eller tåkete utseende 6c. For lang pepsinbehandling eller svært tynn snittykkelse kan forårsake at skyggeceller eller smultringformede celler ( donut cells ) vises. 7. Bruk av utløpt eller ikke anbefalte objektglass i glass 6b. Sørg for å bruke anbefalt forbehandlingstemperatur og tid 6c. Forkort pepsininkubasjonstiden. Se avsnitt B.3, trinn 2. Se til at snittykkelsen er 4 6 µm. 7. Se til at det belagte objektglasset i glass (Dako Silanized Slides, kode S3003, eller poly-llysin-belagte objektglass) ikke har utløpt utløpsdato. MERK: Dersom problemet ikke er noen av de nevnte tilfellene ovenfor, eller dersom den foreslåtte løsningen ikke utbedrer problemet, må du ringe Dakos tekniske avdeling for ytterligere hjelp. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 24/58

25 Brystkreft Vedlegg 1 - Bryst HER2 IQFISH pharmdx, Code K5731 Protokollkontrolliste Fargekjøringslogg-ID: Dato for kjøringen: HER2 IQFISH pharmdx, K5731 Lot: Prøve-ID: Utstyrs-ID: Dato for fortynning/utløpsdato for 1 x Wash Buffer (flaske 6 fortynnet 1:20): / Vev fiksert i nøytralt bufret formalin Ja Nei Trinn 1: Forbehandling Dato for fortynning/utløpsdato for Pre-Treatment Solution (flaske 1 fortynnet 1:20) / Målt temperatur på Pre-Treatment Solution (95 99 C ) hvis vannbad brukes til oppvarming C Forbehandling (10 minutter) og nedkjøling (15 minutter) Vask i Wash Buffer (flaske 6 fortynnet 1:20) (2 x 3 minutter) Trinn 2: Pepsin Varighet på Pepsin-behandling (flaske 2) ved 37 C eller Varighet på Pepsin-behandling (flaske 2) ved romtemperatur C) eller Varighet på pepsinneddykking ved 37 (±2) C Vask i Wash Buffer (flaske 6 fortynnet 1:20) (2 x 3 minutter) Dehydrer objektglass (3 x 2 minutter) i gradert serie med etanol og lufttørk Trinn 3: HER2/CEN-17-prøveblanding Påfør prøveblanding (flaske 3), dekkglass og forsegle med dekkglassforsegling Minutter Minutter Minutter Målt denatureringstemperatur (66 (±1) C) C Denaturering i 10 minutter Målt hybridiseringstemperatur (45 (±2) C) C Hybridiseringstid ( minutter) Trinn 4: Stringensvask Dato for fortynning/utløpsdato for stringensvaskebuffer (flaske 4 fortynnet 1:20) Minutter Målt temperatur på Stringent Wash Buffer (63 (±2) C) C Streng vask (10 minutter) etter fjerning av dekkglassene Vask i Wash Buffer (flaske 6 fortynnet 1:20) (2 x 3 minutter) C Dehydrer objektglass (3 x 2 minutter) i gradert serie med etanol og lufttørk / Minutter Trinn 5: Montering Påfør 15 µl av fluorescerende monteringsmedium (flaske 5) og dekkglass Kommentarer: ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 25/58

26 Brystkreft Dato og signatur, tekniker: ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 26/58

27 Brystkreft Vedlegg 2 - Bryst HER2 IQFISH pharmdx, Code K5731 Scoringsskjema Fargekjøringslogg-ID: Dato for kjøringen: HER2 IQFISH pharmdx, K5731 Lot: Prøve-ID: Nukleus nr. HER2 score (rød) Signaltelling i 20 nukleuser CEN-17 score (grønn) Nukleus nr Sum (1-10) Sum (11-20) HER2 score (rød) CEN-17 score (grønn) For bestemmelse av HER2/CEN-17-forhold, tell antallet HER2-signaler og antallet CEN-17- signaler i de samme 20 nukleusene og del det totale antallet HER2-signaler med det totale antallet CEN-17-signaler. Hvis HER2/CEN-17-forholdet ligger i grenseområdet (1,8 2,2), skal det telles ytterligere 20 nukleuser og forholdet skal beregnes på nytt. Resultater ved eller i nærheten av cut-off (1,8 2,2) skal tolkes med forsiktighet (se opptellingsveiledningen). Total score (1-20) HER2 CEN-17 HER2/CEN-17- forhold Forhold < 2: HER2-genamplifikasjon ble ikke observert Forhold 2: HER2-genamplifikasjon ble observert Dato og signatur, tekniker: Dato og signatur, patolog: For Retningslinjer for scoring: se Tolkning av farging. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 27/58

28 Brystkreft Vedlegg 3 - Bryst HER2 IQFISH pharmdx, kode K5731 Fluorescerende mikroskopspesifikasjoner Dako anbefaler følgende utstyr for bruk med HER2 IQFISH pharmdx, K5731: 1. Mikroskoptype Epifluorescerende mikroskop. 2. Lampe 100 watt kvikksølvlampe (hold oversikten over brennetid). 3. Objektiver For skanning av vev brukes fluorescerende tørr 10X eller fluorescerende oljenedsenkning 16X objektiver. For høy strømforstørrelse og signalscoring anbefales kun fluorescerende oljeneddykkingsobjektiver, f.eks. 100X. 4. Filtre Filtrene er utformet enkeltvis for spesifikke fluorokromer og skal velges deretter. Dako anbefaler bruk av et spesifikt DAPI-filter i kombinasjon med et høykvalitets Texas Red/FITC-dobbeltfilter. DAPI-filter, f.eks. Chroma-filter nr Texas Red/FITC dobbeltfilter, f.eks. Chroma-filter nr Texas Red og FITC enkeltfiltre kan brukes for bekreftelse. Fluorokrom Magnetiseringsbølgelengde Utslippsbølgelengde FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filtre er spesifikke for hver mikroskoptype, og bruken av egnede filtre er avgjørende for tolkningen. Hvis du ønsker detaljert informasjon, vennligst ta kontakt med din mikroskopleverandør eller Dakorepresentant. 5. Olje Ikke-fluorescerende olje. Forholdsregler En 50 watts kvikksølvlampe anbefales ikke. Rodaminfiltre kan ikke brukes. Trippelfiltre anbefales ikke. Et ikke-optimert mikroskop kan forårsake problemer ved lesing av de fluorescerende signalene. Det er viktig at lyskilden ikke har utgått og at den er riktig innrettet og fokusert. Kunder skal overvåke og følge produsentens anbefalinger for kvikksølvlampen. Mikroskopet skal opprettholdes, og kvikksølvlampen skal være justert før tolkning av resultatene. Det skal gjøres en innsats for å utsette prøven for så lite magnetiseringslys som mulig for å kunne minimere blekningen av det fluorescerende lyset. Vi anbefaler at du diskuterer oppsettet av det bestemte mikroskopet med produsenten før den fluorescerende in situ-hybridiseringen startes, eller se litteraturen. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 28/58

29 Magekreft Sammendrag og forklaring - Gastrisk Humant HER2-gen (også kjent som ERBB2 eller NEU) befinner seg på kromosom 17 og koder HER2-proteinet eller p185 HER2. HER2-proteinet er en membranreseptortyrosinkinase med homologi til den epidermiske vekstfaktorreseptoren (EGFR eller HER1) (1-2). HER2-genet finnes i 2 kopier i alle normale diploide celler. Overuttrykk av HER2-proteinet og amplifikasjon av HER2-genet ved magekreft har blitt vist i et stort antall undersøkelser (gjennomgått i (20)). HER2-positivitet kan påvises i omtrent 20 % av pasientene, enten med IHC eller FISH (20). Prekliniske in vitro- og in vivo-studier har vist at trastuzumab (Herceptin ) er effektiv i ulike magekreftmodeller og førte dermed til initieringen av flere kliniske undersøkelser (20-24). I en fase III-undersøkelse BO 18255, ble i ToGA-studien, HER2-positive pasienter med uopererbar lokalt avansert, gjentagende og/eller metastatisk adenokarsinom i magen, eller gastro-øsofageal forbindelse randomisert til å motta 5-FU eller capecitabine og cisplatin enten enkeltstående eller i kombinasjon med trastuzumab. En statistisk betydelig økning i helhetlig overlevelse (OS) ble sett i pasientene som mottok den kombinerte behandlingen med trastuzumab og kjemoterapi (25). Trastuzumab er et humanisert monoklonalt antistoff som binder med høy affinitet til HER2-proteinet og har blitt vist å inhibere proliferasjon av humane tumorceller som overuttrykker HER2-proteinet in vitro og in vivo (21-24). Prosedyreprinsipp - Gastrisk HER2 IQFISH pharmdx inneholder alle nøkkelreagenser som er nødvendige for å fullføre en FISH-prosedyre for formalinfikserte, parafininnstøpte vevsnittsprøver. Etter deparafinisering og rehydrering varmes prøver opp i forbehandlingsløsning etterfulgt av proteolytisk forbrenning ved bruk av pepsin. Etter oppvarming og proteolytiske forbehandlingstrinn, bruker dette settet en ikke-giftig, bruksklar IQISH-prøveblanding basert på en kombinasjon av PNA- (peptidnukleinsyre) (12) og DNA-teknologi. Denne prøveblandingen består av en blanding av Texas Red-merkede DNA-prøver som dekker en 218 kb region inkludert HER2-genet på kromosom 17, samt en blanding av fluorescein-merkede PNA-prøver rettet mot den centromeriske regionen av kromosom 17 (CEN-17). Den spesifikke hybridiseringen til de to målene resulterer i dannelse av et tydelig rødt fluorescerende signal ved hver HER2-genlokus og et tydelig grønt fluorescerende signal ved alle kromosom 17-centromere. Etter en streng vask, monteres prøvene med Fluorescence Mounting Medium som inneholder DAPI og dekkglass. Ved bruk av et fluorescerende mikroskop som er utstyrt med riktige filtre (se vedlegg 3), lokaliseres tumorceller, og opptellingen av de røde (HER2) og grønne (CEN-17) signalene gjennomføres. Deretter beregnes HER2/CEN-17-forholdet. Normale celler i de analyserte vevssnittene vil tjene som indre positiv kontroll for forhåndsbehandling og hybridiseringseffektivitet. Se avsnittet Tolkning av farging for flere opplysninger. For interaktiv e-learning, vennligst bruk HER2 IQFISH pharmdx e-learning-programmet som er utformet til å gi laboratorieteknikere, patologer og forskere en nøyaktig og hurtig kunnskap om hvordan de oppnår optimale resultater ved bruk av HER2 IQFISH pharmdx : Reagenser - Gastrisk Materialer som følger med Materialene som er opplistet nedenfor er tilstrekkelig til 20 tester (en test er definert som et målområde på 22 mm x 22 mm). Antallet tester er basert på bruk av 250 µl per objektglass fra flaske 2A (5-8 dråper), 10 µl per objektglass fra flaske 3 og 15 µl per objektglass fra flaske 5. Løsningene i flaske 3 og flaske 5 er viskøse og må kanskje sentrifugeres kort i en mikrosentrifuge for å samle all den medfølgende reagensen. Settet inneholder materialer tilstrekkelig for 10 individuelle fargingskjøringer (fire separate kjøringer ved bruk av pepsinneddykkingsmetoden). HER2 IQFISH pharmdx leveres på tørris. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 29/58

30 Magekreft For å sikre at settets komponenter ikke har blitt utsatt for høye temperaturer under transport, skal det fortsatt være igjen tørris ved mottak. Vær oppmerksom på at noen settkomponenter fortsatt er frosne, dette vil ikke påvirke ytelsen til HER2 IQFISH pharmdx. Flaske 1 Flaske 2A Flaske 2B Flaske 3 Flaske 4 Flaske 5 Flaske 6 Forbehandlingsløsning (20x) 150 ml, konsentrert 20x MES (2-[N-morfolino]etansulfosyre) buffer. Pepsin 4 x 6,0 ml, klar til bruk Pepsinløsning, ph 2,0; inneholder stabiliseringsmiddel og et antimikrobielt middel. Pepsin Diluent (10x) 24 ml, konsentrert 10x Fortynningsløsning, ph 2,0; inneholder et antimikrobielt middel. HER2/CEN-17 IQISH-prøveblanding 0,2 ml, klar til bruk Blanding av Texas Red-merkede HER2 DNA-prøver og fluorescein-merkede CEN-17 PNA-prøver; leveres i IQISHhybridiseringsbuffer. Stringensvaskebuffer (20x) 150 ml, konsentrert 20x SSC (saltløsningsnatriumcitrat) buffer med rengjøringsmiddel (Tween-20). Fluorescerende monteringsmiddel 0,4 ml, klar til bruk Fluorescerende monteringsmedium med 500 µg/l DAPI (4,6-diamidin-2-fenylindol). Wash Buffer (20x) 500 ml, konsentrert 20x Tris/HCl-buffer. Dekkglassforsegling 1 tube, klar til bruk Løsning for avtakbar forsegling av dekkglass. MERK: Følgende settreagenser: Forbehandlingsløsning (20x), pepsin, Pepsin Diluent (10x), stringensvaskebuffer (20x), fluorescerende monteringsmedium, vaskebuffer (20x) og objektglassforsegling kan utveksles med tilsvarende reagenser i Dako Histology FISH Accessory Kit, kode K5799. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 30/58

31 Magekreft Materialer som er nødvendige, men som ikke medfølger Laboratoriereagenser Destillert eller avionisert vann Etanol, 96 % Xylen eller xylensubstitutter Laboratorieutstyr Absorberende kluter Regulerbare pipetter Kalibrert delvis neddykkingstermometer (område C) Kalibrert overflatetermometer (område C) Dekkglass (22 mm x 22 mm) Tang Avtrekkshette Dako Hybridizer (kode S2450 eller S2451)* Oppvarmingsblokk eller hybridisering* Fuktig hybridiseringskammer* Mikrosentrifuge Objektglass, Dako Silanized Slides, kode S3003, eller poly-l-lysin-belagte objektglass (se Klargjøring av prøver) Fargekar eller -bad Stoppeklokke (som kan måle 2 15 minutters intervaller) Vorteksblander Vannbad med lokk (som kan opprettholde 37 (±2) C, 63 (±2) C og fra 95 C til 99 C) Mikrobølgeovn med sensorevne hvis forhåndsoppvarming utføres ved bruk av mikrobølgeovn (se B3. Fargingsprotokoll. Trinn 1: Forbehandling, metode B) * Oppvarmingsblokk eller hybridiseringsovn for denaturering (66 (±1) C) og hybridisering (45 (±2) C) sammen med et fuktig hybridiseringskammer kan brukes som et alternativ til Dako Hybridizer. Mikroskoputstyr og tilbehør Filtre for fluorescerende mikroskop: DAPI og FITC/Texas Red dobbelt filter, eller FITC og Texas Red monofiltre se vedlegg 3 for detaljer. Fluorescerende mikroskop med en 100 watts kvikksølvlampe som lyskilde bør brukes. Andre lyskilder anbefales ikke med disse filtrene. Objektglassmappe på mikroskopet (pappbrett for 20 objektglass med hengslet deksel eller lignende). ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 31/58

32 Magekreft Forholdsregler - Gastrisk 1. Til in vitro-diagnostisk bruk. 2. For profesjonelle brukere. 3. Flaske 1, Pre-Treatment Solution (20x), inneholder 1-<20 % 2-morfolinoetansulfosyre; flaske 2A, Pepsin, inneholder 5 10 % propan-2-ol; og flaske 6, vaskebuffer (20x), inneholder 1-<20 % trometamol. Ved ulike produktkonsentrasjoner krever ikke disse substansene faremerking. HMS-datablader er tilgjengelige for profesjonelle brukere på forespørsel. 4. Flaske 2, Pepsin, inneholder pepsin A som kan forårsake en allergisk reaksjon. 5. Flaske 2B, Pepsin Diluent (10x) inneholder 60 % propan-2-ol og er merket: Meget brannfarlig. Irriterende. R11 Meget brannfarlig. R36 Irriterer øynene. R67 Damper kan forårsake sløvhet og svimmelhet. S9 Emballasjen oppbevares på et godt ventilert sted. S16 Oppbevares på avstand fra tenningskilder røyking forbudt. S26 Får man stoffet i øynene, skyll straks grundig med store mengder vann og kontakt lege. S60 Dette materialet og beholderen må avhendes som farlig avfall. 6. Dekkglassforsegling inneholder % nafta (petroleum), hydrobehandlet lys, og er merket: Ekstremt brannfarlig. Farlig for miljøet. R11 Meget brannfarlig. R51/53 Giftig for vannlevende organismer, kan forårsake uønskede langtidsvirkninger i vannmiljøet. S9 Oppbevares på et godt ventilert sted. S16 Holdes vekk fra antennelseskilder Røyking forbudt. S35 Produktet og emballasjen skal uskadeliggjøres på en sikker måte. S57 Sørg for forsvarlig emballering for å forebygge miljøforurensning. S61 Unngå utslipp i miljøet. Se spesialinstrukser/sikkerhetsdatablader. Se databladet for materialsikkerhet (MSDS) for ytterligere informasjon. 7. Pasientprøver, før og etter fiksering, og alle materialer som er utsatt for slike, skal håndteres som om de har evne til å overføre infeksjon og avhendes under iakttakelse av relevante forholdsregler (16). Pipetter aldri reagenser med munnen, og unngå at reagenser og prøver kommer i kontakt med hud og slimhinner. Hvis reagens kommer i kontakt med følsomme områder, må det skylles med rikelige mengder vann. 8. Minimer mikrobiell kontaminering av reagenser for å unngå feilaktige resultater. 9. Andre inkubasjonstider og temperaturer, eller andre metoder enn de som er spesifisert, vil kunne gi feilaktige resultater. 10. Andre vevsfikseringsmetoder og tykkelse på prøver enn de som er spesifisert, kan påvirke vevsmorfologi og/eller signalintensitet. 11. Unngå fordampning av HER2/CEN-17 prøveblanding i løpet av hybridisering ved å sørge for tilstrekkelig fuktighet i hybridiseringskammeret. 12. Reagenser har blitt optimalt fortynnet. Ytterligere fortynning kan forårsake tap av ytelse. 13. Bruk egnet personlig verneutstyr for å unngå kontakt med øyne og hud. Vennligst se HMS-databladet for ytterligere informasjon. 14. På grunn av den heterogene naturen til gastriske kreftprøver er det viktig å utføre en grundig skanning av hele prøven for å evaluere signaldistribusjon før valg av område for signalopptelling. 15. Det anbefales ikke å evaluere alle svært små prøver (dvs. prøver må ha intakt morfologi og tilstrekkelig nuklein for oppteling). ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 32/58

33 Magekreft 16. Hvis HER2 FISH-analysen utføres på en biopsiprøve, skal flere (7-8) evaluerbare biopsiprøver fra ulike regioner av tumoren analyseres for å sikre pålitelig bestemmelse av HER2-status. 17. For identifisering av alle vevkjerner i en biopsiprøve er det viktig å undersøke det H&Efargede objektglasset. 18. Kun rene fargingsglass skal brukes til pepsinneddykkingsmetoden (trinn 2, metode C). ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 33/58

34 Magekreft Lagring - Gastrisk Oppbevar HER2/CEN-17 IQISH prøveblanding (flaske 3) ved -18 C i mørket. Alle andre reagenser kan oppbevares ved 2 8 C i mørket. Alle reagenser tåler frossen lagring. Frysing og tining av reagensene opptil 10 ganger påvirker ikke ytelsen. Pepsin, HER2/CEN-17 IQISH prøveblanding og fluorescerende monteringsmedium (flaske 2A, 3 og 5) kan bli påvirket negativt ved utsettelse for varme. Ikke la disse komponentene oppbevares i romtemperatur. HER2/CEN-17 IQISH prøveblanding og fluorescerende monteringsmedium (flaske 3 og 5) kan bli påvirket negativt ved utsettelse for unødige lysnivåer. Ikke oppbevar disse komponentene eller utfør analyse i sterkt lys, slik som direkte sollys. Ikke bruk settet etter utløpsdatoen som er stemplet på settets eske. Hvis reagensene oppbevares under andre forhold enn de som er spesifisert i dette pakningsvedlegget, må reagensytelsen valideres av brukeren (13). Det er ingen tydelige tegn som indikerer at dette produktet er ustabilt. Derfor er det viktig å evaluere normale celler i det analyserte vevssnittet. Hvis det observeres uventet fluorescerende mønster som ikke kan forklares med variasjoner i laboratorieprosedyrer, og det er mistanke om at det er et problem med HER2 IQFISH pharmdx, ta kontakt med Dakos tekniske avdeling. Klargjøre prøve - Gastrisk Adenokarsinomprøver fra magen, inkludert den gastroøsofageale overgangen, fra biopsier, eksisjoner eller reseksjoner må håndteres slik at vevet bevares til FISH-analyse. Standardmetoder for vevsbehandling ved immunocytokjemisk farging skal brukes på alle prøver (14). Ved testing av små biopsiprøver, bestem intakt tumormorfologi og tilstedeværelse av tilstrekkelig nuklein for signalopptelling. Hvis HER2 FISH-analysen utføres på en biopsiprøve, skal flere (7-8) evaluerbare biopsiprøver fra ulike regioner av tumoren analyseres for å sikre pålitelig bestemmelse av HER2-status. Parafininnstøpte vevssnitt Kun vevssnitt som er preservert i nøytralt bufret formalin og parafininnstøpt egner seg for bruk. Prøver skal f.eks. være blokkert i en tykkelse på 3 eller 4 mm og fiksert i timer i nøytral bufret formalin. Biopsiprøver ble fiksert i 6-8 timer i ToGA-studien (for studiereferanse, se (25)). Vevene dehydreres i gradert serie av etanol og xylen, etterfulgt av infiltrering av smeltet parafin som ikke holder mer enn 60 C. Korrekt fikserte og innstøpte vev vil holde seg ubegrenset før snitt og objektglassmontering ved lagring på kjølig sted (15 25 C) (14, 15). Andre fiksativer egner seg ikke. Vevsprøver skal skjæres i snitt på 3 6 µm. Objektglassene som kreves for HER2-genamplifikasjonsanalyse og verifisering av tilstedeværelsen av en tumor, skal prepareres samtidig. Minst 2 seriesnitt anbefales, 1 snitt for tilstedeværelse av tumor farget med hematoksylin og eosin (H&E-farging), og 1 snitt for HER2 genamplifikasjonsanalyse. Det anbefales at vevssnitt monteres på Dako Silanized Slides, kode S-3003, eller poly-l-lysin-belagte objektglass. Prøver skal analyseres innen 4 6 måneder etter snitt ved lagring i romtemperatur (20 25 C). ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 34/58

35 Magekreft BRUKSANVISNING - Gastrisk A. Reagenspreparering - Gastrisk Det er praktisk å klargjøre følgende reagenser før farging: A.1 Forbehandlingsløsning Det kan oppstå krystaller i flaske 1, men de løser seg opp ved romtemperatur. Se til at det ikke finnes noen krystaller før klargjøring av reagensen. Fortynn en tilstrekkelig mengde fra flaske 1 (forbehandlingsløsning 20x) ved å fortynne konsentratet 1:20 i destillert eller avionisert vann. Ubrukt fortynnet løsning kan oppbevares ved 2 8 C i én måned. Kast fortynnet løsning hvis den får et tåkete utseende. A.2 Stringent Wash Buffer Fortynn en tilstrekkelig mengde fra flaske 4 (stringensvaskebuffer 20x) ved å fortynne konsentratet 1:20 i destillert eller avionisert vann. Ubrukt fortynnet buffer kan oppbevares ved 2 8 C i én måned. Kast fortynnet buffer hvis den f år et tåkete utseende. A.3 Wash Buffer Fortynn en tilstrekkelig mengde av flaske 6 (vaskebuffer 20x) ved å fortynne konsentratet 1:20 i destillert eller avionisert vann. Ubrukt fortynnet buffer kan oppbevares ved 2 8 C i én måned. Kast fortynnet buffer hvis den får et tåkete utseende. A.4 Etanolserie Klargjør 3 glass med respektivt 70 %, 85 % og 96 % etanol fra en 96 % etanolløsning. Oppbevar de tildekkede glassene ved romtemperatur eller ved 2 8 C, og bruk til maksimalt 200 objektglass. Kast løsningene hvis de får et tåkete utseende. A.5 Pepsinløsning En pepsinløsning er kun nødvendig ved bruk av pepsinneddykkingsmetoden (metode C). Klargjør pepsinløsningen som følger: Til en beholder med kapasitet til seks snitt klargjøres 60 ml pepsinløsning: Tilsett 48 ml romtemperert (20 25 C) destillert el ler deionisert vann til beholderen. Tilsett 6 ml kald (2 8 C) Pepsin Diluent (10x) (fl aske 2B) til beholderen. Tilsett 6 ml kald (2 8 C) Pepsin (flaske 2A) til b eholderen. Sett lokk på beholderen og balanser pepsinløsningen til 37 (±2) C i et vannbad. Til en beholder med kapasitet til 24 snitt klargjøres 240 ml pepsinløsning: Tilsett 192 ml romtemperert (20 25 C) destillert e ller deionisert vann til beholderen. Tilsett 24 ml kald (2 8 C) Pepsin Diluent (10x) (f laske 2B) til beholderen. Tilsett 24 ml kald (2 8 C) Pepsin (flaske 2A) til beholderen. Sett lokk på beholderen og balanser pepsinløsningen til 37 (±2) C i et vannbad. Den balanserte pepsinløsningen må brukes innen 5 timer. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 35/58

36 Magekreft B. Fargeprosedyre - Gastrisk B.1 Prosedyremerknader Brukeren skal lese disse instruksjonene nøye og gjøre seg kjent med alle komponentene før bruk (se Forholdsregler). Alle reagenser skal stabiliseres ved relevant temperatur før bruk på følgende måte: Flaske 1:Den fortynnede forbehandlingsløsningen skal stabiliseres ved C hvis vannbad brukes til forbehandlingen (B3. Fargingsprotokoll, Trinn 1: Forhåndsbehandlingsmetode A). Hvis mikrobølgeovn med sensorevne brukes til forhåndsbehandlingen (B3. Fargingsprotokoll, Trinn 1: Forbehandling, Metode B) skal den fortynnede forbehandlingsløsningen stabiliseres ved romtemperatur C. Flaske 2A: Pepsin skal brukes ved 2 8 C (B3, fargingsprotokoll, trinn 2: Metode A og B) og holdes kald kontinuerlig. Flaske 2B: Pepsin Diluent (10x) skal brukes ved 2 8 C (B3, fargingsprotokoll, trinn 2: Metode C). Flaske 3: HER2/CEN-17 IQISH prøveblanding separeres inn i to faser under oppbevaring ved -18 C. Før bruk av flaske 3 må du sikre at kun én fase finnes ved å balansere prøveblandingen til romtemperatur (20 25 C ) etterfulgt av blanding. Tin opp flaske 3 ved romtemperatur (20 25 C) i maksimalt 30 minutter (beskyttes mot sterkt lys), roter deretter flasken i 15 sekunder ved 2500 o/min ved bruk av en vorteksblander. Oppbevar flaske 3 ved -18 C umiddelbart etter bruk. Flaske 4: Fortynnet stringensvaskebuffer; ett glass skal balanseres til romtemperatur, det andre skal balanseres til 63 (±2) C før bruk. Flaske 5: Fluorescence Mounting Medium kan påføres ved hvilken som helst temperatur fra 2 25 C. Flaske 6: Den fortynnede vaskebufferen skal balanseres til romtemperatur C. Dekkglassforsegling kan påføres ved hvilken som helst temperatur fra 2 25 C. Alle trinnene skal utføres ved angitt temperatur. Prosedyren inkluderer et antall dehydreringer fulgt av tørking av vevssnittene. Sørg for at vevssnittene er helt tørre før du fortsetter til neste trinn. Ikke la vevssnitt tørke i løpet av de andre prosedyretrinnene. Hvis fargeprosedyren må avbrytes, kan objektglassene oppbevares i vaskebuffer etter avparafiniseringstrinnet i inntil 1 time ved romtemperatur (20 25 C) uten at resultatene påvirkes. B.2 Behandling av vev før farging Avparafinisering og rehydrering: Før analysen utføres, må vevssnittene avparafiniseres for å fjerne innstøpningsmedium og rehydreres. Unngå ufullstendig fjerning av parafin. Resterende innstøpningsmedium vil føre til økt ikke-spesifikk farging. Dette trinnet skal utføres ved romtemperatur (20 25 C). 1. Plasser objektglassene i et xylenbad og inkuber i 5 (±1) minutter. Skift bad og gjenta én gang. 2. Bank forsiktig av overflødig væske og plasser objektglassene i 96 % etanol i 2 (±1) minutter. Skift bad og gjenta én gang. 3. Bank forsiktig av overflødig væske og plasser objektglassene i 70 % etanol i 2 (±1) minutter. Skift bad og gjenta én gang. 4. Bank forsiktig av overflødig væske og plasser objektglassene i fortynnet Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i minst 2 minutter. Begynn fargeprosedyren slik som beskrevet i avsnitt B.3, trinn 1, Forbehandling. Xylen- og alkoholløsningene skal skiftes etter 200 objektglass eller mindre. Det kan benyttes xylensubstitutter. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 36/58

37 Magekreft MERK: Reagenser og instruksjoner som medfølger i dette settet er utviklet for optimal ytelse. Ytterligere fortynning av reagenser eller endring av inkubasjonstemperaturer kan gi feilaktige eller ikke-samsvarende resultater. Forskjeller i vevbehandling og tekniske prosedyrer i brukerens laboratorium kan gjøre analyseresultatene ugyldige. B.3 Fargingsprotokoll Trinn 1: Forbehandling Forbehandlingen kan utføres enten ved bruk av vannbad, slik som beskrevet i metode A) eller alternativt ved bruk av mikrobølgeovn med sensorevne, slik som beskrevet i metode B). Metode A: Forbehandling ved bruk av vannbad Fyll fargingsglassene, f.eks. Coplin-glass, med fortynnet forbehandlingsløsning (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.1). Plasser fargingsglassene som inneholder fortynnet forbehandlingsløsning i vannbad. Varm opp vannbadet og forbehandlingsløsning til C. Mål temperaturen innvendig i karet med et ka librert termometer for å sikre riktig temperatur. Dekk til glassene med lokk for å stabilisere temperaturen og unngå fordampning. Senk ned de romtempererte avparafiniserte snittene i den forvarmede forbehandlingsløsningen i fargingsglassene. Kontroller temperaturen på nytt og inkuber i 10 (±1) minutter ved C. Fjern hele glasset med objektglassene fra vannbadet. Fjern lokket og la objektglassene kjøle seg ned i forbehandlingsløsning i 15 minutter ved romtemperatur. Overfør objektglassene til et glass med fortynnet Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Skift Wash Buffer og nedsenk snittene i enda 3 minutter. MERK: Forbehandlingsløsningen er utviklet kun til engangsbruk. Skal ikke brukes på nytt. Metode B: Forbehandling ved bruk av mikrobølgeovn med sensorevne Fyll en plastbeholder med fortynnet, romtemperert (20 25 C) forbehandlingsløsning. Senk ned de avparafinerte snittene i forbehandlingsløsningen, dekk til beholderen med et gjennomhullet lokk og plasser den i mikrobølgeovnen. Velg kokesensorfunksjonen og et program som går i 10 minutter etter at koketemperaturen er oppnådd*. Etter 10 minutters inkubasjonstid, ta beholderen med snitt ut av ovnen, fjern lokket og kjøl ned i 15 minutter ved romtemperatur. Overfør objektglassene til en beholder med fortynnet Wash Buffer, og neddykk glassene i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Skift Wash Buffer og nedsenk snittene i enda 3 minutter. * Bruk av en mikrobølgeovn med sensorevne betyr at ovnen må inkludere en sensor og programmer som innledningsvis varmer opp Pre-Treatment Solution til kokepunktet og deretter opprettholder nødvendig forbehandlingstemperatur (over 95 C) mens forinnst ilt tid nedtelles (10 (±1) minutter). Noen mikrobølgeovnsmodeller med sensorevne har kanskje ikke noe alternativ for å fritt stille inn en nedtellingstid. Hvis modellen kun inkluderer forinnstilte programmer, se til å velge et program som opprettholder den nødvendige forbehandlingstemperaturen (over 95 C) i minst 10 (±1) minutter, og stopp pro grammet manuelt etter 10 (±1) minutter. MERK: Forbehandlingsløsningen er utviklet kun til engangsbruk. Skal ikke brukes på nytt. Trinn 2: Pepsin, bruksklar (RTU) eller pepsinløsning Pepsininkubasjon kan utføres enten ved direkte påføring av RTU pepsindråper på snittene enten ved romtemperatur (20 25 C) (metode A) eller ved 3 7 C (metode B). Alternativt kan snitt neddykkes i en pepsinløsning og inkuberes ved 37 (±2) C (metode C). Metode A og metode B: ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 37/58

38 Magekreft Bank forsiktig bort overskytende buffer. Ved bruk av en lofri klut (slik som en absorberende wipe eller gas) tørkes det forsiktig rundt prøven for å fjerne resterende væske og holde reagensene innen det foreskrevne området. Påfør 5 8 dråper (250 µl) kald (2 8 C) Pepsin (fla ske 2A) for å dekke prøven. Pepsin skal alltid oppbevares ved 2 8 C. Metode A: Pepsin, RTU Inkubering ved C Inkuber i 5 15 minutter ved romtemperatur (20 25 C ). En inkubasjonstid på 5 15 minutter vil være tilstrekkelig for de flest prøvene, men den optimale inkubasjonstiden kan avhenge av vevsfiksering og/eller tykkelse på prøven og skal bestemmes av brukeren. Bank forsiktig av overflødig pepsin, og neddykk snittene i fortynnet vaskebuffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.3) i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Erstatt fortynnet vaskebuffer, og neddykk snittene i enda 3 minutter. Fortsett til dehydrering. Metode B: Pepsin, RTU Inkubering ved 37 C Plasser prøven med Pepsin på en varmeblokk ved 37 C f.eks. Dako Hybridizer og inkuber i 3-5 minutter. En inkubasjonstid på 3-5 minutter vil være tilstrekkelig for de flest prøvene, men den optimale inkubasjonstiden kan avhenge av vevsfiksering og/eller tykkelse på prøven og skal bestemmes av brukeren. Bank av overflødig pepsin og nedsenk snittene i fortynnet vaskebuffer i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Skift vaskebuffer og nedsenk snittene i ytterligere 3 minutter. Fortsett til dehydrering. Dehydrer vevssnittene gjennom en gradert serie med etanol: 2 minutter i 70 % etanol, 2 minutter i 85 % etanol og 2 minutter i 96 % etanol. La vevssnitt lufttørke fullstendig. Metode C: Pepsinløsning - neddykking av snitt i pepsinløsning på 37 C Settet inneholder tilstrekkelig med reagenser til fire separate kjøringer (60 ml pepsinløsning, liten beholder for seks objektglass) eller en enkelt kjøring ( 240 ml pepsinløsning, stor beholder for 24 objektglass). Klargjør pepsinløsningen slik som beskrevet i snitt A.5. Sett lokk på beholderen og balanser pepsinløsningen til 37 (±2) C i et vannbad. Se til at temperaturen har stabilisert seg. Mål temperaturen inne i beholderen med et kalibrert termometer for å sikre at det holder riktig temperatur. Bank bort overskytende vaskebuffer. Neddykk objektglass i pepsinløsningen på 37 (±2) C og inkuber i minutter. En inkubasjonstid på minutter vil være tilstrekkelig for de fleste prøvene, men den optimale inkubasjonstiden kan avhenge av vevsfiksering og/eller tykkelse på prøven og skal bestemmes av brukeren. Bank av overflødig pepsinløsning og nedsenk snittene i fortynnet vaskebuffer i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Skift vaskebuffer og nedsenk snittene i ytterligere 3 minutter. Fortsett til dehydrering. Dehydrer vevssnittene gjennom en gradert serie med etanol: 2 minutter i 70 % etanol, 2 minutter i 85 % etanol og 2 minutter i 96 % etanol. La vevssnitt lufttørke fullstendig. Trinn 3: HER2/CEN-17 IQISH-prøveblanding HER2/CEN-17 IQISH prøveblanding separeres inn i to faser under oppbevaring ved -18 C. Før bruk av flaske 3 må du sikre at kun én fase finnes ved å balansere prøveblandingen til romtemperatur (20 25 C ) etterfulgt av blanding. Tin opp flaske 3 ved romtemperatur (20 25 C) i maksimalt 30 minutter (beskyttes mot sterkt lys), roter deretter flasken i 15 sekunder ved 2500 o/min ved bruk av en vorteksblander. Oppbevar flaske 3 ved -18 C umiddelbart etter bruk. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 38/58

39 Magekreft Påfør 10 µl HER2/CEN-17 IQISH-prøveblanding (flaske 3) på midten av vevssnittet. Plasser umiddelbart et 22 mm x 22 mm dekkglass over prøveblandingen, og la den spre seg jevnt under dekkglasset. Unngå luftbobler. Hvis det observeres luftbobler, bank dem forsiktig bort fra vevet ved bruk av tang. Husk å oppbevare flaske 3 ved -18 C umiddelbart etter bruk. Forsegle dekkglassene med dekkglassforsegling ved å støte ut forseglingen rundt kanten av dekkglasset. La dekkglassforseglingen overlappe dekkglasset og objektglasset, slik at det dannes en forsegling rundt dekkglasset. Se til at dekkglassforseglingen dekker hele kanten av dekkglasset. Klargjør Dako Hybridizer* (kode S2450 eller S2451) for en hybridiseringskjøring. Se til at Humidity Control Strips (kode S2452) er mettet og optimale for bruk. Start Hybridizer og velg et program som vil: Denaturer ved 66 C i 10 minutter etterfulgt av hyb ridisering ved 45 C i minutter. Plasser objektglassene i Hybridizer. Se til at lokket er godt lukket, og start programmet. Se brukerhåndboken for Dako Hybridizer for detaljer. * Instrumentering som tillater forhold som er identiske med de som beskrives ovenfor, kan brukes til denaturering og hybridisering: Plasser objektglassene på en flat metall- eller steinoverflate (varmeblokk eller på en blokk i en hybridiseringsovn) foroppvarmet til 66 (±1) C. Den aturer i nøyaktig 10 minutter. Plasser objektglassene i et foroppvarmet fuktig hybridiseringskammer. Dekk til kammeret med et lokk og inkuber ved 45 (±2) C i minutter. Vær op pmerksom på at en hybridiseringstemperatur på 37 C ikke egner seg til bruk med probene som finne s i dette settet. Trinn 4: Stringensvask Fyll to fargingsglass, f.eks. Coplin-glass, med fortynnet stringensvaskebuffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.2). Det anbefales et minstevolum på 100 ml eller 15 ml per objektglass i hvert glass. Plasser ett av fargingsglassene som inneholder fortynnet stringensvaskebuffer i romtemperatur i en avtrekkshette og det andre i et vannbad. Varm opp vannbadet og den fortynnede stringensvaskebuffer til 63 (±2) C. Se til at temp eraturen har stabilisert seg. Dekk til karet med lokk for å stabilisere temperaturen og unngå fordampning. Mål temperaturen inne i vannbadglasset med et kalibrert termometer for å sikre at det holder riktig temperatur. Stringent Wash Buffer inneholder rengjøringsmiddel og kan bli turbide ved 63 C; det te vil ikke påvirke ytelsen. Ved bruk av tang eller hansker, ta objektglassene ut fra hybridiseringskammeret og fjern forsiktig dekkglassforseglingen og dekkglasset, og plasser objektglassene i det romtempererte forvaskglasset, ett om gangen. Så snart alle dekkglassene er fjernet, overføres objektglassene fra det romtempererte forvaskglasset til glasset på 63 (±2) C i vannbade t. Umiddelbart etter overføring av snittene til karet på 63 (±2) C i vannbadet skal timeren startes. Utfør stringensvask i akkurat 10 minutter. Fjern objektglassene fra den fortynnede stringensvaskebufferen, og neddykk snittene i fortynnet vaskebuffer i 3 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Skift ut fortynnet vaskebuffer, og neddykk snittene i enda 3 minutter. Dehydrer vevssnittene gjennom en gradert serie med etanol: 2 minutter i 70 % etanol, 2 minutter i 85 % etanol og 2 minutter i 96 % etanol. La vevssnitt tørke fullstendig. Trinn 5: Montering Påfør 15 µl fluorescerende monteringsmedium som inneholder DAPI (flaske 5) på målområdet av objektglasset og legg på et dekkglass. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 39/58

40 Magekreft MERK: Objektglassene kan avleses etter 15 minutter eller innen 7 dager etter montering. Men det oppstår blekning hvis objektglassene utsettes for lys eller høye temperaturer. For å minimere blekning, skal objektglassene oppbevares på et mørkt sted ved C. Kvalitetskontroll - Gastrisk 1. Signalene må være lyse, tydelige og lette å evaluere. 2. Normale celler gir en intern kontroll av fargingen. Normale celler skal ha 1 2 klart synlige grønne signaler som indikerer at hybridiseringen av CEN-17 PNA-prøven til den centromeriske regionen på kromosom 17 var vellykket. Normale celler skal også ha 1 2 klart synlige røde signaler som indikerer at hybridiseringen av HER2 DNA-prøven til HER2-amplikonet var vellykket. På grunn av vevssnitt vil noen normale celler ha mindre enn de 2 forventede signalene av hver farge. Hvis signaler ikke påvises i normale celler, indikerer dette at analysen var mislykket, og resultatene må betraktes som ugyldige. 3. Nukleærmorfologi må være intakt ved evaluering ved bruk av DAPI-filter. Mange skyggeceller og generelt dårlig nukleærmorfologi indikerer overnedbrytning av prøven, noe som fører til tap eller fragmentering av signalene. Slike prøver skal betraktes som ugyldige. 4. Det minste antallet vurderbare tumorceller er Forskjeller i vevsfiksering, prosessering og innstøpning i brukerlaboratoriet kan frembringe variasjon i resultatene og gjør det påkrevd med regelmessig evaluering av interne kontroller. Tolkning av farging - Gastrisk Vev som kan vurderes Lokaliser tumoren innen konteksten til det HE-fargede objektglasset, og evaluer det samme området på det FISH-fargede objektglasset (i DAPI-filteret). Det er kun prøver fra pasienter med adenokarsinom i magen, inkludert den gastroøsofageale overgangen, som skal analyseres. I tilfeller med intestinal metaplasi og adenokarsinom i samme prøve skal kun karsinomkomponenten scores. Unngå områder med alvorlig inflammasjon, med nekrose og områder der de nukleære grensene er tvetydige. Ikke inkluder nukleuser som krever subjektiv bedømmelse. Ikke inkluder nuklein med svak signalintensitet og ikke-spesifikk eller høy bakgrunn. Begynn med mikroskopevaluering av hele den FISH-fargede seksjonen og området som er tilordnet på H&E-seksjonen, respektivt. Før opptellingen av det FISH-fargede objektglasset, merk den helhetlige signaldistribusjonen (homogen eller heterogen) på signalopptellingsarket. I tilfelle heterogen distribusjon, merk om fokal amplifikasjon eller enkeltcelles amplifikasjon (mosaikk) er tilstede. 1) Homogen signaldistribusjon I tilfelle signaldistribusjonen er homogen, tell opp antallet kromosomcentromere (grønne signaler) og antall HER2-gener (røde signaler) respektivt, fra 20 celler i 1-2 representative tumorområder. 2) Heterogen signaldistribusjon I tilfelle signaldistribusjonen er heterogen, tell opp totalt 20 celler fra de valgte områdene, slik som spesifisert nedenfor: A) Hvis fokal amplifikasjon eksisterer, skal områder med amplifiserte celler velges. B) Hvis mosaikkdistribusjon eller amplifiserte, polysomale og disomale celler er tilstede, tell områder med amplifiserte celler. Innenfor disse områdene, skal ikke bare de forsterkede cellene, men også de tilgrensende ikke-forsterkede cellene telles for totalt 20 celler. Hvis mulig, ikke velg overlappingsområder. Se bort fra farging av bakteriell DNA ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 40/58

41 Magekreft Et antall spesialiserte celler (mastceller og makrofager), som finnes spredt i det gastriske vevet, utviser en høynivåfarging av HER2-proben på grunn av tilstedeværelse av bakteriell DNA. Dette fører til sterkt røde fluorescerende celler som er klart distinkte fra tumorceller med høy HER2- genamplifikasjon. Signalopptelling Når et område har blitt valgt for signalopptelling, begynn analysen i en av de 20 tilgrensende valgte nukleiner og tell deretter celle etter celle ved å kun utelate nukleiner som ikke oppfyller kvalitetskriteriene. Tell antallet signaler med nukleær grense for hver evaluerte nukleus etter retningslinjene nedenfor (se også vedlegg 7). - Fokuser opp og ned for å finne alle signalene i den enkelte nukleus. - Tell to signaler som har samme størrelse og er atskilt med en avstand (som tilsvarer eller) er mindre enn diameteren på signalet som kun ett signal. Avstanden må være minst lik diameteren på et signal i normal størrelse for å telle som to individuelle signaler. Hvis avstanden mellom to signaler er mindre enn diameteren på et signal, må det telles som ett. - I nukleuser med høye nivåer av HER2-genamplifikasjon kan HER2-signalene være posisjonert svært nært hverandre og danne en signalgruppe. I disse tilfellene kan antallet HER2-signaler ikke telles, men må beregnes. Det må vies spesiell oppmerksomhet til de grønne signalene, siden grupper av røde HER2-signaler kan dekke over de grønne signalene, slik at det blir umulig å se dem. Hvis det er tvil, skal de grønne signalene kontrolleres ved bruk av et spesifikt FITC-filter. Ikke score nukleuser uten signaler eller med signaler med kun én farge. Score kun nuklein med ett eller flere FISH-signaler av hver farge. Signalopptellingsveiledning 1 Skal ikke telles. Nukleuser overlapper. Ikke alle nukleusområdene er synlige. 2 To grønne signaler, ikke score nuklein med signaler i kun én farge. 3 Tell som 3 grønne og 12 røde signaler (gruppeberegning). 4 Tell som 1 grønt og 1 rødt signal. To signaler som har samme størrelse og er atskilt med en avstand som tilsvarer eller er mindre enn diameteren på ett signal, telles som ett. 5 Ikke tell (over- eller underfordøyd nuklein). elle Manglende signaler i midten av nuklein r (smultringformet nuklein). 6 Tell som 2 grønne og 3 røde signaler. To signaler som har samme størrelse og er atskilt med en avstand som tilsvarer eller er mindre enn diameteren på ett signal, telles som ett. 7 Tell som 1 grønt og 5 røde signaler. 8 Tell som 3 grønne (1 grønt ute av fokus) og 3 røde signaler. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 41/58

42 Magekreft 9 Gruppe med røde signaler skjuler grønne signaler, kontroller de grønne signalene med et spesifikt FITCfilter, eller ikke tell. Registrer opptellingene i en tabell slik som vist i vedlegg 5 og 6. Tell 20 nuklein per vevsprøve, hvis mulig, fra tydelige tumorområder. Beregn HER2/CEN-17-forholdet ved å dele totalt antall røde HER2-signaler på totalt antall grønne CEN-17-signaler. Prøver med et HER2/CEN-17-forhold over eller lik 2 skal betraktes som HER2- genamplifisert (26). Resultater ved eller i nærheten av cut-off (1,8 2,2) skal tolkes med forsiktighet. Hvis forholdet ligger i grenseområdet (1,8 2,2), skal det telles ytterligere 40 nuklein, og kalkuler forholdet for 40 nuklein. Hvis opptellingen fortsetter å være på grensen, er resultatet for den andre evalueringen gyldig. Hvis tilgjengelig skal en immunohistokjemisk farging av HER2 inkluderes for bedre orientering under den andre opptellingen. I tvilstilfeller skal objektglassprøven scores på nytt. For grenseområdetilfeller er det nødvendig med en konsultasjon mellom patologen og den behandlende legen. Begrensninger - Gastrisk 1. FISH er en prosess i flere trinn som krever spesialisert opplæring i valg av egnede reagenser og vev, fiksering, prosessering, preparering av FISH-objektglasset samt tolking av fargeresultatene. 2. FISH-resultatene er avhengig av håndteringen og prosesseringen av vevet før det farges. Uriktig fiksering, vask, tørking, oppvarming, snitting eller kontaminasjon med annet vev eller væsker kan påvirke prøvehybridiseringen. Inkonsekvente resultater vil kunne være en konsekvens av variasjoner i fikserings- og innstøpingsmetoder, eller uregelmessigheter i vevet. 3. For optimale og reproduserbare resultater, må vevsobjektglassene avparafiniseres fullstendig. Parafinfjerningen må fullføres ved begynnelsen av fargeprosessen. (Se BRUKSANVISNING, avsnitt B.2.) 4. Det skal kun brukes temperaturkalibrert vannbad, varmeblokk og hybridiseringsovn. Bruk av andre typer utstyr kan føre til fordampning av HER2/CEN-17-prøveblandingen under hybridiseringen og må valideres av brukeren. Metodeegenskaper - Gastrisk Bakgrunn Sikkerheten og effektiviteten til trastuzumab (Herceptin ) har blitt demonstrert i en klinisk studie (ToGA-studien) (25). Undersøkelsen ble utformet som en åpent merket, randomisert, multisenter fase III studie med HER2-positive pasienter med inoperabel lokalt avansert, tilbakevendende og/eller metastatisk adenokarsinom i magen eller gastroøsofageal overgang. I ToGA-studien ble HER2-positiviteten definert som å være enten IHC-positiv (3+) (HercepTest, Dako) og/eller positiv via HER2 FISH (HER2/CEN-17 2,0)(HER2 FISH pharmdx Kit, Dako (kode K5331)). Etter opptak i studien ble pasientene randomisert til å motta kjemoterapi (5-FU eller capecitabine og cisplatin) eller kjemoterapi pluss trastuzumab. Det primære endepunktet i studien var helhetlig overlevelse (OS). I studien ble totalt 594 pasienter randomisert og 584 pasienter fikk studiemedisineringen og ble inkludert i det fullstendige analysesettet (FAS). For det primære endepunktet viste kombinasjonen av kjemoterapi pluss trastuzumab seg å være statistisk overlegen til kun ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 42/58

43 Magekreft kjemoterapi. Median OS økte fra 11,1 til 13,8 måneder (p=0,0046) med en et fareforhold på 0,74 (95 % CI: 0,60 0,91). Kaplan-Meier-kurver for OS vises i figur 3. Sannsynlighet for å overleve 1,0 0,9 0,8 0,7 Log-Rank Test P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 Tid (måneder) NEI. Venstre Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Behandlingsgruppe Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figur 3. Kaplan-Meier-kurve for OS (n=584). Forspesifiserte utforskende undergruppeanalyser ved HER2-status ble gjennomført med en gang data ble tilgjengelig, og i tillegg ble to nye HER2-undergrupper definert post hoc basert på IHC-scoring: Gruppe 1 ( lav HER2-uttrykksgruppe ): Gruppe 2 ( høy HER2-uttrykksgruppe ): IHC 0/FISH+ og IHC 1+/FISH+ (n=131) IHC 2+/FISH+ og IHC 3+ (FISH + eller FISH- eller FISH ikke noe resultat) (n=446) Når den primære analysen for OS ble gjentatt post hoc for høy HER2-uttrykksgruppe (n=446) var fordelen i favør av den kombinerte behandlingen enda større. Median OS for gruppen av pasienter som hadde mottatt kjemoterapi pluss trastuzumab økte til 16,0 måneder sammenlignet med 11,8 måneder for pasienter på kun kjemoterapi. Fareforholdet for denne analysen sank til 0,65 (95 % CI: 0,51 0,83). Kaplan-Meier-kurver for OS for høy HER2-uttrykksgruppe vises i figur 4. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 43/58

44 Magekreft Sannsynlighet for å overleve 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 Tid (måneder) NEI. Venstre Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Behandlingsgruppe Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figur 4. Kaplan-Meier-kurve for OS for høy HER2-uttrykksgruppe (n=446). BO18255-studien viste den kliniske nytten av både HercepTest og HER2 FISH pharmdx Kit for vurdering av HER2-status hos pasienter med inoperabel lokalt avansert, tilbakevendende og/eller metastatisk adenokarsinom i magen, eller den gastroøsofageale overgangen. Analytisk sensitivitet Den analytiske sensitiviteten til HER2/CEN-17 IQISH-prøveblandingen ble undersøkt ved bruk av 18 prøver for adenokarsinom fra magekreft. Forholdet mellom antall HER2- signaler og CEN-17-signaler ble kalkulert basert på en opptelling av 20 nuklein fra normale celler som omgir tumoren. HER2/CEN-17-forholdet for de 18 prøvene av gastrisk kreft, adenokarsinomprøver var mellom 0,95 og 1,06. Analytisk spesifisitet HER2 DNA-prøver i HER2/CEN-17 IQISH prøveblandingen har blitt sluttsekvensert og kartlagt for å bekrefte en total dekning på 218 kb inkludert HER2-genet. CEN-17 PNA-prøvene i HER2/CEN-17 IQISH-prøveblandingen har blitt testet enkeltvis og i kombinasjon for å bekrefte den spesifikke hybridiseringen til den centromeriske regionen på kromosom 17. For å måle analysens evne til å bare identifisere målstoffene HER2 og CEN-17 uten interferens fra andre stoffer, ble studier gjennomført på gastrisk kreft, adenomkarsinomprøver ved bruk av flaske 3 som inneholder hybridiseringsbufferen, men uten prøveblandingen. Totalt 18 prøver ble evaluert for tilstedeværelse av signaler som ikke er relatert til prøveblandingen. Ingen påvisning av andre kromosommål eller interferens med nært tilknyttede stoffer ble observert i noen av de 18 prøvene. Robusthetsstudier Robustheten til HER2 IQFISH pharmdx analysen ble testet ved å variere forbehandlingstiden, temperaturen og metodene for oppvarming av forbehandlingsbufferen (mikrobølgeovn eller vannbad), pepsininkuberingstid og metode ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 44/58

45 Magekreft (RTU pepsin eller neddykking), denatureringstemperatur og -tid, hybridiseringstid og stringensvasketid og temperatur. Ingen betydelig forskjell ble observert i resultatene ved følgende eksperimentelle betingelser: Forhåndsbehandlingsmetode A) Vannbad i 10 minutter kombinert med hver av temperaturene 95 C, C og 99 C sammen med 9, 10 og 11 minutter ved C. Forbehandlingsmetode B) Mikrobølgeovn i 9, 10 og 11 minutter ved > 95 C. Pepsinforbrenningsmetode A) med inkubasjonstider på 5, 10 og 15 minutter ved romtemperatur (20 25 C). Pepsinforbrenningsmetode B) med inkubasjonstider på 3, 4 og 5 minutter ved 37 C. Pepsinforbrenningsmetode C) med inkubasjonstider på 20, 25 og 30 minutter kombinert med hver av temperaturene 35, 37 og 39 C. Denaturering i 10 minutter kombinert med hver av temperaturene 65, 66 og 67 C sammen med 9, 10 og 11 minutter ved 66 C. Hybridiseringstid på 60, 90 og 120 timer ved 45 C. Stringensvask i 10 minutter kombinert med hver av temperaturene 61, 63 og 65 C sammen med 9, 10 og 11 minutter ved 63 C. Merk: For robusthetstestene ble kun en parameter i fargingsprosedyren endret om gangen, mens alle de andre parametrene ble holdt konstante. Det anbefales å oppfylle tiden og temperaturene som er indikert i fargingsprosedyren. Fargingsprosedyren for HER2 IQFISH pharmdx tilbyr protokollvariabler for varmeforbehandlingen, pepsinforbrenningen og hybridiseringstiden. Hvert unikt kombinasjonsalternativ har blitt validert med hensyn til HER2-genstatus. Valideringen ble utført på 10 FFPE-prøver av humant gastrisk og gastroøsofageal overgangsadenokarsinom for hver av de 12 mulige kombinasjonsalternativene. HER2 FISH pharmdx Kit (K5331) ble brukt som referanse. HER2/CEN-17-forholdet for hver enkelt prøve vises i figur 5. Krysstabuleringer mellom de 12 testene og referansefargingen viste helhetlig overensstemmelse i HER2-genstatus på 100 % (10/10) med nedre og øvre to-grenede 95 % sikkerhetsgrenser ved 78,3 % og 100 %, respektivt. Kappaverdien var 1,00 og McNemars test viste fravær av avvik (to-grenet p-verdi på 1,00). ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 45/58

46 Magekreft Figur 5. Individuelle HER2/CEN-17-forhold for 10 humane gastriske adenokarsinomprøver farget ved bruk av de 12 kombinasjonsvariasjonene som er mulige med HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731) (test 1-12) og HER2 FISH pharmdx Kit (kode K5331)-referanse (R). Den horisontale linjen illustrerer cut-off-verdien på 2,0. Reproduserbarhet Reproduserbarheten til HER2/CEN-17-forholdet ble undersøkt med HER2 IQFISH pharmdx analyse ved bruk av konsekutive seksjoner fra ni ulike gastriske adenokarsinomprøver med enten ikke-amplifisert eller amplifisert HER2-genstatus. Triplikate seksjoner av hver prøve ble testet i samme kjøring. Gjennomsnittlig variasjonskoeffisient var 3,5 % for ikke-amplifiserte prøver (område fra 1 % til 5 %) og 2,8 % for amplifiserte prøver (område 1 % til 5 %). Repeterbarhet på kontinuerlige seksjoner av gastriske adenokarsinomprøver med ulik tykkelse (2, 3, 4, 5, 6 og 7 µm) ble testet med HER2 IQFISH pharmdx. Gjennomsnittlig variasjonskoeffisient for HER2/CEN-17-forholdet var 4,5 % (område 3 % til 6 %), dvs. i det samme området som for vev med lik tykkelse og innenfor de forhåndsinnstilte godkjennelseskriteriene. Reproduserbarhet HER2 IQFISH pharmdx analysen ble testet for en reproduserbarhet fra lot-til-lot og observatør-til-observatør ved bruk av tre loter HER2 IQFISH pharmdx og tre observatører. Reproduserbarheten ble testet på ni ulike gastriske adenokarsinomprøver med enten ikke-amplifisert eller amplifisert HER2-genstatus. Gjennomsnittlig variasjonskoeffisient for lot-til-lot reproduserbarhet var 3,8 % for ikkeamplifiserte prøver (område fra 2 % til 7 %) og 1,8 % for amplifiserte prøver (område fra 1 % til 3 %). Gjennomsnittlig variasjonskoeffisient for observatør-til-observatør reproduserbarhet var 4,3 % for ikke-amplifiserte prøver (område fra 3 % til 5 %) og 4,4 % for amplifiserte prøver (område fra 2 % til 7 %). Gastriske adenokarsinomprøver besto av 78,8 % reseksjons- og 22,2 % biopsiprøver. 55,6 % av prøvene ble oppnådd fra mage og 44,4 % var fra den gastroøsofageale overgangen. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 46/58

47 Magekreft Klinisk nytte Den kliniske nytten av Dako HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731) ble undersøkt i en komparativ studie med Dako HER2 FISH pharmdx Kit (kode K5331). Studien inkluderte 79 gastriske kreftprøver som besto av ulike gastriske adenokarsinomvevtyper, dvs. adenokarsinomer fra mage eller gastroøsofageal overgang og reseksjoner eller biopsier med homogene eller heterogene (fokal eller mosaikk) signalfordeling. Tumorene hadde alle blitt evaluert for HER2-proteinuttrykksstatus ved bruk av Dako HercepTest (kode K5207). Prøver fra hver av de fire IHC-scoringsgruppene (0, 1+, 2+, 3+) ble inkludert i studien. Krysstabulering av HER2-status oppnådd ved de to analysene ga et helhetlig samsvar på 98,7 % med nedre og øvre grenser for 95 % sikkerhetsintervall ved 94,2 % og 99,9 %. Kappa-verdien var 0,97 med nedre og øvre grenser for 95 % sikkerhetsintervall ved 0,92 og 1,00. P-verdien for McNemars test var 1,00, noe som indikerte fravær av avvik mellom de to analysene. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 47/58

48 Magekreft Feilsøking - Gastrisk Problem Mulig årsak Foreslått løsning 1. Ingen eller svake signaler 1a. Settet har vært utsatt for høye temperaturer i løpet av transport eller lagring 1b. Mikroskopet fungerer ikke skikkelig - Feil filtersett - Feil lampe - Kvikksølvlampen for gammel - Skitne og/eller sprukne samlelinser - Uegnet neddykkingsolje 1a. Kontroller oppbevaringsbetingelser. Se til at tørris finnes når leveringen mottas. Se etter om flaske 3 har vært oppbevart ved -18 C i mørket. Se etter om flaske 2A og 5 har vært oppbevart ved maksimalt 2 8 C i mørket. 1b. Kontroller mikroskopet og se til at de brukte filtrene egner seg til bruk med settets fluorokromer og at kvikksølvlampen er riktig og at den ikke har blitt brukt lenger enn forventet levetid. (Se vedlegg 7.) I tvilstilfeller, ta kontakt med den lokale mikroskopleverandøren. 1c. Blekede signaler 1c. Unngå lang mikroskopisk undersøkelse og minimer eksponeringen for sterke lyskilder. 1d. Betingelsene for forbehandling var feil 1d. Sørg for å bruke anbefalt forbehandlingstemperatur og -tid 2. Ingen grønne signaler 1e. Fordampning av prøveblandingen under hybridiseringen 2a. Betingelsene for stringensvask var feil 1e. Sikre tilstrekkelig fuktighet i hybridiseringskammeret 2a. Sikre at anbefalt streng vasketemperatur og tid brukes, og at dekkglass fjernes før utføring av streng vask. 3. Ingen røde signaler 3a. Betingelsene for forbehandling var feil 3a. Sørg for å bruke anbefalt forbehandlingstemperatur og -tid 4. Områder uten signal 4a. Prøvevolum for lite 4a. Sikre at prøvevolumet er stort nok til å dekke området under dekkglasset 4b. Luftbobler fanget ved prøveblandingspåføring eller -montering 4b. Unngå luftbobler. Hvis disse oppdages, bank forsiktig på dem ved bruk av tang ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 48/58

49 Magekreft Problem Mulig årsak Foreslått løsning 5. Overflødig bakgrunnsfarging 5a. Feil vevsfiksering 5a. Se til at kun formalinfikserte, parafininnstøpte vevssnitt brukes 5b. Parafin ikke fullstendig fjernet 5b. Følg prosedyrene for avparafinering og rehydrering som er beskrevet i avsnitt B.2. 5c. Stringensvasketemp. for lav 5c. Se til at stringensvasketemp. er 63 (±2) C 6. Dårlig vevsmorfologi 5d. Forlenget eksponering av hybridisert snitt i sterkt lys 5d. Unngå lang mikroskopisk undersøkelse og minimer eksponeringen for sterke lys 6a. Feil pepsinbehandling 6a. Overhold de anbefalte pepsininkubasjonstidene. Se avsnitt B.3, trinn 2. Sørg for at pepsin håndteres ved riktig temperatur. Se avsnitt B Høyt nivå av grønn autofluorescens på objektglass, inkludert områder uten FFPE-vev 6b. Feil forbehandlingsbetingelser kan gi uklart eller tåkete utseende 6c. For lang pepsinbehandling eller svært tynn snittykkelse kan forårsake at skyggeceller eller smultringformede celler ( donut cells ) vises. 7. Bruk av utløpt eller ikke anbefalte objektglass i glass 6b. Sørg for å bruke anbefalt forbehandlingstemperatur og -tid 6c. Forkort pepsininkubasjonstiden. Se avsnitt B.3, trinn 2. Se til at snittykkelsen er 3 6 µm. 7. Se til at det belagte objektglasset i glass (Dako Silanized Slides, kode S3003, eller poly-llysin-belagte objektglass) ikke har utløpt utløpsdato. MERK: Dersom problemet ikke er noen av de nevnte tilfellene ovenfor, eller dersom den foreslåtte løsningen ikke utbedrer problemet, må du ringe Dakos tekniske avdeling for ytterligere hjelp. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 49/58

50 Magekreft Vedlegg 4 - Gastrisk HER2 IQFISH pharmdx, Code K5731 Protokollkontrolliste Dato for kjøringen: HER2 IQFISH pharmdx, K5731 Lot: Prøve-ID: Utstyrs-ID: Fargekjøringslogg-ID: Dato for fortynning/utløpsdato for 1 x Wash Buffer (flaske 6 fortynnet 1:20): / Vev fiksert i nøytralt bufret formalin Ja Nei Trinn 1: Forbehandling Dato for fortynning/utløpsdato for Pre-Treatment Solution (flaske 1 fortynnet 1:20) Målt temperatur på Pre-Treatment Solution (95 99 C ) hvis vannbad brukes til oppvarming Forbehandling (10 minutter) og nedkjøling (15 minutter) Vask i Wash Buffer (flaske 6 fortynnet 1:20) (2 x 3 minutter) Trinn 2: Pepsin Varighet på Pepsin-behandling (flaske 2) ved 37 C eller Varighet på Pepsin-behandling (flaske 2) ved romtemperatur eller Varighet på pepsinneddykking ved 37 (±2) C Vask i Wash Buffer (flaske 6 fortynnet 1:20) (2 x 3 minutter) Dehydrer objektglass (3 x 2 minutter) i gradert serie med etanol og lufttørk Trinn 3: HER2/CEN-17-prøveblanding Påfør prøveblanding (flaske 3), dekkglass og forsegle med dekkglassforsegling / C Minutter Minutter Minutter Målt denatureringstemperatur (66 (±1) C) C Denaturering i 10 minutter Målt hybridiseringstemperatur (45 (±2) C) C Hybridiseringstid (60 til 120 minutter) Trinn 4: Stringensvask Dato for fortynning/utløpsdato for stringensvaskebuffer (flaske 4 fortynnet 1:20) Minutter Målt temperatur på Stringent Wash Buffer (63 (±2) C) C Streng vask (10 minutter) etter fjerning av dekkglassene Vask i Wash Buffer (flaske 6 fortynnet 1:20) (2 x 3 minutter) C Dehydrer objektglass (3 x 2 minutter) i gradert serie med etanol og lufttørk / Minutter Trinn 5: Montering Påfør 15 µl av fluorescerende monteringsmedium (flaske 5) og dekkglass Kommentarer: ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 50/58

51 Magekreft Dato og signatur, tekniker: ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 51/58

52 Magekreft Vedlegg 5 - Gastrisk HER2 IQFISH pharmdx, Code K5731 Scoringsskjema HER2 IQFISH pharmdx, K5731 lot: Fargekjøringslogg-ID: Dato for kjøringen: Prøve-ID: Karakterisering av signaldistribusjon i vev: Homogent: Heterogent Fokal: eller Heterogent Mosaikk: Signaltelling i 20 nukleuser Nukleinnr. Rød Grønn (HER2) (CEN-17) Nukleinnr Sum 1-10 Sum Rød (HER2) Grønn (CEN-17) For bestemmelse av HER2/CEN-17-forhold, tell antallet HER2-signaler og antallet CEN- 17-signaler i de samme 20 nukleusene og del det totale antallet HER2-signaler med det totale antallet CEN-17-signaler. Hvis HER2/CEN-17-forholdet ligger i grenseområdet (1,8 2,2), skal det telles ytterligere 40 nuklein, og kalkuler forholdet på nytt (se nytellingsscoreskjemaet). Resultater ved eller i nærheten av cut-off (1,8 2,2) skal tolkes med forsiktighet (se opptellingsveiledningen). ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 52/58

53 Magekreft HER2 FISH HER2 CEN-17 HER2/CEN-17-forhold TOTAL SCORING (1-20) Forhold < 2: HER2-genamplifikasjon ble ikke observert Forhold 2: HER2-genamplifikasjon ble observert Dato og signatur, tekniker: Dato og signatur, patolog: For Retningslinjer for scoring: se Tolkning av farging. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 53/58

54 Magekreft Vedlegg 6 - Gastrisk HER2 IQFISH pharmdx, Code K5731 Nytellingsscoringsskjema HER2 IQFISH pharmdx, K5731 lot: Dato for kjøringen: Fargekjøringslogg-ID: Prøve-ID: Signaler i enda 40 nuklein (1-40) Nukleinnr. Rød HER2 Grønn CEN-17 Nukleinnr. Rød HER2 Grønn CEN-17 Nukleinnr. Rød HER2 Grønn CEN-17 Nukleinnr Sum Sum Sum Sum Rød HER2 Grønn CEN-17 For bestemmelse av HER2/CEN-17-forhold, tell antallet HER2-signaler og antallet CEN- 17-signaler i de samme 40 nukleusene og del det totale antallet HER2-signaler med det totale antallet CEN-17-signaler. Rapportert total scoring fra 1-40 nuklein i tabellen nedenfor. HER2 FISH HER2 CEN-17 HER2/CEN-17-forhold TOTAL SCORING (1-40) Forhold < 2: HER2-genamplifikasjon ble ikke observert Forhold 2: HER2-genamplifikasjon ble observert Dato og signatur, tekniker: Dato og signatur, patolog: For Retningslinjer for scoring: se Tolkning av farging. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 54/58

55 Magekreft Vedlegg 7 - Gastrisk HER2 IQFISH pharmdx, kode K5731 Fluorescerende mikroskopspesifikasjoner Dako anbefaler følgende utstyr for bruk med HER2 IQFISH pharmdx, K5731: 1. Mikroskoptype Epifluorescerende mikroskop. 2. Lampe 100 watt kvikksølvlampe (hold oversikten over brennetid). 3. Objektiver For skanning av vev brukes fluorescerende tørr 10X eller fluorescerende oljenedsenkning 16X objektiver. For høy strømforstørrelse og signalscoring anbefales kun fluorescerende oljeneddykkingsobjektiver, f.eks. 100X. 4. Filtre Filtrene er utformet enkeltvis for spesifikke fluorokromer og skal velges deretter. Dako anbefaler bruk av et spesifikt DAPI-filter i kombinasjon med et høykvalitets Texas Red/FITC-dobbeltfilter. DAPI-filter, f.eks. Chroma-filter nr Texas Red/FITC dobbeltfilter, f.eks. Chroma-filter nr Texas Red og FITC enkeltfiltre kan brukes for bekreftelse. Fluorokrom Magnetiseringsbølgelengde Utslippsbølgelengde FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filtre er spesifikke for hver mikroskoptype, og bruken av egnede filtre er avgjørende for tolkningen. Hvis du ønsker detaljert informasjon, vennligst ta kontakt med din mikroskopleverandør eller Dako-representant. 5. Olje Ikke-fluorescerende olje. Forholdsregler En 50 watts kvikksølvlampe anbefales ikke. Rodaminfiltre kan ikke brukes. Trippelfiltre anbefales ikke. Et ikke-optimert mikroskop kan forårsake problemer ved lesing av de fluorescerende signalene. Det er viktig at lyskilden ikke har utgått og at den er riktig innrettet og fokusert. Kunder skal overvåke og følge produsentens anbefalinger for kvikksølvlampen. Mikroskopet skal opprettholdes, og kvikksølvlampen skal være justert før tolkning av resultatene. Det skal gjøres en innsats for å utsette prøven for så lite magnetiseringslys som mulig for å kunne minimere blekningen av det fluorescerende lyset. Vi anbefaler at du diskuterer oppsettet av det bestemte mikroskopet med produsenten før den fluorescerende in situ-hybridiseringen startes, eller se litteraturen. ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 55/58

56 Referanser 1. Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet 1997;76(1-2): Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985;230(4730): King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985;229(4717): Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol 1999;9(4): Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, Thor A, Chen LC, Smith HS, et al. ERBB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A 1992;89(12): Persons DL, Bui MM, Lowery MC, Mark HF, Yung JF, Birkmeier JM, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of HER-2/neu amplification in breast cancer: a multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci 2000;30(1): Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 1987;235(4785): Rennstam K, Baldetorp B, Kytola S, Tanner M, Isola J. Chromosomal rearrangements and oncogene amplification precede aneuploidization in the genetic evolution of breast cancer. Cancer Res 2001;61(3): Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, Clark GM, Ferno M, Fuqua SA, et al. HER-2/neu amplification predicts poor survival in node-positive breast cancer. Cancer Res 1990;50(14): Nichols DW, Wolff DJ, Self S, Metcalf JS, Jacobs D, Kneuper-Hall R, et al. A testing algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer. Ann Clin Lab Sci 2002;32(1): Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol 2003;16(2): Nielsen PE, Egholm M, editors. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Norfolk NR18 0EH, England: Horizon Scientific Press Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of laboratory workers from instrument biohazards and infectious disease transmitted by blood, body fluids, and tissue; Approved guideline. NCCLS document M29-A. 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA: NCCLS Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, FR 7163, February Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER- 2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer 2001;92(12): Ellis IO, Dowsett M, Bartlett J, Walker R, Cooke T, Gullick W, et al. Recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol 2000;53(12): Hanna W. Testing for HER2 status. Oncology 2001;61 Suppl 2: Jorgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010;78(1): Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mori K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007;59(6): Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh do Y, Im SA, Lee D, et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008;32(1): ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 56/58

57 23. Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005;27(3): Tanner M, Hollmen M, Junttila TT, Kapanen AI, Tommola S, Soini Y, et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16(2): Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A, et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet 2010; 376(9742): Hofmann M, Stoss O, Shi D, Buttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology 2008;52(7): ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 57/58

58 Forklaring av symboler Katalognummer Temperaturbegrensning Lotnummer Skadelig In vitro diagnostisk medisinsk utstyr Skal ikke oppbevares i sollys (se avsnittet om oppbevaring) Brukes innen Ekstremt antennelig Se bruksanvisningen Inneholder tilstrekkelig Produsent Farlig for miljøet Produsert av: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Danmark Tlf Faks ( ) P01499NO_002_K /LMA/ s. 58/58