MiSeqDx -instrumentet

Transkript

1 TIL IN VITRO-DIAGNOSTISK BRUK Katalognr. DX Tiltenkt bruk Illumina MiSeqDx et sekvensingsinstrument som mål fluoresente signal fra mkede nukleotid ved bruk av instrumentspesifikke reagens og flowcell (MiSeqDx univsalsett.0 ), avbildingsmaskinvare og dataanalyseprogramvare. MiSeqDx-plattformen begnet for målrettet sekvensing av humant genom-dna fra pife helblodsprøv. MiSeqDx-plattformen ikke begnet for hele genomet ell de novo-sekvensing. MiSeqDx begnet brukt med Illumina-levt IVD-analys og reagenssett. Prosedyreprinsipp Illumina MiSeqDx begnet brukt til målrettet resekvensing av human genomisk DNA fra pife helblodsprøv med Illumina medfølgende forbruksmatial. Det genomiske DNA-et behandles via klargjøringstrinnene for biblioteket, som spesifikt amplifis de tiltenkte genomiske områdene på hv prøve ved bruk av tilpassede oligonukleotid som utformet av bruken, mens det også tilføy indeks og flowcelle innfangingssekvens til de amplifiste produktene. Klargjør av biblioteket består av fire hovedtrinn: Hybridising, ekstensjonsligasjon, PCR-amplifising og biblioteknormalising. De resultende normaliste prøvebibliotekene klar for sekvensing på Illumina MiSeqDx-instrumentet ved bruk av SBS-kjemi (sekvensing ved syntese). SBS-kjemi bruk en revsibel tminatormetode for å dektekte enkle nukleotidebas idet de blir inkorport i voksende DNA-streng. Programvaren for sanntidsanalyse (RTA) utfør bildeanalys og baseg, i tillegg til tildeling av kvalitetsskåre på hv base for hv sekvensingssyklus. Når den primære analysen utført, behandl MiSeq Reportprogramvaren på MiSeqDx-instrumentet basegene med sekundæranalyse, som inklud demultipleksing, FASTQ-filgening, sammenstilling, variantg og gening av VCF (fil) som innehold informasjon om variant som ble funnet ved spesifikke posisjon i et refansegenom. Prosedyrebegrensning Til in vitro-diagnostisk bruk. 2 Dette produktet begrenset til å leve: Sekvensing utgang > Gb Avles >3 million Avlesingslengde (i parvis endekjøring) 2 x 50 bp Bas høye enn Q30 >5 % (m enn 5 % av basene har en kvalitetsskåre på Phred-skalaen som høye enn 30, noe som indik en basegsnøyaktighet på m enn enn 99,9 %) 3 Variant i homopolymkjøring som ovstig åtte bas, filtres ut i VCF-filene (R8-filt). 4 Systemet har blitt validt for detekting av SNV og opptil 3 basesletting. Evaluing av -bases innsetting har blitt begrenset til 3 ulike innsetting på 3 separate kromosom. 5 Systemet har problem med å detekte -bases innsetting ell sletting i homopolymspor (for eksempel polya). 6 MiSeqDx-systemet utformet for leving av kvalitative resultat (det vil si genotypesultat). Som ved all hybridisingsbast arbeidsflyt kan undliggende polymorfism ell mutasjon i oligonukleotidbindende områd påvirke allelene som sondes, og dfor også gene som utføres. Februar 204 Delenumm Rev. A NOR

2 8 Anbefalt minimal dekning p ampli som kreves for nøyaktig variantg (Q(max_gt poly_site) >= 00), 5x. Produktkomponent Illumina MiSeqDx består av følgende: MiSeqDx-instrumentet(Katalognr. DX-40-00) Følgende programvarekomponent påkrevd for MiSeqDx-bruk og dataanalyse: Programvareapplikasjon Funksjon Beskrivelse MOS MiSeqDxdriftsprogramvare RTA programvare for sanntidsanalyse MiSeq Report Kontroll instrumentbetjening Utfør primære analys Utfør sekundæranalyse Oppbevaring og håndting MOS-programvaren styr betjen av instrumentet und sekvensing og gen bild til bruk med programvaren Real-Time Analysis (RTA). RTA-programvaren vt bildene gent av MOS for hv plate p syklus av sekvensingskjør til basegsfil som inngang for MiSeq Report-programvaren. RTA-programvaren innehold ikke brukgrensesnitt. MiSeq Report-programvaren behandl baseg med sekundær analyse, som inklud demultipleksing, FASTQ filgening, innretting, variantg og gening av VCF-fil som innehold informasjon om variant som finnes ved spesifikke posisjon i et refansegenom. Element Tempatur Fuktighet Spesifikasjon Transport og oppbevaring: -0 C til 40 C (4 F til 04 F) Driftsforhold: 9 C til 25 C (66 F til F) Transport og oppbevaring: Ikke-densende fuktighet Driftsforhold: 30-5 % relativ fuktighet (ikke-densende) Utstyr og matial som påkrevd, men som ikke følg med Forbruksmatiell til sekvensing MiSeqDx univsalsett.0 (Katalognr. DX-03-00) Forbruksmatial skaffet av bruken Påse at følgende forbruksmatial, skaffet av bruken, tilgjengelig før en kjøring start. Forbruksmatiale Spritklut, 0 % isopropyl ell etanol, 0 % Laboratorieklut, lavt lo-innhold Linsepapir, 0, x 5,2 cm Tween 20 Pinsett, firkantspiss plast (ekstrautstyr) Vann, DNase-fri, RNase-fri Formål Rengjøring av flowcellehold Rengjøring av flowcellehyllen Rengjøring av flowcellen Vaske instrumentet Fjn flowcelle fra flowcellens transportbehold Vaske instrumentet 2 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

3 Retningslinj for DNase- og RNase-fritt vann Bruk alltid DNase- og RNase-fritt vann for å utføre instrumentprosedyr. Bruk aldri springvann ell avionist vann. Alle følgende eksempl godkjent: 8 Megaohm (MΩ)-vann Milli-Q-vann Sup-Q-vann Molekylært vann av biologiklasse Advarsl og forholdsregl FORSIKTIG Fødal lov begrens denne enheten til salg av, ell på bestilling, av en lege all annen allmennpraktisende lege, lovmessig lisensit i staten vedkommende praktis, for å bruke ell pålegge bruk av enheten. Noen komponent i Illuminas reagens til bruk med MiSeqDx-instrumentet innehold formamid, et alifatisk amid som et mulig reproduktivt toksin. (Se de respektive produktvedleggene for m informasjon.) Psonskade kan forekomme ved inhalasjon, svelging, hudtakt og øyetakt. Kass beholde og eventuelt ubrukt innhold i samsvar med gjeldende lokale offentlige sikkhetsstandard. For m informasjon, takt Illumina tekniske støtte. 2 Noen av komponentene i Illuminas reagenssett innehold 2-mcaptoetanol, et redusingsmiddel. (Se de respektive produktvedleggene for m informasjon.) Psonskade kan forekomme ved inhalasjon, svelging, hudtakt og øyetakt. Brukes i et godt ventilt område og eventuelle beholde og ubrukt innhold skal kasses i samsvar med gjeldende lokale, statlige sikkhetsstandard. For m informasjon, takt Illuminas tekniske støtte. 3 Håndt alle prøv som om de potensielt infeksiøse stoff. 4 Hvis du unnlat å følge prosedyrene som beskrevet, kan det resulte i resultat ell betydelig reduksjon i prøvekvaliteten. 5 Bruk rutinemessige forholdsregl for laboratoriet. Ikke pipett med munnen. Ikke spis, drikk ell røyk i tilordnede arbeidsområd. Bruk engangshansk og laboratoriefrakk når du håndt prøv og settreagens. Vask hendene grundig ett å ha håndtt prøvene og settreagensene. 6 God laboratoriepraksis og god laboratoriehygiene påkrevd for å hindre at PCR-produkt fra taminende reagens, instrumenting og genomiske DNA-prøv. PCR-tamining kan medføre unøyaktige og upålitelige resultat. For å hindre tamining på du påse at preamplifisings- og postamplifisings-områdene har sitt eget utstyr (som pipett, pipettespiss, vorteks og sentrifuge). 8 Indeksprøvesammensetn må samsvare nøyaktig med prøvearket. Misforhold mellom prøvearket og plateoppsettet vil resulte i tap av positiv prøveidentifikasjon og uriktig resultatrapporting. 9 Und biblioteknormalisingstrinnene i de respektive reagensproduktvedleggene, det ekstremt kritisk å resuspende bibliotek-kulen. Dette avgjørende for å oppnå clusttetthet på MiSeqDx flowcellen. 0 Følg de spesifiste inkubasjonstidene i biblioteknormalisingstrinnene som beskrevet i de respektive reagenspakkevedleggene. Feil inkubasjon kan påvirke bibliotekrepresentasjonen og clusttettheten. Installasjon av buklevt antivirusprogramvare anbefales stkt for å beskyttede datamaskinen mot virus. Se brukhåndboken for instruksjon om installasjon. 2 Ikke betjen MiSeqDx med noen av dekslene fjnet. Betjening av instrumentet med noen av dekslene fjnet utgjør mulig eksponing til nettspenning ell likespenning. 3 Ikke bør flowcellehyllen i flowcellekammet. Varmeenheten i dette kammet fung mellom 22 C og 95 C og kan forårsake brannsår. 4 Instrumentet vei omtrent 5 kg og kan forårsake alvorlig skade hvis det fall ned ell behandles på måte. Februar 204 Delenumm Rev. A NOR 3

4 Prosedyremessige mknad Gjennomløpet p MiSeqDx-kjøring kan være mellom 8 og 48 prøv. Indeksingsprimne som brukes und PCRamplifis, må velges på grunnlag av ønsket endelig prøvegjennomløp for å sikre divsitet i indekssekvensen. MERK For å få maksimal gjennomløpseffektivitet må biblioteksklargjøring utføres for opptil 96 prøv, og dett må prøvene deles inn i to sekvensingskjøring med maksimum 48 prøv hv. MiSeqDx bruk en grønn LED-lampe for å sekvense G/T-bas og en rød LED-lampe til sekvensing av A/C-bas. For hv syklus må minst én av to nukleotid i hv fargekanal avleses for å sikre riktig registring. Det viktig å opprettholde fargebalansen for hv base av indeksavles som sekvenses, ells kan det oppstå registrings und sekvensing av indeksavles. Hvis det sekvenses færre enn 48 prøv i en sekvensingskjøring, velg du de aktuelle indeksene bast på de tilhørende sekvensene for å opprettholde fargebalansen i de grønne og røde kanalene. Som minimum må kjøring med 8 til 48 prøv inklude indeksingsprimkombinasjonene som identifises i pakningsvedlegget for MiSeqDx univsalsett.0. For å behandle mindre kjøring på riktig måte må det være minst åtte prøv til stede. Hvis seks unike prøv (ekskludt de positive og negative trollene) ikke tilgjengelige, det akseptabelt å fylle kjør med prøveplikat ell enhv form for human DNA-prøve. Se pakningsvedlegget for MiSeqDx univsalsett.0 for det minimale settet med fargebalanste indeks til bruk ved sekvensingskjøring med åtte prøv. Bruksanvisning Følgende bruksanvisning for MiSeqDx-instrumentet krev reagens, skaffet i MiSeqDx univsalsett.0. MiSeqDx Klargjøre prøveark Fra velkomstskjmen på Illumina Worklist Manag velges Create Worklist (Opprett arbeidsliste). 2 Velg MiSeqDx Univsal i feltet Test Type (Testtype). 3 I feltet Worklist Name (Arbeidslistenavn), oppgi et navn på prøvearket. Hvis den alfanumiske strekkode-id-en på reagenskassetten brukes som prøvearknavn, vil MiSeqdriftsprogramvare (MOS) finne prøvearket automatisk. Hvis det blir brukt et annet navn på prøvearket, kan knappen Browse (Bla gjennom) MiSeqdriftsprogramvare (MOS) brukes til å finne det aktuelle prøvearket. 4 [Valgfritt] Gi en beskrivelse for å identifise kjør. 5 Sørg for at datoen ovensstemm med startdatoen på kjør. 6 Velg Next (Neste). Oppgi prøveinformasjon Fra fanen Table (Tabell) ell Plate, oppgi følgende informasjon for hv brønn som innehold prøve: a Sample-ID (Prøve-ID) Oppgi en unik prøve-id. b Inndex and Index 2 (Indeks og Index 2) Angi indeksadapten som skal brukes for hv indeksavlesing. c Manifest Angi navnet på manifestfilen som innehold informasjon om prøvene i denne spesielle brønnen. 2 [Valgfritt] Hvis du vil registre m detaljt informasjon om prøvene, kan du oppgi et prøvenavn og beskrivelse. 3 [Valgfritt] Du kan identifise troll på platen ved å velge Negativ ell Positiv fra nedtrekkemenyen Control (Kontroll). 4 Gå til fanen for plategrafikk og bruk altnativet Copy to Clipboard (Kopi til utklippstavle) ell Print (Skriv ut) for å fange et bilde av prøveplaten. 4 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

5 5 Velg Finish (Avslutt). Klargjøre prøve Følgende trinn må utføres i samsvar med bruksanvisn i pakningsvedlegget for MiSeqDx Univsal Kit.0: Hybridising av sammenslåtte oligonukleotid Fjning av ubundne oligonukleotid Ekstensjonsligasjon av bundne oligonukleotid PCR-amplifising PCR-rengjøring Biblioteknormalising Biblioteksammenslåing Klargjøre reagenskassetten Tin Reagenskassett for MiSeqDx i vannbad som har tilstrekkelig avionist vann med romtempatur til at bunndelen av reagenskassetten når opp til vannlinjen som trykket på reagenskassetten. Ikke la vannet komme høye enn maksimum vannlinje. 2 La reagenskassetten tine i vannbadet med romtempatur i omtrent time ell til den fullstendig opptint. 3 Ta kassetten opp av vannbadet og bank den forsiktig på benken for å fjne vann fra bunndelen av kassetten. Tørk av bunndelen av kassetten. Påse at det ikke har kommet vann på den øvre delen av reagenskassetten. Kontrolle reagenskassetten Snu reagenskassetten ti gang for å blande de tinte reagensene og troll dett at alle posisjonene tint. MERK Det kritisk av reagensene i kassetten grundig tint og blandet for å sikre tilfredsstillende sekvensing. 2 Kontroll reagensen i posisjon for å påse at den fullt blandet og fri for bunnfall. 3 Bank kassetten forsiktig mot benken for å reduse luftbobl i reagensene. MERK MiSeqDx-sugørene går til bunnen på hvt resvoar for å aspire reagensene, så det viktig at resvoarene fri for luftbobl. 4 Sett reagenskassetten på is ell sett den til side ved 2 C til 8 C (opp til 6 tim) til det klart til å sette opp kjør. For å få de beste resultatene, fortsett direkte til innlasting av prøven og oppsetting av kjør. Klargjøre prøv for sekvensing Bring Bibliotekfortynningsbuff til romtempatur. Vorteks Bibliotekfortynningsbuff og påse at alt bunnfallet fullstendig oppløst. 2 Hvis SGP-platen ble oppbevart frossen, skal SGP-platen tines i romtempatur. 3 Sentrifug SGP-platen ved 000 g i 20 C i minutt. 4 Sett ut et nytt Eppendorf-rør (hett kalt PAL-rør.) 5 Bestem hvilke prøv som skal gruppes for sekvensing. Maksimum 48 prøv kan gruppes for sekvensing. 6 Hvis SGP-platen var oppbevart frossen, blandes hvt bibliotek som skal sekvenses ved å pipette opp og ned 3-5 gang. Ovfør 5 µl av hvt bibliotek som skal sekvenses fra SGP-plate, kolonne ett kolonne, til en strimmel med åtte med PCR-rør. Forsegle SGP med en klebeplateforsegling og sett den til side. MERK Ett bruk oppbevares den forseglede SGP-platen ved -25 C til -5 C. Den forseglede SGP-platen stabil i opp til 3 dag. Februar 204 Delenumm Rev. A NOR 5

6 8 Kombin og ovfør inneholdene i strimmelen med åtte PCR-rør til PAL-røret. Bland PAL-røret grundig. 9 Sett ut et nytt Eppendorf-rør (hett kaltdal-rør.) 0 Tilsett 585 µl Bibliotekfortynningsbuff i DAL-røret. Tilsett 6 µl av 20 pm PhiX-intntroll i DAL-røret. Pipett opp og ned 3-5 gang for å skylle spissen og sikre at ovfør fullstendig. 2 Ovfør 9 µl av PAL- til DAL-røret som innehold Bibliotekfortynningsbuff. Pipett opp og ned 3-5 gang for å skylle spissen og sikre at ovfør fullstendig. 3 Bland DAL ved å vortekse røret med topphastighet. 4 Sentrifug DAL-røret ved 000 g i 20 C i minutt. 5 Inkub DAL-røret på en varmeblokk ved 96 C i 2 minutt. 6 Ett inkubasjonen invtes DAL-røret -2 gang for å blande, og settes dett umiddelbart i isvann. La DAL-røret stå i isvann i 5 minutt. Laste inn prøvebibliotek på kassetten Bruk en separat, ren og tom ml pipettespiss til å gjennomhulle folieforsegl ov resvoaret på reagenskassetten mket Load Samples (Last inn prøv). 2 Pipettet 600 µl fra prøvebiblioteket til resvoaret Load Samples (Last inn prøv). Vær forsiktig slik at du unngår å børe folieforsegl mens prøven dispenses. Sjekk for luftbobl i resvoaret ett at prøven lastet inn. Hvis luftbobl tilstede, bank du kassetten forsiktig mot benken for å frigjøre boblene. 3 Fortsett direkte til kjøringsoppsett-trinnene ved bruk av MiSeq-driftsprogramvare (MOS)-grensesnittet. Kjøringsoppsett Logg inn på MiSeq-driftsprogramvare (MOS). 2 Velg Sequence (Sekvens). En sie med kjøringsoppsettsskjm åpnes i denne rekkefølgen: Select Run Type (Velg kjøringstype), Load Flow Cell (Sett inn flowcelle), Load Reagents (Last inn reagens), Review (Gjennomgang) og Pre-Run Check (Før kjøring-troll). 3 Velg Diagnostic Run (Diagnostisk kjøring). 4 Når skjmen Load Flow Cell (Sett inn flowcelle) vises, skal flowcellen rengjøres og lastes inn. 5 Lukk flowcellesplåsen og døren til flowcellekammet. Både låsen og kammdøren skal være lukket før kjør begynn. Når flowcellen satt inn, vil programvaren lese av og registre RFID-en. En bekreftelse om at RFID var avlest vises nedst i høyre hjørne på skjmen. 6 Når skjmen Load Reagents (Last inn reagens) vises, tømmes avfallsflasken, flasken MiSeqDx SBS-løsning (PR2) settes inn og dett lastes reagenskassetten. Når flasken med MiSeqDx SBS-løsn (PR2) og reagenskassetten lastet inn, vil programvaren lese av og registre RFID-en. En bekreftelse om at RFID var avlest vises nedst i høyre hjørne på skjmen. Velg det aktuelle prøvearket. Som standard vil programvaren se ett en prøvearkfil med et navn som samsvar med strekkodetallet på reagenskassetten som lastet inn på instrumentet. 8 Bekreft kjøringsinnstille og resultatene fra før kjøring-trollen. 9 Start kjør. Sekvensingsskjmen åpnes når kjør begynn. Dette skjmen gir en visuell fremstilling av kjørs fremgang, inkludt intensitet og kvalitetsskår (Q-skår). 6 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

7 Resultat Den integrte primæranalyseprogramvaren ([sanntidsanalyse RTA]) utfør bildeanalyse og baseg, i tillegg til at den tildel en kvalitetsskåre for hv base for hv sekvensingssyklus. Når primæranalysen fdig, start MiSeq Report programvaren på MiSeqDx-instrumentet sekundæranalysen som beskrevet nedenfor. Demultipleksing Demultipleksing det første trinnet i analysen hvis prøvearket har oppført fle prøv og kjør har indeksavlesing. Demultipleksing skill data fra samlede prøv, bast på korte indekssekvens som mk prøv fra ulike bibliotek. Hv indeksavlest sekvens sammenlignes med indekssekvensene som spesifist i prøvearket. Ingen kvalitetsvdi vurdes på dette trinnet. FASTQ-filgening Ett demultipleksing MiSeq Report genes mellomliggende fil i FASTQ-formatet, som en tekstform som brukes til å represente sekvensene. FASTQ-fil innehold avlese for hv prøve og kvalitetsskårene, uten avlesing fra eventuelle cluste som ikke pass filtet. Kvalitetsskåren Q begnes som -0 log 0 P, d P sannsynligheten for at basegen. Sammenstilling Innretting sammenlign sekvens mot refansen for å identifise et forhold mellom sekvens og tildel en skåre, bast på likhetsområd. Innrettede avlesing skrives til fil i BAM-format. For MiSeqDx univsalsett.0 bruk MiSeq Report en "bundet" Smith-Watman-algoritme som utfør lokale sekvenssammenstilling for å fastslå lignende områd mellom to sekvens. Variantg For MiSeqDx univsalsett.0 bruk MiSeq Report Starling-variantg, som påvis SNP- og små indel i tillegg til å oppsumme dybde og sannsynlighet for hv posisjon i genomet. Starling produs html-formatte rapport for SNP- og indel og tabulatoravgrensede tekstfil som innehold variant i variantgsformatet (VCF). For informasjon om hvordan resultatene kan begnes fra VCF-fil, se Brukveiledning for MiSeq Report (delenumm ). Ytelseskaraktistikk Nøyaktighet Tre separate studi ble utført for å vurde nøyaktigheten ved MiSeqDx-plattformen. Studie Denne studien brukte en representativ analyse, utarbeidet for å utforske en rekke gen som dekk bas ov 9 ulike kromosom og innehold potensielt klinisk relevante ekson. De 3 unike prøvene som brukes i denne studien komm fra to foreldre og barn som har blitt sekvensit ofte av fle laboratori og sekvensingsmetod. Det foreligg seks prøv fra kvinn og sju fra menn. Nøyaktigheten ble fastslått for enkle nukleotidevariant (SNV) ved å sammeligne studiedata med en godt karaktist refansedatabase. Refansedatabase-sekvensen ble avledet av kombinasjonen av fle sekvensingsmetod, offentlig tilgjengelige data og arvelighetsinformasjon. Følgende tabell for evaluing av nøyaktigheten i systemet var sammensatt fra data fra den første kjør i studien. Ingen repetisjonstesting ble utført for denne studien. Resultatene fra denne studien beskrevet nedenfor. Februar 204 Delenumm Rev. A NOR

8 Tabell Studie Presisjonsdata på amplinivå for MiSeqDx plattform Kromosonm fragmentstørrelse genomisk innhold unike prøv analyste prøv 2 g p prøve som kan utføres 3 g 4 g p prøve 5 g 6 g 32 Poly C, 63 % GC Poly T Poly T Poly A (6) Poly T, Poly C, Poly T Poly A (4) , Poly A Poly A Poly T Delenumm Rev. A NOR Februar 204

9 Kromosonm fragmentstørrelse genomisk innhold unike prøv analyste prøv 2 g p prøve som kan utføres 3 g 4 g p prøve 5 g 6 g Poly T Poly T, SNV Poly A Poly A (6) Poly T, Homologt område på et annet kromosom Homologt område på et annet kromosom Poly T Poly C (), 66% GC Poly C, 69% GC SNV Delenumm Rev. A NOR Februar 204

10 Kromosonm fragmentstørrelse genomisk innhold unike prøv analyste prøv 2 g p prøve som kan utføres 3 g 4 g p prøve 5 g 6 g Poly A SNV Poly T Poly A Poly T (6) Poly A Poly T, SNV Poly T, SNV SNV Delenumm Rev. A NOR Februar 204

11 Kromosonm fragmentstørrelse genomisk innhold unike prøv analyste prøv 2 g p prøve som kan utføres 3 g 4 g p prøve 5 g 6 g Poly T Poly A () Poly A (6) Poly A Poly A Delenumm Rev. A NOR Februar 204

12 Kromosonm fragmentstørrelse genomisk innhold unike prøv analyste prøv 2 g p prøve som kan utføres 3 g 4 g p prøve 5 g 6 g CT SNV Poly T (6) % GC Poly A (6) Poly T (8) % GC Poly A 59 % GC Poly C, 63 % GC % GC SNV Delenumm Rev. A NOR Februar 204

13 Kromosonm fragmentstørrelse genomisk innhold unike prøv analyste prøv 2 g p prøve som kan utføres 3 g 4 g p prøve 5 g 6 g 8 33 Poly A Poly T % GC % GC Poly G (6); 6 % GC Poly T Poly A (6) % GC % GC Poly T Homologt område på et annet kromosom Delenumm Rev. A NOR Februar 204

14 Kromosonm fragmentstørrelse genomisk innhold unike prøv analyste prøv 2 g p prøve som kan utføres 3 g 4 g p prøve 5 g 6 g 93 9 Homologt område på et annet kromosom Poly A (4) (av 30) 5 99, Homologt område på et annet kromosom SNV Poly A Poly C % GC Poly A 5 % GC % GC Poly C, 6 % GC Delenumm Rev. A NOR Februar 204

15 Kromosonm fragmentstørrelse genomisk innhold unike prøv analyste prøv 2 g p prøve som kan utføres 3 g 4 g p prøve 5 g 6 g % GC % GC % GC % GC SNV % GC Poly T % GC Poly T ; Homologt område på et annet kromosom CA(4) Poly A (6); Homologt område på et annet kromosom Poly C, SNV Delenumm Rev. A NOR Februar 204

16 Kromosonm fragmentstørrelse genomisk innhold unike prøv analyste prøv 2 g p prøve som kan utføres 3 g 4 g p prøve 5 g 6 g % GC Poly T (0) Poly T Poly A Poly T Poly A (6) Poly T (6) Poly T Poly T (8); 9 % GC Poly A ; Poly T Delenumm Rev. A NOR Februar 204

17 Kromosonm fragmentstørrelse genomisk innhold unike prøv analyste prøv 2 g p prøve som kan utføres 3 g 4 g p prøve 5 g 6 g 36 3 Poly A % GC SNV 38 3 Poly T (8); SNV Poly A Poly A % GC Poly C SNV Poly T (6) Poly T ; 26 % GC Poly A Delenumm Rev. A NOR Februar 204

18 Kromosonm fragmentstørrelse genomisk innhold unike prøv analyste prøv 2 g p prøve som kan utføres 3 g 4 g p prøve 5 g 6 g % GC Poly C % GC Poly C (6), 60 % GC SNV % GC Poly C, 65% GC Delenumm Rev. A NOR Februar 204

19 Kromosonm fragmentstørrelse genomisk innhold unike prøv analyste prøv 2 g p prøve som kan utføres 3 g 4 g p prøve 5 g 6 g 0 3 Poly G (6); 6 % GC SNV % GC Poly C % GC % GC Poly A (6) % GC Poly G (6); 66 % GC % GC % GC Delenumm Rev. A NOR Februar 204

20 Kromosonm fragmentstørrelse genomisk innhold unike prøv analyste prøv 2 g p prøve som kan utføres 3 g 4 g p prøve 5 g 6 g % GC Homologt område på et annet kromosom Poly C, 2 % GC Homologt område på et annet kromosom % GC % GC Poly T Poly A () Poly A ; Poly C % GC SNV % GC fragment betyr størrelsen på det sekvenste genomiske området i bas, ikke inkludt målspesifikke prime. 2 oppførte prøv 5, fordi to av de 3 unike prøvene som var analyst var kjørt i to uavhengige replikat. 3 g/prøv som kunne gjøres et bas som hadde tilstrekkelig kvalitet til å bli påvist av systemet. 20 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

21 4 et g et bas i et ampli som result i en g i kjør. 5 et g p prøve et påviste bas i ampliet som hadde resultat som samsvarte med refansesekvensen for det humane genomet, bygg 9 og den godt karaktiste sammensatte refansen. 6 et u g var det totale et u g for SNV ell indel i dette ampliet. Yttlige detalj om g beskrevet i fotnoten nedenfor. Prosenttallet for g like den gsfrekvensen for alle basene i ampliet, d den gen for SNV ell indel bast på den godt karaktiste sammensatte refanseinformasjonen, og den gen for bas i gjenværende amplisekvens bast på sammenligning med refansesekvensen for humant genom, bygg 9. Denne kolonnen kan ha m enn ett forventet resultat for et gitt ampli hvis noen prøv innehold en indel, mens andre ikke gjør det, det vil si ampli 9. Prosenttallet for g for prøvene med resultat vises i tabellen. 8 con 9 har en homopolymkjøring på 4 A- i samsvar med refansesekvensen for det humane genomet, bygg 9. Den godt karaktiste sammensatte refanseinformasjonen for og 3 prøv har imidlltid 3 A- i denne homopolymkjør. I disse prøvene represent sletting av dette ene baseparet en falsk negativ i MiSeqDx sekvensings nøyaktighetsstudie har en én baseinnsetting som rapportt i 9 prøv i godt karaktist refansedatabase og riktig detektt i alle analyste prøv har en homopolymkjøring på 4 A- i samsvar med refansesekvensen for humant genom, bygg9. Den godt karaktiste sammensatte refansesekvensen for 3 av 3 prøv har 5 A- i denne homopolymkjør. I disse 3 prøvene denne ene parinnsett en falsk negativ i MiSeqDx sekvensings nøyaktighetsstudie. 2 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

22 Følgende tabell innehold data fra Studie, vist med positiv og negativ prosentsamsvar, d variantresultatene sammenlignet med den godt karaktiste sammensatte refanseinformasjonen for PPA-begning. Siden den sammensatte refanseinformasjonen kun gir resultat for de enkle nukleotidevariantene og innsetting/sletting, ikke-variante basesultat sammenlignet med refansesekvensen for humant genom, bygg 9, for NPA-begning. Alle ikke-variantbas hadde 00 % samsvar med refansesekvensen. Alle SNV- hadde 00 % samsvar med refansesekvensen. Variant som manglet var enten baseinnsetting ell basesletting i homopolymområd. Tabell 2 Samsvar mellom MiSeqDx plattform basepåviste resultat og refansedata for 3 godt karaktiste prøv. Prøve amplie r Prosent amplideknin g Variante r forvente t p prøve 2 Variante r riktig påvist Variante r gått tapt 3 Ikkevariantbase r riktig p [vist PPA 4 (%) NP A 5 (%) NA28 NA28 8 NA28 9 NA288 0 NA288 NA288 2 NA288 3 NA288 4 NA288 5 NA288 6 NA288 NA288 8 NA , , , , , , , , , , , , , Prosentvis amplidekning et bas i ampli sekvenst med fidens. 2 Variant forventet p prøve inklud både SNV- og indel. 3 Du finnes de tapte variantene i den første tabellen for studie og fotnotene Positivt prosentsamsvar (PPA) = 00xTP/(TP+FN), d de sanne positive (TP) et positive variantg på genomiske koordinat, d variant tilstede i henhold til refensesekvensen og påvist mutant-allele ovensstemm med refansesekvensen (kolonnen kalt "Variant påvist riktig"), og de falske negative (FN) et negative variantg på genomiske koordinat, d variant tilstede i henhold til refansesekvensen (kolonnen kalt "Variant gått tapt"). Februar 204 Delenumm Rev. A NOR 22

23 5 Negativt prosentsamsvar (NPA) = 00xTN/(FP+TN) d de falske positive (FP) et positive variantg på genomiske koordinat, d variant fraværende i henhold til refansesekvensen, ell hvis påvist mutant-allele uovstemm med refansesekvensen (ikke i tabellen, falske positive variantg ble gjort i denne studien) og sanne negative (TN) et negative variantg på genomiske koordinat, d variant fraværende i henhold til refansestandarden (kolonnen kalt "ikke-variantbas påvist riktig ). Studie 2 Sekvensingsresultatet for amplipanelet ovenfor ble sammenlignet med en høyt fident genotype, etablt for NA288 av National Institutes of Standards and Technology (NIST) (v.2.5 ). Av de 95 ampliene var 84 ampli innen høye fidentt refanseg i NIST-sekvensen og ble sammenlignet. Ikke-variante baseg ble sammenlignet med refansesekvensen for humant genom, bygg 9. Tabell 3 Sammenligning av MiSeqDx plattform sekvensingsresultatet for NA288-prøve med NIST-database Prøve amplie r Prosentvis amplideknin g 2 Variante r forvente t Variante r riktig påvist Variante r gått tapt Ikkevariantbase r påvist riktig PPA 3 (%) NP A 3 (%) NA , 2 00 Zook, JM et al. Integre sekvensende datasett for å opprette høyt fident SNP og indel genotypeg for et helt humant genom. arxiv: [q-bio.gn]. 2 % amplidekning et bast i ampli sekvenst med fidens. 3 Positivt prosentsamsvar (PPA) = 00xTP/(TP+FN). 4 Negativt prosentsamsvar (NPA) = 00xTN/(FP+TN). 5 Den manglende varianten den ene baseparslett i ampli 9 i homopolymkjøringne av 4 A- som ikke påvist av MiSeqDx som tilstede i NIST-sekvensen. Vær oppmksom på at NIST-sekvensen ikke inklud den ene baseparinnsett i den andre homopolymen av A- som var tilstede i den andre refansedatabasen brukt ovenfor i studie. Studie 3 En ekstra nøyaktighetsstudie ble utført for å vurde ytelsen til små innsetting og sletting innen en representativ analyse, Illumina MiSeqDx Cystic Fibrosis 39-Variant Assay, som inkludte en delmengde med CFTR klinisk signifikante genetiske variasjon, analyst med MiSeq Report-programvaren som bruk MiSeqDx plattformmålrettet DNA-sekvensingsflyt. De forespurte innsette og slette ble detektt d de var forventet med høy fidens. Disse prøvene ble karaktist av toveis Sang-sekvensing som en refansemetode til oppretting av den forventede sekvensen. Tabell 4 Oppsumming av indeldeteksjon med MiSeqDx-plattform Innsettstør relse genomisk innhold g/ prøv som ikke kunne utføres påviste bas/pr øve påvisni ng g/ prøve u påvisni ng Prosent påvisni ng 29 baseinnset ting Delenumm Rev. A NOR Februar 204

24 Innsettstør relse genomisk innhold g/ prøv som ikke kunne utføres påviste bas/pr øve påvisni ng g/ prøve u påvisni ng Prosent påvisni ng baseslettin g baseslettin g 4 34 baseslettin g 5 32 baseslettin g 6 29 baseslettin g Dataene fra disse nøyaktighetsstudiene støtt påstanden om at MiSeqDx-plattformen kan sekvense nøyaktig: GC-innhold 9 % (alle bas i 35 av 35 sekvenste ampli med 9 % GC-innhold riktig påvist) GC-innhold 2 % (alle bas i 35 av 35 sekvenste ampli med 2 % GC-innhold riktig påvist) PolyA-lengd (PolyA-gjentakelse av nukleotid ble riktig påvist i 20 av 20 sekvenste ampli som inneholdt PolyA =) PolyT-lengd 8 (PolyT-gjentakelse av 8 nukleotid ble riktig påvist i 20 av 20 sekvenste ampli som inneholdt PolyT =8) PolyG-lengd 6 (PolyG-gjentakelse av 6 nukleotid ble riktig påvist i 405 av 405 sekvenste ampli som inneholdt PolyG =6) PolyC-lengd (PolyC-gjentakelse av nukleotid ble riktig påvist i 35 av 35 sekvenste ampli som inneholdt PolyC =) Dinukleotidegjentakelseslengd 5x (alle bas i 35 av35 sekvenste ampli med 5x dinukleotidegjentakelse ble riktig påvist) Trinukleotidegjentakelseslengd 4x (alle bas i 80 av 80 sekvenste ampli med 4x trinukleotidegjentakels ble riktig påvist) baseinnsetting og 3 ell færre basesletting 2 av 3 -baseinnsetting som ble testet ble riktig påvist. Riktige g ble gjort for to - baseinnsetting i ikke-homopolymregion i 82 ampli. Én -baseinnsetting ble ikke påvist i en homopolymkjøring på 4 A- på kromosom 2 i 35 ampli. 3 av 4 -basesletting ble riktig påvist. Alle g ble gjort i ikke-homopolymregion i 4 ampli. Én -basesletting ble ikke påvist i en homopolymkjøring på 4 A- på kromosom 9 i 63 ampli. 2-basesletting ble riktig påvist i én prøve. Februar 204 Delenumm Rev. A NOR 24

25 3-basesletting ble riktig påvist i 2 prøv. Reprodusbarhet Reprodusbarheten i MiSeqDx-plattformen ble bestemt ved bruk av to representative analys. Studie En representativ analyse ble utarbeidet for å utforske en rekke gen som dekk bas ov 9 ulike kromosom og innehold potensielt klinisk relevante ekson. Studien undsøkte 3 prøv ov ni kjøring som brukte tre ulike MiSeqDx-instrument og tre ulike opatør (Tabell 5). Et enkelt parti med reagens for klargjøring av biblioteket og to parti med sekvensingsforbruksmatiell ble brukt. De 3 prøvene var fra to foreldre og barn som hadde blitt sekvensit ofte av fle laboratori og sekvensingsmetod. To prøv ble kjørt i duplikat, slik at hv kjøring gente resultat fra 5 prøv. For evaluing av reprodusbarheten fra parti til parti, ble 94 prøv og to ikke-templat-troll testet på tvs av tre parti. Hvt parti ble delt i to 48-prøvs kjøring for å teste alle reagens og mulige indeksprimkombinasjon. Alle sekvensingskjøre ble fullført av en enkel opatør og på et enkelt MiSeqDxinstrument for å fjne eventuell potensiell varians fra opatøren ell instrumentet (Tabell 6). Nøyaktige g ble fastslått for enkle nukleotidevariant (SNV) ved å sammenligne studiedata med en godt karaktist refansedatabase. Det var mislykkede kjøring ell nye kjøring i reprodusbarhetsstudien. Følgende tabell vis resultatene fra studiene som evalute reprodusbarheten i systemet. 25 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

26 Tabell 5 Study Resultat fra instrument til instrument-reprodusbarhet for MiSeqDx-plattformen (amplinivå) K r. fragmentstør relse - genom isk innhol d antal let prøv i kjøri ng 2 MiSeqDx MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 32 Poly C, 63 % GC 2 28 Poly T , , Poly T Poly A (6) 2 22 Poly T ; Poly C Poly T Poly A (4) , , ,54 26 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

27 K r. fragmentstør relse - genom isk innhol d antal let prøv i kjøri ng 2 MiSeqDx MiSeqDx 2 MiSeqDx Poly A Poly A ; Poly T Poly T Poly T ; SNV Poly A 2 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

28 K r. fragmentstør relse - genom isk innhol d antal let prøv i kjøri ng 2 MiSeqDx MiSeqDx 2 MiSeqDx Poly A (6); Poly T ; Homol ogt område på et annet kromos om Homol ogt område på et annet kromos om Poly T Poly C (), 66 % GC 28 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

29 K r. fragmentstør relse - genom isk innhol d antal let prøv i kjøri ng 2 MiSeqDx MiSeqDx 2 MiSeqDx Poly C ; 69 % GC SNV Poly A ; SNV Poly T Poly A Poly T (6) 29 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

30 K r. fragmentstør relse - genom isk innhol d antal let prøv i kjøri ng 2 MiSeqDx MiSeqDx 2 MiSeqDx Poly A ; Poly T ; SNV Poly T ; SNV SNV Poly T Poly A () 30 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

31 K r. fragmentstør relse - genom isk innhol d antal let prøv i kjøri ng 2 MiSeqDx MiSeqDx 2 MiSeqDx Poly A (6) Poly A Poly A CT 3 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

32 K r. fragmentstør relse - genom isk innhol d antal let prøv i kjøri ng 2 MiSeqDx MiSeqDx 2 MiSeqDx SNV Poly T (6) % GC Poly A (6); Poly T (8) % GC Poly A ; 59% GC Poly C ; 63 % GC 32 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

33 K r. fragmentstør relse - genom isk innhol d antal let prøv i kjøri ng 2 MiSeqDx MiSeqDx 2 MiSeqDx % GC SNV Poly A ; Poly T % GC % GC 84 9 Poly G (6); 6% GC Poly T 33 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

34 K r. fragmentstør relse - genom isk innhol d antal let prøv i kjøri ng 2 MiSeqDx MiSeqDx 2 MiSeqDx Poly A (6) % GC % GC Poly T Homol ogt område på et annet kromos om Homol ogt område på et annet kromos om Delenumm Rev. A NOR Februar 204

35 K r. fragmentstør relse - genom isk innhol d antal let prøv i kjøri ng 2 MiSeqDx MiSeqDx 2 MiSeqDx Poly A (4) Homol ogt område på et annet kromos om SNV , , , Poly A ; Poly C % GC Poly A ; 5% GC 35 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

36 K r. fragmentstør relse - genom isk innhol d antal let prøv i kjøri ng 2 MiSeqDx MiSeqDx 2 MiSeqDx % GC Poly C ; 6% GC % GC % GC 20 60% GC % GC SNV % GC 0 23 Poly T % GC Delenumm Rev. A NOR Februar 204

37 K r. fragmentstør relse - genom isk innhol d antal let prøv i kjøri ng 2 MiSeqDx MiSeqDx 2 MiSeqDx Poly T ; Homol ogt område på et annet kromos om CA(4) Poly A (6); Homol ogt område på et annet kromos om 9 Poly C ; SNV Delenumm Rev. A NOR Februar 204

38 K r. fragmentstør relse - genom isk innhol d antal let prøv i kjøri ng 2 MiSeqDx MiSeqDx 2 MiSeqDx % GC Poly T (0) Poly T 3 Poly A Poly T Poly A (6) 38 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

39 K r. fragmentstør relse - genom isk innhol d antal let prøv i kjøri ng 2 MiSeqDx MiSeqDx 2 MiSeqDx Poly T (6) 32 Poly T Poly T (8); 9% GC 34 Poly A ; Poly T 3 Poly A 33 SNV; 26 % GC 3 Poly T (8); SNV 3 Poly A 39 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

40 K r. fragmentstør relse - genom isk innhol d antal let prøv i kjøri ng 2 MiSeqDx MiSeqDx 2 MiSeqDx Poly A % GC Poly C SNV Poly T (6) 40 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

41 K r. fragmentstør relse - genom isk innhol d antal let prøv i kjøri ng 2 MiSeqDx MiSeqDx 2 MiSeqDx Poly T ; 26% GC 5 Poly A % GC Delenumm Rev. A NOR Februar 204

42 K r. fragmentstør relse - genom isk innhol d antal let prøv i kjøri ng 2 MiSeqDx MiSeqDx 2 MiSeqDx Poly C % GC Poly C (6); 60% GC SNV % GC 68 8 Poly C ; 65 % GC Delenumm Rev. A NOR Februar 204

43 K r. fragmentstør relse - genom isk innhol d antal let prøv i kjøri ng 2 MiSeqDx MiSeqDx 2 MiSeqDx Poly G (6); 6% GC SNV 2 6 % GC 8 Poly C 38 6 % GC 3 58 % GC Poly A (6) Delenumm Rev. A NOR Februar 204

44 K r. fragmentstør relse - genom isk innhol d antal let prøv i kjøri ng 2 MiSeqDx MiSeqDx 2 MiSeqDx % GC Poly G (6); 66% GC % GC 3 6% GC % GC Homol ogt område på et annet kromos om 44 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

45 K r. fragmentstør relse - genom isk innhol d antal let prøv i kjøri ng 2 MiSeqDx MiSeqDx 2 MiSeqDx Poly C ; 2% GC Homol ogt område på et annet kromos om % GC % GC Poly T 36 Poly A () 22 Poly A ; Poly C 45 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

46 K r. fragmentstør relse - genom isk innhol d antal let prøv i kjøri ng 2 MiSeqDx MiSeqDx 2 MiSeqDx % GC SNV 9 66 % GC fragment størrelsen på det sekvenste genomiske området i bas, ikke inkludt målspesifikke prime. 2 et prøv blir begnet fra 9 kjøring av 5 prøv ( prøv kjøres én gang og 2 prøv kjøres to gang). 3 g det kombinte et g oppnådd for alle 45 kjøre som analys det spesifikke ampliet ved bruk av et spesifikt MiSeqDxinstrumentet 4 u g det kombinte et u g oppnådd for alle 45 kjøring som analys det spesifikke ampliet ved bruk av MiSeqDx-instrumentet. 5 % g lik den gsraten for alle basene i ampliet, d den gen for SNV ell indel bast på den godt karaktiste refansedatabasen, og den gen for bas i den gjenværende amplisekvensen bast på sammenligning med refansekvens bygg 9 for humant genom. Denne kolonnen har kanskje m enn ett forventet resultat for et gitt ampli hvis noen prøv forventes å ha en indel og noen ikke, for eksempel ampli 9. 6 con hadde et bast med genotype som ikke kunne påvises: 2 bas i /9 kjøring i NA288; base i 2/9 kjøring og 3 bas i /9 kjøring i NA2886; 20 bas i /9 kjøring og 26 bas i /9 kjøring i NA2888. Dette skyldes lav dekning ved gsbas i disse kjøre, d gjennomsnitts sekvensingsdybde var 33,2, med minimum 2 og maksimum 52. Når " g" ikke inkludt i begn, riktig gsrate 00 %. 8 9 har en homopolymkjøring på4 A- i henhold til refansesekvens bygg 9 for humant genom. Den godt karaktiste refanseinformasjonen for av 3 prøv har imidltid 3 A- i denne homopolymkjør. I disse prøvene blir denne ene baseparslett kalt en falsk negativ og blir kalt falsk negativ reprodusbarhet i alle ni kjøre har en homopolymkjøring på 4 A- i henhold til refansesekvens bygg 9 for humant genom. Den godt karaktiste refanseinformasjonen for 3 av 3 prøv har imidltid 5 A- i denne homopolymkjør. I disse 3 prøvene denne ene baseparinnsett 00 % reprodusbart ikke påvist (den falsk negativ). 46 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

47 Resultatene fra reprodusbarhetsstudie for hv prøve vises sammensatt av alle ni kjøre i én kolonne De viste resultatene kun for de enkle nukleotidevariantene og resultatene fra innsetting/sletting vsus refansedatabasesekvensen for tre kjøring på tre instrument. Denne analysen viste at resultatene for variantene var reprodusbare på tvs av ni kjøring for disse prøvene. Tabell 6 Oppsumming av MiSeqDx-plattformens reprodusbarhetsresultat for 3 godt karaktiste prøv DNAnumm DNA- prøve- ID kjøring p prøve SNV- Enkle nukleotidevariant (SNV-) påvist riktig falske positive falske negative 2 indel Innsetting\Sletting (Indel) påvist riktig falske positive falske negative 2 NA28 2 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA Falsk positiv = Variant påvist av sekvenskjøring på MiSeqDx, men ikke i refansedatabasen. 2 Falsk negativ = Variant i refansedatabasen, men ikke påvist i sekvenskjøring på MiSeqDx. 3 Prøve NA28 og NA288 ble kjørt i duplikat. Replikatprøvene ga identiske resultat. 4 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

48 Studie 2 En sted-til-sted reprodusbarhetsstudie utført med en representativ analyse, Illumina MiSeqDx cystisk fibrose 39 variantanalysen, inkludte en delmengde med CFTR klinisk signifikante genetiske variasjon, analyst med MiSeq Report-programvaren med bruk av MiSeqDx-plattform, rettet mot DNAsekvensingsarbeidsflyt. Den blindete studien brukte 3 prøvested og 2 opatør på hvt sted. To godt karaktiste panel på 46 prøv hv ble testet av hv opatør på hvt sted med totalt 80 g p sted. Panelene inneholdt en blanding av genomisk DNA fra cellelinj med kjente variant i CFTR - genet, i tillegg til leukocytt-utarmet blod tilsatt cellelinj med kjente variant i CFTR-genet. Blodprøvene ble gitt for å tilrettelegge inkorporing av ekstraksjonstrinnene som ble brukt til å forbede gdna som fung som primærinngang for analysearbeidsflyten. Prøvegjennomgangsfrekvensen, defint som et prøv som går gjennom QC-metrikken på første forsøk, var 99,88 %. Alle testresultat bast på innledende testing. Tabell Oppsumming av resultatene av reprodusbarhetsstudien, utført med en representativ MiSeqDx cystisk fibrose 39-Variantanalyse. Pan el Prøvenumm Prøvegenotype Variant Totale g p sted Positive samsvarsg (variant) Sted Sted Sted 2 3 Negative samsvarsg (villtype) Sted Sted Sted 2 3 g g Positiv t samsv ar (%) Negati vt samsva r (%) Gene lt samsva r (%) A S549N (HET) A G>A (HET) A 3 Q493X/F508del (HET) A 4 F508del/284delA (HET) A 5 2 Y22X/R58X (HET) A 6 F508del/283AA>G (HET) ,44 94,44 94, A R5X (HET) A 8 I50del/F508del (HET) Delenumm Rev. A NOR Februar 204

49 Pan el Prøvenumm Prøvegenotype Variant Totale g p sted Positive samsvarsg (variant) Sted Sted Sted 2 3 Negative samsvarsg (villtype) Sted Sted Sted 2 3 g g Positiv t samsv ar (%) Negati vt samsva r (%) Gene lt samsva r (%) A 9 3 F508del/W282X (HET) A 0 3 F508del/322-26A>G (HET) A F508del/3849+0kbC >T (HET) A 2 62+G>T/320+G> A (HET) ,22 99,96 99, ,22 99,96 99, A 3 E60X/F508del (HET) A 4 M0K (HET) A 5 M0K (HOM) A 6 F508del (HOM) I506V, I50V, F508C not presen t A F508del/3659delC (HET) A 8 RH/F508del (HET) (TG)0 (T)9/ (TG)2 (T) Delenumm Rev. A NOR Februar 204

50 Pan el Prøvenumm Prøvegenotype Variant Totale g p sted Positive samsvarsg (variant) Sted Sted Sted 2 3 Negative samsvarsg (villtype) Sted Sted Sted 2 3 g g Positiv t samsv ar (%) Negati vt samsva r (%) Gene lt samsva r (%) A 9 62+G>T/+G>T (HET) A 20 G85E/62+G>T (HET) A 2 A455E/F508del (HET) A 22 F508del/R560T (HET) A 23 F508del/Y092X (C>A) (HET) A 24 N303K (HET) A 25 G542X (HOM) A 26 G542X (HET) A 2 G55D/R553X (HET) A kbC>T (HOM) A 29 WT N/A A 30 F508del (HET) A 3 -G>A (HET) A 32 R62X (HET) Delenumm Rev. A NOR Februar 204

51 Pan el Prøvenumm Prøvegenotype Variant Totale g p sted Positive samsvarsg (variant) Sted Sted Sted 2 3 Negative samsvarsg (villtype) Sted Sted Sted 2 3 g g Positiv t samsv ar (%) Negati vt samsva r (%) Gene lt samsva r (%) A 33 R34P/G55D (HET) A 34 R334W (HET) A 35 WT N/A A 36 G85E (HET) A 3 I336K (HET) A 38 WT N/A A 39 F508del/3849+0kbC >T (HET) A G>T/320+G> A (HET) A 4 F508del/3659delC (HET) A 42 RH/F508del (HET) A 43 G85E/62+G>T (HET) A 44 A455E/F508del (HET) (TG)0 (T)9/ (TG)2 (T) A 45 N303K (HET) Delenumm Rev. A NOR Februar 204

52 Pan el Prøvenumm Prøvegenotype Variant Totale g p sted Positive samsvarsg (variant) Sted Sted Sted 2 3 Negative samsvarsg (villtype) Sted Sted Sted 2 3 g g Positiv t samsv ar (%) Negati vt samsva r (%) Gene lt samsva r (%) A 46 G55D/R553X (HET) B G>A (HOM) B 48 CFTR dele2, 3/F508del (HET) B 49 F508del/898+G>A (HET) B 50 WT N/A B 5 F508del/243delT (HET) B delA (HET) B insT (HET) B delTT (HET) B 55 F508del (HET) B 56 WT N/A B 5 WT N/A B 58 F508del (HET) B 59 WT N/A B 60 L206W (HET) Delenumm Rev. A NOR Februar 204

53 Pan el Prøvenumm Prøvegenotype Variant Totale g p sted Positive samsvarsg (variant) Sted Sted Sted 2 3 Negative samsvarsg (villtype) Sted Sted Sted 2 3 g g Positiv t samsv ar (%) Negati vt samsva r (%) Gene lt samsva r (%) B 6 WT N/A B 62 G330X (HET) B 63 WT N/A B 64 R34H (HET) B 65 08delT (HET) B 66 G8R/F508del (HET) B 6 S549R (c.64t>g) (HET) B 68 S549N (HET) B 69 W846X (HET) B 0 WT N/A B E92X/F508del (HET) B G>T/54insT C (HET) ,96 99,96 B 3 G542X (HET) B 4 F508del (HET) B 5 2 F508del (HET) ,44 94,44 94,44 53 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

54 Pan el Prøvenumm Prøvegenotype Variant Totale g p sted Positive samsvarsg (variant) Sted Sted Sted 2 3 Negative samsvarsg (villtype) Sted Sted Sted 2 3 g g Positiv t samsv ar (%) Negati vt samsva r (%) Gene lt samsva r (%) B 6 F508del (HET) B 62+G>T/A455E (HET) B G>A (HET) B 9 WT N/A B 80 F508del/R553X (HET) B 8 F508del/G55D (HET) B 82 R34P/F508del (HET) B 83 RH/F508del (HET) (TG)0 (T)9/ (TG)2 (T) B 84 I50del (HET) B G>A (HOM) B 86 4 CFTR dele2, 3/F508del (HET) B 8 F508del/898+G>A (HET) ,96 99, Delenumm Rev. A NOR Februar 204

55 Pan el Prøvenumm Prøvegenotype Variant Totale g p sted Positive samsvarsg (variant) Sted Sted Sted 2 3 Negative samsvarsg (villtype) Sted Sted Sted 2 3 g g Positiv t samsv ar (%) Negati vt samsva r (%) Gene lt samsva r (%) B 88 WT N/A B 89 F508del/243delT (HET) B insT (HET) B 9 394delTT (HET) B 92 F508del (HET) Total , 99,88 99,88 Villtypeplass som tilsvar N303K-varianten for ett replikat resultte i en Ingen g på grunn av utilstrekkelig dekning. 2 Ett replikat av prøvene 5 og 5 hadde 0 % gsfrekvens. Yttlige undsøkelse angir at prøvene kanskje ikke har vært tilsatt prøveplaten før klargjør av biblioteket, fordi de gjenværende prøvevolumene i rørene var i samsvar med volum som var fjnet. 3 Bevis angir at prøvene 9 og 0 sannsynligvis ble byttet om av opatøren før biblioteket var klargjort. 4 Villtypeplass som tilsvar MV-varianten for ett replikat av hv av to prøv, resultte i Ingen g på grunn av utilstrekkelig dekning. 55 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

56 DNA-ekstraksjon Tre ulike ekstraksjonsmetod, ekstraksjon med magnetiske kul, alkoholutfall og kvartsfilt-kolonneisolasjon ble evalut med K 2 EDTA antikoagult helblod. Fjorten unike blodprøv som ble brukt i studien represent en genotypebredde fra ett representativt gen. De tre DNA-ekstraksjonsmetodene ble testet uavhengig av 2 ulike opatør som hv utførte 3 kjøring p ekstraksjonsmetode. Hv ekstraksjon ble utført av hv opatør på ulike dag. DNA-sentrasjonen og A260/A280-forholdet i de ekstrahte gdna-prøvene ble bestemt med spektrofotometri. Den totale prøvestørrelsen for hv ekstraksjonsmetode i denne studien var 68 (4 prøv x 2 opatør/ekstraksjonsmetode x 3 kjøring/opatør x 2 replikat/ekstraht gdna-prøve). Ekstraksjonsmetode prøv som ble testet Påvisnings-frekvens Nøyaktighet gjennomgangshastighet Prøvens første 2 Alkoholutfelling 68 00% 00% 00% Kvartsfilt kolonneisolasjon Ekstraksjon med magnetiske kul 68 00% 00% 00% 68 00% 00% 00% DNA-inngang Nøyaktighet- Prosentsamsvaret med en refansetestmetode (toveis sekvensing med Sang) begnet for de baseposisjonene som mottar en baseg. 2 Prøvens første gjennomgangshastighet - et prøv som oppfyll den angitte gshastigheten første gang de behandles (det vil si uten behov for ny kjøring ell ekstra behandling) som en prosentvdi av det totale et prøv kjørt i et enkelt MiSeqDxsekvensingsekspiment. Inngangsområdet for DNA for MiSeqDx-plattformen ble evalut ved å utføre en siell fortynningsstudie med 4 representative DNA-prøv som inneholdt 6 unike genevariant. Hv prøve ble testet i duplikat på 9 DNAinngangsnivå fra 250 ng til ng (250 ng, 500 ng, 250 ng, 00 ng, 50 ng, 25 ng, 0 ng, 5 ng og ng). For å bestemme nøyaktighet ble prøvegenotypene sammenlignet med toveis Sang-sekvensingsdata. 250 ng og 25 ng ble identifist som henholdsvis øvre og nedre grense for DNA-inngang 95 % prøvens første gjennomgangshastighet med u g (00 % nøyaktighet og gsfrekens). DNA-inngang på 250 ng, 250 ng og 00 ng ble yttlige testet med 4 representative DNA-prøv og 20 replikat p DNA-inngangsnivå for hv prøve (n=4*20=80 prøv), mens den nedre grensen på 25 ng ble testet med 4 prøv, 20 replikat for hv prøve (n=4*20=280 prøv). Nøyaktigheten og prøvens første gjennomgangshastighet var 00 % på alle DNA-inngangsnivå og prøvegsfrekvens på >99 %. Forstyrrende substans For å vurde virkn av forstyrrende substans på MiSeqDx-plattformen, ble en representativ analyse, utformet for å undsøke et enkelt gen som dekket.529 bas evalut i nærvær og fravær av mulige forstyrrende substans. Åtte helblodprøv, som representte åtte unike genotyp, ble brukt i studien. Fire kroppsegne forstyrrende substans (bilirubin, kolestol, hemoglobin og triglycid) ble testet ved å tilsette dem i blodprøv før DNAekstraksjonen. For å vurde forstyrrelsen som resultte fra blodtapping (kort tapping), ble EDTA tilsatt blodprøvene i to sentrasjon. Konsentrasjonsgrensene for hv substans vises i tabellen nedenfor. Dessuten, for å vurde forstyrrelsen fra prøveklargjør, ble 5 % vaskebuff tilsatt 8 renset genomisk DNA. En 00 % gsfrekvens ble oppnådd for alle prøvene som ble testet i tillegg til 00 % reprodusbarhet i genotypeg mellom prøv i nærvær og fravær av forstyrrende substans. Februar 204 Delenumm Rev. A NOR 56

57 Testsubstans replikat Konsentrasjon testet i blod (Øvre grense) Konsentrasjon testet i blod (Nedre grense) Påvisningsfrekvens Bilirubin µmol/l 3 µmol/l 00% Kolestol 6 3 mmol/l 2,6 mmol/l 00% Hemoglobin 6 2 g/l 0,4 g/l 00 % Triglycid 6 3 mmol/l,4 mmol/l 00 % EDTA 6 mg/ml 2,8 mg/ml 00 % Prøveindeksing Prøveindeksprime brukes i settet for å tildele en unik strekkode til hv prøve-dna, som gir mulighet til å samle sammen fle prøv i en enkel sekvensingskjøring. 96 prøveindeks ble testet med en representativ analyse, utformet for å undsøke et enkelt gen som dekk.529 bas med 8 unike DNA-prøv for å vifise analysens evne til å utføre tinulig genotypingg for en gitt prøve på tvs av ulike kombinasjon av indeksingsprimen. Hv prøve ble testet med 2 ulike indeksingsprimkombinasjon. Førtiåtte (48) indekskombinasjon ble testet i én sekvensingskjøring. Prøvesultatene ble sammenlignet mot toveis Sang sekvensingsdata for alle posisjon/variant. Reprodusbarheten og nøyaktigheten var 00 % for alle prøve/indeks-primkombinasjon. Patent og varemk Dette dokumentet og dets innhold opphavsrettslig beskyttet for Illumina, Inc. og tilknyttede selskap ("Illumina"), og ment utelukkende for traktbruk av sin kunde i forbindelse med bruk av produktet(ene) beskrevet h, og for intet annet formål. Dette dokumentet og dets innholdet skal ikke brukes ell distribues til andre formål og/ell på annen måte kommunises, fremlegges ell reproduses på noen måte uten forutgående, skriftlig samtykke fra Illumina. Illumina før ikke noen lisens und sin patent, varemke, opphavsrettighet ell sedvanett ell lignende rettighet til tredjepart ved dette dokumentet. Instruksjonene i dette dokumentet skal være strengt og tydelig fulgt av kvalifist og tilfredsstillende utdannet psonell for å sikre riktig og sikk bruk av produktet(ene) som beskrevet i dette dokumentet. Alt innhold i dette dokumentet skal leses fullt ut og være forstått før produktet(ene) brukes. HVIS DET UNNLATES Å FULLSTENDIG LESE OG UTTRYKKELIG FØLGE ALLE INSTRUKSJONENE I DETTE DOKUMENTET, KAN DETTE FØRE TIL SKADE PÅ PRODUKTET(ENE), SKADE PÅ PERSONER, INKLUDERT BRUKERE ELLER ANDRE, OG SKADE PÅ ANNEN EIENDOM. ILLUMINA PÅTAR SEG IKKE ANSVAR SOM FØLGE AV FEIL BRUK AV PRODUKTET(ENE) SOM ER BESKREVET I DETTE DOKUMENTET (INKLUDERT DELER AV DETTE ELLER PROGRAMVARE) ELLER ALL BRUK AV SLIKE PRODUKT(ER) UTENFOR RAMMEN AV UTTRYKTE SKRIFTLIGE LISENSER ELLER TILLATELSER GITT AV ILLUMINA FORBINDELSE MED KUNDEKJØP AV SLIKE PRODUKT(ER). TIL IN VITRO-DIAGNOSTISK BRUK 204 Illumina, Inc. Med enett. Illumina og MiSeqDx varemk ell registrte varemk for Illumina, Inc. Alle andre mk og navn i dette dokumentet tilhør sine respektive eie. AMPure, Beckman og Beckman Coult varemk ell registrte varemk for Beckman Coult, Inc. 5 Delenumm Rev. A NOR Februar 204

58 Kontaktinformasjon Illumina San Diego, California, 9222 U.S.A ILMN (4566) (utenfor Nord-Amika) Emgo Europe Molenstraat BH The Hague Nedland Produktmking Se symbolforklar som følg med hvt sett for å finne fullstendig refanse til symbolene som kan vises på produktpakn og mk Februar 204 Delenumm Rev. A NOR 58