MiSeqDx Cystisk fibrose 139-variantanalyse

Transkript

1 TIL IN VITRO-DIAGNOSTISK BRUK Katalognr. DX : 2 kjøringer, opp til 96 prøver per sett Katalognr. DX : 20 kjøringer, opp til 960 prøver per sett Tiltenkt bruk Illumina MiSeqDx Cystisk fibrose 139-variantanalyse er et kvalitativt in vitro-diagnostisk system som brukes til samtidig deteksjon av 139 klinisk relevante cystisk fibrose-forårsakende mutasjoner og varianter av det transmembrane konduktivitetsregulator-genet for cystisk fibrose (CFTR) i genomisk DNA, isolert fra humant perifere fullblodsprøver. Variantene inkluderer de som var anbefalt i 2004 av American College of Medical Genetics (ACMG) 1 og i 2011 av American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) 2. Testen er beregnet på carrierscreening hos voksne i reproduktiv alder, i diagnostisk bekreftelsestesting av nyfødte og barn og som en innledende test for å bistå i diagnosen av personer med mistenkt cystisk fibrose. Resultatene av denne testen er ment å bli tolket av en nemndsertifisert klinisk molekylær genetiker eller tilsvarende og bør brukes sammen med annen tilgjengelig laboratorieinformasjon og klinisk informasjon. Testen er ikke beregnet brukt på screening av nyfødte, føtal diagnostisk testing, preimplantasjonstesting eller for enkeltstående diagnostiske formål. Testes er beregnet brukt på Illumina MiSeqDx-instrumentet. Oppsummering og forklaring av analysen Klinisk beskrivelse Cystisk fibrose (CF) er en av de vanligste genetiske sykdommene i den vestlige verden og den vanligste livstruende autosomale recessive sykdommen i den ikke-spanske hvite befolkningen 3-7. CF innvirker på viskositeten i slimsekretet og påvirker epitelet i luftveiene, bukspyttkjertelen, tarmene, lever-galle-systemet, mannlige kjønnsorgan og svettekjertlene, som resulterer i kompleks multiorgan-, multisystem-sykdom 4-6 der lungene er det primære organsystemet assosiert med morbiditet og mortalitet 8. I mange tilfeller vil tilbakegang i ernæringen være et forvarsel på CF-lungesykdom, slik at et viktig fokus på gjeldende intervensjonelt arbeid er tidlig diagnose ved nyfødtscreening. 7 og dermed legge til rette for rask tilgang til livsviktige medisinske tjenester og oppnå best mulig resultat for personer med 4,7. Selv om det er kjønnsforskjeller i overlevelse, med median rapportert overlevelse større hos menn enn hos kvinner, er generell medial overlevelse i USA 38,3 år 8. CFTR-varianter og insidens Cystisk fibrose trans-membran konduktans regulator-genet (CFTR) identifisert i 1989 befinner seg på den lange armen på kromosom 7 og inneholder 27 kodingseksoner, spredt over 230 kb 4. En 6,5 kb mrna, produsert av den normale allelen, koder CFTR, et 1490-aminosyre integralt membranprotein som fungerer som en regulert kloridkanal i epitelceller i flere organer 4,5. Mer enn 1900 varianter av CFTR er nå beskrevet og de fleste er punktmutasjoner 9. Den vanligste CFTR-varianten er F508del-allelen 5 som utgjør nesten 70 % av alle CFTR-variantene 3. Andre vanlige CFTR-varianter resulterer imidlertid ofte i en CF-fenotype og andre CFTR-relaterte sykdommer 3-5. Cystisk fibrose har en sykdomsinsidens anslått å være én i 2000 til 4000 levendefødte og en prevalens på omtrent personer i USAs befolkning. 4. Det forekommer i alle etniske og rasemessige befolkninger med varierende frekvenser: én av 3000 kaukasiere, én av 9200 latinamerikanere, én av indianere, én av afroamerikanere. og én av asiatiske amerikanere 4,6. Gjeldende estimater av CFTR mutasjonscarrierfrekvens etter etnisitet i USA, Januar 2014 Delenummer Rev. A NOR 1

2 basert på en kohort på personer som var henvist for carriertesting uten familiehistorie med CF, finnes i Tabell 1. Tabell 1 Generell mutasjonscarrierfrekvens for cystisk fibrose i ulike etniske grupper i USA 10 Etnisk gruppe Observert carrierfrekvens Afroamerikanere 1 av 84 Ashkenazi-jøder 1 av 29 Asiatisk 1 av 242 Kaukasiere 1 av 28 Latinamerikanere 1 av 59 Jøder 1 av 32 Fra Midt-Østen 1 av 91 Indianere 1 av 70 Fra Sør-Asia 1 av 118 Annen etnisitet 1 av 111 > 1 etnisitet 1 av 34 Delvis afroamerikanere 1 av 56 Delvis kaukasisk 1 av 32 Delvis latinamerikansk 1 av 51 Ikke oppgitt 1 av 37 Alle personer 1 av 38 Oversikt over CFTR2-prosjektet CFTR2-prosjektet er et internasjonalt initiativ, ledet av en gruppe forskere og klinikere og støttet av et tilskudd fra National Institute of Health og U.S. Cystic Fibrosis Foundation. 11,12 CFTR2 har som formål å gi omfattende og ekspertanmeldt funksjonell og klinisk informasjon om CFTR-varianter. I et forsøk på å klinisk validere alle CFvarianter med allelefrekvensene på 0,01 % og høyere, samlet 25 CF-registre og klinikker fra hele verden 13 sammen ressurser i den hensikt å sammenligne klinisk informasjon fra over CF-pasienter med de nesten 1900 CFvariantene som hadde blitt registrert i løpet av årene i CFTR1-databasen på Hospital for Sick Children i Toronto. 11,13 Kliniske karakteristikker, som svettekloridkonsentrasjon, lungefunksjon (FEV1 % predikert) og pankreatisk status, ble analysert sammen med CFTR genotypeinformasjon. Den systematiske metoden for samtidig analyse av disse variantene fra kliniske, funksjonelle og genetiske perspektiver, ga 134 unike CF-fremkallende varianter på 129 unike genomiske posisjoner (fordi for fem posisjoner vises to nukleotidforandringer på samme posisjon) for tiden finnes i CFTR2- databasen (per august 2013). Bruk en et panel som omfatter alle disse variantene forventes å stå for 95,4 % av cystisk fibrose-fremkallende alleler og øker identifikasjonen av parene i risikosonen gjennom detektering av begge allelene til ~91 % fra 72 % med ACMG-anbefalte panelet på 23 varianter. CFTR-varianter i panelet Variantene som ble rapportert av MiSeqDx Cystisk fibrose 139-variantanalyse ble spesifikt valgt fordi de representerer det fullstendige settet med klinisk validerte varianter, klassifisert om CF-fremkallende i CFTR2-databasen ved Johns Hopkins University, et produkt av CFTR2-initiativet (Klinisk og funksjonell oversettelse av CFTR). Analysen tester for: 134 CF-fremkallende varianter, én ACMG-anbefalt panelvariant (R117H, klassifisert som en mutasjon med varierende klinisk konsekvens, MVCC, av CFTR2), én betinget rapportert modifiserende variant (PolyTG/PolyT) og tre betinget rapporterte godartede varianter (I506V, I507V, F508C) 14 med en total på 139 rapporterte varianter. The 134 CF-fremkallende variantene tilsvarer 129 CF-fremkallende varianter i CFTR2-databasen. CFTR2-databasen inkluderer fem CF-fremkallende varianter, der de samme proteinnivåendringene kan oppstå fra to distinkte nukleotideendringer [det vil si S466X(C>A) og S466X(C>G)]. Disse fem variantene er oppført i med 2 Delenummer Rev. A NOR Januar 2014

3 aminosyrekodonet i CFTR2-databasen (det vil si S466X), mens analysen rapporterer hver individuelle variant [det vil si S466X(C>A) og S466X(C>G)]. Listen over 139 varianter rapportert av MiSeqDx Cystisk fibrose 139-variantanalyse finnes i Tabell 2. Tabell 2 MiSeqDx Cystisk fibrose 139-variantanalyse Oppsummering av varianter [Oppført i genomisk koordinatrekkefølge; Fet skrift=acmg-23; Kursiv=Forutsetningsvis rapportert] M1V T338I Q552X G>A CFTR dele2,3 1154insTC R553X A>G Q39X S341P A559T L1065P E60X R347H R560T R1066C P67L R347P R560K R1066H R75X R352Q kb A>G L1077P G85E 1213delT G>A W1089X 394delTT G>A E585X Y1092X(C>A) G>A 1259insA G>A Y1092X(C>G) 406-1G>A W401X (c.1202g>a) A>G M1101K E92X W401X (c.1203g>a) 2143delT E1104X E92K G>A R709X R1158X Q98X PolyTG/PolyT K710X R1162X 457TAT>G 1461ins4 2183delAA>G 3659delC D110H A455E 2184insA S1196X R117C G>A 2184delA W1204X (c.3611g>a) R117H S466X (C>A) 2307insA W1204X (c.3612g>a) Y122X S466X (C>G) L732X 3791delC 574delA L467P 2347delG kbC>T 621+1G>T 1548delG R764X G1244E 663delT S489X 2585delT 3876delA G178R S492F E822X S1251N 711+1G>T Q493X G>A 3905insT 711+3A>G I507del E831X W1282X G>A F508del W846X G>A G>T 1677delTA R851X N1303K H199Y V520F 2711delT 4016insT P205S Q525X G>A Q1313X L206W G>A Q890X 4209TGTT>AA Q220X G>A L927P CFTRdele22,23 852del22 G542X S945L 4382delA 1078delT S549R (c.1645a>c) 3007delG I506V G330X S549R (c.1647t>g) G970R I507V R334W S549N 3120G>A F508C I336K G551D G>A Klassifisert i CFTR2-database 12 som en CF-fremkallende variant, mens Sosnay-avhandlingen 13 klassifiserer varianten som ubestemt. Databaseklassifiseringen er mer aktuell og avspeiler den fullførte funksjonelle testingen, som ikke var tilgjengelig da Sosnaypubliseringen fant sted. Prosedyreprinsipper Illumina MiSeqDx Cystisk fibrose 139-variantanalyse består i to hovedprosedyrer. Den første er å manuelt klargjøre prøvene for sekvensering, som kalles bibliotekklargjøring. Klargjøringen av biblioteket består av fire hovedtrinn: Hybridisering, ekstensjonsligasjon, PCR-amplifisering og biblioteknormalisering. Den andre prosedyren er å sekvensere den klargjorte prøven med SVS-kjemi (sekvensering med syntese) på MiSeqDx. Januar 2014 Delenummer Rev. A NOR 3

4 Bibliotekklargjøring A B C D Hybridisering Det første trinnet, hybridisering, hybridiserer en pool av oppstrøms og nedstrøms oligonukleotider til prøvegenomiske DNA. Oligonukleotidene er spesifikke for MiSeqDx Cystisk fibrose 139- variantanalyse. På slutten av denne prosessen vil en tretrinns vaskeprosedyre med et filter som kan velge størrelse, fjerne ubundne oligonukleotider fra det genomiske DNA. Ekstensjonsligasjon Det andre trinnet, ekstensjonsligasjon, forbinder hybridiserte oppstrøms og nedstrøms oligonukleotider. En DNA-polymerase strekker seg fra oppstrøms-oligonukleotider gjennom målregionen, fulgt av ligasjon til 5 -enden på nedstrøms-oligonukleotiden med en DNA ligase. Resultatet er dannelsen av produkter som inneholder de CF-spesifikke oligonukleotidene, flankert av sekvenser som kreves for amplifisering. PCR-amplifisering Det tredje trinnet, PCR-amplifisering, amplifiserer ekstensjonsligasjonsproduktene ved bruk av primere som tilføyer indekssekvenser for prøvemultipleksing, i tillegg til adaptere som kreves for clustergenerering på MiSeqDx. På slutten av denne prosessen vil en PCR-rengjøringsprosedyre rense PCRproduktene (kalt et bibliotek). Biblioteknormalisering Det siste trinnet, biblioteknormalisering, normaliserer kvantiteten i hvert bibliotek for å sørge for mer lik bibliotekrepresentasjon i det endelige poolede biblioteket. På slutten av denne prosessen blir det poolede biblioteket lastet inn på MiSeqDx for sekvensering med SBS-kjemi. Sekvensering SBS-kjemi bruker en reversibel terminatormetode for å detektere enkle nukleotidebaser idet de blir inkorporert i voksende DNA-strenger. Under hver sekvenseringssyklus blir en enkel fluorescensmerket deoksynukleotide trifosfat (dntp) tilført nukleinsyrekjeden. Nukleotidemerkingen fungerer som en terminator for polymerisering, slik at etter hver dntp-inkorporering, blir den fluorescerende fargestoffet avbildet for å identifisere basen og deretter enzymatisk spaltet for å gjøre det mulig å inkorporere den neste nukleotiden. På grunn av alle fire reversible terminatorbundne dntp-ene (A, G, T, C) er tilstede som enkle, separate molykyler, vil den naturlige konkurranse minimere inkorporeringstilbøyelighet. Base gjøres direkte fra signalintensitetsmålingene under hver sekvenseringssyklus. Sluttresultatet er base-for-base-sekvensering. 4 Delenummer Rev. A NOR Januar 2014

5 Dataanalyse MiSeq Reporter behandler base, generert under primæranalysen og gir informasjon om hver prøve, basert på informasjonen angitt i prøvearket, kalt sekundæranalyse. Sekundæranalysen inkluderer demultipleksing, FASTQ filgenerering, innretting, variantpåvisning og generering av VCF-filer som inneholder informasjon om CFTR-varianter som finnes ved spesifikke posisjoner i et referansegenom. Demultipleksing Dette er det første trinnet i analysen hvis prøvearket har oppført flere prøver og kjøringen har indeksavlesinger. Demultipleksing atskiller data fra poolede prøver, basert på de unike sekvensindeksene som ble tilføyd under PCR-amplifiseringstrinnet. FASTQ filgenerering Etter demultipleksingen genererer MiSeq Reporter mellomliggende filer i FASTQformat, som er et tekstformat som brukes til å representere sekvenser. FASTQ-filer inneholder avlesingene for hver prøve og kvalitetsskårene, uten avlesinger fra eventuelle clustere som ikke passerer filteret. Justering Justering sammenligner sekvenser mot referansen for å identifisere et forhold mellom sekvenser og tildeler en skår, basert på likhetsområder. Innrettede avlesinger skrives til filer i BAM-format. MiSeq Reporter bruker en "bundet" Smith-Waterman-algoritme som utfører lokale sekvenssammenstillinger for å fastslå lignende områder mellom to sekvenser. Variantpåvisning Dette trinnet registrerer enkle nukleotidevarianter (SNV), innsettinger og slettinger (indels) og andre strukturvarianter i en standardisert testfil kalt MiSeqDxCF139VariantAssay.txt. For mer informasjon, se avsnittet Analyserapportfil i Brukerveiledning for MiSeq Reporter (delenummer ). Prosedyrebegrensninger 1 Til in vitro-diagnostisk bruk. Resultatene som ble oppnådd med Illumina MiSeqDx Cystisk fibrose 139- variantanalyse bør brukes og tolkes i sammenheng med en full klinisk evaluering. 2 Analysen er utformet for å identifisere en spesifikk delmengde med kjente varianter i CFTR-genet, men inkluderer ikke alle variantene som er identifisert i CFTR-genet. Selv om en variant ikke har blitt identifisert, garanterer ikke dette at andre CFTR-varianter ikke er til stede i prøvene som analyseres. 3 Varianter identifisert av denne analysen varierer i frekvens blant ulike befolkninger. 4 Som ved all hybridiseringsbasert analyse, kan underliggende polymorfismer eller varianter i oligonukleotidebindende områder innvirke på alleler som blir sondert, og derfor også på påvisningene som blir utført. 5 Analysen kan ikke bestemme om orienteringen til PolyTG/PolyT-varianten er i cis/trans mot R117Hvarianten. For pasienter med en R117H-variant, bør det utføres ytterligere testing for å bestemme om en PolyTG/PolyT-variant, som kan påvirke den kliniske fenotypen [det vil si (TG) eller 5T] er i en cis/transorientering i forhold til R117H-varianten. 6 PolyTG/PolyT er homopolymerregioner som er kjent for å være vanskelig å tolke med sekvensbaserte analyser på grunn av polymerasemangel. En 0,9 % (4/448) feilpåvisningsfrekvens ble observert for PolyTG/PolyTresultater som viste et ±1 TG-avvik, sammenlignet med Sanger toveissekvensering (Tabell 17). Produktkomponenter Illumina MiSeqDx-plattformen består av følgende: MiSeqDx Cystisk fibrose 139-variantanalyse (Katalognr. DX or DX ) MiSeqDx Instrument (Katalognr. DX ) Januar 2014 Delenummer Rev. A NOR 5

6 Reagenser Reagenser som følger med Reagenser for Illumina MiSeqDx Cystisk fibrose 139-variantanalyse leveres av Illumina. Katalognr. DX har blitt konfigurert for 20 kjøringer med maksimum 48 prøver per kjøring (opp til 960 prøver totalt). Katalognr. DX har blitt konfigurert for to kjøringer med maksimum 48 prøver per kjøring (opp til 96 prøver totalt). MiSeqDx Cystisk fibrose 139-variantanalyseBoks 1 Tabell 3 Boks 1A Pre-Amp-reagenser Kvantitet Komponent DX DX Fyllingsvolum Aktive ingredienser Oppbevaring CF 139-Variant- 10 rør 1 rør 600 µl Bufret vannløsning som -25 C til -15 C Oligo-pool inneholder oligonukleotider rettet mot CFTR-genet Hybridiseringsbuffer 10 rør 1 rør 4,32 ml Bufret vannløsning som -25 C til -15 C inneholder salter og formamid Ekstensjonsligeringsblanding 10 rør 1 rør 4,8 ml Bufret vannløsning som inneholder proprietær blanding av DNApolymeraser, DNA-ligase og dntp-er. -25 C til -15 C Indeksprimere A (A501) - H (A508) Indeksprimere 1 (A701) - 12 (A712) 10 rør per primer 10 rør per primer 1 rør per primer 1 rør per primer 192 µl PCR-primere med indekssekvenser og sekvenseringsadaptere 128 µl PCR-primere med indekssekvenser og sekvenseringsadaptere -25 C til -15 C -25 C til -15 C PCR polymerase 10 rør 1 rør 56 µl Proprietær DNA-polymerase -25 C til -15 C PCR hovedblanding 10 rør 1 rør 2,8 ml Bufret vannløsning som -25 C til -15 C inneholder salter og dntp-er Tabell 4 Boks 1B Post-Amp-reagenser Kvantitet Komponent DX DX Fyllingsvolum Aktive ingredienser Oppbevaring Biblioteknormaliseringsfortynning 10 rør 1 rør 4,6 ml Bufret vannløsning som -25 C til -15 C inneholder salter, 2- mercaptoetanol og formamid Bibliotekfortynningsbuffer 10 rør 1 rør 4,5 ml Bufret vannløsning -25 C til -15 C PhiX internkontroll 1 rør 1 rør 10 µl Bufret vannløsning som inneholder PhiX genomisk DNA -25 C til -15 C 6 Delenummer Rev. A NOR Januar 2014

7 MiSeqDx Cystisk fibrose 139-variantanalyse, Boks 2 Tabell 5 Boks 2 Post-Amp-reagenser Komponent Kvantitet DX DX Innhold MiSeqDx 20 kassetter 2 kassetter Engangskassett som inneholder reagenskassett - CF clustergenerering og sekvenseringsreagenser 139-variantanalyse til bruk med MiSeqDx, inkludert formamid, 2-mercaptoetanol og < 2 % DMSO Oppbevaring -25 C til -15 C MiSeqDx Cystisk fibrose 139-variantanalyse, Boks 3 Tabell 6 Boks 3A Pre-Amp-reagenser Komponent Kvantitet DX DX Fyllingsvolum Aktive ingredienser Oppbevaring Stringent vaskebuffer 10 flasker 1 flaske 24 ml Bufret vannløsning som 2 C til 8 C inneholder salter, 2- mercaptoetanol og formamid Universalvaskebuffer 10 rør 1 rør 4,8 ml Bufret vannløsning som inneholder salter 2 C til 8 C Tabell 7 Boks 3B Post-Amp-reagenser Komponent Kvantitet DX DX Fyllingsvolum Aktive ingredienser Oppbevaring PCR rengjøringskuler 10 rør 1 rør 5 ml Bufret vannløsning som 2 C til 8 C inneholder fast faseparamagnetiske kuler og polyetylenglykol Vaskeløsning for 20 rør 2 rør 4,8 ml Bufret vannløsning som 2 C til 8 C biblioteknormalisering inneholder salter, 2- mercaptoetanol og formamid Bibliotekkuler 10 rør 1 rør 1,2 ml Bufret vannløsning som inneholder fast faseparamagnetiske kuler 2 C til 8 C MiSeqDx Flowcelle - CF 139-variantanalyse 20 beholdere 2 beholdere 1 flowcelle Glass-substrat med kovalent bundne oligonukleotider MiSeqDx Cystisk fibrose 139-variantanalyse, Boks 4 2 C til 8 C Tabell 8 Boks 4 Post-Amp-reagenser Komponent Kvantitet DX DX Fyllingsvolum Aktive ingredienser Oppbevaring MiSeqDx SBSløsning (PR2) - CF 139-variantanalyse 20 flasker 2 flasker 353,1 ml Bufret vannløsning 2 C til 8 C MiSeqDx Cystisk fibrose 139-variantanalyse, Boks 5 Tabell 9 Boks 5 Pre-Amp-reagenser Komponent Kvantitet DX DX Fyllingsvolum Aktive ingredienser Oppbevaring Filterplate 20 plater 2 plater Ikke aktuelt Mikrotiterplate av polypropylen med en modifisert polyetersulfonmembran 15 C til 30 C Januar 2014 Delenummer Rev. A NOR 7

8 Tabell 10 Boks 5 Post-Amp-reagenser Komponent Kvantitet Fyllingsvolum Aktive DX DX ingredienser Elueringsbuffer 10 rør 1 rør 4,8 ml Bufret vannløsning Bibliotekoppbevaringsbuffer 10 rør 1 rør 3,5 ml Bufret vannløsning Oppbevaring 15 C til 30 C 15 C til 30 C Reagenser som er påkrevd, men følger ikke med Preamplifiseringsreagenser 10 N NaOH (tilbered fra tabletter eller bruk en standardoppløsning) TE-buffer DNase- og RNase-fritt vann Postamplifiseringsreagenser 10 N NaOH (tilbered fra tabletter eller bruk en standardoppløsning) Etanol, 200 proof for molekylær biologi TE-buffer DNase- og RNase-fritt vann Oppbevaring og håndtering 1 Romtemperatur defineres som 15 C til 30 C. 2 Følgende reagenser blir sendt i frossen tilstand og er stabile når de lagres ved -25 C til -15 C inntil den angitte utløpsdatoen. CF 139-Variant-Oligo-pool Hybridiseringsbuffer Ekstensjons-ligeringsblanding Indeksprimere A (A501) - H (A508) Indeksprimere 1 (A701) - 12 (A712) PCR polymerase PCR hovedblanding Biblioteknormaliserings-fortynning Bibliotekfortynningsbuffer PhiX internkontroll MiSeqDx reagenskassett - CF 139-variantanalyse Bortsett fra reagenskassetten er reagensene stabile i maksimum 6 fryse/tine-sykluser som utføres før den angitte utløpsdatoen. Reagenskassetten skal ikke fryses på nytt etter å ha vært opptinet. Den kan oppbevares i opp til 6 timer ved 2 C til 8 C. 3 Følgende reagenser blir sendt nedkjølt og er stabile når de lagres ved 2 C til 8 C inntil den angitte utløpsdatoen. Stringent vaskebuffer Universalvaskebuffer PCR rengjøringskuler Bibliotekkuler Vaskeløsning for biblioteknormalisering 8 Delenummer Rev. A NOR Januar 2014

9 MiSeqDx SBS-løsning (PR2) - CF 139-variantanalyse MiSeqDx Flowcelle - CF 139-variantanalyse 4 Følgende reagenser blir sendt i omgivelsestemperatur og er stabile når de lagres ved romtemperatur inntil den angitte utløpsdatoen. Elueringsbuffer Filterplate Bibliotekoppbevaringsbuffer 5 Endringer i de leverte reagensenes fysiske utseende kan indikere nedbryting av materialene. Hvis det forekommer endringer i det fysiske utseendet (for eksempel åpenbare endringer i reagensfarge eller uklarhet sammen med mikrobiell kontaminering), skal ikke reagensene brukes. 6 Hybridiseringsbuffer-, Stringent vaskebuffer- og Biblioteknormaliserings-fortynning-reagenser kan danne synlig bunnfall eller krystaller. Før de brukes skal de vortekseres kraftig og deretter kontrolleres visuelt for å påse at ingen bunnfall er tilstede. 7 Overhold følgende beste praksis når du håndterer PCR rengjøringskuler og Bibliotekkuler: Kulene skal aldri fryses. La kulene komme opp til romtemperatur. Umiddelbart før bruk skal kulene vortekseres til de er godt suspendert og fargen er homogen. Bland prøven grundig etter at kulene er tilsatt ved å pipettere opp og ned 10 ganger. En rystemaskin kan brukes til grundig blanding av prøver. Inkuber kule/prøve-blandingen i romtemperatur i hele den angitte tiden. Følg instruksjonene når du bruker magnetstativet. Vent til løsningen er klar før du aspirerer. La platen ligge på magnetstativet mens supernatanten aspireres langsomt og vær nøye med å ikke bevege de atskilte kulene. 8 PCR-amplifiseringsplaten kan forbli på termosykleren over natten, eller den kan oppbevares ved 2 C til 8 C i opp til 2 dager. Før platen settes til oppbevaring ved 2 C til 8 C, skal den forsegles godt. 9 Ikke frys Bibliotekkuler eller bland den med Biblioteknormaliserings-fortynning-reagensen hvis den ikke skal brukes umiddelbart. 10 Den ferdige biblioteknormaliseringsplaten kan oppbevares ved -25 C til -15 C i opp til 3 dager. 11 Det poolede amplikonbiblioteket kan oppbevares ved -25 C til -15 C i opp til 3 dager. 12 Last umiddelbart inn den nytilberedte, fortynnede amplikonpoolen i reagenskassetten. Oppbevaring av den fortynnede amplikonpoolen kan resultere i en betydelig reduksjon i clustertetthet. Utstyr og materiell Utstyr og materialer som følger med, selges separat. 1 MiSeqDx Instrument, katalognr. DX TruSeq indeksplateenhetssett, katalognr. FC TruSeq indeksplateenhetssett & Muffesett, katalognr. FC Utskiftingshetter for indeksadapter, katalognr. DX Utstyr og materialer som er påkrevd, men som ikke følger med Utstyr og materialer til preamplifisering 1 Varmeblokk Én varmeblokk for 96-brønners plate er påkrevd. Varmeblokken skal oppfylle følgende ytelsesspesifikasjoner: Varmeblokker med oppvarmede lokk er godtatt for bruk. Temperaturområde: Omgivelsestemperatur +5 C til 99 C Temperaturregulering: 0,1 C til 37 C (0,4 C til 60 C) 2 Prøveinkubator Én inkubator (hybridiseringsovn) er påkrevd. Inkubatoren skal oppfylle følgende ytelsesspesifikasjoner: Januar 2014 Delenummer Rev. A NOR 9

10 Temperaturområde: 10 C til 100 C Temperaturregulering: ±0,2 C 3 Bordsentrifuge Én bordsentrifuge med kapasitet til å opprettholde 20 C er påkrevd. (En separat sentrifuge er påkrevd i postamplifiseringsområdet.) Alle platesentrifuger som når tilordnede hastigheter i protokollen (280 til 2400 g) er akseptabelt. 4 Presisjonspipetter Ett sett av presisjonspipetter er påkrevd. (Et separat sett er påkrevd i postamplifiseringsområdet.) Bruk av presisjonspipetter er påkrevd for å sikre nøyaktig reagens- og prøvetilførsel. Pipetter med enkel kanal eller flere kanaler kan brukes hvis de blir kalibrert regelmessig og er nøyaktige innen 5 % av oppgitt volum. 5 Forbruksmateriell Følgende forbruksmateriell er påkrevd. 96-brønners PCR-plater med muffer, 0,2 ml, polypropylen eller tilsvarende MERK: Sørg for at 96-brønnersplaten er kompatibel med magnetstativet. 96-brønners oppbevaringsplater, 0,8 ml (MIDI-plater) Oppløsningskum, PVC, DNase/RNase-fritt (brett) Klebende aluminiumfolieforsegling Passende PCR-plateforsegling Aerosolmotstandige pipettespisser Utstyr og materialer til postamplifisering 1 Termosykler En termosykler er påkrevd. Termosykleren skal ha et oppvarmet lokk og oppfylle følgende ytelsesspesifikasjoner: Temperaturkontrollområde: 4 C til 99 C Kontrollnøyaktighet: ±0,25 C fra 35 C til 99 C 2 Mikroplaterister Én mikroplaterister er påkrevd i bibliotekets postamplifiseringsområde. Plateristeren skal oppfylle følgende ytelsesspesifikasjoner: Maks. blandingshastighet: 3000 opm Blandingshastighetsområde: 200 til 3000 opm 3 Bordsentrifuge Én bordsentrifuge med kapasitet til å opprettholde 20 C er påkrevd. (En separat sentrifuge er påkrevd i preamplifiseringsområdet.) Alle platesentrifuger som når tilordnede hastigheter i protokollen(280 til 2400 g) er akseptabelt. 4 Varmeblokk Én varmeblokk for rør er påkrevd. Varmeblokken skal oppfylle følgende ytelsesspesifikasjoner: Temperaturområde: Omgivelsestemperatur +5 C til 99 C Temperaturregulering: 0,1 C til 37 C (0,4 C til 60 C) 5 Magnetstativ Ett magnetstativ for 96-brønners plate er påkrevd. Bedre ytelse oppnås når magnetene er på siden av stativet og ikke på bunnen. 6 Presisjonspipetter Ett sett av presisjonspipetter er påkrevd. (Et separat sett er påkrevd i preamplifiseringsområdet.) Bruk av presisjonspipetter er påkrevd for å sikre nøyaktig reagens- og prøvetilførsel. Pipetter med enkel kanal eller flere kanaler kan brukes hvis de blir kalibrert regelmessig og er nøyaktige innen 5 % av oppgitt volum. 7 Forbruksmateriell Følgende forbruksmateriell er påkrevd. 96-brønners PCR-plater med muffer, 0,2 ml, polypropylen eller tilsvarende MERK: Sørg for at 96-brønnersplaten er kompatibel med magnetstativet. 96-brønners oppbevaringsplater, 0,8 ml (MIDI-plater) Koniske rør, 15 ml Eppendorf mikrosentrifugerør (skrukork anbefales) Åtterørs PCR-strimmel Oppløsningskum, PVC, DNase/RNase-fritt (brett) Klebende aluminiumfolieforsegling Klebende plateforsegling 10 Delenummer Rev. A NOR Januar 2014

11 Aerosolmotstandige pipettespisser Prøvetaking, transport og oppbevaring MERK Håndter alle prøver som om de er potensielt infeksiøse stoffer. 1 Fullblodsprøver tatt i K 2 EDTA-rør kan brukes. 2 Fullblodsprøver kan oppbevares opp til 7 dager i romtemperatur, opp til 30 dager ved 2 C til 8 C, eller opp til 30 dager hvis de er frosset ved -25 C til -15 C. 3 Fullblod kan transporteres i opp til 7 dager i romtemperatur, 30 dager ved 2 C til 8 C, eller 30 dager hvis de er frosset ved -25 C til -15 C. Transport av fullblod skal overholde statlige og lokale retningslinjer for transport av etiologiske midler. 4 Det ble ikke observert ugunstig virkning på analyseytelsen når genomisk DNA ble gjenstand for 6 fryse/tinesykluser. 5 Det ble ikke observert ugunstig virkning på analyseytelsen med fullblodsprøver med elevert bilirubin, kolesterol, triglyserider, EDTA eller hvis hemoglobin var til stede. Advarsler og forholdsregler FORSIKTIG Føderal lov begrenser denne enheten til salg av, eller på bestilling, av en lege aller annen allmennpraktiserende lege, lovmessig lisensiert i staten vedkommende praktiserer, for å bruke eller pålegge bruk av enheten. 1 Noen komponenter i denne analysen inneholder formamid, et alifatisk amid som er en mulig reproduksjonstoksin. (Se Reagenser på side 6 for mer informasjon.) Personskade kan forekomme ved inhalasjon, svelging, hudkontakt og øyekontakt. Kasser beholdere og eventuelt ubrukt innhold i med gjeldende lokale offentlige sikkerhetsstandarder. For mer informasjon, kontakt Illuminas tekniske støtte. 2 Noen av komponentene i denne analysen inneholder 2-mercaptoetanol, et reduseringsmiddel. (Se Reagenser på side 6 for mer informasjon.) Personskade kan forekomme ved inhalasjon, svelging, hudkontakt og øyekontakt. Brukes i et godt ventilert område og eventuelle beholdere og ubrukt innhold skal kasseres i med gjeldende lokale, statlige sikkerhetsstandarder. For mer informasjon, kontakt Illuminas tekniske støtte. 3 Håndter alle prøver som om de er potensielt infeksiøse stoffer. 4 Hvis du unnlater å følge prosedyrene som beskrevet, kan det resultere i feil resultater eller betydelig reduksjon i prøvekvaliteten. 5 Bruk rutinemessige forholdsregler for laboratoriet. Ikke pipetter med munnen. Ikke spis, drikk eller røyk i tilordnede arbeidsområder. Bruk engangshansker og laboratoriefrakker når du håndterer prøver og analysereagenser. Vask hendene grundig etter å ha håndtert prøvene og analysereagensene. 6 Ikke bruk noen analysekomponenter utover deres oppgitte utløpsdato på etiketten på analyseesken. Ikke bytt om analysekomponenter fra ulike analysevarepartier. Vær oppmerksom på at analysevarepartier er identifisert på etiketten på analyseesken. 7 Oppbevar analysekomponentene ved angitt temperatur i tilordnede pre-amplifiserings- og postamplifiserings-områder. 8 Gjentatt fryse/tine-sykluser (opp til 6) i Boks 1-komponenter vil ikke ødelegge analysens intakthet. 9 For å hindre nedbryting av prøver eller reagens, må det påses at all natriumhypoklorittdamp er fullstendig oppløst før protokollen startes. 10 God laboratoriepraksis og god laboratoriehygiene er påkrevd for å hindre at PCR-produkter fra kontaminerende reagens, instrumentering og genomiske DNA-prøver. PCR-kontaminering kan medføre unøyaktige og upålitelige resultater. Januar 2014 Delenummer Rev. A NOR 11

12 11 For å hindre kontaminering på du påse at preamplifiserings- og postamplifiserings-områdene har sitt eget utstyr (som pipetter, pipettespisser, vortekser og sentrifuge). 12 Unngå krysskontaminasjon. Bruk nye pipettespisser mellom prøvene og mellom dispensering av reagenser. Bland prøver med en pipette og sentrifuger platen når dette angis. Ikke vortekser platene. Bruk av aerosolmotstandige spisser reduserer risikoen for amplikon-overføring og krysskontaminasjon fra prøve til prøve. 13 Indeksprøvesammensetningen må e nøyaktig med prøvearket. Misforhold mellom prøvearket og plateoppsettet vil resultere i tap av positiv prøveidentifikasjon og uriktig resultatrapportering. 14 Tilbered alltid ny 80 % etanol for vasketrinnene. Etanol kan absorbere vann fra luften, noe som påvirker resultatene. 15 Sørg for at all etanol blir fjernet fra bunnen av brønnene under vasketrinnene. Rester av etanol kan påvirke resultatene. 16 Følg de angitte tørketidene etter magnetstativtrinnet for å sikre fullstendig fordamping. Rester av etanol kan påvirke ytelsen til påfølgende reaksjoner. 17 Ikke bland CF 139-Variant-Oligo-pool og Hybridiseringsbuffer for oppbevaring. Hvis de blandes, blir CF 139- Variant-Oligo-pool ustabil, selv når den oppbevares i frossen tilstand. 18 Bruk av termosyklere med aktiv avkjøling (for eksempel Peltier, termoelektrisk avkjølt) anbefales ikke for hybridiseringstrinnet. Det passive avkjølingstrinnet er kritisk for riktig hybridisering. 19 Tilsett alltid PCR polymerase i PCR hovedblanding rett før bruk. Kombinert arbeidsoppløsning skal aldri oppbevares. 20 Under biblioteknormaliseringstrinnet er det ekstremt kritisk å resuspendere bibliotek-kulen fullstendig. Dette er avgjørende for å oppnå clustertetthet på MiSeqDx flowcellen. 21 Følg de oppgitte inkubasjonstidene i biblioteknormaliseringstrinnet. Feil inkubasjon kan påvirke bibliotekrepresentasjonen og clustertettheten. 22 På grunn av antallet plateoverføringer og derved mulighet for kontaminering, bør du være ekstremt forsiktig for å sikre at brønninnholdet forblir fullt ut i brønnen. Innholdet skal ikke sprute. 23 Anbefalingen på 250 ng DNA-innmating gir rom for variasjoner i DNA-kvantiteten, analyseytelsen blir drevet av dette innmatingsnivået. 24 Prøvevarianter med betegnelsen "No Call" (Ingen påvisning) på testrapporten angir at dataene for denne variantposisjonen ikke oppfylte definerte sekvenseringsterskler. Varianter med betegnelsen "No Call" (Ingen påvisning) skal ikke rapporteres med mindre gjentatt testing gir verdier som oppfyller definerte terskler og ikke lenger har betegnelsen "No Call" (Ingen påvisning). Prosedyremessige merknader 1 Illumina krever at én positiv kontroll-dna-prøve og en negativ kontroll (NTC eller Ingen templat-kontroll) er inkludert i hver kjøring, som defineres som sett med prøver som behandles parallelt. Den positive kontroll- DNA-prøven bør være en godt karakterisert prøve med én eller flere kjente CFTR-varianter. Illumina anbefaler bruk av en villtypekontroll. Villtypekontrollen bør kjøres som en prøve og bør ikke erstatte den positive eller negative kontrollen. 2 Før MiSeqDx Cystisk fibrose 139-variantanalyse startes, må du ekstrahere og kvantifisere DNA-et. 3 Hvilken som helst validert DNA-ekstraksjonsmetode kan brukes. 4 Kvantifiser DNA med et spektrofotometer. Kontroller at A260/A280 av DNA-prøven er > 1,5. Normaliser DNA-prøven til 50 ng/µl. Hver prøve krever 5 µl genomisk DNA (totalt 250 ng). Prøvegjennomløp og indeksfremstilling For Illumina MiSeqDx Cystisk fibrose 139-variantanalyse kan prøvegjennomløpet per MiSeqDx-kjøring være mellom 8 og 48 prøver. Indekseringsprimerne som brukes under PCR-amplifiseringen må være valgt på grunnlag av ønsket endelig prøvegjennomløp for å sikre diversitet i indekssekvensen. MERK For å oppnå maksimal gjennomløpseffektivitet, utføres biblioteksklargjøring for opp til 96 prøver og deretter deles prøvene inn i to sekvenseringskjøringer med maksimum 48 prøver hver. 12 Delenummer Rev. A NOR Januar 2014

13 MiSeqDx bruker en grønn LED-lampe for å sekvensere G/T-baser og en rød LED-lampe til sekvensering av A/C-baser. For hver syklus må minst én av to nukleotider i hver fargekanal avleses for å sikre riktig registrering. Det er viktig å opprettholde fargebalansen for hver base av indeksavlesingen som sekvenseres, ellers kan det oppstå registreringsfeil under sekvensering av indeksavlesingen. Januar 2014 Delenummer Rev. A NOR 13

14 Se Tabell 11 for å velge indeksprimerkombinasjoner for 48 eller 96 prøvekjøringer. Tabell 11 Indeks-primerkombinasjonen for sekvenseringskjøringer med 48 prøver eller 96 prøver Radene A-H Kolonne 1-6 Kolonne 7-12 Indeksprimer A (A501) Indeksprimer 1 (A701) Indeksprimer 6 (A706) Indeksprimer B (A502) Indeksprimer 2 (A702) Indeksprimer 7 (A707) Indeksprimer C (A503) Indeksprimer 3 (A703) Indeksprimer 8 (A708) Indeksprimer D (A504) Indeksprimer 4 (A704) Indeksprimer 9 (A709) Indeksprimer E (A505) Indeksprimer 5 (A705) Indeksprimer 11 (A711) Indeksprimer F (A506) Indeksprimer 10 (A710) Indeksprimer 12 (A712) Indeksprimer G (A507) Indeksprimer H (A508) Hvis det sekvenseres færre enn 48 prøver i en sekvenseringskjøring, velges de aktuelle indeksene, basert på sine sekvenser for å opprettholde fargebalansen i de grønne og røde kanalene. Se Tabell 13 og Tabell 14. Som minimum må kjøringer med 8 til 48 prøver inkludere indekseringsprimerkombinasjonene som identifiseres i Tabell 12. For å behandle mindre kjøringer på riktig måte, må det være minst åtte prøver tilstede. Hvis seks unike prøver (ekskludert de positive og negative kontrollene) ikke er tilgjengelige, er det akseptabelt å fylle kjøringen med prøvereplikater eller enhver form for human DNA-prøve. Se Tabell 12 for det minimale settet med fargebalanserte indekser til bruk ved sekvenseringskjøringer med åtte prøver. Tabell 12 Indeks-primerkombinasjonen for sekvenseringskjøringer med 8 prøver Indeksprimer 1 (A701) Indeksprimer 2 (A702) Indeksprimer 10 (A710) Indeksprimer C (A503) Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Indeksprimer D (A504) Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Indeksprimer E (A505) Prøve 7 Prøve 8 -- Indeksprimersekvenser Tabell 13 Sekvenser for Indeksprimere A (A501) - H (A508) Indeksprimer Indeksprimer A (A501) Indeksprimer B (A502) Indeksprimer C (A503) Indeksprimer D (A504) Indeksprimer E (A505) Indeksprimer F (A506) Indeksprimer G (A507) Indeksprimer H (A508) Sekvens TGAACCTT TGCTAAGT TGTTCTCT TAAGACAC CTAATCGA CTAGAACA TAAGTTCC TAGACCTA Tabell 14 Sekvenser for Indeksprimere 1 (A701) - 12 (A712) Indeksprimer Indeksprimer 1 (A701) Indeksprimer 2 (A702) Indeksprimer 3 (A703) Indeksprimer 4 (A704) Indeksprimer 5 (A705) Sekvens ATCACGAC ACAGTGGT CAGATCCA ACAAACGG ACCCAGCA 14 Delenummer Rev. A NOR Januar 2014

15 Indeksprimer Indeksprimer 6 (A706) Indeksprimer 7 (A707) Indeksprimer 8 (A708) Indeksprimer 9 (A709) Indeksprimer 10 (A710) Indeksprimer 11 (A711) Indeksprimer 12 (A712) Sekvens AACCCCTC CCCAACCT CACCACAC GAAACCCA TGTGACCA AGGGTCAA AGGAGTGG Bruksanvisning MiSeqDx Klargjøre prøveark 1 Fra Illumina Worklist Manager (IWM) Velkomstskjermen velges Create Worklist (Opprett arbeidsliste). 2 Velg CF 139-variantanalyse i feltet Test Type (Testtype). 3 I feltet Worklist Name (Arbeidslistenavn), oppgi et navn på prøvearket. Hvis den alfanumeriske strekkode-id-en på reagenskassetten brukes som prøvearknavn, vil MiSeq brukerprogramvare (MOS) finne prøvearket automatisk. Hvis det blir brukt et annet navn på prøvearket, kan knappen Browse (Bla gjennom) MiSeq brukerprogramvare (MOS) brukes til å finne det aktuelle prøvearket. 4 [Valgfritt] Gi en beskrivelse for å identifisere kjøringen. 5 Sørg for at datoen overensstemmer med startdatoen på kjøringen. 6 Velg Next (Neste). Oppgi prøveinformasjon 1 Fra fanen Table (Tabell) eller Plate, oppgi følgende informasjon for hver brønn som inneholder prøve: a Prøve-ID Oppgi en unik prøve-id. b Indeks 1 og Indeks 2 Spesifiser indeksadapteren som skal brukes for hver indeksavlesing. 2 [Valgfritt] Hvis du vil registrere mer detaljert informasjon om prøvene, kan du oppgi et prøvenavn og beskrivelse. 3 [Valgfritt] Du kan identifisere kontroller på platen ved å velge Negative eller Positive fra nedtrekkmenyen Control (Kontroll). 4 Gå til fanen Plate Graphic (Plategrafikk) og bruk alternativet Copy to Clipboard (Kopier til utklippstavle) eller Print (Skriv ut) for å ta et bilde av prøveplaten. 5 Velg Finish (Avslutt). Hybridisering av oligonukleotid-pool Tilberedelse 1 Bring CF 139-Variant-Oligo-pool, Hybridiseringsbuffer, genomiske DNA-prøver og positiv kontrollprøve til romtemperatur. 2 Vortekser CF 139-Variant-Oligo-pool og Hybridiseringsbuffer kraftig for å sikre at alt bunnfallet er fullstendig oppløst og gjør en kort sentrifugering av rørene for å samle væske. 3 Still inn en 96-brønners varmeblokk på 95 C. 4 Forvarm en inkubator til 37 C. 5 Sett opp prøveplaten i henhold til plategrafikkutskriften fra IWM. Januar 2014 Delenummer Rev. A NOR 15

16 Prosedyre 1 Sett opp en ny 96-brønners PCR-plate (heretter kalt HYB-plate). 2 Tilsett 5 µl av prøven eller kontrollen til 50 ng/µl (250 ng totalt) til de aktuelle brønnene i HYB-platen. Følg det genererte plateoppsettet for riktig brønnvalg. 3 Tilsett 5 µl av CF 139-Variant-Oligo-pool i alle brønnene som inneholder genomisk DNA. 4 Tilsett 40 µl av Hybridiseringsbuffer i hver prøve i HYB-platen. Pipetter forsiktig opp og ned 3 5 ganger for å blande. 5 Forsegle HYB-platen, og sentrifuger ved 1000 g ved 20 C i 1 minutt. 6 Legg HYB-platen på den forhåndsoppvarmede blokken ved 95 C, og inkuber i 1 minutt. 7 Reduser varmeblokken til 40 C, og fortsett å inkubere til varmeblokken når 40 C (omtrent 80 minutter). Gradvis avkjøling er avgjørende for riktig hybridisering. PCR-termosyklere med aktiv avkjøling (for eksempel Peltier, termoelektrisk avkjølt) anbefales derfor ikke for denne prosessen. SIKKERT STOPPEPUNKT Når varmeblokken har nådd 40 C, er HYB-platen stabil på 40 C i 2 timer. Fjerning av ubundne oligonukleotider Tilberedelse 1 Bring Ekstensjons-ligeringsblanding, Stringent vaskebuffer og Universalvaskebuffer til romtemperatur og gjør en kort vorteksering. 2 Sett sammen filterplateenheten (heretter kalt FPU) i denne rekkefølgen fra topp til bunn: lokk, filterplate, adaptermuffe og MIDI-plate. 3 Forvask filterplatemembranen slik: a Tilsett 45 µl Stringent vaskebuffer i hver brønn. b Dekk til filterplaten med lokket og sentrifuger deretter ved 2400 g i 20 C i 5 minutter. Prosedyre 1 Dekk til HYB-platen med lokket og sentrifuger deretter ved 1000 g i 20 C i 1 minutt. 2 Overfør hele volumet (omtrent 55 µl) for hver prøve til de tilsvarende brønnene på filterplaten. 3 Dekk til filterplaten med lokket og sentrifuger deretter ved 2400 g i 20 C i 5 minutter. 4 Vask filterplaten slik: a Tilsett 45 µl Stringent vaskebuffer i hver prøvebrønn. b Dekk til filterplaten med lokket og sentrifuger deretter ved 2400 g i 20 C i 5 minutter. 5 Gjenta vaskingen som beskrevet i tidligere trinn. MERK Hvis vaskebufferen ikke dreneres helt, sentrifuger på nytt ved 2400 g i 20 C til all væsken har gått gjennom (ytterligere 5 10 minutter). 6 Kasser alt som flyter gjennom (som inneholder formamid) og setter deretter sammen FPU. 7 Tilsett 45 µl Universalvaskebuffer i hver prøvebrønn. 8 Dekk til filterplaten med lokket og sentrifuger deretter ved 2400 g i 20 C i 10 minutter. MERK Påse at all væske er drenert etter sentrifugering Gjenta sentrifugeringen hvis dette er nødvendig. 16 Delenummer Rev. A NOR Januar 2014

17 Ekstensjonsligasjon av bundne oligonukleotider Prosedyre 1 Tilsett 45 µl av Ekstensjons-ligeringsblanding i hver prøvebrønn på filterplaten. 2 Forsegle filterplaten med klebende aluminiumfolie og dekk deretter til med lokket. 3 Inkuber FPU-anordningen i den forhåndsoppvarmede inkubatoren på 37 C i 45 minutter. PCR-amplifisering Tilberedelse 1 Tilbered ny 0,05 N NaOH. 2 Bestem hvilke indeksprimere som skal brukes i henhold til plategrafikkutskriften fra Illumina Worklist Manager. 3 Bring PCR hovedblanding og de aktuelle indeksprimerne opp til romtemperatur. Vortekser hvert tint rør for å blande og gjør deretter en rask sentrifugering av rørene. 4 Sett opp en ny 96-brønners PCR-plate (heretter kalt AMP-plate). 5 Tilsett indeksprimere i AMP-platen slik: a Tilsett 4 µl av de valgte indeksprimerne [A (A501) H (A508)] i den aktuelle brønnen i en kolonne på AMP-platen. b Kasser de opprinnelige hvite hettene og sett på nye hvite hetter. c Tilsett 4 µl av de valgte indeksprimerne [1 (A701) 12 (A712)] i den aktuelle brønnen på AMP-platen. Spissene skal byttes etter hver rad for å unngå indeks-krysskontaminering. d Kasser de opprinnelige oransje hettene og sett på nye oransje hetter. 6 Tilbered PCR hovedblanding/pcr polymerase PCR-arbeidsoppløsning slik: a For 96 prøver tilsettes 56 µl PCR polymerase til 2,8 ml PCR hovedblanding. b Snu den tilberedte PCR-arbeidsoppløsningen 20 ganger for å blande. PCR-arbeidsoppløsningen er stabil i romtemperatur i 10 minutter. Prosedyre 1 Ta FPU ut av inkubatoren og fjern deretter aluminiumfolieforseglingen. 2 Dekk til filterplaten med lokket og sentrifuger deretter ved 2400 g ved 20 C i 2 minutter. 3 Tilsett 25 µl av 0,05 N NaOH i hver prøvebrønn på filterplaten. Pipetter NaOH opp og ned 5 6 ganger. 4 Dekk til og inkuber filterplaten ved romtemperatur i 5 minutter. 5 Mens filterplaten inkuberes, overføres 22 µl PCR-arbeidsoppløsning i hver brønn på AMP-platen som inneholder indeksprimere. 6 Overfør prøver som er eluert fra filteret til AMP-platen slik: a Pipetter prøvene i første kolonne på filterplaten opp og ned 5 6 ganger. b Overfør 20 µl fra filterplaten til tilsvarende kolonne på AMP-platen. c Pipetter forsiktig opp og ned 5 6 ganger for å grundig kombinere DNA med PCR-arbeidsoppløsningen. d Overfør gjenværende kolonner fra filterplaten til AMP-platen på samme måte. Spissene skal byttes etter hver kolonne for å unngå indeks- og prøvekrysskontaminering. 7 Forsegle AMP-platen og fest den med en gummivalse. 8 Sentrifuger ved 1000 g i 20 C i 1 minutt. 9 Overfør AMP-platen til postamplifiseringsområdet. 10 Utfør PCR med følgende program på en termosykler: 95 C i 3 minutter 25 sykluser på: 95 C i 30 sekunder 62 C i 30 sekunder Januar 2014 Delenummer Rev. A NOR 17

18 72 C i 60 sekunder 72 C i 5 minutter Holdes på 10 C SIKKERT STOPPEPUNKT Hvis du ikke fortsetter umiddelbart til PCR-rengjøring, kan AMP-platen bli på termosykleren over natten eller oppbevares ved 2 C til 8 C i opp til 48 timer. PCR-rengjøring Tilberedelse 1 Bring PCR rengjøringskuler til romtemperatur. 2 Tilbered ny 80 % etanol fra absolutt etanol. Prosedyre 1 Sentrifuger AMP-platen ved 1000 g i 20 C i 1 minutt. 2 Sett opp en ny MIDI-plate (heretter kalt CLP-plate). 3 Snu PCR rengjøringskuler 10 ganger. Vortekser kraftig og snu deretter ytterligere 10 ganger. Kontroller visuelt oppløsningen for å sikre at kulene er resuspendert. 4 Tilsett 45 µl av PCR rengjøringskuler i hver brønn i CLP-platen. 5 Overfør hele PCR-produktet fra AMP-platen til CLP-platen. 6 Forsegle CLP-platen og rist den på en mikroplaterister ved 1800 opm i 2 minutter. 7 Inkuberes i romtemperatur uten risting i 10 minutter. 8 Sett platen på et magnetstativ i minst 2 minutter eller til supernatanten er klar. 9 Mens CLP-platen står på magnetstativet, fjernes supernatanten forsiktig og kasseres. 10 Mens CLP-platen står på magnetstativet, vaskes kulene slik: a Tilsett 200 µl nytilberedt 80 % etanol i hver prøvebrønn. b Inkuber platen på et magnetstativ i minst 30 sekunder eller til supernatanten er klar. c Fjern supernatanten forsiktig og kasser den. 11 Gjenta vaskingen som beskrevet i tidligere trinn. 12 Bruk et P20 flerkanalspipettesett på 20 µl til å fjerne overskytende etanol. 13 Ta CLP-platen ut av magnetstativet og la kulene lufttørke i 10 minutter. 14 Tilsett 30 µl Elueringsbuffer til hver prøve og gjør en kort vorteksering. 15 Forsegle CLP-platen og rist den på en mikroplaterister ved 1800 opm i 2 minutter. Etter ristingen må du kontrollere at prøvene ble resuspendert. Hvis ikke, skal dette trinnet gjentas. 16 Inkuberes i romtemperatur i 2 minutter. 17 Sett CLP-platen på et magnetstativ i minst 2 minutter eller til supernatanten er klar. 18 Sett opp en ny MIDI-plate (heretter kalt LNP-plate). 19 Overfør 20 µl av supernatanten fra CLP-platen til LNP-platen. 20 [Valgfritt] Overfør gjenværende 10 µl av supernatanten fra CLP-platen til en ny plate og merk platen med et kjøringsnavn og dato. Oppbevar denne platen ved -25 C til -15 C til sekvenseringskjøringen og dataanalysen er ferdig. De rengjorte PCR-produktene kan brukes til feilsøking hvis det oppstår prøvefeil. SIKKERT STOPPEPUNKT Hvis den stopper på dette punktet, forsegles LNP-platen og sentrifugeres med 1000 g ved 20 C i ett minutt. Platen er stabil i opp til 3 timer ved 2 C til 8 C. Biblioteknormalisering Tilberedelse 1 Tilbered ny 0,1N NaOH. 18 Delenummer Rev. A NOR Januar 2014

19 2 Bring Biblioteknormaliserings-fortynning, Bibliotekkuler og Vaskeløsning for biblioteknormalisering til romtemperatur. 3 Vortekser Biblioteknormaliserings-fortynning kraftig og påse at alt bunnfallet er fullstendig oppløst. 4 Vortekser Bibliotekkuler kraftig i 1 minutt med vekselvis snuing til kulene er resuspendert og ingen pellet finnes på bunnen av røret når røret er snudd. Prosedyre 1 Bland Biblioteknormaliserings-fortynning og Bibliotekkuler i et nytt 15 ml konisk rør slik: a b MERK Hvis du behandler < 24 prøver, bruk et nytt rør på 1,5 ml. For 96 prøver tilsettes 4,4 ml av Biblioteknormaliserings-fortynning. Pipetter Bibliotekkuler opp og ned 10 ganger for å resuspendere. MERK Det er ekstremt kritisk at bibliotekkulepelleter på bunnen av røret blir resuspendert. Bruk av en P1000 sikrer at kulene er homogent resuspendert og at det ikke finnes kulemasse på bunnen av røret. Dette er avgjørende for å oppnå clustertetthet på flowcellen. c For 96 prøver pipetteres 800 µl av Bibliotekkuler til røret inneholder Biblioteknormaliserings-fortynning. d Bland ved å snu røret ganger. 2 Tilsett 45 µl av den kombinerte Biblioteknormaliserings-fortynning/Bibliotekkuler arbeidsløsningen i hver brønn på LNP-platen som inneholder biblioteker. 3 Forsegle LNP-platen og rist den på en mikroplaterister ved 1800 opm i 30 minutter. 4 Sett platen på et magnetstativ i minst 2 minutter eller til supernatanten er klar. 5 Mens LNP-platen står på magnetstativet, fjernes supernatanten forsiktig og kasseres. 6 Ta LNP-platen ut av magnetstativet og vask kulene med Vaskeløsning for biblioteknormalisering slik: a Tilsett 45 µl Vaskeløsning for biblioteknormalisering i hver prøvebrønn. b Forsegle LNP-platen og rist den på en mikroplaterister ved opm i 5 minutter. c Sett platen på et magnetstativ i minst 2 minutter eller til supernatanten er klar. d Fjern supernatanten forsiktig og kasser den. 7 Gjenta Vaskeløsning for biblioteknormalisering-prosedyren som beskrevet i tidligere trinn. 8 Bruk et P20 flerkanalspipettesett på 20 µl til å fjerne overskytende Vaskeløsning for biblioteknormalisering. 9 Ta LNP-platen ut av magnetstativet og tilsett 30 µl med 0,1 N NaOH i hver brønn. 10 Forsegle LNP-platen og rist den på en mikroplaterister ved 1800 opm i 5 minutter. 11 I løpet av elueringen på 5 minutter, sett opp en ny 96-brønners PCR-plate (heretter kalt SGP-platen). 12 Tilsett 30 µl Bibliotekoppbevaringsbuffer i hver brønn som skal brukes på SGP-plate. 13 Etter elueringen på 5 minutter, påse at alle prøvene på LNP-platen er fullstendig resuspendert. Hvis prøvene ikke er fullstendig resuspendert, pipetteres disse prøvene forsiktig opp og ned, eller bank platen forsiktig mot benken for å resuspendere kulene og rist deretter i ytterligere 5 minutter. 14 Sett LNP-platen på et magnetstativ i minst 2 minutter. 15 Overfør supernatanten fra LNP-platen tilsgp-platen. Pipetter forsiktig opp og ned 5 ganger for å blande. 16 Forsegle SGP-platen og sentrifuger deretter ved 1000 g ved 20 C i 1 minutt. SIKKERT STOPPEPUNKT Hvis du ikke fortsetter umiddelbart til bibliotekpooling og påfølgende sekvensering på MiSeqDx, oppbevares den forseglede SGP-platen i -25 C til -15 C i opptil 3 dager. Bibliotek-pooling Klargjøring for bibliotek-pooling 1 Still inn en varmeblokk som rommer 1,5 ml sentrifugerør på 96 C. Januar 2014 Delenummer Rev. A NOR 19