til bruk sammen med LightCycler 2.0-instrumentet

Transkript

1 FOR BRUK MED: LightCycler SeptiFast Test MG til bruk sammen med LightCycler 2.0-instrumentet (serienummer og høyere) For bruk til in vitro-diagnostikk. LightCycler SeptiFast Kit MG 54 Tests REF : SeptiFast Lys Kit MG 100 Tests REF : SeptiFast Prep Kit MG 10 Tests REF : SeptiFast Software Set REF : TILTENKT BRUK LightCycler SeptiFast Test MG er en in vitro nukleinsyreamplifikasjonstest til deteksjon og identifikasjon av bakterier og sopp i DNA fra mikroorganismer spesifisert i SeptiFast Master-listen (SML), i humant K-EDTA-blod ved hjelp av LightCycler 2.0-instrumentet. Testen brukes i sammenheng med klinisk presentasjon, etablerte mikrobiologiske analyser og/eller andre laboratoriemarkører, som hjelp i utredningen av pasienter med mistanke om sepsis og andre bakterie-/soppinfeksjoner i blodstrømmen. SAMMENDRAG OG BESKRIVELSE AV TESTEN Sepsis betraktes som en av hovedårsakene til dødelighet og morbiditet på sykehus, som oftest forårsaket av bakteriemi og/eller fungemi. Riktig behandling med antibiotika og rask igangsettelse av behandling er kritiske faktorer for å redusere morbiditeten og mortaliteten forbundet med sepsis. Andelen av pasienter som innledningsvis behandles med inadekvate antibiotikaregimer på intensivavdelinger er betydelig, og varierer fra 11 % til 46 % (1,2,3). På sykehus tar det normalt minst 48 timer å identifisere bakterie-/soppatogenene og tilhørende medikamentfølsomhet fra blodkulturer (1). En rask deteksjon av patogener med molekylære diagnostiske verktøy kan gjøre det lettere å stille en rask diagnose av bakteriemi/fungemi, slik at oppstart av korrekt antibiotikabehandling kan skje på et tidligere tidspunkt, dette vil også redusere uhensiktsmessig overforbruk av bredspektret antibiotika (4,5). LightCycler SeptiFast-testen MG er designet for å påvise mikroorganismene som forårsaker cirka 90 % av alle infeksjoner i blodstrømmen (1,6). Mens mikrobiologiske metoder påviser levende mikroorganismer, vil denne testen påvise både levende og ikke-levende mikroorganismer samt fritt mikrobielt DNA. Mål-species vises i SeptiFast Master-listen (SML) i tabell 1. Disse artene ble detektert som positive med LightCycler SeptiFast-testen MG i interne undersøkelser og/eller kliniske forsøk. Noen av disse artene er de som hyppigst behandles utilstrekkelig: Enterococcus spp.; E. coli; Candida spp.; Klebsiella spp (6). For noen av artene på SML-listen er tidlig identifikasjon viktig, da disse forårsaker infeksjoner som er svært vanskelige å behandle: Acinetobacter spp., Stenotrophomonas spp., Enterococcus spp., Candida spp., Pseudomonas spp. (6). Det kan detekteres mer enn én art i en prøve. Real-Time PCR-resultatet er derfor et supplerende verktøy som forenkler en tidlig klinisk vurdering. Tabell 1: SeptiFast Master-liste (SML) Gram ( ) Gram (+) Sopp Escherichia coli Staphylococcus aureus Candida albicans Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) CoNS 1 Candida tropicalis Serratia marcescens Streptococcus pneumoniae Candida parapsilosis Enterobacter (cloacae/aerogenes) Streptococcus spp. 2 Candida glabrata Proteus mirabilis Enterococcus faecium Candida krusei Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis Aspergillus fumigatus Acinetobacter baumannii 3 Stenotrophomonas maltophilia 1 Koagulasenegative stafylokokker (arter som representerer gruppen CoNS, vises i tabell 8). 2 Arter som representerer gruppen Streptococcus spp., vises i tabell 8. 3 Arter ofte referert til som A. calcoaceticus-a. baumannii (Acb complex) påvises ikke (8). 1

2 TESTPRINSIPPER LightCycler SeptiFast Test MG er basert på 3 hovedprosesser: Prøvepreparering med mekanisk lysering og opprensing av DNA Sanntids PCR-amplifikasjon av mål-dna i 3 parallelle reaksjoner (gram-positive bakterier, gram-negative bakterier, sopp) og deteksjon med spesifikke hybridiseringsprober Automatisert identifikasjon av arter og kontroller Prøvepreparering Den mekaniske lyseringen av prøvene utføres med SeptiFast Lys-kitet MG og MagNA Lyser-instrumentet. Ved hjelp av SeptiFast Prep-kitet MG blir de lyserte prøvene inkubert ved forhøyet temperatur med en protease og kaotropisk lyseringsbuffer som frigjør nukleinsyrer og beskytter det frigjorte DNA-et fra DNaser i blodet. Et definert volum av internkontroll (IC) tilsettes hver prøve sammen med lyseringsreagenset. Internkontrollen består av syntetiske dobbelttrådete DNA-molekyler med primerbindingsområder identiske med de som er i målsekvensene. Internkontrollen inneholder unike H-probebindingsområder som gjør det mulig å skille amplifisert internkontroll fra det målspesifikke ampliconet. Etter tilsetning av en bindingsbuffer, overføres blandingen til en spinnkolonne med en filterinnsats av glassfiber. Humant genomisk DNA og bakterie-/sopp-mål-dna binder seg til glassfiberets overflate. Ubundne substanser, slik som salter, proteiner og andre cellulære fragmenter, fjernes i to vasketrinn. Etter at vasketrinnene er fullført, elueres de adsorberte nukleinsyrene ved forhøyet temperatur. Eluatene blir gjenstand for PCR-analyse. Sanntids PCR-amplifikasjon og deteksjon Valg av mål ITS-regionen (internal transcribed spacer) er valgt som målregion for differensiering av bakterie- og soppartene. Den gir en høyere analytisk sensitivitet enn enkeltkopigener fordi det er atskillige operoner i bakterie- og sopp-genomene. ITS er også mer artsspesifikk enn ribosomalt RNA og egner seg derfor best til artsdifferensiering. Den er lokalisert mellom de ribosomale DNA-sekvensene 16S og 23S i alle gram(+)- og gram(-)-bakterier samt mellom de ribosomale DNA-sekvensene 18S og 5,8S i alle sopparter. Amplifikasjon Forut for PCR-amplifikasjonen reduseres risikoen for ampliconkontaminering ved hjelp av AmpErase (uracil-n-glykosylase)-enzymet. Det gjenkjenner og katalyserer destruksjonen av DNA-tråder som inneholder deoksyuridin, men ikke DNA som inneholder deoksytymidin. De preparerte prøvene tilsettes til amplifikasjonsmiksen som inneholder "hot-start" Taq-polymerase i LightCycler -kapillærrørene (100 µl) MG der PCR-amplifikasjonen finner sted. Hver av målsekvensene for de spesifiserte artene amplifiseres med generiske eller spesifikke primere. En miks av målsekvenser blir samtidig amplifisert i reagenskontrollene (RC). Deteksjon i sanntid av PCR-produkter ved hjelp av H-prober Ampliconet detekteres via fluorescens fremkommet gjennom bruk av et spesifikt H-probepar. Disse fluorescensmerkede H-probene hybridiserer til en intern sekvens av det amplifiserte fragmentet under hybridiseringsfasen i amplifikasjonssyklusen. Den emitterte fluorescensen måles av LightCycler 2.0-instrumentet i en av de fire ulike deteksjonskanalene. Etter at amplifikasjonen er fullført, blir det utført en smeltekurveanalyse. Smeltetemperaturen T M er avhengig av lengde, sekvens og graden av homologi mellom proben og mål-dna. Probene er designet for å differensiere de artene som detekteres i én kanal, ved hjelp av deres T M. Automatisert identifikasjon av arter og kontroller Smeltetemperaturer (T M -er) for prøver og kontroller analyseres av en spesialutviklet identifikasjonsprogramvare (SeptiFast Identification Software), og en rapport blir opprettet. Lave konsentrasjoner av koagulasenegative stafylokokker (CoNS) og streptokokker som reflekterer området for kontaminasjon fra omgivelsene, vil ikke bli vist som et resultat. Hvis resultatet er positivt for Staphylococcus aureus, bør påfølgende testing for meca-resistens vurderes. Se pakningsvedlegget til LightCycler SeptiFast meca-kitet MG for mer informasjon (P/N: ). REAGENSER SeptiFast Lys Kit MG P/N: tester LM (lyseringsmatriks) 100 x partikler av glass/keramikk SeptiFast Prep Kit MG P/N: tester [1] LB (lyseringsbuffer) < 50 % guanidiniumthiocyanat 20 % triton X-100 Helseskadelig 20 x 1500 µl [2] PK (proteinase K) 2 % proteinase K Glyserol [3] BB (bindingsbuffer) < 50 % guanidiniumthiocyanat 20 % triton X-100 [4] IRB (buffer for fjerning av hemmere) < 50 % guanidinium-hcl < 40 % etanol Helseskadelig Helseskadelig Helseskadelig 2 x 850 µl 10 x 1000 µl 10 x 1800 µl 2

3 SeptiFast Prep Kit MG P/N: tester [5] WB (vaskebuffer) < 0,2 % natriumklorid < 80 % etanol Meget brannfarlig 10 x 1600 µl [6] EB (elueringsbuffer) 10 x 400 µl BET (rør for ekstrahering av blod) 1 x 50 FC (filterkolonner) 2 x 5 LightCycler SeptiFast Kit MG P/N: tester [1a] RM 1a (reaksjonsmiks 1a) 3 U/µl FastStart Taq-polymerase 3 x 27 µl < 0,1 % AmpErase (uracil-n-glykosylase)-enzym [1b] RM 1b (reaksjonsmiks 1b) < 1 % Brij < 0,1 % magnesiumløsning < 0,1 % dntp [2] DM G+ (deteksjonsmiks, Gram-positive) < 0,001 % primer, prober for G+ < 1 % Brij [3] DM G- (deteksjonsmiks, Gram-negative) < 0,001 % primer, prober for G- < 1 % Brij [4] DM F (deteksjonsmiks, sopp) < 0,001 % primer, prober for F < 1 % Brij [5] RC G+ (reagenskontroll, Gram-positive) < 0,001 % DNA-kontrolltemplat for G+ EDTA [6] RC G- (reagenskontroll, Gram-negative) < 0,001 % DNA-kontrolltemplat for G- EDTA [7] RC F (reagenskontroll, sopp) < 0,001 % DNA-kontrolltemplat for F EDTA [8] IC (internkontroll) < 0,001 % DNA prosesskontrolltemplat for G+, G-, F EDTA [9] NC (negativ kontroll) < 35 % polyetylenglykol x 620 µl 3 x 126 µl 3 x 126 µl 3 x 126 µl 1 x 330 µl 1 x 330 µl 1 x 330 µl 5 x 100 µl 10 x 1600 µl SeptiFast Software Set v1.1 P/N: x SeptiFast Identification Software v1.1 SeptiFast Macro v1.0 SeptiFast meca Macro v1.0 SeptiFast MCC Macro v1.0 SeptiFast Proof Files v1.1 3

4 ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Generelle advarsler og forholdsregler For bruk til in vitro-diagnostikk. Denne testen skal kun brukes for humant blod tatt i K-EDTA. Ikke pipetter med munnen. Ikke spis, drikk eller røyk i laboratoriets arbeidsområder. Bruk beskyttende engangshansker uten pudder, laboratoriefrakk og vernebriller når du håndterer prøver og reagenser. Vask hendene nøye etter håndtering av prøver og reagenser. Reagenser fra ulike lot må ikke slås sammen. Reagenser fra ulike kit må ikke blandes, unntatt de som trengs i Master Mix. Kast ubrukte reagenser, avfall og prøver i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk. Kit som er utgått på dato må ikke brukes. Dataark om materialsikkerhet (MSDS) kan på forespørsel sendes fra ditt lokale Roche-kontor. Prøver må håndteres som infeksiøse, og sikre laboratorierutiner må følges. Disse er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (8) og CLSI-dokumentet M29-A (9). Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater og hansker nøye med et DNA-dekontamineringsreagens (f.eks. LTK-008 ). Kontroller at hanskene er resistente overfor DNA-dekontaminasjonsreagenset. Bruk vernebriller, laboratoriefrakk og engangshansker ved håndtering av reagenser. Unngå at reagensene kommer i kontakt med hud, øyne eller slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis slik kontakt oppstår. Hvis kontaktstedet ikke blir behandlet, kan det oppstå brannskade. Fortynn med vann før du tørker opp eventuelt søl fra reagensene. Unngå at lyseringsbuffer (LB) og bindingsbuffer (BB) kommer i kontakt med hud, øyne og slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis en slik kontakt oppstår, ellers kan det oppstå brannskade. Fortynn reagensene med vann før du tørker opp eventuelt søl. LB og BB må ikke komme i kontakt med hypoklorittoppløsning (blekemiddel). Denne blandingen kan produsere en svært giftig gass. Arbeidsflyten i laboratoriet må være unidireksjonal, og starte i preamplifikasjonsområdet og fortsette videre til postamplifikasjonsområdet (amplifikasjon/deteksjon). Preamplifikasjonsaktiviteter omfatter reagenstillaging og prøvepreparering. Forbruksmateriell og utstyr må være dedikert for hver preamplifikasjonsaktivitet og må ikke brukes til andre aktiviteter eller flyttes mellom områdene. Hansker må brukes i alle områder og må byttes før området forlates. Utstyr og forbruksmateriell som brukes til reagenstillaging, må ikke brukes til prøve- eller kontrollprepareringsaktiviteter eller til pipettering eller bearbeiding av amplifisert DNA eller andre kilder for mål-dna. Forbruksmateriell og utstyr for postamplifikasjon skal forbli i postamplifikasjonsområdet. Tilstedeværelsen av AmpErase-enzymet i Master Mix reduserer risikoen for kontaminasjon fra amplicon. Kontaminasjon fra positive kontroller og kliniske prøver kan kun unngås gjennom gode laboratorierutiner og ved å følge anvisningene i dette pakningsvedlegget nøye. Spesifikke advarsler og forholdsregler ved bruk av LightCycler SeptiFast Test MG DNA fra målorganismene for LightCycler SeptiFast Test MG er til stede i miljøet. For å unngå falske positive resultater grunnet deteksjon av et slikt miljø-dna (DNA-kontaminering) er det nødvendig å etablere en arbeidsflyt som er fri for kontaminerende DNA. Operatører kan i særskilt grad være kilde til DNA-kontaminering, da menneskets hud og øvre luftveier inneholder ulike mikroorganismer som også er målorganismer i LightCycler SeptiFast-testen MG [f.eks. streptokokker og koagulasenegative stafylokokker (CoNS)]. Følgende prinsipper er anbefalinger for å unngå DNA-kontaminering. Reagenser og engangsartikler for LightCycler SeptiFast Test MG LightCycler SeptiFast Test MG-reagenser og engangsmateriell er av MG-kvalitet. MG-produkter er utviklet for svært sensitiv deteksjon av nukleinsyrer fra bakterier og sopp. Det er utviklet patenterte fremstillingsprosesser for å eliminere DNA-kontaminering som kan påvirke slike analyser. Unngå at reagensrørene åpnes og lukkes unødig. Klær og hansker Bruk pudderfrie hansker under hele arbeidsflyten. Unngå eksponering av huden. Brett hanskene over ermene på laboratoriefrakken. Hanskene må byttes umiddelbart ved kontaminering eller behandles med DNA-kontamineringsreagens (f.eks. LTK-008 ; hanskene må være resistente overfor reagenset). Unngå å berøre hanskenes håndflate eller fingre når de tas på. Vedlikehold av Laminar Flow-kabinettet Rengjør arbeidsflatene på Laminar Flow-kabinettet med DNA-dekontamineringsreagens etter hver prøvepreparering. MERK: Kontroller at utstyret er resistent overfor DNA-dekontamineringsreagens. Rengjør alle overflater på innsiden av Laminar Flow-kabinettet regelmessig (vegger, området under bunnplaten og gulvplaten). Sikre at Laminar Flow-kabinettet er DNA-fritt hvis det benyttes av flere brukere. Slå på UV-lys og luftstrøm minst 30 minutter før arbeidet starter. Slå av UV-lyset under arbeid. Vedlikehold av PCR-arbeidsstasjon Rengjør arbeidsoverflatene på PCR-arbeidsstasjonen med DNA-dekontamineringsreagens etter hvert PCR-oppsett. Rengjør alle overflater inni PCR-arbeidsstasjonen regelmessig. Slå på UV-lyset i minst 30 minutter før arbeidet starter. Kontroller at UV-lyset er slått av under arbeid. MERK: Skift UV-lampe i Laminar Flow-kabinettet og PCR-arbeidsstasjonen i samsvar med produsentens anbefalinger. Behandling av utstyr og forbruksmateriell La spesifikt forbruksmateriell og utstyr som brukes for LightCycler SeptiFast-testen MG bli værende i Laminar Flow-kabinettet hvis det er mulig. Alle gjenstander må bestråles i minst 30 minutter med UV-lys før arbeidet starter. Bruk kun DNA-frie engangsartikler (f.eks. MG-kvalitet. Se avsnittet "Materiell som kreves, men som ikke medfølger". Engangsmateriell skal kun brukes én gang. Bruk Capping-verktøy for å lukke kapillærrør (se operatørmanualen for LightCycler 2.0-instrumentet for opplysninger om håndtering). Se operatørmanualen for LightCycler 2.0-instrumentet (kapittelet om vedlikehold) hvis kapillærrør knuses. 4

5 Forholdsregler under pipettering Reagensrør, esker med pipettespisser og kapillærrør må kun åpnes under Laminar Flow-kabinettet. Ikke bruk de samme pipettespissene og kapillærrørene utenfor Laminar Flow-kabinettet. Ikke berør kanten eller gjengene på et åpent rør. Under pipettering skal røret holdes under kanten. Ikke berør kanten på et åpent kapillærrør. Sorter alle gjenstander som skal brukes under prosedyrene under Laminar Flow-kabinettet i logisk rekkefølge (unngå pipettering på kryss og tvers). Hvis det blir sølt væske, fullfør den aktuelle arbeidsoppgaven, og behandle så arbeidsområdet umiddelbart med DNA-dekontamineringsreagens (f.eks. LTK-008 ). KRAV TIL OPPBEVARING OG HÅNDTERING SeptiFast Lys Kit MG Oppbevar ved 15 C til 25 C. Rørene må kun åpnes én gang. Skal ikke gjenbrukes. Må ikke brukes etter utløpsdato. SeptiFast Prep Kit MG Oppbevares ved 15 C til 25 C (må ikke fryses eller oppbevares i kjøleskap). PK kan åpnes maks. 3 ganger. Andre rør skal kun åpnes én gang, og ubrukte reagenser skal kastes. Ikke bruk reagenser fra ulike lot i samme ekstraksjonsoppsett. Må ikke brukes etter utløpsdato. LightCycler SeptiFast Kit MG Oppbevar ved 15 C til 25 C. Oppbevares på et mørkt sted. Oppbevar Master Mix-løsning (blandinger av [1a], [1b] og [2] eller [3] eller [4]) ved 2 C til 8 C i maks. 3 dager. Oppbevar RC ved 2 8 ºC i opptil 10 dager etter bruk, eller frys det ned umiddelbart ved 15 ºC til 25 C etter hver bruk. RC kan åpnes maks. 6 ganger. Andre rør skal kun åpnes én gang, og ubrukte reagenser skal kastes. Ikke bruk reagenser fra ulike lot i samme PCR-kjøring. Må ikke brukes etter utløpsdato. MATERIELL SOM MEDFØLGER SeptiFast Lys Kit MG P/N: tester SeptiFast Prep Kit MG P/N: tester LightCycler SeptiFast Kit MG P/N: tester SeptiFast Software Set v1.1 (medfølger én gang) P/N: MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Kan kjøpes fra Roche LightCycler 2.0 Instrument med Software LightCycler Capillaries MG (100 µl) LC Carousel Centrifuge MagNA Lyser Instrument (230 V) LightCycler Multicolor Compensation Set SeptiFast Cooling Block Kan kjøpes fra andre produsenter Sentrifuge med utsvingende rotor for 15 ml-rør, min g (f.eks. Eppendorf) 1 sentrifuge adaptere (1 par) med innsatser for 15 ml-rør med konisk bunn 1 utsvingende rotor, min x g Sentrifuge (f.eks. Eppendorf) 1 MiniSpin 2 termomiksere (f.eks. Eppendorf) 2 Thermomixer Comfort inkl. 1 termoblokk for 24 x 2,0 ml rør og 1 termoblokk for 8 x 15 ml rør Rør/flaske-rullemikser (f.eks. Stuart Scientific) 1 rullemikser 1 vortexmikser VWR International VWR International VWR International VWR International

6 DNA-frie rør og spisser (f.eks. MG-engangsartikler, Greiner bio-one) 5 ml filterspiss MG 1 ml filterspiss MG 100 µl filterspiss MG 20 µl filterspiss MG 1 ml serumpipette MG 1,5 ml rør MG DNA-dekontamineringsreagens (f.eks. Biodelta GmbH) LTK-008 -sett Pipette 1 5 ml (f.eks. Thermo Life Sciences) 1 Finnpette 1 5 ml Pipette µl (f.eks. Eppendorf) 2 referansepipetter µl 2 referansepipetter µl 1 referansepipette 2 20 µl (kun til meca-testing) Laminar Flow-kabinett (f.eks. Cleanair) BioSafety Cabinet EF 4E PCR-arbeidsstasjon (f.eks. Safety Cabinet Solutions Ltd.) Biocap Passive DNA PCR-kabinett Positivt kontrollmateriale Leveres av andre produsenter eller prepareres i brukerens laboratorium (se avsnittet "Forslag til fremstilling av positivt kontrollmateriale"). Greiner bio-one MG MG MG MG MG MG Biodelta GmbH VWR International VWR International VWR International VWR International PRØVETAKING, TRANSPORT OG OPPBEVARING MERK: Alle prøver og kontroller må behandles som om de er potensielt infeksiøse. Prøvetaking LightCycler SeptiFast Test MG skal kun brukes for K-EDTA-blodprøver. Blodprøver skal tas i sterile rør med K-EDTA som antikoagulant. Transport og oppbevaring av prøver Transport av fullblod må skje i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk for transport av biologisk materiale (10). Fullblod må transporteres/oppbevares ved 15 C til 25 C eller ved 2 C til 8 C i opptil 3 dager eller ved 15 C til 25 C i opptil 4 timer. Stabilitet for eluater Bruk den preparerte prøven rett etter DNA-opprensing. Oppbevar en avpipettert mengde for klargjøring av etterfølgende meca-analysering, om nødvendig (se LightCycler SeptiFast meca-kitet MG for mer informasjon). Eluater kan oppbevares ved 15 C til 25 C i opptil 30 dager eller ved 2 C til 8 C i opptil 8 dager eller ved 15 C til 25 C i opptil 4 timer. BRUKSANVISNING Før start av prøve- og kontrollpreparering Klargjør LightCycler 2.0-instrumentet og PCR-arbeidsstasjonen Fargekompensasjon: Bruk LightCycler Multicolor Compensation-settet (P/N: ). Hvis fargekompensasjonsfilen er utløpt, må en ny fil opprettes. Se pakningsvedlegget for LightCycler Multicolor-kompensasjonssettet hvis du ønsker mer informasjon. Installering av programvaren SeptiFast Identification Software (SIS): Ved installering av oppdateringer må det kontrolleres om det følger tilleggsinformasjon med produktet. 1. Logg deg på LightCycler -datastasjonen som administrator. 2. Sett SeptiFast-programvaresett-CD-en inn i CD-stasjonen i LightCycler -datastasjonen. 3. Førstegangsinstallasjon: Hvis Microsoft.NET 1.1 framework ikke er installert, vil du bli bedt om å installere det ved starten av SIS-installasjonen. Microsoft.NET 1.1 framework må installeres, ellers vil ikke SIS fungere på riktig måte. 4. Trykk på <OK> for å starte SIS-installasjonen, og følg installasjonsveiviseren. 5. Velg <just me> hvis kun én bruker skal jobbe på LightCycler -datastasjonen. Velg <everyone> hvis mer enn én bruker skal jobbe på LightCycler -datastasjonen. 6. Bekreft vinduet <Setup succeeded> ved å klikke på <OK> (SIS kan nå startes fra skrivebordet ved å klikke på ikonet). 7. Datamappen til *.ixo-filer: <C:\Export to SIS> opprettes automatisk. Test av korrekt installasjon av SIS (for analysering med LightCycler SeptiFast-test MG og LightCycler SeptiFast meca-kit MG). 1. Alle proof-filer kopieres automatisk fra SeptiFast-programvaresett-CD-en til mappen <C:\Export to SIS>. 2. Dobbeltklikk på SIS-ikonet på skrivebordet, og trykk på <Start>. 3. Velg proof-filen fra <C:\Export to SIS> (henholdsvis SeptiFast Proof 1.0.ixo eller SeptiFast meca Proof 1.0). 4. Velg "NO" for å avgjøre om LightCycler -rapporten skal inneholde flagget <User Developed or Modified Test Method>. 5. Filen analyseres automatisk, og dataene vises. 6. Skriv ut rapporten. 7. Åpne og skriv ut de tilhørende pdf-filene (henholdsvis SeptiFast Proof v1.1.pdf eller SeptiFast meca Proof v1.1.pdf). 8. Den utskrevne rapporten og den utskrevne proof.pdf-en må stemme overens. Ta kontakt med din lokale Roche-representant hvis dette ikke er tilfelle. 9. Utfør trinn 3 8 med den andre proof-filen. 6

7 Avinstallering av SIS: 1. Logg deg på LightCycler -datastasjonen som administrator. 2. Klikk på <Start> på oppgavelinjen på LightCycler -datastasjonen. 3. Velg <Settings Control Panel Add/Remove Programs>. 4. En liste over alle installerte programmer vises. Klikk på <SIS>. 5. Velg <Remove> og bekreft med <Yes>. Installasjon av SeptiFast-makroer: 1. Installer makroer fra SeptiFast-programvaresett-CD-en. 2. Se operatørmanualen til LightCycler 2.0-instrumentet ("for bruk til in vitro-diagnostikk") for installasjon av en makro. Klargjør Laminar Flow-kabinettet og PCR-arbeidsstasjonen 1. Rengjør og dekontaminer Laminar Flow-kabinettet og PCR-arbeidsstasjonen grundig (med f.eks. LTK-008 ). 2. Skal være påslått i minst 30 minutter: UV-lys og luftstrøm i Laminar Flow-kabinettet, UV-lys i PCR-arbeidsstasjon. 3. Slå av UV-lyset under arbeid. 4. Åpne LightCycler SeptiFast-kit MG og ta ut: 1 rør IC og 1 rør NC, og la dem tine ved 2 C til 8 C i et stativ for prøvepreparering (følger ikke med). 1 rør RM 1a, RM 1b, DM G+, DM G-, DM F, RC G+, RC G-, RC F og la dem tine i SeptiFast-kjøleblokken ved 2 C til 8 C under prøveprepareringen. 5. Slå på: termomikser 1 (til 15 ml-rør) og juster den til 56 C, termomikser 2 (til 1,5 ml-rør) og juster den til 70 C. 6. Plasser et tilstrekkelig antall rør med EB (1 rør per prøve/nc) i termomikseren 2 (70 C). 7. Plasser blodprøverørene eller prøverørene i rullemikseren og la dem rulle i 30 minutter. Prøvene skal behandles umiddelbart. Prøve- og kontrollpreparering MERK: Alle håndteringstrinn skal utføres i Laminar Flow-kabinettet. Forslag til fremstilling av positivt kontrollmateriale Når prøveprepareringen har startet, må alle trinn fullføres. Positivt kontrollmateriale kan kjøpes fra andre leverandører. Hvis materialet fremstilles i brukerens laboratorium, bør det velges ut velkarakteristiske kliniske isolater i henhold til lokal prevalens og klinisk betydning. Disse isolerte koloniene resuspenderes og tilsettes til negativt blod til en konsentrasjon på ca. 300 CFU/ml. Som positiv kontroll kan ATCC-materiale 33592, som er en meticillinresistent S. aureus, brukes, noe som gjør det mulig å benytte eluatet som en positiv kontroll både for LightCycler SeptiFast-testenMG samt for LightCycler SeptiFast meca-kitet MG (P/N: ). Stammen ble dyrket i timer ved 28 C til 37 C på blodagar (5 % saueblod) og resuspendert i buffer til 0,5 McFarland (~1,5 x 10 8 CFU/ml). Denne oppløsningen tilsettes til negativt blod til en sluttkonsentrasjon på 300 CFU/ml. Prelyseringsprosedyre med SeptiFast Lys-kit MG MERK: Les operatørmanualen til MagNA Lyser-instrumentet nøye. 1. Bruk 1 relevant merket rør med LM til hver prøve eller negativ kontroll (NC). 2. Åpne røret, og overfør 1500 µl prøveblod eller NC. 3. Lukk røret godt. MERK: Rørene skal ikke merkes på toppen av korken. 4. Prøvene prelyseres i MagNA Lyser-instrument i 70 sekunder ved 7000 o/min. 5. La rørene stå utenfor instrumentet i 10 minutter. Skal ikke sentrifugeres! Prøvepreparering med SeptiFast Prep-kit MG MERK: Alle reagenser skal være klare løsninger. Hvis det er dannet bunnfall, varmes løsningen opp (til maks. 37 C). Ryst forsiktig til bunnfallet løses opp. 1. Tilsett 150 µl PK i BET Tilsett 1 ml prelysert prøve eller NC til BET 1. Unngå å pipettere fast lyseringsmatriks eller skum. 3. Sett på kork og vortex kort. 4. Tilsett 10 µl IC. Bruk en ny pipettespiss for hver prøve eller NC. 5. Tilsett innholdet fra 2 rør med LB, sett på kort og vortex umiddelbart og grundig. 6. Inkuber i 15 minutter ved 56 C, og bland forsiktig (f.eks. 500 o/min med Eppendorf-termomikser). MERK: All væske i BET 1 må være dekket av inkuberingsenheten. 7. Tilsett innholdet fra 1 rør med BB, sett på kork og vortex. 8. Plasser FC i BET 2. Ikke rør innsiden eller åpningen på FC. 9. Pipetter halvparten av prøveprepareringsblandingen fra BET 1 og avsett på FC-filteret (ca. 2,7 ml). 10. Kork BET 2-FC-enheten og sentrifuger i 1 minutt ved 1900 x g. 11. Pipetter resterende prøveprepareringsblanding fra BET 1 og avsett på FC-filteret (ca. 2,7 ml). Bruk en ny pipettespiss for hver prøve eller NC. 12. Kork BET 2-FC-enheten og sentrifuger i 3 minutter ved 1900 x g. 13. Plasser FC i BET 3. Kast BET 2 med væskeinnhold. 14. Tilsett innholdet fra et rør med IRB til FC-filteret i BET Kork BET 3-FC-enheten og sentrifuger i 2 minutter ved 4200 x g. 16. Tilsett innholdet fra et rør med WB til FC-filteret i BET Kork BET 3-FC-enheten og sentrifuger i 10 minutter ved 4200 x g. 18. Plasser FC i BET 4. Kast BET 3 med væskeinnhold. 19. Sentrifuger BET 4 i 1 minutt ved 4200 x g. 20. Legg FC i BET 5. Kast BET Pipetter 300 µl forvarmet EB (70 C) sentrert i FC. 22. Sett på kork og inkuber i 5 minutter i romtemperatur. 23. Sentrifuger i 2 minutter ved 4200 g. 24. Kast FC. Overfør eluatet til 1,5 ml rør (med f.eks. serumpipetter fra Greiner bio-one). Unngå kontakt med rørveggen. 7

8 Reagenstillaging med LightCycler SeptiFast-kit MG MERK: Det er anbefalt å utføre alle håndteringstrinn i en PCR-arbeidsstasjon atskilt fra området for prøvepreparering. 1. Ta ut SeptiFast-kjøleblokken med reagensrør fra kjøleskapet, dekontaminer med DNA-dekontamineringsreagens (f.eks. LTK-008 ), og overfør den til PCR-arbeidsstasjonen. 2. Vortex de tinte reagensene kort (unntatt RM 1a), og spinn ned alle reagenser ved kort sentrifugering (hvis det er dannet bunnfall, må løsningen varmes opp ved 37 C i 5 minutter og blandes forsiktig til bunnfallet er oppløst). 3. Plasser rørene med tinte reagenser og rør med eluat på de angitte posisjonene i SeptiFast-kjøleblokken. 4. Åpne rør RM 1b, RM 1a, DM G+, DM G- og DM F. 5. Pipetter 600 µl RM 1b og tilsett til RM 1a, bland forsiktig ved å pipettere opp og ned. 6. Pipetter 200 µl reaksjonsmiks fra 1a til hvert av rørene med DM G+, DM G- og DM F for å lage Master Mix MM G(+), MM G(-) og MM F. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned. Klargjøring av PCR-oppsett 1. Plasser nødvendig antall kapillærrør i SeptiFast-kjøleblokken, 3 kapillærrør til RC-ene (posisjon 1, 2, 3), 3 kapillærrør til eluat fra NC (posisjon 4, 5, 6) og 3 kapillærrør for hvert prøveeluat (posisjon 7 og oppover). 2. Pipetter 50 µl MM G(+) i hvert kapillærrør i øverste rad. 3. Pipetter 50 µl MM G(-) i hvert kapillærrør i midterste rad. 4. Pipetter 50 µl MM F i hvert kapillærrør i nederste rad. 5. Åpne det første røret med prøveeluat. Start med røret på høyre side av SeptiFast-kjøleblokken. 6. Pipetter 50 µl prøveeluat i hvert av de tre kapillærrørene nevnt over, og som inneholder MM G(+), MM G(-) og MM F. MERK: Skift spiss etter hvert pipetteringstrinn. 7. Lukk de tre kapillærrørene med Capping-verktøyet (en del av LightCycler 2.0-instrumentet. Se LightCycler 2.0-instrumentets operatørmanual for retningslinjer om bruk. 8. Fortsett med de resterende prøveeluatene som beskrevet i trinn 5 7. Pipetter NC-eluatet til slutt i kapillærrørene i posisjon 4, 5 og Åpne RC G Pipetter 50 µl i kapillærrøret i posisjon Lukk kapillærrøret og lukk deretter RC G Pipetter RC G- og RC F i kapillærrørene i henholdsvis posisjon 2 og 3, som beskrevet i trinn Overfør alle kapillærrør i henhold til nummer til LightCycler -prøvekarusellen. 14. Sentrifuger LightCycler -prøvekarusellen med LC Carousel Centrifuge Plasser LightCycler -prøvekarusellen i LightCycler 2.0-instrumentet. Oppbevaring av gjenværende reagenser og eluater 1. Merk ev. ubrukt Master Mix-løsning, MM G(+), MM G(-) og MM F, med antall gjenværende reaksjoner samt dato. Plasser rørene i tilsvarende posisjoner i SeptiFast-kjøleblokken. 2. Master Mix MM kan oppbevares ved 2 C til 8 C i opptil 3 dager. Til neste oppsett kan oppbevart Master Mix (MM) etterfylles med nylaget MM for å oppnå det nødvendige volumet av aktiv løsning. Denne løsningen må brukes umiddelbart. 3. Merk prøve- og NC-eluatene med oppsettnummer og dato, og oppbevar dem i henhold til anbefalingene. 4. Kast alle tomme reagensrør. Innlasting og betjening av LightCycler 2.0-instrumentet MERK: Det anbefales å ha LightCycler 2.0-instrumentet i et rom som er atskilt fra DNA-opprensing og tillaging av aktive løsninger. 1. Start SeptiFast Macro "SeptiFast_1.0_ " eller høyere (se operatørmanualen for LightCycler 2.0-instrumentet kapittelet "Å utføre en Roche Macro"). MERK: Hvis brukeren er logget av, må analyseringen ikke fortsette. Start en ny analyseserie med et nytt navn. MERK: Ikke bruk feltet <assay lot number>. Hvis du ønsker å tilføye analysens lotnummer til analyseserien, må du taste inn opplysningene i det respektive feltet i prøveredigereren ("Sample editor"). 2. Lagre serien med et navn som sikrer en entydig identifikasjon (med f.eks. brukernavn og dato). 3. Reduser antall prøver fra standard innlastingsliste hvis mindre enn 7 prøver skal kjøres. Slett alle 3 kapillærrør fra en prøve på listen, ikke bare 1 eller 2 av de 3 parallelle analysene. Hvis for mange kapillærrør slettes ved en feiltakelse, ikke legg dem til, men start prosedyren forfra. 4. Det er mulig å legge inn pasientspesifikke data i <parenteser> i stedet for å bruke standardinnstillinger [f.eks. G(+) <Navn_01> i stedet for G(+) <prøve 1>]. Teksten skal være identisk for de 3 parallelle analysene på prøvelisten for å sikre at prøvene gjenkjennes korrekt av SIS. Alternativt kan standardinnstillingene brukes, og om ønskelig kan <Run Note> brukes til å legge inn data. 5. Når alle prøvespesifikke opplysninger er lagt inn, fortsetter du med kit-veiviseren og starter analyseserien på LightCycler 2.0-instrumentet. MERK: Prefiksene G(+), G(-), F må ikke endres. Navn på reagenskontroller [f.eks. G(+) #RC#] og negative kontroller [f.eks., G(+) #NC#] må ikke endres. 6. Når serien er fullført, må væskenivået i kapillærrørene sjekkes (resultatene for et kapillærrør er ugyldige hvis mengden i kapillærrøret er avvikende). Deteksjon av topper og automatisk artsbestemmelse Generell forklaring av analysemoduler MERK: Ikke start dataanalysen når LightCycler 2.0-instrumentet er i gang. Manuell T M calling krever 12 T M calling-moduler (3 analyser, 4 kanaler). Absolute Quantification-modulene krever ikke manuell betjening. Manuell T M calling kan utføres for opptil 6 topper ved hjelp av T M -stolper. T M -stolpene for hver analysemodul er forhåndsdefinert i SeptiFast Macro. I smeltetopp-vinduet vises alle kurver for de valgte grafene. Det er mulig å velge eller velge bort T M -stolper uten flagg. Baseline for hver analysemodul er forhåndsdefinert i SeptiFast Macro. Baseline må ikke endres eller velges bort. Hvis baseline blir endret utilsiktet, skriv inn de korrekte verdier fra tabell 3: Baseline-verdier. 8

9 Hvis mer enn ett kapillærrør er aktivert, vises innstillingene for det første kapillærrøret i avkrysningsboksen. Stolpeforskyvninger har innvirkning på alle aktiverte kapillærrør. MERK: Følgende innstillinger må ikke endres: <Channel>, <Color Compensation>, <Program>, <Method>, <Show Shoulders>, <Peak Area> og <Peak Width>. Innstillingen <Display - Peak Height> kan velges. Topper defineres som maksima over baseline. Skuldre er ikke topper. Unntak er RC G-, kanal 610 (f.eks. figur 1, graf 2) og 670 og RC F, kanal 705. I graf 1 er de to toppene til venstre maksima, og disse skal markeres med stolper. I graf 2 er en av toppene (f.eks. den andre toppen) vist som en skulder, men denne må også markeres. I graf 3 og 4 mangler en av toppene. Kun to stolper skal aktiveres, ikke tre. Figur 1: RC G-, CH 610 Graf 1 Graf 2 Graf 3 Graf 4 T M -stolper må settes innenfor de gyldige T M -områdene (se tabell 2). Tabell 2: T M -områder for gyldige topper CH 610 CH 640 CH 670 CH 705 Lav T M [ C] Høy T M [ C] Lav T M [ C] Høy T M [ C] Lav T M [ C] Verdiene for baseline er forhåndsdefinert i samsvar med tabellen nedenfor og må ikke endres (hvis de endres ved et uhell, må verdiene skrives inn på nytt i henhold til tabellen, ellers vil analyseserien bli flagget). Høy T M [ C] Justering av T M -stolper 1. Etter at analyseserien er avsluttet, viser forsøksveiviseren meldingen <Analyses have been created>. 2. Gå til nederste vindu (ikke trykk på <Finish>). 3. Kontroller at T M og baseline-verdier er synlige. 4. Klikk på analysemodulen [f.eks. T M Calling G(+) 610]. 5. Aktiver alle posisjoner for analysen for å få et overblikk [f.eks. G(+)]. 6. Det skal kun klikkes på posisjonen G(+) #RC#. 7. Juster T M -stolpene til toppmaksima over baseline. Husk å kun fokusere på gyldige T M -områder (se tabell 2: T M -områder for gyldige topper). Hvis det ikke finnes en topp over baseline, må T M -stolpen slettes (fjern avkryssing i den aktuelle boksen). Ved slutten av T M Calling for et bestemt kapillærrør, må det kun være toppmaksima med T M -stolper. I enkelte tilfeller kan lave konsentrasjoner av E. faecium (G+, CH 705, T M 51,8 55,9) og C. albicans (F, CH 640, T M 53,4 57,5) vises som skuldre av de respektive IC-toppene (G+, CH 705, T M 45,5 49,6; F, CH 640, T M 44,8 48,0). Merk disse skuldrene med T M -stolper ved T M 53,9 (G+, CH 705) og T M 55,5 (F, CH 640). 8. Aktiver neste posisjon [f.eks. G(+) #NC#] sammen med G(+) #RC# for å få oversikt (den automatiske skaleringen vil justeres etter den høyeste toppen). 9. Aktiver kun den valgte posisjonen [f.eks. G(+) #NC#] (den automatiske skaleringen vil justeres etter bakgrunnstoppene for NC. Baseline vil muligens ikke lenger være synlig). 10. Fortsett med å detektere toppene som beskrevet i trinn Etter at analysen av en analyse er fullført [f.eks. T M Calling G(+) 610], fortsett med den neste som beskrevet i trinn Fullfør T M Calling 1. Flytt forsøksveiviseren til midten av skjermen og trykk på <Finish>. 2. En rapport blir opprettet automatisk og må skrives ut. 3. Analyseserien lagres automatisk. MERK: Hvis det gjøres endringer av pasientspesifikke data i felter med <parentes> i LightCycler -programvaren, skal operatøren oppdatere databasen ved å velge og klikke på ikonene "Abs Quant G(+) 610" og "Abs Quant G(+) 640". 4. Eksporter *.ixo-filen til <C:\Export to SIS>. 9 Lav T M [ C] Høy T M [ C] G(+) G( ) F Tabell 3: Baseline-verdier CH 610 CH 640 CH 670 CH 705 G(+) 0,159 0,027 0,061 0,027 G( ) 0,234 0,001 0,236 0,065 F 0,196 0,033 0,111 0,059

10 5. Sjekk rapporten for flagg og om <run state: complete> vises. 6. Hvis det vises flagg eller andre meldinger for "run state", er serien ugyldig, og alle prøver må analyseres på nytt. Automatisk identifikasjon av topper med SeptiFast Identification Software (SIS) 1. Dobbeltklikk på SIS-ikonet på skrivebordet, og trykk på <Start>. 2. Velg analyseserien fra mappen <C:\Export to SIS> og last inn *.ixo-filen. 3. Velg "Yes" eller "No" for å avgjøre om LightCycler -rapporten inneholde flagget <User Developed or Modified Test Method>. 4. *.ixo-filen analyseres automatisk, og dataene vises i en rapport. 5. Skriv ut SIS-rapporten. RESULTATER Tolking av resultater FLAGG og KOMMENTARER kan genereres av SeptiFast Identification Software (SIS) som RUN FLAGS, ASSAY FLAGS og FLAGS i boksen SPECIMEN (se nedenfor). Operatøren må sjekke analyseutskriftene for FLAGS eller COMMENTS i alle boksene. Figur 2: Boksen Specimen Specimen Assay Data Result Flags Comment SeptiFast sample 1 G(+) <CH..., TM..., PH..., CP...> <species> G( ) F Ytterligere informasjon kan fremkomme i COMMENT-feltene under RUN FLAGs og ASSAY FLAGs. Prøveresultater Navnene på <species> i feltet RESULT angir at prøven er positiv for den relevante mikroorganismen. Rådata for de relevante toppene vises i feltet DATA, inkludert kanal (CH), smeltepunkt (T M ), topphøyde (P H ) og skjæringspunkt (CP 1 ). Symbolet i feltet RESULT betyr at ingen analytt ble detektert innenfor de definerte kriterier for artene. 1 CP vises kun for G(+) kanal 610, 640. meca Testing Hvis resultatet er positivt for Staphylococcus aureus, bør det vurderes etterfølgende meca-resistenstesting. For mer informasjon, se pakningsvedlegget til LightCycler SeptiFast meca-kitet MG (P/N: ). Validering Valideringen utføres av SeptiFast Identification Software (SIS). Ugyldige analyseserier blir automatisk vist og merket med. Hele serien må gjentas. Kommentarene til flaggene og de tilhørende fortolkningene vises nedenfor. Tabell 4: Flagg for validering av analyseserier Kommentarer 1 Tolkning ASSAY FLAG NC: IC not detected Verken målorganismer eller IC ble detektert i NC. ASSAY FLAG NC: < CH, TM, PH, CP 2 >,< species > Det ble påvist en art i NC ASSAY FLAG NC: more amplicons detected Tilleggsflagg hvis flere enn 3 amplicon ble påvist i NC. ASSAY FLAG RC: No amplicon: <species> Ett eller flere amplicon i RC kunne ikke detekteres ASSAY FLAG RC: more amplicons not detected Tilleggsflagg hvis flere enn 3 av RCs amplicon ikke kunne detekteres. SPECIMEN FLAG IC not detected Verken målorganismer eller IC ble detektert. 1 Systemfeil er angitt under Feilsøking. 2 CP vises kun for G(+) kanal 610, 640. KVALITETSKONTROLL Ett replikat av den negative kontrollen (NC) og ett av hver av de 3 reagenskontrollene (RC-er) må inkluderes i hver av de 3 parallelle analysene [G(+), G(-), F] i hvert analyseoppsett. NC og RC-ene må plasseres i de angitte posisjonene, slik det er beskrevet under Klargjøring av PCR-oppsett. Det anbefales å inkludere en "in-house" positiv kontroll gjennom hele arbeidsforløpet (se under Materiell som ikke medfølger). SIS bestemmer resultatet for IC, NC og RC. Hvis kontrollene ikke møter de definerte spesifikasjonene, blir alle prøveresultatene flagget i feltet i boksen SPECIMEN. Kontroller boksen SPECIMEN på analyseutskriften for flagg og kommentarer for å sikre at analyseserien er gyldig. Negativ kontroll (NC) Den negative kontrollen må være negativ, mens dens internkontroll må være positiv. Hvis NC ikke oppfyller disse kriteriene, blir alle analysens prøveresultater markert med flagg. Hele serien må gjentas. Reagenskontroller (RC) Hver RC må være positiv for RC-ens målamplicon. Hvis RC ikke oppfyller dette kriteriet, blir alle analysens prøveresultater markert med flagg. Hele serien må gjentas. Positiv kontroll Den positive kontrollen må være positiv. Hvis de positive "in-house" materialene eller de eksterne positive kontrollene ikke oppfyller dette kriteriet, er hele serien ugyldig. SIS viser ingen flagg. Internkontroll (IC) Internkontrollen må detekteres positiv i alle negative prøver, også i den negative kontrollen. Hvis internkontrollen ikke oppfyller dette kriteriet, markeres prøveresultatet med flagg. 10

11 Ved ugyldige kontroller må hele prosedyren gjentas (prøve- og kontrollpreparering, amplifikasjon og deteksjon av alle 3 analysene). Kontakt ditt lokale Roche-kontor for teknisk hjelp hvis prøvene gjentatte ganger er ugyldige. FEILSØKING Tabell 5: Systemfeil vist som COMMENTS til RUN FLAGS og på SIS-utskriften Systemmelding (vises i Mulig årsak flaggfeltene på SIS-utskriften) User Developed or Modified Test Method CCC File Name: Multiple CCC used! Color Compensation has expired on DD-Month-YY Analyseserien er ugyldig. Mulige årsaker er beskrevet i operatørmanualen til LightCycler 2.0-instrumentet. Standardinnstillingene for makroen (f.eks. baseline, analyseprotokoll osv.) kan ha blitt endret. To eller flere ulike fargekompensasjonsfiler er aktive i en eller flere analysemoduler Fargekompensasjonsobjektet er eldre enn seks måneder Korrigerende tiltak Åpne den originale *.ixo-filen i LightCycler -programvaren, og sjekk baselineverdier i henhold til tabell 3. Lagre og eksporter på nytt. Velg riktig fargekompensasjon og foreta en ny kalkulering. Opprett et nytt fargekompensasjonsobjekt. Invalid Macro Feil makro er brukt Sjekk at makroen i LightCycler -programvaren og/eller i SeptiFast-programvaresettet er riktig. Invalid Baseline Baseline-verdiene kan ha blitt endret utilsiktet Åpne den originale *.ixo-filen i LightCycler -programvaren, og sjekk baselineverdier i henhold til tabell 3. Lagre og eksporter på nytt. Invalid Control Tube En eller flere kontroller har feil navn Åpne den originale *.ixo-filen i LightCycler -programvaren og sjekk inntastingen av kontrollnavn i prøveredigereren ("sample editor"). Endre navnene til standardnavn, lagre og eksporter på nytt. Missing Sample Tube Invalid LightCycler SW Version No Manual T M Calling Én eller flere prøvekapillærrør er navngitt feil eller mangler Det er brukt feil versjon av LightCycler -programvaren for prosedyren Det er ikke utført manuell T M Calling (i prøver eller analysemoduler). Makroen er avsluttet uten analyse Åpne den originale *.ixo-filen i LightCycler -programvaren og sjekk inntastingen av prøvenavn i prøveredigereren ("sample editor). Endre navnene til standardnavn, lagre og eksporter på nytt. Åpne LightCycler -programvaren og sjekk at det er riktig versjonsnummer. Åpne den originale *.ixo-file i LightCycler -programvaren og utfør manuell T M Calling. Lagre og eksporter på nytt. + additional run flags Mer enn 5 analyseflagg er registrert Prøv å løse de flaggene som er spesifikt beskrevet, og analyser serien på nytt med SIS. Invalid CCC File Name To eller flere ulike fargekompensasjonsfiler er aktive i Velg riktig fargekompensasjonsfil og foreta en ny kalkulering. en eller flere analysemoduler Hvis én eller flere prøver mangler på SIS-rapporten, må følgende kontrolleres: 1) Har et av de tre analysekapillærrørene for en prøve feil navn, dvs. at de analysespesifikke prefiksene (G+, G, F) er slettet utilsiktet, eller 2) Har et eller flere prøvekapillærrør feil navn eller mangler det prøvekapillærrør? Dette kan korrigeres ved å åpne den originale *.ixo-filen i LightCycler -programvaren og sjekke inntastingen av prøvenavn i prøveredigereren ("sample editor"). Endre navnene til standardnavn, lagre og eksporter på nytt. PRODUKTETS BEGRENSNINGER Denne testen er kun validert for bruk med humant blod tatt med K-EDTA som antikoagulant. Testing av andre prøvematerialer kan føre til feil resultat, falske negative eller falske positive resultater. Pålitelige resultater er avhengig av adekvat prøvetaking, transport, oppbevaring og håndtering. Dette produktet skal kun brukes av personell som har fått spesiell opplæring i bruk og arbeidsflyt for LightCycler SeptiFast-test MG. Ytelsen for LightCycler SeptiFast-testen MG er etablert for blod som inneholder WBC/µl. Gjeldende taksonomi for mikroorganismer baseres hovedsakelig på fenotypeklassifisering (biokjemiske og fysiologiske egenskaper) og kan muligens avvike fra genetiske bestemmelser. I sjeldne tilfeller kan prøver med store mengder mål-dna fra Streptococcus spp. gi et falskt negativt resultat. Selv om primere og prober er designet mot høykonserverte regioner i ITS (Internal Transcribed Spacer)-regionen, kan den målspesifikke smeltetemperaturen (T M ) for H-probene påvirkes av tilfeldig sekvensvariasjon som finnes i mikrobielle arter. 11

12 EVALUERING AV ANALYTISK YTELSE Interfererende substanser Følgende substanser interfererer ikke i deteksjonen av bakterie- og sopp-dna med denne testen. Tabell 6: Interfererende substanser Nr. Handelsnavn Aktivt stoff Produsent 1 x C max 3 x C max Benevning 1 Piperacillin Piperacillin Hexal 4,0 12,0 mg/ml 2 Fortum Ceftazidim GlaxoSmithKline 0,50 1,5 mg/ml 3 Zienam Imipenem/Cilastatin MSD Sharp & Dohme 0,27 0,67 mg/ml 4 Tazobac Piperacillin/Tazobactam Wyeth Pharma 0,75 2,3 mg/ml 5 Ciprobay Ciprofloxacin Bayer 33,3 100,0 µg/ml 6 Vancomycin Vancomycin Lilly 83,0 250,0 µg/ml 7 Refobacin Gentamicin Merck 80,0 240,0 µg/ml 8 Zyvoxid Linezolid Pfizer 0,10 0,30 mg/ml 9 Sobelin Clindamycin Pfizer 0,30 0,90 mg/ml 10 InfectoClont Metronidazol Infectopharm 83,3 250,0 µg/ml 11 Diflucan Flukonazol Pfizer 0,13 0,39 mg/ml 12 Cancidas Caspofungin MSD Sharp & Dohme 8,3 25,0 µg/ml 13 Amphotericin B Amphotericin B Bristol-Myers Squibb 20,0 60,0 µg/ml 14 Novalgin Metamizol Aventis Pharma 0,83 2,5 mg/ml 15 Dexahexal Deksametason Hexal 1,3 4,0 µg/ml 16 ARA-cell Cytarabin cellpharm 63,3 190,0 µg/ml 17 Arterenol Norepinephrine (noradrenalin) Aventis Pharma 4,8 14,4 µg/ml 18 Aquo-Trinitrosan Glycerolnitrat Merck 1,3 4,0 µg/ml 19 Heparin-Natrium ratiopharm Heparin ratiopharm 0,83 2,5 I.U./ml Analytisk sensitivitet Den analytiske sensitiviteten for LightCycler SeptiFast testen MG ble analysert ved treffrateanalyse for hver analytt i en serie av fortynninger på 100, 30 og 3 CFU/ml i EDTA-blod fra friske donorer (se tabell 7). Det ble funnet en minimumssensitivitet på 30 CFU/ml for alle arter, unntatt Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae og Streptococcus mitis (100 CFU/ml). Tabell 7: Arter testet ved treffrateanalyse Målorganisme Antall positive / antall testet Målorganisme Antall positive / antall testet Konsentrasjon [CFU/ml] Konsentrasjon [CFU/ml] Acinetobacter baumannii 8/8 12/12 11/20 Klebsiella pneumoniae 8/8 12/12 17/20 Aspergillus fumigatus 8/8 12/12 20/20 Proteus mirabilis 8/8 12/12 16/20 Candida albicans 8/8 12/12 12/20 Pseudomonas aeruginosa 8/8 12/12 5/20 Candida glabrata 8/8 12/12 10/20 Serratia marcescens 8/8 12/12 19/20 Candida krusei 8/8 12/12 8/20 Staphylococcus aureus 8/8 12/12 8/20 Candida parapsilosis 8/8 12/12 7/20 Staphylococcus epidermidis 1 8/8 1/12 0/20 Candida tropicalis 8/8 12/12 9/20 Staphylococcus haemolyticus 1 8/8 0/12 0/20 Enterobacter aerogenes 8/8 12/12 16/20 Stenotrophomonas maltophilia 8/8 12/12 18/20 Enterobacter cloacae 8/8 12/12 12/20 Streptococcus pneumoniae 8/8 7/12 1/20 Entercoccus faecalis 8/8 12/12 15/20 Streptococcus agalactiae 2 8/8 7/12 0/20 Entercoccus faecium 8/8 12/12 17/20 Streptococcus pyogenes 2 8/8 9/12 4/20 Escherichia coli 8/8 12/12 20/20 Streptococcus mitis 2 8/8 9/12 0/20 Klebsiella oxytoca 8/8 12/12 14/20 1 Arter som representerer gruppen CoNS fra SML i tabell 1. 2 Arter som representerer gruppen Streptococcus spp. fra SML i tabell 1. 12

13 Analytisk spesifisitet Inklusivitet For å bevise ensartetheten og homogeniteten til ITS-målregionen, ble det samlet inn kliniske isolater fra flere geografiske regioner i Europa (sør, midt, nord), Japan og USA. Totalt 1709 isolater ble karakterisert ved hjelp av mikrobiologiske metoder og testet med LightCycler SeptiFast -testen MG [se tabell 1 SeptiFast Master List (SML)]. Prøvesamlingen fra USA og Japan omfatter ikke Aspergillus fumigatus, Candida krusei og Staphylococcus haemolyticus. I gruppene Streptococcus spp. og koagulasenegative stafylokokker (CoNS), ble artene som er angitt i tabell 8, funnet positive med LightCycler SeptiFast-testen MG. Prøvesamlingen fra Japan omfatter ikke Aspergillus fumigatus og Candida krusei. Tabell 8: Arter som representerer henholdsvis gruppene Streptococcus spp. og koagulasenegative stafylokokker (CoNS), og funnet positive med LightCycler SeptiFast-testen MG Streptococcus spp. Koagulasenegative stafylokokker (CoNS) S. agalactiae S. hominis subsp. novobiosepticus S. anginosus S. pasteuri S. bovis S. warneri S. constellatus S. cohnii subsp. urealyticum S. cristatus S. hominis subsp. hominis S. gordonii S. lugdunensis S. intermedius S. cohnii subsp. cohnii S. milleri S. capitis subsp. ureolyticus S. mitis S. capitis subsp. capitis S. mutans S. caprae S. oralis S. saprophyticus S. parasanguinis S. saprophyticus subsp. saprophyticus S. pneumoniae S. xylosus S. pyogenes S. epidermidis S. salivarius S. haemolyticus S. sanguinis S. thermophilus S. vestibularis S. viridans Avvikende resultater ble funnet i mindre enn 1,2 % av alle resultatene. 6 av 143 Enterobacter (aerogenes/cloacae)-stammer var identiske med Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) i ITS-regionen og ble tolket som Klebsiella (pneumoniae/oxytoca). Citrobacter freundii og Salmonella enterica kan være identiske med henholdsvis Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) og E. coli i deres ITS-regioner og vil bli tolket som henholdsvis Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) og E. coli. 14 av 160 Streptococcus viridans-stammer var identiske med Streptococcus pneumoniae i ITS-regionen og vil bli tolket som S. pneumoniae. I sjeldne tilfeller kan ikke Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) påvises hvis en mutasjon i målsekvensen forårsaker en forskyvning av smeltepunktet. 13

14 Eksklusivitet Tabell 9: Alle de testede artene var negative i hver analyse Actinobacillus actinomycetemcomitans Corynebacterium jeikeium Mycoplasma pneumoniae Aeromonas hydrophila Cryptococcus neoformans Neisseria meningitidis Bacillus cereus Gemella haemolysans Pantoea agglomerans Bacteroides fragilis Haemophilus influenzae Peptostreptococcus magnus Bartonella henselae Histoplasma capsulatum Porphyromonas gingivalis Bordetella pertussis Legionella pneumophila Prevotella denticola Borrelia burgdorferi Listeria monocytogenes Propionibacterium acnes Burkholderia cepacia Moraxella (Branhamella) catarrhalis Proteus vulgaris Campylobacter jejuni Morganella morganii Yersinia enterocolitica Cardiobacterium hominis Mycobacterium fortuitum Clostridium perfringens Mycobacterium tuberculosis 14

15 MERKNAD TIL KJØPER Kjøp av dette produktet gir brukeren rett til å bruke det til amplifikasjon og deteksjon av nukleinsyresekvenser i forbindelse med human in vitro-diagnostikk. Det gis ingen generelle patent- eller andre lisensrettigheter i forbindelse med kjøpet bortsett fra bruksretten. REFERANSER 1. Kollef M, et al. Inadequate antimicrobial treatment of infections, Chest 1999, 115: Garnacho-Montero J, et al. Impact of inadequate empirical antibiotic therapy on the outcome of patients admitted to the ICU with Sepsis, Crit Care Med. 2003, 31(12): Byl B, et al. Impact of Infectious Disease Specialists and Microbiological Data on the Appropriateness of Antimicrobial Therapy for Bacteremia, Clin Infect Dis 1999: 29: Suttorp N. Changing populations and future trends in the management of serious infections from: AIM website ( 5. Peterson LR, et al. Towards targeted prescribing: will the cure for antimicrobial resistance be specific, directed therapy through improved diagnostic testing?, J Antimicrob Chemother 2004, 53: Harbarth S, et al. Inappropriate initial antimicrobial therapy and its effect on survival in a clinical trial of immunomodulating therapy for severe sepsis, Am J Med. 2003, 115: Houang, E.T.S., et al. Significance of Genomic DNA Group Delineation in Comparative Studies of Antimicrobial Susceptibility of Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother, Apr. 2003, p Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) Clinical Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids, and Tissue. Approved Guideline. CLSI Document M29-A Villanova, PA:CLSI, International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition pp. 15

16 " Distributed by Produsert i Tyskland for: Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ USA Roche Diagnostics Indianapolis, IN USA (For Technical Assistance call the Roche Response Center toll-free: ) Roche Diagnostics H7V 4A2 Laval, Quebec (For Technical Assistance call: Pour toute assistance technique, appeler le: ) Roche Diagnostics (Schweiz) AG CH-6343 Rotkreuz Roche Diagnostics F Meylan Roche Diagnostics GmbH D Mannheim, Germany Distributore in Italia: Roche Diagnostics SpA Piazza Durante 11 I Milano Roche Diagnostics S.L. E Barcelona Distribuidor em Portugal: Roche Farmacêutica Química, Lda P-2700 Amadora C Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland, ROCHE, LIGHTCYCLER, MGRADE, MAGNALYSER, FASTSTART, HYBPROBE, SEPTIFAST og AMPERASE er varemerker for Roche. ROCHE RESPONSE CENTER er et servicemerke som tilhører Roche. Amphotericin B er et registrert varemerke for Bristol-Myers Squibb Company. Aquo-Trinitrosan er et registrert varemerke for Merck & Co., Inc. ARA-cell er et registrert varemerke for cell pharma GmbH. Arterenol er et registrert varemerke for Aventis Pharma Ltd. Cancidas er et registrert varemerke for MSD Sharp & Dohme GmbH. Ciprobay er et registrert varemerke for Bayer AG. Dexahexal er et registrert varemerke for Hexal AG. Diflucan er et registrert varemerke for Pfizer Inc. Fortum er et registrert varemerke for GlaxoSmithKline. Heparin-Natrium-5000-ratiopharm er et registrert varemerke for ratiopharm International. InfectoClont er et registrert varemerke for Infectopharm GmbH. LTK-008 er et varemerke for biodelta, ZTB GmbH. MiniSpin er et registrert varemerke for Eppendorf. Novalgin er et registrert varemerke for Aventis Pharma Ltd. Piperacillin er et registrert varemerke for Hexal AG. Refobacin er et registrert varemerke for Merck & Co., Inc. Sobelin er et registrert varemerke for Pfizer Inc. Tazobac er et registrert varemerke for Wyeth Pharmaceuticals AG. Vancomycin er et registrert varemerke for Lilly Pharma Holding GmbH. Zienam er et registrert varemerke for MSD Sharp & Dohme GmbH. Zyvoxid er et registrert varemerke for Pfizer Inc. 2007, Roche Molecular Systems, Inc. Med enerett. 6/2007 ( ENGL)