PNA ISH Detection Kit

Transkript

1 PNA ISH Detection Kit Kode nr. K utgave Til in situ-hybridisering ved bruk av fluorescein-konjugerte PNA-prøver. Settet inneholder reagenser til minst 40 tester*. * Antall tester basert på bruk av 25 µl av prøver og 150 µl av andre reagenser per objektglass. ( ) P04101NO_01_K / s. 1/9

2 Innhold Side Tiltenkt bruk...3 Prosedyreprinsipp...3 Reagenser A. Utstyr i denne pakken...3 B. Materialer som er nødvendige, men som ikke medfølger...4 C. Klargjøre reagenser...4 Forholdsregler...5 Oppbevaring...7 Endags in situ-hybridiseringsprosedyre for RNA-deteksjon ved bruk av PNA-prøver Rehydrering...8 Forhåndsbehandling...8 Hybridisering...8 Stringent Wash Solution...8 Deteksjon...8 Kontrastfarging og montering...8 Prosedyremerknader... 9 Symbolforklaring... 9 ( ) P04101NO_01_K / s. 2/9

3 Tiltenkt bruk Til in vitro-diagnostisk bruk. PNA ISH Detection Kit er ment for påvisning av fluorescein-konjugert peptidnukleinsyre (PNA)-prøver som hybridiseres til mål-rna i celle- eller vevspreparater. Prosedyreprinsipp Dette settet gir brukeren alle reagensene som er nødvendige til å utføre en in situ- hybridisering for å påvise cellulær RNA, unntatt for den spesifikke fluorescein-konjugerte PNA-prøven. På et vevssnitt eller celleutstryk (gitt av brukeren) hybridiseres en fluorescein-konjugert peptidnukleinsyre (PNA)-prøve til sitt RNA-mål etter den prosedyren som er gitt nedenfor. Hybridiseringen følges av en post-hybridiseringsvask med en Stringent Wash Solution ved 55 C i 25 minutter. Alkalisk fosfatase-konjugert F(ab ) Anti-FITC fra kanin tilføres, og prøven inkuberes ved romtemperatur i ca. 30 minutter fulgt av en vask. Bruken av antistoffets F(ab )-fragment sikrer at ikke-spesifikk binding til prøven holdes ved et minimum. Substrat (enzymsubstrat, BCIP/NBT) tilføres og prøven inkuberes ved romtemperatur i minutter, etterfulgt av en vask. En lett kontrastfarging med hematoksylin er frivillig. Tilslutt monteres prøven. Positiv farging gjenkjennes under mikroskopet som en mørk blå/svart farge ved hybridiseringspunktet. Reagenser A. Utstyr i denne pakken Flaske 1 (2 ml) Flaske 2 (0,5 ml) Flaske 3 (0,5 ml) Flaske 4 (25 ml) Proteinase K (x 10) 10 x konsentrert proteinase K i 50 mmol/l Tris/HCl, 15 mmol/l natriumazide, ph 7,5. Siden proteinase K er selvnedbrytende, er det viktig å lagre flaske 1 ved 2 8 C. Negative Control PNA Probe/FITC (bruksklar) Fluorescein-konjugerte vilkårlige PNA-prøver i hybridiseringsløsning. Inneholder 30 % formamid. Positive Control PNA Probe/FITC (bruksklar) Fluorescein-konjugert PNA-prøve rettet mot glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenase i hybridiseringsløsning. Inneholder 30 % formamid. Stringent Wash Solution (x 60) 60 x konsentrert Stringent Wash Solution. Flaske 5 (6 ml) ( ) P04101NO_01_K / s. 3/9

4 Anti-FITC/AP (bruksklar) Alkalisk fosfatase-konjugert antistoff for fluorescein (affinitets-isolert kanin F(ab )) i 50 mmol/l Tris buffer, 5 mmol/l MgCl 2, 0,25 mmol/l ZnCl 2, 3 % BSA, stabilisator, konserveringsmiddel, ph 7,5. Flaske 6 (6 ml) Substrate (bruksklar) 5-bromo-4-kloro-3-indolylfosfat (BCIP) og nitroblå tetrazolium (NBT) i 100 mmol/l Tris, 100 mmol/l NaCl, 50 mmol/l MgCl 2, konserveringsmiddel, ph 9,0. Inneholder 1,7 % N,N-dimetylformamid. TBS (Tris-Buffered Saline, ph 7,5) 3 foliepakninger hver for 1 l buffer, ph 7,5. Hver pakning inneholder Tris-Base 1,4 g ±4 %, Tris/HCl 6,0 g ±4 %, 8,75 g NaCl ±4 %. Løs opp innholdet i hver foliepakning i 1 l rent vann. B. Materialer som er nødvendige, men som ikke medfølger 1. Generelt laboratorieutstyr for histologiske prosedyrer. 2. Utstyr og spesifikk fluorescein-konjugert PNA-prøve som er nødvendig for hybridiseringstrinnet. 3. Vannbad justert til 55 C. Risteevne er nødvend ig for strengvasken. 4. Dako Silanized Slides, kodenr. S Dako Pen, kode nr. S2002 (ekstrautstyr). 6. Rent vann (f.eks. Milli-Q vann eller destillert vann). 7. Monteringsmedium, Dako Faramount, kode nr. S3025 eller Dako Glycergel, kode nr. C0563. C. Klargjøre reagenser TBS Buffer Løs opp innholdet til én TBS foliepakning i 1l rent vann. Stringent Wash Solution (arbeidsløsning) Fortynn nødvendig mengde Stringent Wash Solution, flaske 4, 60 ganger i rent vann og forhåndsoppvarm til 55 C i vannbad. Proteinase K (arbeidsløsning) Rett før bruk fortynnes nødvendig mengde Proteinase K, flaske 1, 1:10 i TBS. Straks etter bruk returneres flaske 1 til 2 8 C. (Se prosedyremerknader, 3). ( ) P04101NO_01_K / s. 4/9

5 Forholdsregler 1. For profesjonelle brukere. 2. Flaske 2 og 3, Positive og Negative Control PNA Probes, inneholder 25-<50% formamid og 1-<3% natriumklorid. Flaske 2 og 3 er merket: Fare H319 H360 P201 P202 P281 P280 P264 P308 + P313 P305 + P351 + P338 P337 + P313 P405 P501 Gir alvorlig øyeirritasjon. Kan gi fosterskader. Innhent særskilt instruks før bruk. Skal ikke håndteres før alle advarsler er lest og oppfattet. Bruk påkrevd personlig verneutstyr. Bruk vernehansker. Bruk vernebriller eller ansiktsvern. Bruk verneklær. Vask hendene grundig etter håndtering. Ved eksponering eller mistanke om eksponering: Søk legehjelp. VED KONTAKT MED ØYNENE: Skyll forsiktig med vann i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser dersom dette enkelt lar seg gjøre. Fortsett skyllingen. Hvis øyenirritasjon vedvarer: Søk råd/oppmerksomhet fra lege Oppbevares innelåst. Disponer innholdet og emballasje i henhold til lokale, regionale, nasjonale og internasjonale forskrifter. 3. Flaske 6, Substratet, inneholder 1-<3% N,N-dimetylformamid og 1-<3% trometamol. Flaske 6 er merket: H360 H373 P201 P202 P280 Fare P260 P314 P308 + P313 P405 P501 Kan gi fosterskader. Kan forårsake organskader ved langvarig eller gjentatt eksponering. Innhent særskilt instruks før bruk. Skal ikke håndteres før alle advarsler er lest og oppfattet. Bruk vernehansker. Bruk vernebriller eller ansiktsvern. Bruk verneklær. Ikke innånd damp. Søk legehjelp ved ubehag. Ved eksponering eller mistanke om eksponering: Søk legehjelp. Oppbevares innelåst. Disponer innholdet og emballasje i henhold til lokale, regionale, nasjonale og internasjonale forskrifter. 4. Foliepakninger av TBS (Tris-Buffered-Saline, ph 7,5) inneholder 25-<50% trometamol og 25-<50% 2-amino-2-(hydroksymetyl) propan-1,3-diol hydroklorid. Foliepakninger av TBS er merket: Advarsel ( ) P04101NO_01_K / s. 5/9

6 H319 H315 H335 P280 P271 P261 P264 P304 + P340 + P312 P302 + P352 + P P363 P337 + P313 P405 P501 Gir alvorlig øyeirritasjon. Irriterer huden. Kan forårsake irritasjon av luftveiene. Bruk vernehansker. Bruk vernebriller eller ansiktsvern. Brukes bare utendørs eller i et godt ventilert område. Unngå innånding av støv. Vask hendene grundig etter håndtering. VED INNÅNDING: Flytt personen til frisk luft og sørg for at vedkommende har en stilling som letter åndedrettet. Kontakt et GIFTINFORMASJONSSENTER eller lege ved ubehag. VED HUDKONTAKT: Vask med mye vann. Tilsølte klær må fjernes. Tilsølte klær må vaskes før de brukes på nytt. Ved vedvarende øyeirritasjon: Søk legehjelp. Oppbevares innelåst. Disponer innholdet og emballasje i henhold til lokale, regionale, nasjonale og internasjonale forskrifter. 5. Flaske 4, Stringent Wash Solution, inneholder 3,6 % Trometamol. Ved ulike produktkonsentrasjoner krever ikke Trometamol faremerking. Databladet for materialsikkerhet (MSDS) er tilgjengelige for profesjonelle brukere på forespørsel. 6. Flaskene 1 og 5, Proteinase K og Anti-FITC/AP, inneholder natriumazid som konserveringsmiddel. Natriumazid (NaN 3 ) er en kjemikalie som er svært giftig i ren form. Selv om produktkonsentrasjonene ikke klassifiseres som farlige ved, kan natriumazid reagere med bly- og kopperrør og danne høyeksplosive avleiringer av metallazider. Ved avfallsbehandling, skyll rikelig med vann for å forhindre ansamling av metallazid i rørene. 7. Flaske 5, Anti-FITC/AP inneholder materialer med dyreopprinnelse. Riktig håndteringsprosedyrer bør brukes i likhet med alle andre produkter derivert fra biologiske kilder. ( ) P04101NO_01_K / s. 6/9

7 Oppbevaring Reagensene i settet bør lagres ved 2 8 C. Flaskene 2 og 3 skal lagres mørkt. Skal ikke benyttes etter utløpsdato som er stemplet på flasken. Hvis reagensene oppbevares under andre forhold enn de som er spesifisert, må forholdene verifiseres av brukeren. Det er ingen tydelige tegn som indikerer at dette produktet er ustabilt. Positive og negative kontroller bør derfor kjøres samtidig med pasientprøver. Hvis det observeres uventet farging som ikke kan forklares med variasjoner i laboratorieprosedyrer, og det er mistanke om at det er et problem med produktet, ta kontakt med vår tekniske avdeling. Siden proteinase K er selvnedbrytende, er det viktig å lagre flaske 1 ved 2 8 C og å minimere eksponeringen til romtemperatur. Endags in situ-hybridiseringsprosedyre for RNA-deteksjon ved bruk av PNA-prøver Prosedyren har blitt utviklet for formalinfikserte, parafininnstøpte vevssnitt. Reagenser inkludert i dette settet, samt hybridiserings- og vaskeforhold, har blitt justert for å gi optimale resultater ved bruk av Dako fluorescein-konjugerte PNA-prøver. En positiv vevskontroll skal kjøres samtidig med prøvene. MERK: Alle inkubasjoner er ved romtemperatur hvor annet ikke er oppgitt. ( ) P04101NO_01_K / s. 7/9

8 Rehydrering Forhåndsbehandling Hybridisering Stringent Wash Deteksjon Kontrastfarging og montering Neddykk objektglassene med vevssnittene i xylen. Neddykk i 99 % etanol. Neddykk i 96 % etanol. Karet må være RNase-fritt (se prosedyremerknader, 1). Sirkle inn prøven med Dako Pen, kodenr. S2002. Neddykk i rent vann. Plasser objektglassene i et fuktighetskammer (bruk rene hansker). Rett før bruk fortynnes nødvendig mengde med Proteinase K, flaske nr. 1, 1:10 i TBS, f.eks. ved bruk av 11 dråper fra flaske nr. 1 (eller 500 µl) i 4,5 ml TBS (se prosedyremerknader, 2). Tilfør 150 µl fortynnet Proteinase K til hvert snitt (se prosedyremerknader, 3). Straks etter bruk, returnes flaske 1 til 2 8 C. Inkuber. Neddykk objektglassene i rent vann. Neddykk objektglassene i 96 % etanol. Lufttørk objektglassene Tilfør 1-2 dråper med fluorescein-konjugert PNA-prøve til vevssnittet. Legg til kontrollprøver på separate snitt, flaskenr. 2 og 3. Dekk til snittene med dekkglass. Plasser objektglassene i et fuktighetskammer (for å unngå uttørking av snittene). Plasser fuktighetskammeret i en inkubator (se prosedyremerknader, 4). Forhåndsoppvarm Stringent Wash Solution (flaskenr. 4 fortynnet 1:60) til 55 C i vannbad. Fjern dekkglassene. Neddykk objektglassene i forhåndsoppvarmet Stringent Wash Solution. Tilpass objektglassene til romtemperatur gjennom en hurtig neddykking i TBS. Plasser objektglassene i et fuktighetskammer. Tilfør 2 3 dråper av Anti-FITC/AP, flaskenr. 5, til hvert snitt. Inkuber. Bank forsiktig bort antistoffet. Neddykk objektglassene i TBS. Neddykk objektglassene i rent vann. Plasser objektglassene i et fuktighetskammer. Tilfør 2 5 dråper substrat, flaske 6 til hvert snitt (se prosedyremerknader, 5). Inkuber. Bank forsiktig bort Substrate. Neddykk objektglassene i vann fra springen. Kontrastfarging med hematoksylin hvis det er ønskelig. Monter i Dako Faramount, kodenr. S3025 eller Glycergel, kodenr. C x 5 min. 3 min min. ~ 10 s ~ 5 min. 1½ t ved 55 C 25 min. ved 55 C med risting 10 s 30 min. 2 x 1 min min. 5 min s ( ) P04101NO_01_K / s. 8/9

9 Prosedyremerknader 1. Fra dette punktet i prosedyren og inntil hybridiseringen er utført, er det viktig å unngå forurensning av snittene med RNaser, og objektglassene skal kun berøres med rene engangshansker. Glasstøy kan gjøres Rnase-fri ved inkubasjon over natten ved 200 C. Andre metoder for inaktivering av RNase i løsninger beskrives i Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (se også under Forholdsregler). 2. Løs opp innholdet til én TBS foliepakning i 1 L rent vann (RNase-fritt). 3. Siden proteinase K er selvnedbrytende, er det viktig å lagre flaske 1 ved 2 8 C og å minimere eksponeringen til romtemperatur. Optimal proteolytisk fordøyelse kan variere mellom de ulike vevsblokkene. For frosne snitt og cytospin skal Proteinase K fortynnes mer enn 1:10; som retningslinje fortynn 1:100 1:1000, avhengig av fikseringen. 4. Vi finner at en inkuberingstid på 1½ time gir optimal følsomhet, men tilfredsstillende resultater kan likevel oppnås ved å redusere inkubasjonstiden til min., avhengig av mengden mål som er tilstede i prøven. 5. Vi finner at Substrate (BCIP/NBT), som er inkludert i PNA ISH Detection Kit, gir høyeste sensitivitet, men også Dako New Fuchsin (kodenr. K0625) gir svært tilfredsstillende resultater. 6. Ikke rist flaske 6 før bruk. Substratet danner av og til et presipitat som kan påvirke fargingsresultatene hvis løsningen ristes. Symbolforklaring Katalognu mmer Temp eraturbegrensn ing Lotnummer Produsen t In vitro diagnostisk medisinsk utstyr Skal ikke oppb evares i sollys (se avsnittet om oppbeva ring) Tilsett vann GHS-faresymbol (se a vsnittet om forholdsre gler) Se bruksa nvisningen In neh older tilstrekkelig fo r <n> tester Bruke s innen GHS-faresymbol (se a vsnittet om forholdsre gler) Produsert av: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Danmark Tlf Faks ( ) P04101NO_01_K / s. 9/9