Rapport nr. 4617/115. Metode for bestemmelse av peptidstørrelse i fiskehydrolysat, ensilasje og gelatin

Rapport nr. 4617/115 Metode for bestemmelse av peptidstørrelse i fiskehydrolysat, ensilasje og gelatin

RAPPORT-TITTEL Marked Metode for bestemmelse av peptidstørrelse i fiskehydrolysat, ensilasje og gelatin RAPPORTNUMMER 115 PROSJEKTNUMMER 4617 UTGIVER RUBIN DATO April 2004 UTFØRENDE INSTITUSJONER Fiskeriforskning, avd. Bergen Kjerreidviken 16 5141 Fyllingsdalen Tlf.: 55 50 12 00 Kontaktperson: Anders Aksnes (anders.aksnes@fiskeriforskning.no) SAMMENDRAG OG KONKLUSJONER Bestemmelse av peptidstørrelser er viktig for karakterisering av proteinhydrolysat og fiskegelatin. For proteinhydrolysat er data for peptidstørrelse en sentral parameter for karakterisering av det ferdige produkt ovenfor kunde og for å tilfredsstille EU krav for proteinholdige produkter basert på biprodukter. For karakterisering av fiskegelatin er peptidstørrelse også en viktig faktor for produktoptimalisering og for spesifikasjon ovenfor kunde. Dette fordi fiskegelatinets egenskaper og anvendelsesmuligheter for en stor del bestemmes av peptidstørrelsen av produktet og vil være avhengig av prosess og prosessparametre. HPLC-gelfilterering er en mulig metode for separering av molekyler ved hjelp av størrelsesforskjeller. Hensikten med prosjektet var således å teste ut om bruk av HPLC-gelfilterering kan være en nyttig metode for å bestemme peptidstørrelser i henholdsvis proteinhydrolysat, fiskegelatin og ensilasje. Ved bruk av HPLC-gelfilterering skjer separasjonen ved at små molekyler trenger inn i porer i kolonnematerialet og derved får en forsinket flow gjennom kolonnen. Evalueringshastigheten vil i prinsippet være omvendt proporsjonalt med logaritmen til molekylvekten for tilnærmet globulære molekyler. Langstrakte molekyler vil i prinsippet gi en lavere evalueringshastighet enn det molekylvekten skulle tilsi. Ved separasjon vil en dessuten få uspesifikk interaksjon mellom molekyl og kolonnematerialet på grunn av ladninger eller hydrofob interaksjon. Disse effektene er søkt eliminert ved å kjøre separasjonen i nærvær av SDS (natrium dodecyl sulfat). SDS vil binde seg til overflaten av molekylene og derved gi forskjellige molekyler tilnærmet lik ladning. De innledende forsøkene viser at det er mulig å skille peptider i størrelsesområdet fra ca 60.000 til 2.000 daltons. Rapporten beskriver en analytisk metode for å separerer peptider etter størrelse ved hjelp av HPLC-gelfiltrering. Metoden har viss begrensninger, men synes å kunne benyttes for karakterisering av fiskehydrolysat, ensilasje og ekstrakter av fiskegelatin. Stiftelsen RUBIN Pirsenteret 7462 Trondheim Telefon 73 54 56 30 Telefax 73 51 70 84 E-mail: rubin@rubin.no Internett: www.rubin.no

Norsk institutt for fiskeri- og havbruksforskning AS Hovedkontor: Postboks 6122, 9291 Tromsø Besøksadresse: Muninbakken 9-13, Tlf.: 77 62 90 00, faks: 77 62 91 00 E-post: post@fiskeriforskning.no Avd. Bergen: Kjerreidviken 16, 5141 Fyllingsdalen Tlf.: 55 50 12 00, faks: 55 50 12 99 E-post: office@fiskeriforskning.no Internett: www.fiskeriforskning.no Organisasjonsnr.: NO 964 441 898 MVA RAPPORT Tilgjengelighet: Konfidensiell Tittel: Metode for bestemmelse av peptidstørrelse i fiskehydrolysat, ensilasje og gelatin Forfatter(e): Anders Aksnes og Bente Asbjørnsen Oppdragsgiver: Rubin 3 stikkord: Peptidstørrelse - HPLC gelfiltrering Sammendrag: (maks 200 ord) Rapportnr: K-289 ISBN: Dato: 18.12.03 Antall sider og bilag: 15 Forskningssjef: Ola Flesland Prosjektnr.: 5624 Oppdragsgivers ref.: Sigrun Bekkevold Rapporten beskriver en analytisk metode for å separere peptider etter størrelse ved hjelp av HPLC gelfiltrering. Gelfiltreringskolonnen separerer peptider med molekylvekt mellom ca. 2000 og 60 000 Daltons. Metoden er benyttet for separering og molekylbestemmelse av peptider i fiskehydrolysat, ensilasje og ekstrakter av fiskegelatin.

INNHOLD 1 INNLEDNING... 1 2 KJEMIKALIER OG UTSTYR... 2 2.1 Kjemikalier... 2 2.2 Utstyr... 2 2.3 HPLC Apparatur... 3 2.4 Tillaging av prøver... 3 2.5 Tillaging av standarder... 3 2.6 Kromatografering... 3 3 RESULTATER... 5 4 KROMATOGRAFERING AV ENSILASJE... 6 5 KROMATOGRAFERING AV LAKSEHYDROLYSAT... 9 6 KROMATOGRAFERING AV FISKEGELATIN... 12 7 VURDERING AV METODIKK... 15 8 KONKLUSJON... 15 1

1 INNLEDNING Bestemmelse av peptidstørrelser er viktig for karakterisering av proteinhydrolysat og fiskegelatin. For proteinhydrolyat er data for peptidstørrelse en sentral parameter for karakterisering av det ferdige produkt ovenfor kunde og for å tilfredsstille EU krav for proteinholdige produkter basert på biprodukt. For karakterising av fiskegelatin er peptidstørrelse også en viktig faktor for produktoptimalisering og for spesifikasjon ovenfor kunde. Dette fordi fiskegelatinets egenskaper og anvendelsesmuligheter for en stor del bestemmes av peptidstørrelsen av produktet og vil være avhengig av prosess og prosessparametre. HPLC-gelfiltrering er en metode for separering av molekyler ved hjelp av størrelsesforskjeller. Separasjonen skjer ved at små molekyler trenger inn i porer i kolonnematerialet og derved får en forsinket flow gjennom kolonnen. Elueringshastighet vil i prinsippet være omvendt proporsjonalt med logaritmen til molekylvekten for tilnærmet globulære molekyler. Langstrakte molekyler vil i prinsippet gi en lavere elueringshastighet enn det molekylvekten skulle tilsi. Ved separasjon vil en dessuten kunne få uspesifikk interaksjoner mellom molekyl og kolonnematerialet på grunn av ladninger eller hydtofob interaksjon. Disse effektene er forsøkt eliminert ved å kjøre separasjonen i nærvær av SDS (natrium dodecyl sulfat). SDS vil binde seg til overflaten av molekylene og derved gi forskjellige molekyler tilnærmet lik ladning. En metode for separasjon av peptidstørrelse vil kunne benyttes til karakterisering av fiskehydrolysat, ensilasje og gelatin, ved at en kan kvantifisere mengden av forskjellige peptidstørrelser. Et HPLC-gelkromatogram vil således gi antydning om hydrolysatets karakter og reproduserbarhet. Metoden kan i prinsippet også benyttes til karakterisering av andre proteinholdige væskefaser som kan gi informasjon om hvor oppløst råstoffet har vært og underbyggende data for vurdering av viskositet i limvann. I dette arbeidet er det benyttet en HPLC-gelkolonne som skiller relativt små peptider. Kolonnen er oppgitt å ha en nedre grense på ca 2000 5000 daltons. Dette valget er gjort med tanke på karakterisering av fiskehydrolysat og er ikke nødvendigvis det beste valg for karakterisering av alle typer gelatin.

2 KJEMIKALIER OG UTSTYR 2.1 Kjemikalier Protein / Peptid-standarder Bovine albumin Pepsin Carbonic anhydrase Lysozyme Cytocrome C Blue Dextran Ovalbumin Aprotinin Polymyxin Leucylglycylglycin Glycylglycin Andre kjemikalier NA 2 HPO 4 NaH 2 PO 4 n-dodesylsulfat Na-salt (SDS) M 13760 NaCl NaN 3 (Natrium azid) Ultra rent vann Buffer: 0.1M Na-fosfatbuffer ph 6.8, inneholdende. 0.1M NaCl, 0,3% SDS og 0,001 N NaN 3 2.2 Utstyr Reagensrør Automatpipetter Reagensrør-ryster Sprøyte-filter, Sartorius 0.2µm Sentrifuge

2.3 HPLC Apparatur Autosampler: HPLC-pumpe: degassing Detektor: Kolonne: Forkolonne: Tilbaketrykksregulator Perkin Elmer Series 200 Autosampler Perkin Elmer Series 200 Pump m/vakuum Perkin Elmer Series 200 UV/VIS detektor Gel-kolonne TSK G2000 SW 7,5 mm x 30,0 cm TSK SW 7,5 mm IDx7,5cm L (TOSOHBIOSIP) 2.4 Tillaging av prøver Det ble veid inn ca 3 mg prøve pr ml buffer. Etter tilsats av buffer ble prøven ristet på reagensrørmixer. For injisering på kolonnen, må prøven være fri for partikler. For de prøver som er benyttet i dette arbeid, er hydrolysat og ensilasjekonsentrat sentrifugert 10 min. ved 10000 rpm. Dette ble ikke gjort med gelatinprøvene. Prøvene ble filtrert gjennom sprøytefilter og injisert i HPLC systemet. 2.5 Tillaging av standarder Det ble benyttet ca 3mg standard pr. ml buffer. Standardene ble ristet på reagensrørmixer, filtrert gjennom sprøytefilter og injisert i HPLC systemet. 2.6 Kromatografering Kromatograferte med flow-rate 0.5 ml/min og med 0.1M Na-fosfatbuffer ph 6.8 inneholdende 0.1M NaCl 0,3% SDS og 0,001 N NaN 3 som mobilfase. Normalt trykk under kromatografering var 350 psi. Peptidene ble detektert ved 220 nm og kromatograferingen ble avsluttet etter 40 min.

Tabell 1. Standarder. Mw lg Mw Elueringstid (gj.sn) Blue Dextran 2 mill 6,30 13,21 Bovine albumin 66 000 4,82 14,14 Ovalbumin 45 000 4,65 14,51 Pepsin 34 700 4,54 14,42 Carbonic anhydrase 29 000 4,46 15,19 Lysozym 14 300 4,16 18,07 Cytochrom C 12 600 4,10 17,79 Aprotonin 6 000 3,78 17,23 Polymyxin 1 470 3,17 18,81 Leu-gly-gly 345 2,54 25,97 Gly-gly 132 2,12 26,36 5,00 Carb.anhydr. Lysozyme 4,00 Cyt. C Aprotinin log Mw 3,00 polymyxine leuglygly 2,00 glygly 1,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 Elueringstid - min Figur 1. Standardkurve.

3 RESULTATER Figur 1 viser sammenheng mellom elueringstid og lg Mw. Resultatene viser at kolonnen har en øvre ekslusjonsgrense på ca. 60 000 daltons. Det er rimelig bra overensstemmelse mellom lg Mw og standarder. Avvik fra beregnet kurve antas å skyldes uspesifikk interaksjon mellom peptider og kolonnemateriale, forskjell i form og ladning eller kompleksdannelse. Den linære regresjon av punktene i figur 1 har ligningen: lg Mw = 7,46 0.199*elueringstid med en regresjonskoeffisient R 2 = 0.924. Beregnet molekylvekt av standarder ut fra standardkurven er gitt i tabell 2 sammen med enkeltverdier for forskjellige kromatograferinger. Disse kromatograferingene er tildels utført etter diverse demonteringer/monteringer og bufferskifte. Jevnt over synes reproduserbarheten å være akseptabel. Tabell 2. Reproduserbar - elueringstid av standarder Blue Dex Bovin alb. Ov- alb. Peps. Carb. anh. Lysozyme Cytoc. C Aprot. Poly- myxin Leugly gly Glygly Molekylvekt: 2 mill 66000 45000 34700 29000 14300 12600 6000 1470 345 132 Elueringstid: 13,20 14,10 14,55 14,57 15,10 17,70 17,18 25,70 13.14 14,15 14,47 14,37 15,22 17,83 17,21 25,71 13,25 14,15 14,52 14,38 15,22 18,07 17,81 17,26 18,91 26,22 26,36 13,24 14,15 14,49 14,35 15,23 18,07 17,81 17,27 18,70 26,23 26,35 Snitt: 13,21 14,14 14,51 14,42 15,19 18,07 17,79 17,23 18,81 25,97 26,36 Std. avvik: 0,05 0,03 0,04 0,10 0,06 0 0,06 0,04 0,15 0,03 0 Bereg. Mw* 44716 37750 39337 27652 7399 8334 10866 5273 199 166 *Mw beregnet ut fra standardkurve.

4 KROMATOGRAFERING AV ENSILASJE Det ble valgt ut 2 tilfeldige prøver av ensilasje for å teste metoden på denne type prøver. En prøve var fersk ensilasje, vesentlig fra slo fra laks. Denne var kun et par dager gammel, og mage / tarm var ikke skikkelig oppløst ved prøveuttak. Den andre prøven var en kommersiell ensilasjekonsentrat fra hvitfisk avskjær som var ment som fôringrediens i fôr til laks. Ensilasjekonsentratet hadde stått ca 3 år på lager før prøveuttak. Figur 2 og Figur 3 viser kromatograferingsresultatene for fersk ensilasje og ensilasjekonsentrat. Tabell 3 gir en oppstilling for fordeling av peptidstørrelsen i ensilasjeprøvene som relativ andel. Figur 2. Kromatogram av fersk ensilasje.

Figur 3. Kromatogram for ensilasjekonsentrat. Tabell 3. Kromatograferingsresultater av fersk ensilasje og ensilasje-konsentrat. %-vis fordeling. Fersk ensilasje Lagret ensilasje konsentrat Mw peptid > 60 000 0,8 1,5 60 50 000 0,4 0,5 50 40 000 0,4 0,5 40 30 000 0,4 0,8 30 20 000 0,5 1,2 20 10 000 1,0 1,4 10-5 000 10,0 12,4 5 1 000 18,5 5,8 1000 100 40,7 55,5 < 100 27,4 20,4

Kromatogrammene av ensilasjer i Figur 2 og 3 viser at hoveddelen av peptidene er i størrelse mindre enn 10 000 daltons. I fersk ensilasje fra lakseslo er kun 3% av peptidene større enn 10 000 daltons. Det er ellers en tydelig forskyvning fra store til mindre peptider i fersk ensilasje sammenlignet med kommersielt ensilasjekonsentrat. Mens andelen av peptider i området fra 1 000 5 000 daltons er 18,5% i fersk ensilasje er denne andelen i konsentratprøven kun 5,8%. Det er samtidig øket andelen av peptider i området fra 100 1000 daltons. Kromatogrammene fra ensilasjeprøvene viser ellers en mindre andel av detektert material omkring ekslusjonsgrensen for kolonnen (ca 60 000 daltons). Det synes videre å være en tilnærmet stabil topp i området fra 5 000 til 10 000 daltons og som også om enn i liten grad strekker seg til peptider over 10 000 daltons. At denne toppen er tilnærmet konstant, indikerer at det i dette området dannes peptider som kan være vanskelig å bryte ytterligere ned til mindre peptider.

5 KROMATOGRAFERING AV LAKSEHYDROLYSAT Det ble valgt ut 3 tilfeldige prøver av hydrolysat fra lakse-avskjær og slo. Prøvene er produsert fra lakse-overskudd og hydrolysert med tilsetning av kommersielle proteolyttiske enzymer (endopeptidaser). En prøve var hydrolysat fra lakse- hoder og rygg, en prøve var fra hydrolysat produsert fra lakse-slo og den tredje prøven var fra laksehydrolysat med ukjent bakgrunn. Figur 4, 5 og 6 viser kromatograferingsresultatene for de 3 hydrolysatprøvene. Tabell 4 gir en oppstilling for fordeling av peptidstørrelsen i hydrolysatprøvene som relativ andel. Figur 4. Kromatogram av hydrolysat fra lakse-hode/rygg

Figur 5. Kromatogram for hydrolysat fra lakseslo. Figur 6. Kromatogram av laksehydrolysat.

Tabell 4. Kromatograferingsresultater av hydrolysat fra lakseoverskudd. Hode rygg hydrolysat Slo hydrolysat Laksehydrolysat Mw peptid > 60 000 1,4 2,4 1,1 60 50 000 0,2 0,4 0,1 50 40 000 0,4 0,4 0,4 40 30 000 0,5 0,5 0,6 30 20 000 0,7 0,8 0,8 20 10 000 0,7 1,4 0,3 10-5 000 25,5 13,5 36,7 5 1 000 12,1 8,0 8,0 1000 100 47,7 52,2 38,8 < 100 10,8 20,7 11,1 Kromatogrammene av laksehydrolysat i Figur 4 og 5 viser tilsvarende som for ensilasjeprøvene at hoveddelen av peptidene er i størrelse mindre enn 10 000 daltons. I hydrolysat fra hode/rygg er kun 3,9% av peptidene større enn 10 000 daltons, mens tilsvarende tall for hydrolysat fra slo viser 5,9%. Dette kan skyldes at slofraksjonen inneholder vev fra mage/tarm som er vanskelig å spalte tilfredsstillende ved hydrolyse. Dette kromatogrammet viser også større andel av peptider ved ekslusjonsgrensen for kolonnen. Kromatogrammene i figur 4 og 5 og dataene i tabell 4, viser for øvrig at hydrolysat fra slo gir vesentlig mindre peptider enn tilsvarende fra hode/rygg. Tilsvarende antyder kromatogrammet at prøven fra laksehydrolysat med ukjent bakgrunn er produsert fra råstoff fra hode/rygg. Disse sammenligningene trenger ikke være absolutt da det ikke er data for om disse er produsert under sammenlignbare råstoff eller betingelser, men tas opp her for å vise anvendelighet og tolkningsmuligheter for metodikken.

6 KROMATOGRAFERING AV FISKEGELATIN Det ble valgt ut 4 tilfeldige prøver av fiskegelatin produsert fra lakse-avskjær. Prøvene er valgt ut for å teste anvendeligheten av metodikken i sammenheng med å karakterisere denne type prøver i forbindelse med de tekniske egenskaper av produktene. Figur 7, 8, og 9 viser kromatograferingsresultatene for de 3 prøvene av fiskegelatin. Tabell 5 gir en oppstilling for fordeling av peptidstørrelsen i prøvene som relativ andel. Figur 7. Kromatogram av fiskegelatin med gode gelingsegenskaper.

Figur 8. Kromatogram for fiskegelatin med mindre gode gelingsegenskaper. Figur 9. Kromatogram av fiskegelatin uten gelingsegenskaper.

Tabell 5. Kromatograferingsresultater av fiskegelatin. Gode gelingsegenskaper (10 C) Mindre god geling (3,5 C) Ikke geling Mw peptid > 60 000 34,7 7,3 0,9 60 50 000 8,2* 7,1* 0,1 50 40 000 8,2* 2,3 0,2 40 30 000 14,5 23,2 0,3 30 20 000 13,1* 0,8* 0,4 20 10 000 10,5 26,8 0,5 10-5 000 9,2 27,3 36,6 5 1 000 0,7 1,6 11,5 1000 100 1,0 3,2 47,6 < 100 0,0 0,4 2,0 * : ikke beregnet, tatt fra kurven. Kromatogrammene av fiskegelatin i Figur 7, 8 og 9 (og data i tabell 5) viser en klar sammenheng mellom peptidstørrelse og gelingsegenskaper. Geling krever store molekyler og fortrinnsvis molekyler større enn ca 100 0000 daltons. Den valgte HPLC-kolonne er i første omgang valgt for å karakterisere små peptider i hydrolyserte fiskemateriale og derfor ikke egnet for separering av molekyler i området over 60 0000 daltons. Kromatogrammene viser likevel en klar sammenheng mellom peptidstørrelse og fysiske egenskaper av prøver fra fiskegelatin. Metoden er derfor godt egnet som et hjelpemiddel for å standardisere fiskegelatin for spesifikke formål. For optimalisering av fiskegelatin for gelingsegenskaper, er det imidlertid behov for en annen kolonne som separerer større peptider.

7 VURDERING AV METODIKK Reproduserbarhet av standarder og prøver er god, og også i godt samsvar med tidligere analyser på tilsvarende metodikk. Bestemmelsen av molekylvekt er definert av de standarder som benyttes. Elueringstiden vil være avhengig av ikke bare størrelse, men også uspesifikk interaksjon mellom peptid og kolonnemateriale, kompleksdannelse, form på peptider, evne til å binde SDS og ekstinksjonskoeffisienten ved deteksjon. Spesielt for små peptider og frie aminosyrer kan evnen til å binde SDS være forskjellig og enkelte frie aminosyrer detekteres ikke ved 210 nm. Denne bølgelengde er i første rekke valgt for å detektere peptidbindinger. Standardkurven for de utvalgte peptider viser at enkelte av standardene ikke faller sammen med på den beregnede verdi ut fra standardkurven. De beregnede verdier må derfor ikke vurderes som absolutte, men som en definisjon av metode og de standarder som er benyttet for definere standardkurven. Metoden anses likevel som anvendelig for å karakterisere hydrolysat, ensilasje og gelatin. Tilsvarende anses metoden viktig i forbindelse med produktoptimalisering for spesifikke formål og for produktstandardisering. 8 KONKLUSJON Disse innledende forsøkene viser at det er mulig å skille peptider i størrelsesområdet fra ca 60.000 til 2000 daltons. Et HPLC gelkromatogram kan således gi en informasjon av peptidstørrelser i vandige fiskeprodukt. Til tross for begrensninger i metoden, synes metoden å kunne benyttes for karakterisering av fiskehydrolysat, ensilasje og gelatin.