1 LC MS/MS gjennomgang av hele instrumentet NITO kurs i kromatografi og massespektrometri Trondheim 23.05.2018 Åse Marit Leere Øiestad Skjematisk oversikt over et MS instrument Ionekilde Detektor Innføringssystem Masseanalysator Registreringssystem I tillegg har vi pumper som gjør at det er meget lavt trykk (vakuum) i instrumentet 2 1
Teknikker for spektroskopisk analyse av molekyler Infrarød UV/synlig NMR Samme type prinsipp absorpsjon av elektromagnetisk stråling MS 3 Prinsipp for MS Danner og analyserer ioner stoffet ioniseres og spaltes (fragmenterer) Måler masse over ladning, vi veier ioner! Derav navnet massespektrometri Analyserer i vakuum (gassfase) Destruktiv teknikk 4 2
Konsekvenser av disse prinsippene Hvis man ikke får dannet ioner kan man ikke se noe til stoffet! Må ha vakuum, ellers blir ionene borte ved kollisjoner med luft Når molekylene blir til ioner går de i stykker slik at man ikke kan måle en gang til på det samme prøvematerialet 5 Innføringssystemer Gasskromatografi (GC) Væskekromatografi (LC) Superkritisk fluid kromatografi (SFC) Kapillærelektroforese (CE) Direkte innføring Med bruk av kromatografi får vi i tillegg til separasjon retensjonstiden som en parameter til å identifisere stoffer. 6 3
Gode MS betingelser = godt vakuum. Hva med mobilfasen? GC: mobilfasen er en gass, og er derfor kompatibel med MS en. For kapillærkolonner kan kolonnen gå rett inn i ionekilden. For større kolonner kan man ha en separator der bæregassen pumpes vekk. LC: mobilfasen er en væske kan ikke føres direkte inn i vakuum (0,1 ml/min væske ca. 100 ml/min gass!!) 7 Ulike typer ionekilder Molekylene ioniseres i ionekilden. Bare molekyler med ladning går videre til analysatoren. Ionene dras inn i MS en av linser med motsatt ladning. Ionisation Used in LC-MS (AP-)ESI + + Electrospray ionisation AP-CI + + Chemical ionisation AP-PI + + Photo ionisation ICP + + Inductively coupled plasma MALDI +/- Matrix assisted laser desorption ionisation DART - Direct analysis in real time DESI - Desorption ESI 4
Koble LC til MS 9 Nødvendige egenskaper: Analytt må kunne komme over i gassfasen Analytt må kunne ioniseres Dette oppnås ved ionisering ved atmosfærisk trykk før vakuumdelen av MS en vanligvis med elektrospray (AP ESI) eller kjemisk ionisering (AP CI). I begge tilfeller fordampes mobilfase og ioniseres analyttene (ulikt prinsipp). Deretter ledes ionene inn i MS en og inn i stadig bedre vakuum (flere steg med pumping). Mobilfase må inneholde flyktige komponenter! For LC MS: from liquid phase to gas phase Generally important : use volatile mobile phase components acetonitrile, methanol, THF, CH 3 COOH, CHOOH, NH 4 CHOO, NH 4 CH 3 COO, NH 3 Never use non-volatile components Example In the preparation of an acetate buffer use acetic acid and ammonium acetate both components are volatile Do NOT use acetic acid and sodium acetate sodium acetate is not volatile! 5
Ionisering Gjennom ph i mobilfase HPLC kolonne MS electrospray Ionisering Gjennom ph i mobilfase ph < pk a ph > pk a 6
Ionisering = 235 = 179 50 150 250 350 50 150 250 350 molekylionet = 234 + H + = 235 [M+H] + =235 POSITIVE MODE = 180 H + = 179 [M-H] - =179 NEGATIVE MODE Elektrosprayionisering, ESI Sprayer væske med analytten i ut av et kapillærrør Har på en høy spenning som gjør at det dannes ladde dråper Fordamper løsningsmiddelet fra dråpene og får ioner. Store molekyler kan få mange ladninger. Myk teknikk = mindre fragmenter 7
Elektrospray HPLC kolonne MS electrospray 16 8
Massespektrometre til LC nanospray: cap. HPLC-column directly attached to ESI tip capillary flow rate no sheath gas is needed www.rsc.org/images http://www.youtube.com/watch?v=87urq7kwbb0&feature=related http://youtu.be/r6tgvg7ruyo 9
APCI ion source 500 C vaporizer tube Typical flow 0.2 2 ml/min Polar and relative non polar compounds Evaporation mobile phase / analyte Ionisation is caused by applying voltage on the discharge electrode (corona needle) APCI ion source Reaction cascade in ion source causes ionisation vaporizer tube 10
APCI & APPI ion source AP-CI AP-PI www.shimadzu.com AP-PI is similar to AP-CI In AP-PI photons (UV-lamp; hv) used to ionise instead of corona discharge (non-polar compounds) ESI and AP CI ion source Electrospray and chemical ionisation are widely used in LC-MS When to use electrospray (ESI)? When chemical ionisation (AP-CI)? Ionisable compounds (bases / acids) ESI Non-ionisable compounds (steroids) AP-CI 11
Hvilken ionekilde skal man bruke? 10 000 masse [M+H] + peptider/proteiner ESI [M H] 1 000 AP PI AP CI 100 ikke polar polar Fra ionekilden til masseanalysatoren 2 Torr 10-4 Torr 10-6 Torr Pump 12
Masseanalysatorer Analyser Separation principle - Magnetic sector momentum - Electrostatic sector kinetic energy - Quadrupole trajectory stability - Ion-trap resonance frequency (Paul trap and linear IT) - Time-of-flight velocity (linear TOF and reflectron TOF) - Orbitrap resonance frequency Kvadrupol masseanalysator Har en enkel oppbygning og er enkle i bruk Dekker et bra masseområde Har god linearitet for kvantitativt bruk Bra oppløsning og kvalitet på massespektrene Er relativt rimelige og tar liten plass Er ikke så følsomme for forurensninger Skanner veldig hurtig (bra i SIM modus) Brukes både til GC MS og LC MS 26 13
Kvadrupol masseanalysator non-resonant ion _ + resonant ion Detector Stable (resonant) ion + _ Quadrupole Mass Filter Prefilter Postfilter Ion Source DC and AC Voltages Rejected ions 27 Kvadrupol masseanalysator Stavene i kvadrupolen er koblet sammen elektrisk to og to, hvor to staver er positive og to er negative. Ved hjelp av varierende spenninger på stavene vil ionene bevege seg i et komplisert sikk sakkmønster mellom stavene. Kvadrupolen virker som et massefilter siler ut ioner med bestemt masse. De andre ionene krasjer med stavene. 28 14
Kvadrupol masseanalysator detector source U 1 2 4 3 1 2 stable along xz and yz V 3 U V cos t 4 direct potential 500 V to 2000 V alternating potential -3000 V to + 3000 V Kvadrupol masseanalysator 1 1 < 2 < 3 < 4 2 U U/V = constant 3 4 2 4 3 1 V 1: shows all values no resolution 2: shows only 1 good resolution 3: shows 3 and 4 poor resolution 4: shows 2, 3 and 4 poor resolution 15
Kvadrupol masseanalysator 1 no transmission optimum 2 3 4 U 2 4 poor resolution 3 1 V 1: shows all values no resolution 2: shows only 2 good resolution 3: shows 3 and 4 poor resolution 4: shows 2, 3 and 4 poor resolution Kvadrupol masseanalysator signal mass spectrum U U/V = constant V 1 2 3 4 1 2 3 4 16
Ion trap - mass analyser 3D ion trap or Paul trap 50-2000 a.m.u. Ion trap - mass analyser a z Equations stability limit: q z q z 8zeV m(r 0 2 2z 0 2 ) 2 a z 16zeU 2 m( r 2 2 0 2z0 ) Keeping U at 0, a z =0 q z ~ 1/() Increasing V destabilises small ions first 17
stable ion ion of interest unstable ion ion trap - tandem MS Ion trap - mass analyser -U DC Stability diagram for ion-trap Increasing V RF causes destabilisation of small ions first. V RF Keeping U DC at 0, V RF correlates with the 1 Increasing V RF destabilises small ions first 2 1 < 2 < 3 3 18
Ion trap - mass analyser a z signal q z 1 2 3 Trippelkvadrupol instrumenter MS1 Kollisjonscelle MS2 I et trippelkvadrupol eller tandem massespektrometer er MS1 og MS2 masseanalysatorer som filtrerer ioner. Kollisjonscellen er fylt med argon, og et potensiale settes på for å fragmentere ionene. 38 19
Gir ytterligere strukturinformasjon Økt selektivitet Generelt prinsipp: Tandem MS 418 312 344 HPLC column MS 1 Selection Selection of one particular mass Fragmentation MS 2 Analysis Structural information Selective fragments Trippelkvadrupol tandem MS detector 1 st quadrupole 2 nd quadrupole 3 rd quadrupole ions from ion scource Filtering the ion of interest High-pass filter Collision induced fragmentation Determination of fragment masses 20
Trippelkvadrupol tandem MS detector 1 st quadrupole 2 nd quadrupole 3 rd quadrupole ions from ion scource collision induced dissociation / fragmentation gass molecules (Ar, He) Fragmentering tandem MS varying collision energy effect on fragmentation signal 455 0% 20% 40% 50% 260 signal 455 260 303 signal signal 165 303 303 165 260 455 455 21
Detektorer 43 Measurement of Total Ion Count (TIC) Faraday cup Electron multiplier Photo multiplier Array detector not for Orbitrap Detektorer 44 Measurement of Total Ion Count (TIC) Faraday cup Electron multiplier Photo multiplier Array detector not for Orbitrap 22
Registreringssystem I datamaskinen blir signalene fra MS en prosessert og konvertert til masser i henhold til instrumentets massekalibrering. Intensiteten på toppene bestemmes enten fra arealet eller høyden på toppen. 45 Oppsummering LC MS instrumenter chromatography ion source mass analyser detector 0.500 VOLATILE MOBILE PHASES! ESI AP CI Quadrupole Ion trap Time-of-flight Orbitrap Faraday cup Electron multiplier Photo multiplier Array detector not for Orbitrap 23
Hva ser vi i MS en? EI Molekylioner [M] +. CI, ESI [M+H] + /[M H] Fragmentioner [M] +. [M+H] + /[M H] X1 X2... Xn Addukter [M+ NH4] + (M+18) [M+ Na] + (M+23) hovedsakelig [M+ K] + (M+39) for LC MS [M+ CH3CN + H] + (M+42) 47 Molekylionet Hvis molekylionet synes i spekteret er det den høyeste massen (~alltid med EI) Unntak: hvis det dannes addukter. De vil da ha høyere masse enn molekylionet. Eller hvis molekylionet har flere ladninger enn fragmentet. Vi ser verdien = masse delt på ladning. Molekylionets masse = molekylvekten til stoffet Molekylionet må inneholde alle isotoper som fragmentene har 48 24
Fragmentioner Fragmentioner dannes når molekylionet går i stykker de består av biter av molekylet Må derfor stemme med det antall atomer/typer atomer som molekylionet har Dvs. kan ikke forklare et fragment med at det inneholder oksygen hvis molekylionet ikke gjør det Molekylet kan omleire (dvs. at strukturen endres ved at atomene får en litt annen rekkefølge) og gi uventede masser 49 Opptak av MS spektra scan vs. SIM/MRM Scan sveiper over et valgt masseområde og detekterer alle masser Gir mye informasjon Kan plukke ut interessante masser i ettertid Biblioteksøk fingeravtrykk SIM (=single ion monitoring)/mrm (=multiple reaction monitoring) detekterer en valgt masse eller overgang gir mye lavere deteksjonsgrense NB! Får bare det man ser etter 50 25
MS ingen fragmentering MS/MS fragmentering ved hjelp av gassmolekyler gass molecules (Ar, He) MS ingen fragmentering 455 MS/MS fragmentering ved hjelp av gassmolekyler 165 260 303 26
Hvordan ser informasjonen ut etter LC MS analyse? Uten fragmentering Kromatogrammet og massespektrale egenskaper tid (min) = 180 MDA = 260 Clobenzorex = 136 Amfetamin 50 150 250 350 50 150 250 350 50 150 250 350 Hvordan ser informasjonen ut etter LC MS analyse? Uten fragmentering Kromatogrammet og ionekromatogrammer MDA =180 Clobenzorex =260 Amfetamin =136 27
Hvordan ser informasjonen ut etter LC MS analyse? Med fragmentering Kromatogrammet og massespektrale egenskaper H+ 270 clozapin 270 192 192 50 150 250 327 350 [M+H] + =327 Hvordan ser informasjonen ut etter LC MS analyse? Med fragmentering Kromatogrammet og ionekromatogram Clozapin 327 270 28
100 376 % abundance 455 300 400 500 100 165 265 376 165 265 % abundance Selected reaction monitoring (SRM) 318 376 200 300 400 100 376 % abundance 455 100 165 265 300 400 500 303 376 165 265 % abundance 260 455 260 303 Multiple reaction monitoring (MRM) 200 300 400 29
100 376 % abundance 455 100 165 300 400 500 % abundance 265 Product ion scan 318 376 200 300 400 Tandem MS collision Product Ion Scan Selected Scan Selected Reaction Monitoring Selected Selected Multiple Reaction Monitoring Selected several selected Constant Neutral Loss* Scan =x Scan =x-a Precursor Ion Scan* Scan Selected 30
SIM Diazepam har en RT på 8,51 min Molekylmasse (molekylion) er 285,1 (M+H)+ 215-0029 STD 3 8918_A_ny_5 8.51 100 2105697 % 4: SIR of 4 Channels ES+ 285.1 2.12e6 Height Fragmentionet har riktig retensjonstid riktig masse (193,1) riktig størrelse i forhold til molekylionet (høyde 285/193 = 2,8) 0 8918_A_ny_5 100 % 8.51 747879 4: SIR of 4 Channels ES+ 193.1 7.65e5 Height 0 61 8.20 8.40 8.60 8.80 9.00 Time Eksempel på bruk av fragment til avkrefting av identitet: Er dette klonazepam? Riktig molekylmasse, men ikke noe fragment dvs. negativ 62 31
Sammenlikning av SIM og MRM Ion Chromatograms from SIR s of =255 Fenbufen O MixIso_1G14_022 100 From a Sample that is 60 ng/ml Ketoprofen 60 ng/ml Fenbufen % 1.31 SIR of 1 Channel ES+ TIC 5.95e6 O OH Ketoprofen Fenbufen Ketoprofen O O OH Both have a MW of 254 0.80 0 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70 Time MixIso_1G14_023 100 From a Sample that is 60 ng/ml Ketoprofen 6 ng/ml Fenbufen % 1.31 SIR of 1 Channel ES+ TIC 6.03e6 Ketoprofen Fenbufen?? 0.80 0 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 631.70 Time Sammenlikning av SIM og MRM MixIso_1G14_023 100 % From SIR of m/ z= 255 1.31 SIR of 1 Channel ES+ TIC 6.03e6 0.80 0 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70 Time Ion Chromatograms from SIR and MRM Analyses of a Sample that is 60 ng/ml Ketoprofen 6 ng/ml Fenbufen MixIso_1G14_024 100 % From MRM of = 255 > 209 1.31 MRM of 2 Channels ES+ 255.25 > 209.2 1.43e6 Ketoprofen 0 MixIso_1G14_024 100 1.42 MRM of 2 Channels ES+ 255.25 > 237.2 8.06e4 % From MRM of = 255 > 237 Fenbufen 64 0.80 0 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70 Time 32
Identifikasjon av stoffer Singel MS (SIM): Retensjonstid for molekylion Evt. fragmentioner (qualifier ions) riktig retensjonstid + riktig størrelse i forhold til molekylionet Trippel MS (MRM) Retensjonstid for overgang(er) Evt. ratio mellom to overganger 65 How is the mass spectrometer used? Singel MS Full scan: The whole spectrum is recorded Single MS: Full scan ( 1000 4000) Qualitative info ++ Quantitative data + Single MS: SIM( 1605) Qualitative info +/ Quantitative data ++ Selected ion monitoring (SIM): A certain signal is recorded 33
Singel MS og tandem MS How is the mass spectrometer used? Single MS: Full scan ( 1000 4000) Qualitative info ++ Quantitative data + Single MS: SIM( 1605) Qualitative info +/ Quantitative data ++ Tandem MS: Product ion scan ( 1605 100 900) Qualitative info +++ Quantitative data + Tandem MS: MRM/SRM ( 1605 743) Qualitative info + Quantitative data +++ 68 Takk til Elisabeth Øiestad, RMF, OUS Léon Reubsaet, Farmasøytisk institutt, UiO 34
Spørsmål? 69 35