Helse. Nye sjukdommer Fra fenomen til problem Virulensmekanismer Immunsystemet hos fisk

Transkript

1 Helse Nye sjukdommer Fra fenomen til problem Virulensmekanismer Immunsystemet hos fisk

2 Atle Lillehaug 1), Aud Skrudland 2) 1) Veterinærinstituttet, 2) Mattilsynet Nye sjukdommer Fra fenomen til problem «Svinn» i fiskeoppdrett omfatter dødelighet, rømming, predasjon, utkast slakteri, samt annen uregistrert avgang av fisk, og svinnet representerer et betydelig økonomisk tap. Svinnet har de siste 15 årene vært på et nokså stabilt nivå. Man kan anta at en vesentlig årsak hos laksefisk skyldes «nye» sjukdommer som pankreassjukdom (PD), hjerte- og skjelettmuskelbetennelse (HSMB), cardiomyopatisyndrom (CMS), epiteliocystis/proliferativ gjellebetennelse (PGI) og sjukdom forårsaket av Parvicapsula pseudobranchiola. Ved oppdrett av marin fisk har bakterier som Vibrio anguillarum og Aeromonas salmonicida vist seg å skape problemer, det samme gjelder infeksjoner med nodavirus. Parasitter som «skottelusa» (Caligus elongatus) og andre lus (Caligus curtus, Argulus sp.), samt parasitter som omfatter gjellemark, flagellater, ciliater, mikrosporidier og nematoder, og ulike gyrodactylusarter, kan vise seg å gi problemer for slik virksomhet. 148 Havbruksforskning: Fra merd til mat

3 Mål for helsesituasjon Helsesituasjonen i Norsk oppdrettsnæring har blitt oppfattet som vesentlig bedre de siste årene enn situasjonen var på slutten av 80- og begynnelsen av 90-tallet. Som dokumentasjon på at helsesituasjonen har forbedret seg, har forbruket av antibakterielle midler til fisk og antall utbrudd av ILA blitt brukt som mål. Dersom vi bruker svinn av fisk som mål, viser data fra Kontali Analyse AS at svinnet, etter en betydelig nedgang på begynnelsen av 90-tallet, har vært konstant eller svakt stigende, som vist i figur 1. En vesentlig del av offentlige og private forskningsmidler har de siste årene blitt brukt innen fagområdet fiskehelse eller områder som er tett knyttet til dette. Dette har ikke gitt seg utslag i redusert svinn. Det foreligger ikke egnet statistikk over årsakene til dette svinnet. Selskapsstrukturen innen oppdretts- og fiskehelseselskaper kan føre til liten åpenhet omkring årsaker til tap, og redsel for markedsreaksjoner gjør at helseproblemer ikke blir omtalt på samme måte som tidligere. Enkelte sjukdommer er meldepliktige i henhold til Matloven, og utbrudd registreres dersom det pålegges restriksjoner. Omfanget av tap under slike utbrudd blir ikke registrert. Det er ingen opplysningsplikt for andre sjukdommer som loven ikke gjelder for. Fra fenomen til problem Man kan anta at den vesentligste årsak til svinnet skyldes «nye» sjukdommer som CMS, HSMB, PD etc. Dette er tilstander som ser ut til å ha fått økt betydning de seinere år, som har utviklet seg «fra fenomen til problem», og som derfor blir behandlet spesielt i dette kapitlet. I prinsippet har de aller fleste infeksjonssjukdommer som manifesterer seg under oppdrettsbetingelser, utviklet seg fra å være sjeldnere fenomener hos villfisk, i første rekke de viktige bakterieinfeksjonene vibriose og furunkulose. Vi har også fått «nye» sjukdommer som først er beskrevet under oppdrettsbetingelser, og som ikke har vært kjent hos villfisk, slik som kaldtvannsvibriose, IPN og ILA. Disse har også, et- 145x100//Kap09-fig01.eps Figur 1. Figuren viser utvikling av beregnet svinn per generasjon atlantisk laks fra 86G til 03G i perioden Tallene er presentert i prosentvis svinn av antall utsatt smolt. 92G er et uttrykk for fisk satt i sjøen for kalenderåret 1992, minus antallet fisk som er slaktet av generasjonen de påfølgende år. Svinn inkluderer dødelighet, rømming, predasjon, utkast slakteri, samt annet uregistrert svinn. Tema: Helse 149

4 ter overveiende sannsynlighet, sitt naturlige reservoar hos villfisk eller andre viltlevende organismer. I oppdrett samles et stort antall individer i et begrenset vannvolum, og forholdene blir tilrettelagt for smitteoppblomstring og smitteoverføring. De ovennevnte sjukdommene, som etter hvert er godt beskrevet, blir ikke nærmere omhandlet i dette kapitlet. Vibrioinfeksjonene og furunkulose hos laksefisk er under effektiv kontroll ved bruk av vaksiner, og som en følge av det har antibiotikaforbruket i norsk fiskeoppdrett vært lågt i mange år. Imidlertid ser det nå ut til å være en økning i antallet foreskrivninger av antibiotika, og de er i første rekke knyttet til oppdrett av torsk i yngelfasen. Vi ser følgelig her at nye infeksjoner eller nye varianter av velkjente infeksjoner, kan være i ferd med å utvikle seg «fra fenomen til problem». Pankreassjukdom (PD) Pankreassjukdom er en virussjukdom som første gang ble beskrevet i Skottland i 1976 av Munro et al. PD er seinere rapportert fra Nord- Amerika, og i Irland har sjukdommen hatt spesielt stor betydning. I Norge har PD vært til stede siden siste halvdel av 80-tallet, med utbredelse i Hordaland og sørlige deler av Sogn og 145x100//Kap09-fig02.eps Figur 2. Laks som er angrepet av pankreassjukdom, men som ikke dør, vil ha redusert tilvekst og dårlig slaktekvalitet. De to fiskene er av samme utsett. (Foto: T.T. Poppe) Fjordane. PD er i dag trolig en av de aller mest tapsbringende sjukdommene ved oppdrett av laksefisk på Vestlandet. I 2003 ble det rapportert utbrudd også i Troms og Finnmark, sannsynligvis som følge av spredning fra Vestlandet med smolt. Fra 2002 til 2005 har antall lokaliteter med utbrudd økt fra 12 til 35, i 2004 var det utbrudd på 44 lokaliteter, og dette året spredde sjukdommen seg også til Nordland og Rogaland. Pankreassjukdom angriper både laks og regnbueørret i sjøvannsoppdrett, og typisk opptrer utbrudd et halvt år eller mer etter utsetting. Forløpet er gjerne kronisk, med nedsatt appetitt og låg dødelighet, men over lang tid kan den samlede dødeligheten bli høg, og det er rapportert om tap av flere hundre tonn fisk på enkeltlokaliteter. I tillegg vil angrepet fisk som ikke dør, ha redusert tilvekst, og fisk som slaktes etter utbrudd, kan ha dårlig slaktekvalitet pga. muskelskader. Sjukdommen utvikler seg ved at virus først gir opphav til nekroser i bukspyttkjertelen (pankreas), noe som har gitt navn til tilstanden. I neste omgang oppstår skader i hjertemuskel, og seinere også i skjelettmuskulatur. I norske utbrudd er det også påvist forandringer i nyre og milt seint i forløpet. Ved undersøkelser med tanke på PD er det viktig å velge ut fisk med kliniske symptomer. Obduksjon kan vise slimet tarminnhold pga. manglende næringsopptak, og tegn på sirkulasjonsforstyrrelser som ødem i skjellommer, utstående øyne og væske i bukhulen. Småblødninger i fettvevet rundt pankreas kan også finnes. Typiske, akutte skader i pankreas ses ved histologi helst tidlig i forløpet, og da kan man også få positiv immunhistokjemi for PD-virus. Seinere finnes betennelsesreaksjoner og skader først i hjerte-, og seinere i skjelettmuskulatur. 150 Havbruksforskning: Fra merd til mat

5 Det har vært vanskelig å isolere PD-virus i cellekultur, men det er gjort forbedringer av metoden. Virus kan også påvises med PCR. Ved diagnostikk av pankreassjukdom har også påvisning av antistoffer mot virus i blodet hos fisk en sentral plass. Slike undersøkelser kan først benyttes ei tid ut i forløpet av sjukdommen, men antistoffene kan finnes i lang tid etter smitte, og kan benyttes i ettertid for å klarlegge om fisk i et anlegg har hatt infeksjon med PD-virus. Årsakssammenhenger Det er beskrevet tre forskjellige, men nært beslektede PD-virus. I tillegg til «salmon pancreas disease virus» (SPDV), som gir opphav til PD på laks i Skottland og Irland, er det beskrevet en egen norsk variant som kalles salmonid alphavirus (NSAV), og som da gir sjukdom både på laks og regnbueørret. Det er også påvist en tredje variant av viruset som gir «sleeping disease» på regnbueørret i ferskvann i Europa. Det er foreslått å samle disse tre variantene under speciesnavnet «Salmonid alphavirus». Det er erfaringer for at PD-smitte er knyttet til lokaliteten, ved at det gjerne kommer nye utbrudd når det settes ut fisk på lokaliteter der det tidligere har vært PD. Smitte til nye områder antas særlig å skje ved at det skjer flytting av smittet fisk. En vaksine er under utprøving mot pankreassjuke. Aktuelle forskningstemaer Studier som har bidratt til å framskaffe ny kunnskap om PD, herunder utvikle diagnostisk metodikk, har foregått i samarbeid mellom forskningsinstitusjoner i Norge, Irland og Skottland. Dette samarbeidet fortsetter i nye prosjekter som har som mål å studere utbredelsen av de aktuelle virusvariantene, å kartlegge risikofaktorer som disponerer for smitte med PD-virus og for utbrudd av sjukdommen, samt å karakterisere virusisolater og validere diagnostiske metoder. Hjerte- og skjelettmuskelbetennelse (HSMB) HSMB ble første gang oppdaget ved rutinediagnostikk av sjuk oppdrettslaks i 1999, og siden har sjukdommen blitt et økende problem for norsk oppdrettsnæring. De fleste utbruddene opptrer i Midt-Norge, men HSMB registreres årlig langs det meste av kysten. Det er foreløpig ikke bekreftet tilfeller utenfor Norge, men det har vært mistanke om HSMB-utbrudd i Skottland. 145x100//Kap09-fig03.eps Figur 3. Fisk som er angrepet av hjerte- og skjelettmuskelbetennelse. Hjertet er tydelig bleikere enn normalt. (Foto: T. Taksdal) Tema: Helse 151

6 145x100//Kap09-fig04.eps Figur 4. Til venstre vises et histologisk bilde av normal rød skjelettmuskulatur, og til høgre er det snitt av muskulatur fra laks med hjerte- og skjelettmuskelbetennelse. Ved denne sjukdommen blir den røde skjelettmuskulaturen infiltrert av betennelsesceller, og mange muskelceller skrumper inn og dør. (Foto: R.T. Kongtorp) HSMB rammer atlantisk laks i sjøvannsfasen. Utbrudd opptrer som regel mellom fem og ni måneder etter sjøutsett, og fisken veier vanligvis under 1,5 kg. Resultater fra feltundersøkelser og smitteforsøk indikerer at nær 100 prosent av fisken på affiserte lokaliteter kan ha sjukdommen, til tross for at ikke alle viser symptomer. Ved HSMB-utbrudd observerer man svimere og økt dødelighet i én til seks måneder. Dødeligheten er varierende, fra nesten ubetydelig og opp mot 20 prosent i enkeltmerder. Det ser ut til at stress i anlegget kan gi økt dødelighet. Resultater fra et studium av sjukdomsforløpet indikerer at HSMB kan starte som en subklinisk betennelse i hjertet flere måneder før dødeligheten begynner å øke på lokaliteten, og at hjerteskadene vedvarer i lang tid etter at dødeligheten er tilbake på et normalnivå. Diagnosen stilles på grunnlag av kliniske tegn, som forhøyet dødelighet og et økt antall «svimere», sammen med obduksjonsfunn og histopatologi. Typiske obduksjonsfunn er koagel i hjertesekken, blekt og slapt hjerte, væske i bukhulen, gulaktig eller spettet lever med fibrinslør over kapselen, småblødninger i fettvevet, samt svullen milt. Histologisk kjennetegnes HSMB ved alvorlig betennelse og celledød (nekrose) i hjertet og den røde skjelettmuskulaturen. I hjertekammeret er alle lag involvert. Det er vanligvis en uttalt infiltrasjon av betennelsesceller i epikardiet (hjertehinnen), samt betennelse og nekrose i både kompakt og spongiøst muskellag. Som regel er det mindre skader i forkammeret, og i bulbus arteriosus (pæreformet utvidelse av første del av aorta, hovedsakelig elastisk vev) er det ikke observert betennelse i forbindelse med HSMB. Det er også betennelsesreaksjoner og nekroser i rød skjelettmuskulatur, men hvit skjelettmuskulatur er sjelden affisert. I leveren kan det være nekroser, noe som antas å oppstå sekundært som følge av sirkulasjonsforstyrrelser. En del individer har dessuten ødematøse drag i miltvevet, og i de øvrige organene kan det også være varierende grad av sirkulasjonsforstyrrelser. 152 Havbruksforskning: Fra merd til mat

7 Årsakssammenhenger Smitteforsøk har vist at sjukdommen er overførbar både ved intraperitoneal injeksjon av hjertevev fra sjuk fisk, og ved kohabitasjon med injisert fisk. Det er antatt at HSMB skyldes et virus, men isolasjon og karakterisering av aktuelle agens er foreløpig ikke vitenskapelig publisert. Ettersom HSMB er en smittsom sjukdom, er det viktig å forebygge videre spredning ved hjelp av smitteforebyggende tiltak, som desinfeksjon av utstyr og brakklegging av lokaliteter mellom utsett. Det at en stor andel av fisken angripes, kombinert med et antatt langvarig forløp, fører til at det vil være stor smitterisiko forbundet med flytting av fisk i sjøvannsfasen og introduksjon av ny fisk til lokaliteter hvor det allerede går laks. Aktuelle forskningstemaer Et studium av betennelsesreaksjonen hos fisk som rammes av HSMB er igangsatt, med tanke på å få bedre forståelse for sjukdomsutviklingen. Et viktig mål for framtidig forskning vil være å bestemme årsaken til sjukdommen, samt å utvikle diagnostiske verktøy for å øke sikkerheten omkring diagnosen. Det er også ønskelig å få større kunnskap om patogenesen gjennom patologiske og mikrobiologiske undersøkelser. Videre vil det være nødvendig å gjennomføre et større epidemiologisk studium for å kartlegge utbredelse og spredning, samt risikofaktorer for smitte, slik at man kan gi mer presise råd om kontroll og bekjempelse av HSMB. Cardiomyopatisyndrom (CMS) Cardiomyopatisyndrom er en alvorlig hjertelidelse som i hovedsak gir sjukdom på oppdrettslaks seint i sjøvannsfasen, når de nærmer seg slaktestørrelse mnd. etter sjøsetting, og Figur 5. Laks død av cardiomyopatisyndrom. Man kan se at hjertesekken er fylt av et blodkoagel, såkalt hjertetamponade. (Foto: T.T. Poppe) 145x100//Kap09-fig05.eps følgelig har størst verdi. CMS ble først observert i Norge i 1985, og har seinere blitt diagnostisert i Skottland og på Færøyene. Det har også vært mistenkelige tilfeller i Canada. Liknende sjukdomsforandringer er også sett hos villaks. I Norge forekommer CMS langs det meste av kysten, men har et tyngdepunkt i Midt-Norge, i Møre og Romsdal og Trøndelagsfylkene. Sjukdommen er sjelden i Troms og Finnmark. Det var en økning i årlige diagnostiserte utbrudd fra 25 i 1998 til 101 i 2002, og tall fra diagnostiske undersøkelser ved Veterinærinstituttet viser at antall tilfeller har holdt seg høgt i de seinere år. Et klinisk utbrudd kan vare fra én til seks måneder eller mer, og et typisk utbrudd oppstår et drøyt år etter sjøsetting av fisken (gjennomsnitt 400 dager), når den har en størrelse på 2 3 kg. Ifølge en studie av Østvik & Kjerstad i 2003 var samlet dødelighet under et utbrudd i snitt seks prosent. I de aller fleste tilfeller var bare noen av merdene affisert av utbruddet. Likevel var sjukdommen årsak til opptil 80 prosent av tapene i angrepne anlegg. Forløpet kan ta én av to beskrevne veger; en med plutselig oppstått dødelighet hos tilsynelatende frisk fisk, og en med moderat forhøyet dødelighet over flere måne- Tema: Helse 153

8 der. Ved langvarig forløp kan man se unormale svømmebevegelser og opphørt matlyst før fisken dør. Da CMS i alminnelighet angriper stor fisk, kan de økonomiske tapene bli betydelige. Tapene kan reduseres ved å unngå at fisken utsettes for stress; dvs. sortering, flytting, avlusing eller annen håndtering av fisken bør ikke foretas hvis CMS mistenkes eller er diagnostisert i anlegget. Nødslakting kan bidra til at tapene begrenses. Ved obduksjon av fisk med CMS finner man i typiske tilfeller blødninger i huden, skjell som står ut, samt utstående øyne. Væske i buken og fibrinbelegninger på levra kan også sees. I hjertet finnes vanligvis forstørret forkammer og tilførselsvener, og det kan være blodkoagler i hjertesekken. Noen ganger kan veggen i forkammeret ha revnet. De beskrevne forandringene kan dels også observeres med ultralydundersøkelser på levende, bedøvet fisk. Histologisk er CMS karakterisert av betennelsesreaksjoner og degenerasjoner i hjertemuskelens spongiøse muskellag. Studier har vist at forandringene utvikler seg over flere måneder, og i tidlige stadier er disse forandringene avgrenset. Etter hvert får forandringene generell utbredelse, og betennelsesforandringer og nekroser i muskelcellene kan føre til svekkelse og ruptur av forkammerveggen. Også i levra kan man finne nekroser, og i andre organer, som gjeller og milt, kan man se blodstuvning, trolig som følge av en generell sirkulasjonssvikt. Årsakssammenhenger Hjertemuskelbetennelse og -nekrose gir holdepunkter for at årsaken til CMS er en infeksjon. Det har også vært lansert teorier basert på bl.a. ernæringsmessige feil, autoimmune reaksjoner og miljømessige påvirkninger. Andre årsakssammenhenger enn de infeksiøse har imidlertid fått liten forskningsmessig oppmerksomhet. Allerede i den første beskrivelsen av lidelsen foreslo Amin & Trasti (1988) en virusetiologi, basert på påvisning av inklusjonslegemer i muskelceller som lå inntil skadde celler. Andre studier har imidlertid ikke lyktes i å dyrke virus eller påvise viruspartikler med elektronmikroskopi, men Grotmol et al. rapporterte i 1997 funn av nodavirusliknende partikler i hjertemuskel hos fisk med CMS, både ved hjelp av immunhistokjemi mot nodavirus, og ved å påvise virusliknende partikler på 25 nm størrelse med elektronmikroskopi. Om de påviste viruspartiklene var årsak til sjukdommen, kunne ikke fastslås, og tilsvarende funn er ikke gjort ved andre utbrudd av CMS. 145x100//Kap09-fig06.eps Figur 6. Til venstre vises et histologisk bilde av normal gjellefilament, og til høgre er det bilde av gjellefilament med proliferativ gjellebetennelse. Det viser fortykkede lameller med infiltrasjon av betennelsesceller. (Foto: A. Kvellestad) 154 Havbruksforskning: Fra merd til mat

9 Det er beskrevet overføring av sjukdommen ved injeksjon av cellefritt materiale fra hjerte-, lever- og nyrevev fra sjuk til frisk fisk, noe som støtter en virusteori. I en epidemiologisk undersøkelse er det funnet en sammenheng mellom CMS-utbrudd og tidligere utbrudd av infeksiøs pankreasnekrose (IPN) i samme anlegg. Hjertemuskelbetennelse er også påvist i forbindelse med «erythrocytic inclusion body syndrome» (EIBS). Nylig ble det dessuten meldt at en variant av PD-virus, norsk salmonid alfavirus, er blitt isolert fra fisk med CMS. Det er uklart om dette var et tilfeldig funn. Aktuelle forskningstemaer Det er mange uløste spørsmål omkring CMS, i første rekke knyttet til årsakssammenheng, klarlegging av patogenesen, samt kartlegging av risikofaktorer. En tilnærming til disse problemene kan man oppnå ved å følge fiskegrupper gjennom hele sjøvannsfasen, fortrinnsvis også under utbrudd av CMS, og gjøre kliniske observasjoner og foreta jevnlige prøveuttak av fisk som undersøkes mht. patologiske forandringer og forekomst av mikroorganismer. Eventuelle funn av mikroorganismer bør følges opp med nærmere karakteriseringer, samt med smitteforsøk for å forsøke å reprodusere lidelsen. Mulige sammenhenger mellom CMS og andre sjukdommer, i første rekke IPN, bør studeres, og andre risikofaktorer bør også kartlegges i epidemiologiske studier. Patologistudiene, sammen med eventuelle funn av mikroorganismer, bør munne ut i utviklingen av bedre diagnostiske verktøy for sjukdommen. Epiteliocystis/proliferativ gjellebetennelse (PGI) Laks i sjø med omfattende gjelleproblemer, som gir redusert tilvekst og betydelig dødelighet, er observert i varierende grad langs hele kysten fra 1980-tallet. Enkelte fiskehelsetjenester rapporterer at omfanget av problemet har økt de senere år. Utbrudd oppstår typisk den første høsten fisken går i sjø, noen måneder etter utsetting, og dødelighet ved utbrudd kan variere fra nesten ikke noe til over 20 prosent. Enkelttilfeller rapporteres også med langt høyere dødelighet. Tap som følge av redusert tilvekst på sjuk fisk som overlever, kommer i tillegg. Det hevdes også at fisk med disse gjelleproblemene i enkelte tilfeller er mer utsatt for andre lidelser. Den økonomiske betydningen av sjukdommen er derfor betydelig. Så langt har diagnostikk av PGI i hovedsak vært basert på kliniske funn og histologi. Histologisk påvises det intracellulære ansamlinger av rickettsie- eller klamydieliknende organismer som kalles «epiteliocyster» i gjellevev. Sjukdomstilstanden har derfor ofte blitt kalt epiteliocystis. Typisk for sjukdommen er betennelse og økt antall overflateceller i gjellene. Lidelsen har derfor i senere tid blitt kalt proliferativ gjellebetennelse. Det har hittil ikke vært mulig å dyrke de aktuelle organismene, og smitteforsøk er derfor ikke utført. Molekylær karakterisering av organismen har ført til at den er foreslått som en ny art; «Candidatus pisciclamydia salmonis». Det er også isolert et paramyxovirus fra gjellene til sjuk post-smolt, «Atlantic salmon paramyxovirus» (ASPV), og viruset er påvist i gjeller fra laks med kliniske utbrudd i felt. Imidlertid har man ikke klart å reprodusere sjukdommen med dødelighet i smitteforsøk. Årsaksforholdene ved proliferativ gjellebetennelse er derfor ikke endelig klarlagt, men det er sannsynlig at samspill mellom klamydie, virus og ugunstige miljøforhold kan bidra som årsaker til utbrudd. Tema: Helse 155

10 Det er ingen kjent behandling mot PGI. Det er gjort forsøk både med badebehandling med ulike midler, samt med antibiotikabehandling via fôr, uten synlig effekt. Forskningsrådet støtter to pågående prosjekter som har som mål å identifisere risikofaktorer for utbrudd av gjellebetennelse, samt å utvikle diagnostiske metoder. Parvicapsula pseudobranchiola Våren og forsommeren 2002 ble det registrert sjukdomsutbrudd på laks i fem nordnorske matfiskanlegg. Dødeligheten i angrepne anlegg varierte fra tre til 50 prosent. Årsaken ble vist å være infeksjon med en encellet parasitt, Parvicapsula pseudobranchiola. Parasitten er en myxosporidie og har trolig en livssyklus med veksling mellom laks (mellomvert) og virvelløse dyr (hovedvert). Det er ingen kjent behandling. Sjukdom forårsaket av Parvicapsula er tidligere påvist på laks i Nord-Amerika. Funn av en for norske forhold ny parasitt førte til stor oppmerksomhet når det gjelder risiko for viktige bestander av vill laks. Diagnosen ble stilt på bakgrunn av histologiske undersøkelser. I løpet av 2003 ble parasitten påvist på laks på over 30 lokaliteter fra Møre og Romsdal og nordover, i løpet av 2004 ble parasitten funnet også i Sunnhordaland. Påvisningen i 2002 førte til at nye rutiner for rutinemessig histologiske undersøkelser av diagnostisk materiale ble tatt i bruk. Dette kan bidra til å forklare det økte antallet påvisninger i seinere år. Forskningsrådet har bevilget penger til et prosjekt som har som mål å øke kunnskapen om parasitten og dens spredning, biologi og evne til å gi sjukdom. Slik kunnskap vil være viktig for å kunne vurdere forebyggende tiltak. Bakterieinfeksjoner hos marin fisk Det satses betydelig på å utvikle oppdrett av marine arter, og produksjonen er økende, i første rekke for torsk, men også kveite. Sjukdomspanoramaet synes å minne om det man så i oppdrettet av laksefisk på 80- og tidlig 90-tall; bakterieinfeksjonene dominerer bildet i disse relativt tidlige fasene av næringsutviklingen for marin fisk. I 2005 ble en ny bakterieart påvist og isolert fra torsk som hadde granulomatøse forandringer i ulike organer. Bakterien tilhører genus Francisella. Sjukdommen synes allerede å ha betydning for torskeoppdrettet. Vibriose Vibriose er trolig den vanligste systemiske bakterieinfeksjonen hos oppdrettsfisk på verdensbasis. Sjukdommen forårsakes av den gramnegative bakterien som vanligvis er kjent under navnet Vibrio anguillarum. Bakterien er blitt klassifisert i genus Listonella, men den taxonomiske overføringen fra genus Vibrio er ikke fullt ut akseptert og diskuteres fortsatt. Sjøl om vibriose forårsaker sporadisk dødelighet hos villfisk, er sjukdommen i første rekke et problem for fiskeoppdrett under marine forhold og i brakkvann i tempererte områder, ved relativt høge vanntemperaturer om sommeren. Sørensen og Larsen foreslo opprinnelig 10 serovarianter av bakterien, og i tillegg er det funnet et antall undergrupperinger. Ved vibriose på torsk i Norge isoleres utelukkende V. anguillarum serovar O2α og O2β, og den sistnevnte dominerer. 156 Havbruksforskning: Fra merd til mat

11 145x100//Kap09-fig07.eps Figure 7. Vibrio anguillarum-isolater fra torsk undersøkt for resistens mot et antibiotikum. Fra venstre mot høgre vises resistent, moderat følsomt og følsomt isolat. (Foto: D.J. Colquhoun) I Norge er vibriose den viktigste bakterieinfeksjonen ved produksjon av torskeyngel, og de fleste reseptene som foreskriver antibiotika til oppdrettsfisk, er rettet mot slike sjukdomstilfeller. Vibriose er også påvist hos sei, og symptomene er ofte sår og hudblødninger, særlig i hoderegionen, samt ved finnebasis. I kroniske tilfeller kan man også se blodige, utstående øyne. Bakterien er i 2005 isolert ved forøket dødelighet hos både yngel, matfisk og stamfisk av sei langs kysten nordover t.o.m. Trøndelag. Tap pga. vibriose kan i stor grad begrenses ved vaksinasjon. Mens de vaksinene som benyttes i dag er uten adjuvans og ikke gir fullgod effekt, har forsøk med oljeholdige injeksjonsvaksiner gitt lovende resultater. Disse vaksinene er imidlertid ikke aktuelle til små fisk. Ved vaksinasjon av yngel er det vist at man oppnår bedre beskyttelse på to grams fisk enn ett grams, og fisk som vaksineres som fem grams, er beskyttet i minst seks måneder. Vibriobakterier er normalt følsomme for antibiotika, og de behandles gjerne med oxolinsyre. Imidlertid er det funnet noen resistente isolater. Pågående studier indikerer at mens norske V. anguillarum O2β er nokså homogene, er det stor variasjon mellom O2α-isolater. Disse forskjellene kan ha betydning for utviklingen av vaksiner mot vibriose hos torsk. Studier av genetiske forskjeller mellom isolater av V. anguillarum O2α og O2β fra forskjellige land i Europa er under arbeid. Dette vil forhåpentligvis gi oss bedre kunnskap om populasjonsstrukturene til V. anguillarum. Videre forskning bør på den ene siden rettes mot forbedrede vaksiner, og på den andre siden mot driftsforhold ved oppdrett av torskelarver som kan bidra til redusert smittepress. Tema: Helse 157

12 Aeromonas salmonicida A. salmonicida kan gi alvorlig, systemisk infeksjon hos en rekke fiskearter over store deler av verden. Bakterien kan deles inn i fem subspecies, men i forhold til fiskesjukdommer deles isolatene inni to hovedgrupper, subspecies salmonicida og «atypiske» isolater. Det er i første rekke blant de atypiske vi finner årsakene til sjukdomsutbrudd på marin fisk i oppdrett, men infeksjoner med subsp. salmonicida forekommer også. I norsk fiskeoppdrett gir A. salmonicida problemer først og fremst ved oppdrett av de marine artene kveite, torsk, steinbit og piggvar. Typiske utvendige symptomer er hudforandringer med sårdannelser. Atypiske A. salmonicida isoleres ofte, og er et tilbakevendende problem. Akutt dødelighet forekommer, men det er vanligere med et moderat forøket dødelighetsnivå. Fisk kan gjerne være latent infisert uten å vise tegn på sjukdom. Det kan forventes at økningen i oppdrett av marin fisk i nordatlantiske områder kan føre til større problemer med ulike varianter av A. salmonicida. Reservoaret for infeksjon antas å være infisert fisk, enten vill eller i oppdrett, og utløsende årsaker for utbrudd ligger trolig i stresspåkjenninger som høge fisketettheter, handtering eller dårlig vannkvalitet. Tapene ved utbrudd kan reduseres gjennom å holde gode driftsforhold, dvs. sikre god vannkvalitet og holde låg fisketetthet, samt unngå handtering og annet stress. Antibiotikabehandling ved utbrudd gir gjerne god effekt, men infeksjonen blusser gjerne opp igjen, og A. salmonicida har evne til raskt å utvikle multiresistente stammer. Vaksinering mot atypisk furunkulose hos marin fisk har hittil ikke gitt like god effekt som vaksiner mot furunkulose hos laksefisk. Beskyttelsesgraden etter vaksinering synes å avhenge av bakteriestammen som gir sjukdom, og forskjeller i A-lagsproteinet på bakterieoverflaten har betydning for denne effekten. A-lagsvariasjonen på DNA-nivå er lovende som epidemiologisk markør for virulens. Forskningsaktiviteter som pågår er i stor grad rettet mot seleksjon av bakterieisolater for vaksineutvikling, samt på molekylærbiologiske typingssystemer som kan benyttes i epidemiologiske sammenhenger. Nodavirus Nodavirus er årsak til viral encephalopati og retinopati (VER) hos kveiteyngel. Sjukdommen ga betydelige tap på 90-tallet, men de seinere år er det ikke rapportert utbrudd. Det antas at smittehygieniske tiltak i kveiteoppdrettene har hatt god effekt. Ved smitte av større fisk synes ikke viruset å forårsake sjukdom, men de kan bli bærere av virus. Slik bærerstatus kan være symptomfri, men den kan også påvirke tilveksten negativt. Viruset kan overføres til flekksteinbit, og fører til et sjukdomsbilde som minner om det man ser hos kveite. Fra piggvar er det også isolert et nodavirus i forbindelse med sjukdomsutbrudd med et bilde som likner VER. Viruset var imidlertid forskjellig fra kveiteviruset. Tilsvarende sjukdom er også registrert hos torsk i andre land, med virus som likner kveiteviruset. Det er etablert metodikk for å dyrke viruset i cellekultur, antiserum er framstilt som bl.a. er benyttet til immunhistokjemi, og ELISA for måling av immunrespons er etablert. PCRmetoder er også utviklet for påvisning av virus. Forsøksvaksiner er utviklet og testet på piggvar, og vaksine basert på rekombinant kapsid protein ga beskyttelse. 158 Havbruksforskning: Fra merd til mat

13 Det er behov for ytterligere studier av patogenese for sjukdommen, samt videreutvikling av diagnostiske verktøy. Parasitter hos marin fisk Når en fiskeart settes i monokultur for oppdrett, gis det svært gode betingelser for oppvekst av parasitter, i første rekke slike som ikke er avhengige av mellomvert(er). Parasittene får svært god tilgang til et stort antall vertsdyr som lever i betydelig større tettheter enn i normale, ville forekomster. Det er derfor av stor betydning å kjenne til hvilke parasitter som finnes hos viltlevende fisk av samme art, samt å følge nøye med i utviklingen av parasittbyrde hos fisk i oppdrett. Oppformering av parasitter i oppdrett kan også ha betydning ved å øke smittepåkjenningen tilbake til villfisk. En spesiell utfordring synes å ligge i «skottelusa» Caligus elongatus. Denne lusa kan parasittere på en rekke fiskearter, herunder laks, torsk og kveite. I et forskningsprosjekt blir det gjennomført studier av lus samlet inn fra ulike fiskearter, for å avdekke om det er forskjeller i morfologi, genetisk materiale og/eller vertspreferanser hos lus fra ulike vertsarter. Det finnes også andre «lus» på torsk, slik som Caligus curtus som bare angriper torskefisk, og «fiskelus» av genus Argulus. Alle disse artene er parasittiske krepsdyr. 145x100//Kap09-fig08.eps Figur 8. Torskelus (Caligus curtus) som sitter på huden til en torsk. (Foto: T.T. Poppe) Andre parasitter som finnes på torsk, omfatter gjellemark (Lernaeocera branchialis, hoppekreps), flagellaten Spironucleus torosa i tarm, samt mikrosporidien Pleistophora gadi i muskulatur. En rekke ciliater (bl.a. Trichodina), flagellater (bl.a. Ichthyobodo) og myxosporidier (bl.a. Pleistophora) kan angripe ulike marine fiskearter som torsk, kveite og steinbit. Blant nematoder er arter som gir kveis (Anisakis og Pseudoterranova) av spesiell betydning, da de også kan gi helseproblemer på mennesker (zoonoser). Haptormark krever også spesiell oppmerksomhet, da det finnes flere gyrodactylusarter som kan tenkes å forårsake problemer på oppdrettstorsk. Tema: Helse 159

14 Referanser Amin AB, Trasti J. Endomyocarditis in Atlantic salmon in Norwegian seafarms. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 1988; 8(4): Austin B, Alsina M, Austin DA, Blanch AR, Grimont F, Grimont PAD, Jofre J, Koblavi S, Larsen JL, Pedersen K, Tiainen T, Verdonck L, Swings J (1995).Identification and typing of Vibrio anguillarum: a comparison of different methods. Systematic Applied Microbiology 1995; 18: Bergh Ø, Nilsen F, Samuelsen OB. Diseases, prophylaxis and treatment of the Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus: a review. Diseases of Aquatic Organisms 2001; 48: Bolinches J, Lemos ML, Fouz B, Cambra M, Larsen JL, Toranzo AE. Serological relationships among Vibrio anguillarum strains. Journal of Aquatic Animal Health 1990; 2: Brocklebank J, Raverty S. Sudden mortality caused by cardiac deformities following seining of preharvest farmed Atlantic salmon (Salmo salar) and by cardiomyopathy of postintraperitoneally vaccinated Atlantic salmon parr in British Columbia. Canadian Veterinary Journal 2002; 43: Brun E, Poppe TT, Skrudland A, Jarp J. Cardiomyopathy syndrome in farmed Atlantic salmon Salmo salar: Occurrence and direct financial losses for Norwegian aquaculture. Diseases of Aquatic Organisms 2003; 56: Bruno DW, Poppe TT. Diseases of uncertain aetiology. Cardiac myopathy syndrome. A colour atlas of salmonid diseases. London: Academic press, 1996: Colquhoun DJ, Steinum T, Fjellvang C. Molecular characterisation of quinolone resistance in Vibrio anguillarum serotype O2b isolated from Atlantic cod Gadus morhua. Poster: 12 th bi-annual conference of the European Association of Fish Pathologists, Copenhagen September Dannevig BH, Nilsen R, Modahl I, Jankowska M, Taksdal T, Press CM. Isolation in cell culture of nodavirus from farmed Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus in Norway. Diseases of Aquatic Organisms 2000; 43: Draghi A, Popov VL, Kahl MM, Stanton JB, Brown CC, Tsongalis GJ, West AB, Frasca S. Characterization of «Candidatus pisciclamydia salmonis» (order Chlamydiales), a clamydia-like bacterium associated with epitheliocystis in farmed Atlantic salmon (Salmo salar). Journal of Clinical Microbiology 2004; 42: Ferguson HW, Poppe T, Speare DJ. Cardiomyopathy in farmed Norwegian salmon. Diseases of Aquatic Organisms 1990; 8: Ferguson HW, Kongtorp RT, Taksdal T, Guttvik A, Falk K. An outbreak of disease resembling heart and skeletal muscle inflammation in Scottish farmed salmon, Salmo salar L., with observations on myocardial regeneration. Journal of Fish Diseases 2005; 28: Fridell F, Devold M, Nylund A. Phylogenetic position of a paramyxovirus from Atlantic salmon Salmo salar. Diseases of Aquatic Organisms 2004; 59: Grotmol S, Totland GK, Thorud K, Hjeltnes BK. Vacuolating encephalopathy and retinopathy associated with a nodavirus-like agent: A probable cause of mass mortality of cultured larval and juvenil Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus. Diseases of Aquatic Organisms 1997; 29: Grotmol S, Totland GK, Kryvi H. Detection of a nodavirus-like agent in heart tissue from reared Atlantic salmon Salmo salar suffering from cardiac myopathy syndrome (CMS). Diseases of Aquatic Organisms 1997; 29: Grotmol S, Bergh O, Totland GK. Transmission of viral encephalopathy and retinopathy (VER) to yolk sac larvae of the Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus: occurence of nodavirus in various organs and possible route of infection.diseases of Aquatic Organisms 1997; 36: Grotmol S, Nerland AH, Biering E, Totland GK, Nishizawa T. Characterisation of the capsid protein gene from a nodavirus strain affecting the Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus and design of an optimal reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) detection assay. Diseases of Aquatic Organisms 2000; 39: Grove S, Johansen R, Dannevig BH, Reitan LJ, Ranheim T. Experimental infection of Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus with nodavirus: tissue distribution and immune response. Diseases of Aquatic Organisms 2003; 53: Gudmundsdóttir S, Lange S, Magnadóttir B, Gudmundsdóttir BK. Protection against atypical furunculosis in Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus (L.); comparison of a commercial furunculosis vaccine and an autogenous vaccine. Journal of Fish Diseases 2003; 26: Hemmingsen W, MacKenzie K. The parasite fauna of the Atlantic cod, Gadus morhua L. Advances in Marine Biology 2001; 40:1 80. Hodneland K, Bratland A, Christie KE, Endresen C, Nylund A. New subtype of salmonid alphavirus 160 Havbruksforskning: Fra merd til mat

15 (SAV), Togaviridae, from Atlantic salmon Salmo salar and Rainbow trout Oncorhynchus mykissin Norway. Diseases of Aquatic Organisms 2005; 66: Holm JA, Flesjå K, Falk K, Kvellestad A. Epiteliocystis og proliferativ gjellebetennelse hjå laks kva veit vi om årsaker? Norsk Fiskeoppdrett 2005; 30(12):60. (in Norwegian) Johansen R, Ranheim T, Hansen MK, Taksdal T, Totland GK. Pathological changes in juvenil Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus persistently infected with nodavirus. Diseases of Aquatic Organisms 2002; 50: Johansen R, Amundsen M, Dannevig BH, Sommer AI. Acute and persistent experimental nodavirus infection in spotted wolffish Anarhichas minor. Diseases of Aquatic Organisms 2003; 57: Johansen R, Grove S, Svendsen AK, Modahl I, Dannevig B. A sequential study of pathological findings in Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus (L.), throughout one year after an acute outbreak of viral encephalopathy and retinopathy. Journal of Fish Diseases 2004a; 27: Johansen R, Sommerset, I, Tørud B, Korsnes K, Hjortaas MJ, Nilsen F, Nerland AH, Dannevig BH. Characterization of nodavirus and viral encephalopathy and retinopathy in farmed turbot, Scophthalmus maximus (L.). Journal of Fish Diseases 2004b; 27: Jones S, Prosperi-Porta G, Dawe S, Taylor K, Goh B. Parvicapsula minibicornis in anadromous sockeye (Oncorhynchus nerka) and coho (Oncorhynchus kisutch) salmon from tributaries of the Columbia River. Journal of Parasitology 2004; 90: Karlsbakk E, Otterlei E, Hoie H, Nylund A. Parasites of cultured cod (Gadus morhua) postlarvae fed natural zooplankton. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 2001; 21: Karlsbakk E, Saether PA, Hostlund C, Fjellsoy KR, Nylund A. Parvicapsula pseudobranchicola n.sp (Myxozoa), a myxosporidian infecting the pseudobranch of cultured Atlantic salmon (Salmo salar) in Norway. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 2002; 22: Kongtorp RT, Taksdal T, Lyngøy A. Pathology of heart and skeletal muscle inflammation (HSMI) in farmed Atlantic salmon Salmo salar. Diseases of Aquatic Organisms 2004a; 59: Kongtorp RT, Kjerstad A, Guttvik A, Taksdal T, Falk K. Heart and skeletal muscle inflammation in Atlantic salmon, Salmo salar L.: a new infectious disease. Journal of Fish Diseases 2004b; 27: Kongtorp RT, Halse M, Taksdal T, Falk K. Longitudinal study of a natural outbreak of heart and skeletal muscle inflammation in Atlantic salmon Salmo salar L. Journal of Fish Diseases (in press). Kvellestad A, Dannevig BH, Falk K. Isolation and partial characterization of a novel paramyxovirus from the gills of diseased seawater-reared Atlantic salmon (Salmo salar L.). Journal of General Virology 2003; 84: Kvellestad A, Falk K, Nygaard SM, Flesja K, Holm JA. Atlantic salmon paramyxovirus (ASPV) infection contributes to proliferative gill inflammation (PGI) in seawater-reared Salmo salar. Diseases of Aquatic Organisms 2005; 67: L Abée-Lund T, Sørum H. Class 1 integrons mediate antibiotic resistance in the fish pathogen Aeromonas salmonicida worldwide. Microbial Drug Resistance 2001; 7: Lund V, Jenssen LM, Wesmajervi MS (2002) Assessment of genetic variability and relatedness among atypical Aeromonas salmonicida from marine fishes, using AFLP-fingerprinting. Diseases of Aquatic Organisms 2002; 50: Lund V, Espelid S, Mikkelsen H. Vaccine efficacy in spotted wolfish Anarhichus minor: relationship to molecular variation in A-layer protein of atypical Aeromonas salmonicida.diseases of Aquatic Organisms 2003; 56: Lysne DA, Skorping A. The parasite Lernaeocera branchialis on caged cod: infection pattern is caused by differences in host susceptibility. Parasitology 2002; 124: MacDonald MT, Colwell RR. Phylogeny of the Vibrionaceae and recommendations for two new genera, Listonella and Shewanella. Systematic and Applied Microbiology 1985; 6: McLoughlin MF, Nelson RN, McCormick JI, Rowley HM, Bryson DB. Clinical and histopathological features of naturally occurring pancreas disease in farmed Atlantic salmon, Salmo salar L. Journal of Fish Diseases 2002; 25: Mikkelsen H, Schroder MB, Lund V. Vibriosis and atypical furunculosis vaccines; efficacy, specificity and side effects in Atlantic cod, Gadus morhua L. Aquaculture 2004; 242: Munro ALS, Ellis AE, McVicar AH, McLay HA, Needham EA. An exocrine pancreas disease of farmed Atlantic salmon in Scotland. Helgoländer Meeresuntersuchungen 1984; 37: Myklebust CF, Holm JA. Epiteliocystis og proliferativ gjellebetennelse felterfaringar. Norsk Fiskeoppdrett 2005; 30(12): (in Norwegian) Tema: Helse 161

16 Nelson RT, McLoughlin MF, Rowley HM, Platten MA, McCormick JI. Isolation of a toga-like virus from farmed Atlantic salmon Salmo salar with pancreas disease. Diseases of Aquatic Organisms 1995; 22: Nylund A. Hjertesprekk, kardiomyopatisyndrom (CMS). Fiskehelse 1, (in Norwegian) Olsen AB, MikalsenJ, Rode M, Alfjorden A, Hoel E, Straum-Lie K, Haldorsen R, Colquhoun DJ. A novel systemic granulomatous inflammatory disease in farmed Atlantic cod, Gadus morhua L, associated with a bacterium belonging to the genus Francisella. Submitted. Poppe TT, Seierstad SL. First description of cardiomyopathy syndrome (CMS)-related lesions in wild Atlantic salmon Salmo salar in Norway. Diseases of Aquatic Organisms 2003; 56: Poppe T, Rimstad E, Hyllseth B. Pancreas disease of Atlantic salmon Salmo salar L. post-smolts infected with infectious pancreatic necrosis virus (IPNV). Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 1989; 9: Rasmussen HB. Subgrouping of lipopolysaccharide O antigens from Vibrio anguillarum serogroup O2 by immunoelectrophoretic analysis. Current Microbiology 1987; 16: Rodger H, Turnbull T. Cardiomyopathy syndrome in farmed Scottish salmon. Veterinary Record 2000; 146: Rodger HD, Richards RH. Observational study of erythrocytic inclusion bodies in farmed Atlantic salmon, Salmo salar L., in the British Isles. Journal of Fish Diseases 1998; 21: Schram TA, Iversen L, Heuch PA, Sterud E. Argulus sp (Crustacea: Branchlura) on cod, Gadus morhua from Finnmark, northern Norway. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom 2005; 85: Schrøder MB, Mikkelsen H, Børdal S, Gravningen K, Lund V. Early vaccination and protection of Atlantic cod (Gadus morhua L.) juveniles against classical vibriosis. Aquaculture in press. Skrudland A, Poppe TT, Jarp J, Brun E. Hjertesprekk hos norsk oppdrettslaks. En feltundersøkelse (in Norwegian) Sommer AI, Strand MA, Rasmussen E, Mennen S. Susceptibility of spotted wolffish Anarhichas minor to experimental infection with nodavirus and infectious pancreatic neccrosis virus. Diseases of Aquatic Organisms 2004; 59: Sommerset I, Skern R, Biering E, Bleie H, Fiksdal IU, Grove S, Nerland AH. Protection against Atlantic halibut nodavirus in turbot is induced by recombinant capsid protein vaccination but not following DNA vaccination. Fish and Shellfish Immunology 2005; 18: Sørensen UBS, Larsen JL Serotyping of Vibrio anguillarum. Applied and Environmental Microbiology 1986; 5: Starkey WG, Ireland JH, Muir KF, Jenkins ME, Roy WJ, Richards R, Ferguson HW. Nodavirus infection in Atlantic cod and doversole in the UK. Veterinary Record 2001; 149: Sterud E, Simolin P, Kvellestad A. Infection by Parvicapsulasp. (Myxozoa) is associated with mortality in sea-caged Atlantic salmon Salmo salar in northern Norway. Diseases of Aquatic Organisms 2003; 54: Taksdal T, Olsen AB, Bjerkås I, Dannevig BH, Graham DA, Todd D, McLoughlin MF. Features of naturally occurring outbreaks of pancreas disease (PD) in rainbow trout Oncorhynchus mykiss W. and Atlantic salmon Salmo salar L. in Norway. Submitted. Thompson FL, Iida T, Swings J. Biodiversity of Vibrios. Microbiology and Molecular Biology Reviews 2004; 68: Tiainen T, Pedersen K, Larsen JL. Immunological reactivity of Vibrio anguillarum sero-groups O2a and O2b, and comparison of their lipopolysaccharide profiles. Current Microbiology 1997; 34: Watanabe K, Økland S, Holand T, Midttun B, Nylund A. Hjertesprekk (CMS): Forårsaket av virus? Norsk Fiskeoppdrett 1995; 21: (in Norwegian) Welsh M, Weston J, Borghmans BJ, Mackie D, Rowley H, Nelson R, McLoughlin M, Todd D. Biochemical characterization of salmon pancreas disease virus. Journal of General Virology 2000; 81: Weston JH, Welsh MD, McLoughlin MF, Todd D. Salmon pancreas disease virus, an alphavirus infecting farmed Atlantic salmon, Salmo salar L. Virology 1999; 256(2): Wiklund T, Dalsgaard I. Occurrence and significance of atypical Aeromonas salmonicida in non-salmonid and salmonid fish species: a review. Diseases of Aquatic Organisms 1998; 32: Østvik A, Kjerstad A. En kartlegging av utbredelse, tap og økonomiske konsekvenser av kardiomyopatisyndrom (CMS) og andre hjertelidelser på Atlantisk laks. Fiskehelse 2003; 2: (in Norwegian) 162 Havbruksforskning: Fra merd til mat

17 Øystein Evensen 1), Nina Santi 1), Ann-Inger Sommer 2), Siri Mjaaland 1) 1) Norges veterinærhøgskole, 2) Fiskeriforskning Virulensmekanismer Virulens er den evnen som et smittsomt agens har til å fremkalle sykdom. Denne egenskapen har agens utviklet gjennom mange millioner år i et nært samspill med sin vert. Når agens og vert har «levd sammen» over et stort tidsspenn, har det også utviklet seg et avstemt forhold hvor det er en balanse mellom agens evne til å spre seg i en mottakelig vertspopulasjon og utfallet av infeksjonen i en populasjon. For rask replikasjon og spredning som gir store skader i verten, vil medføre rask død og være til hinder for spredning og agensets overlevelse i verten og populasjonen. Disse mekanismene antar man finnes innenfor alle dyrerekker, fra de helt laverestående arter til de mest avanserte. I dette kapitlet beskrives generelle forhold omkring virulens hos virus, og vi presenterer resultater fra de siste årenes forskning for to fiskevirus; infeksiøs pankreas nekrose-virus (IPNV) og infeksiøs lakseanemivirus (ILA). For IPN har man kommet langt med å assosiere ulike virusstammers signatur (aminosyresammensetning i overflatemolekyler) med virulens. Likeledes har man indikasjoner for hvilke endringer som kan assosieres med tap av eller redusert virulens. For ILA har man ikke kommet så langt, men det er vist store variasjoner i overflatemolekyler hos ulike ILA-virusstammer, uten at man har vært i stand til å assosiere disse forskjellene med virulens. Man er også kommet langt med å forstå hvordan viruset kan motvirke vertens forsvarsmekanismer. Tema: Helse 163

18 Definisjoner og avgrensing Virulens er en betegnelse som er benyttet for å beskrive det sykdomsfremkallende agens relative patogenitet eller den relative evnen (kapasiteten) til å forårsake skade/sykdom hos verten. Mens virulensegenskaper hos bakterier ofte kan relateres til ulike toksiner og produksjonen av disse, er virulensegenskaper hos virus langt mindre veldefinert. Denne gjennomgangen vil sette søkelyset på virulensegenskaper hos virus av den enkle grunn at dette har vært hovedtema for Havbruksprogrammet. Dette betyr på ingen måte at alle forhold omkring virulensegenskaper hos fiskepatogene bakterier er klarlagt. En rekke faktorer bidrar til patogeniteten til et gitt virus, som evnen til å entre cellen, evnen til vekst (replikasjon) i cellen, evnen til å bekjempe (eller motstå) cellens forsvarsmekanismer, og evnen til å forårsake midlertidig eller varig skade av verten via cellelysis, produksjon av toksiske substanser, celletransformasjon, og produksjon av substanser som produseres av cellen som respons på virusinfeksjon. I tillegg kommer induksjon av strukturelle endringer i cellen både i kjernen og i cytoplasma. Virus kan infisere verten via traume eller insektbitt (hos fisk har for eksempel lakselus vært mistenkt for å være bærer av enkelte smittsomme agens), men for både høyere- og laverestående vertebrater er slimhinner en langt vanligere inngangsport. Virus må dermed ha evne til å overleve på slimhinner i kompaniskap med en normalflora, både virus og bakterier. Replikasjon kan skje i slimhinnene, dvs. i primært infeksjonssted (som eksempel ved koi-herpes virusinfeksjon), men oftere tjener slimhinnene som inngangsport for en systemisk infeksjon. Virusreplikasjon Evnen til replikasjon er en viktig virulensfaktor, ikke minst replikasjonsraten. Desto raskere replikasjon, desto mer sannsynlig er det også at virus vil forårsake sykdom eller sykdomssymptomer. Evnen til å replikere in vivo avhenger av virusets evne til å replikere under de biologiske forhold som tilbys i den infiserte celle, samt motstå eller unngå å aktivere de celleforsvarsmekanismene som vil drepe eller fjerne virus. Et virus evne til å replikere i en celle avhenger av en nøye avstemming mellom cellens og virusets egenskaper. Dette gjelder i flere faser av infeksjon og replikasjon som tilheftelse, penetrasjon, frigjøring av virusets indre deler, tilgang til energi, syntese av komponenter av betydning i tidlig replikasjonsfase, syntese av virusets proteiner og genom, sammensetning og frigivelse av virus fra cellen. Vevsskade En vellykket infeksjon gir ofte lysis av vertscellen, typisk for cytolyttiske virus. Man ser gjerne tap av membranintegritet med lekkasje av enzymer og påfølgende celleskade. Apoptose er en annen klassisk cellerespons på virusinfeksjonen, og av den grunn har mange virus utviklet en evne til å hemme cellens apoptoseresponser. Interaksjonspunktene er mange og dels ukjente, men den gjennomgående effekten er en utsettelse av cellens inntreden i apoptosen som i sin tur gir virus anledning til å gjennomgå flere replikasjonssykluser før cellens «produksjonsapparat» skrus av. Ikke-cytolyttiske virus medfører ofte celleskade via de immunologiske forsvarsmekanismene. Komponenter av virus og svært ofte kapsideller membran- komponenter uttrykkes i cellemembranen til infiserte celler og gjenkjennes av spesifikke antistoffer. Sammen med komplementaktivering kan dette gi lysis av cellen. Virusantigener uttrykt i celleoverflaten kan også gjenkjennes av aktiverte cytotoksiske T-celler, noe som også resulterer i cellelysis. 164 Havbruksforskning: Fra merd til mat

19 En viktig virulensegenskap hos mange virus er evnen til å unngå vertens immunresponser. Ulike virus har valgt ulike strategier, og noen av de kjente er hemming av presentasjon av virusproteiner via MHC-molekyler, eller en uttalt evne til endringer (mutasjoner) i noen av de mest immundominante virusproteinene. Cellulære effekter Virusinfeksjoner kan også ha effekter på den infiserte celle gjennom dannelsen av toksiske substanser hvor resultatet kan være syncytiedannelser, fusjon av kromosomer (polykaryocytose) etc. Virusinfeksjoner kan føre til celletransformasjoner (forstadier til cancerceller) og suppresjon av immunresponser som for eksempel hemming av interferonresponser. Man kan også se strukturelle forandringer i cellene, som inklusjonslegemer både i cytoplasma og i kjernen. I de etterfølgende avsnitt gis det en presentasjon av virulensmekanismer hos infeksiøs pankreas nekrose-virus og infeksiøs lakseanemivirus. IPN-virus IPN-viruset er et relativt lite (60 nm) og enkelt oppbygget virus. Det er et nakent virus med ikosahedrisk symmetri i kapsidet (se figur 1). Arvestoffet består av to dobbelttrådete RNA molekyler, som koder for fem virusproteiner (VP1 5). Det er særlig virusproteinene VP2 og VP5 som er antatt å bære IPN-virusets virulensegenskaper. VP2 er eksponert på overflaten av viruspartikkelen, og kan være viktig for virusets evne til å binde til og infisere vertsceller. På VP2 finnes også virusets serotypespesifikke og nøytraliserende epitoper. VP5 kan fremme virusets evne til å replikere, i og med at det er vist at VP5 hos en asiatisk stamme av IPN-viruset har anti-apoptotisk effekt. 145x100//Kap10-fig01.eps Figur 1. Elektronmikroskopisk bilde av IPN-viruspartikler (Trygve Eliassen). Metoder for å studere virulensmekanismer hos IPN-viruset Både smitteforsøk og genteknologiske metoder er sentrale i studier av IPN-virusets virulensmekanismer. Det har lenge vært kjent at enkelte IPN-virusisolater ga høyere dødelighet enn andre samt at passering i cellekultur endrer virusets virulensegenskaper. Bruk av smitteforsøk er et viktig redskap for å studere betydningen av antatte virulensfaktorer ved IPN-viruset. En viktig forutsetning er at IPN-dødelighet kan oppnås etter smitte. Det er svært mange faktorer som kan virke inn på sykdomsutvikling og registrert dødelighet både ute i merdene og i smitteforsøk. Sammenligning av IPN-virusstammers virulens må derfor foregå samtidig og under kontrollerbare forhold. Alle betingelser må være like, så som antall fisk i gruppene, viruskonsentrasjon, smittetid, temperatur, karstørrelse, vannmengde og utskiftingshastighet. Variasjoner i sykdomsfrembringende evne blant IPN-virusisolat innen samme serotype, og identifikasjon av virulens knyttet til RNA-segment A, ble tidlig vist ved bruk av Tema: Helse 165

20 145x100//Kap10-fig01.eps Figur 2. Revers genetikk-teknikk for produksjon av rekombinante IPN-virus. Først lages det en cdna-kopi av virusgenomet, som klones inn i en plasmidvektor. Foran gensekvensen til begge virussegmentene ligger en kort sekvens som kjennes igjen av en RNA-polymerase (T7). Dette gjør det mulig å lage nye RNA-kopier av virussegment A og B. Når disse blir tatt opp i en cellekultur, blir det etter hvert produsert nye virusproteiner og nytt virusarvestoff, som settes sammen til nye viruspartikler. Underveis kan det legges inn mutasjoner i cdna-kopien av virusgenomet, som vil komme til uttrykk i det nye, rekombinante virusisolatet. smitteforsøk på IPN-mottakelig yngel av regnbueørret. Sekvensering og sammenligning av genmaterialet til ulike virusstammer er nyttig for å identifisere forskjeller og molekylære motiver som kan knyttes til virulens. Isolatene skiller seg imidlertid ofte fra hverandre på mer enn én måte, slik at det kan være vanskelig å avgjøre hva som er mest vesentlig for virulensegenskapene. Metoden revers genetikk kan benyttes for å studere dette i detalj (se figur 2). Denne teknikken gjør det mulig å tilføre viruset spesifikke modifikasjoner. Det er for eksempel mulig å endre en aminosyre hos et høyvirulent isolat til å bli lik det man finner hos lavvirulente varianter, for å bekrefte eller avkrefte om dette endrer virusets virulens. Revers genetikk er derfor et unikt redskap for studier av virusets livssyklus, og av de enkelte virusproteinenes rolle i virusreplikasjon, patogenitet og interaksjon med vertens immunforsvar. En revers genetikk-teknikk er også blitt utviklet for IPN-virus. Påviste virulensmekanismer hos IPN-viruset Det er vist at smitte av yngel av atlantisk laks med ulike feltisolater av IPN-virus viser store 166 Havbruksforskning: Fra merd til mat