, 1C Geir Slupphaug, IKM Vil bli gjennomgått: Hovedvekt på prosesser i eukaryote celler I løpet av cellens livssyklus, må DNAinnholdet i cellekjernen fordobles G0 G1 Initiering av replikasjonen Dannelse av primere og Okazaki-fragment Koordinering av DNA-syntesen i leading og lagging strand Fjerning av gamle primere Dette skjer i S- (syntese-)fasen i cellesyklus. Selve prosessen kalles M G2 S 4n Hva skjer ved inkorporering av feil base, eller hvis replikasjonskomplekset møter en DNA-skade? Tallet foran n angir hvor mange kopier av hvert kromosom (unntatt xog y) som er tilstede i cellekjernen 4n Viktige punkt (repetisjon) skjer i cellekjernen og i mitokondriene I cellekjernen skjer dette en gang pr generasjon, i S-fasen. Nytt DNA kan også dannes i forbindelse med DNA-reparasjon Replikasjonen er semikonservativ (Meselsohn & Stahl) Kromosomal replikasjon er bidireksjonell Replikasjon foregår i replikasjonsfabrikker Ved hjelp av immunologiske teknikker, og studier av merkede proteiner, har en vist at en foregår i store proteinkompleks som dannes tidlig i S-fasen. Disse kompleksene inneholder svært mange (også uidentifiserte) proteiner. Mye tyder på at kompleksene ligger på relativt fikserte punkt i kjernen, og at DNAet spoles gjennom kompleksene under replikasjonen. Hver fabrikk inneholder sannsynligvis mange replikasjonsgafler Replikasjonen skjer i bestemte replikasjonsorigi DNA-syntesen skjer i 5-3 - retning DNA-polymeraser utfører selve syntesen PCNA koblet til Green Fluorescent protein kolokaliserer med nydannet DNA i S-fasen, visualisert med anti-brdu antistoff 1
De klassiske eukaryote DNA-polymerasene Masse (kda) 180 170 256 36-38 160-300 Lokalisering kjernen kjernen kjernen kjernen mitokondrier 3-5 -exonuklease nei ja ja nei ja primase ja nei nei nei nei Prosessivitet lav høy høy lav høy Nøyaktighet høy høy høy lav høy Replikasjon ja ja ja nei ja Reparasjon ja ja ja ja ja Initiering av replikasjonen (dagens modell) Langs DNA-molekylet ligger mange replikasjonsorigi (ori) I G1-fasen vil et prereplikasjonskompleks av ORC-proteiner, Cdc6, Cdt1 og MCM2-7 binde til ori. I S-fasen fosforyleres MCM av S- fasespesifikke kinaser, slik at det lastes rundt DNA-trådene og helikaseaktiviteten aktiveres. Dette danner et åpent replikasjonskompleks Det åpne replikasjonskomplekset rekrutterer Cdc45 og DNApolymerase /primase, og dannelsen av primere kan starte Samtidig binder Geminin til Cdt1 og inaktiverer det, slik at enda en initiering av samme ori ikke kan skje før neste S-fase Helikase P P ori Inhibering av CDT1 ved geminin er en sentral del av det som kalles «Replication Licensing System» (RLS) og som forhindrer at det skjer bobbelt replikasjon fra en og samme ori innen en S-fase. I S-fasen vil MCM-komplekset forskyves av replikaksjonsgaffelen, og til slutt «falle av» når replikasjonen avsluttes Mangel på geminin Mangel på geminin, eller overproduksjon av CDT1 kan føre til re-replikasjon og genomisk ustabilitet. Normalt vil dette lede til cellesyklusarrest og apoptose Geminin Transkripsjonsfaktorer ser ut til å påvirke initieringen ORC i høyere eukaryoter (inkludert mennesket) ser ut til å ha lav DNAsekvensspesifisitet. Dette er en av årsakene til at vi har mange potensielle initieringsseter Det er imidlertid bare en undergruppe av disse som i blir aktivert helt i starten av S-fasen, og disse ser ut til å ligge i områder med høy transkripsjonsaktivitet En tror at transkripsjonsfaktorene påvirker initieringen enten via kromatin-remodellering, eller via direkte interaksjon med ORC 2
Replikasjonen starter med en RNA-primer Korte fragmenter av RNA/DNA dannes først, og tjener som utgangs-punkt for forlengelse ved DNA polymerase (og ) (både på leading og lagging strand) Mange primere dannes på lagging strand Leading strand syntetiseres kontinuerlig fra én primer, og i samme retning som replikasjonsgaffelen. Lagging strand syntetiseres i små biter fra hver sin primer, og i motsatt retning av replikasjonsgaffelen. Syntesen av begge trådene er imidlertid nøye koordinert. Primerene dannes av Pol /primase DNA-polymeraser kan ikke starte DNA-syntese direkte på ss (singlestrand)-dna. Evolusjonen har funnet 3 ulike løsninger på dette problemet: Ved å designe DNA-templaten slik at den passer til et kort RNAfragment som allerede finnes i cellen (HIV-virus) Ved å bruke en protein-primer (adenovirus) DNA pol Pol / primase Okazaki-fragmentene forlenges av Pol og hjelpeproteiner RFC (replikasjonsfaktor C) binder først på enden av primeren PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen - prosessivitetsfaktor for polymerasen) binder RFC, og lastes på DNA-tråden Polymerase / binder til PCNA og DNA-syntesen starter. Ved å bruke et spesialisert enzym, primase til å lage korte RNAprimere (alle bakterier og eukaryoter). I eukaryoter er dette enzymet et kompleks, som blant annet inneholder DNA pol DNA-polymeraseaktiviteten fins i p180, mens p49/p58 inneholder RNA-primase-aktiviteten. En tror p70 er med på å dirigere komplekset til replikasjonsgaffelen. I eukaryoter danner p49 først et 8-12 nt RNA-fragment, og p58 overfører dette til p180, som forlenger dette med ca 20 DNA-trinn. Det to delene utgjør tilsammen primeren. Deretter dissosierer primasekomplekset, og Pol fortsetter forlengelsen av Okazakifragmentet Krystallstrukturen til PCNA i kompleks med RFC 3
Modell av eukaryot replikasjonsgaffel Basert på studier av replikasjonsgaffelen i bakterier, og lignende forsøk i gjær og mammalske celler, har en kommet frem til en modell av replikasjonsgaffelen som har mange likhetstrekk med E. coli Det er imidlertid flere proteiner involvert i eukaryot replikasjon, noe som tyder på et mer komplekst reguleringsnivå Forenklet modell Hva skjer når Okazakifragmentet når det forrige Okazakifragmentet? 1 Pol pløyer av primeren i det forrige fragmentet 2 RPA (replikasjonsprotein A, ss-dnabindende) binder 3 Endonukleasen Dna2 rekrutteres av RPA, og kutter av RNA-delen 4 Fen1 (Flap-endonuklease1) (eller andre) kutter resten av primeren 5 DNA ligase 1 danner fosfodiesterbinding mellom gammelt og nytt fragment Hva skjer når polymerasen treffer en DNA-skade? Mange typer DNA-skader fører til at de replikative polymerasene blir blokkert, og replikasjonen stanser opp. En slik stans gjør cellen i stand til å reparere DNAskaden. Hvis massive skader opptrer, kan cellen velge å gå inn i programmert celledød (apoptose) for å unngå å introdusere mutasjoner. Endel celler kan ikke ofres på denne måten, og det fins derfor en gruppe (relativt nyoppdagete) polymeraser som kan polymerisere over skadene. Slike polymeraser kalles translesion-synthesis (TLS-) polymeraser. Disse har generelt lav nøyaktighet, selv om enkelte faktisk setter inn riktige nukleotider ovenfor bestemte skader Ett eksempel på sistnevnte er DNA polymerase (eta), som vil sette inn AA ovenfor en tymindimer (vanlig UVskade) eller C ovenfor 8-oxoG (oksydert guanin). Pol kan bytte plass med Pol ved at PCNA først ubiquitineres som følge av DNA-skade TLS-polymeraser (foreløpige data) Navn MW Karakteristika hittil funnet Pol (eta) 78 TLS av UV skader (AA ovenfor TT-dimer C ovenfor 8-oxoG) (defekt gir Xeroderma pigmentosum type V, XPV) Pol (iota) 81 TLS av UV skader. Setter ofte inn feil nukleotid ovenfor skade, men foretrekker G ovenfor U Pol (zeta) 353 TLS? Mispar ekstensjon Pol (kappa) 99 TLS? Mispar ekstensjon. Kan lese gjennom bulky skader dcmp transferase 138 TLS? Setter inn dcmp ovenfor AP-seter Pol (theta) 198 Helikase? Reparasjon av kryssbindinger Pol (lambda) 66 Meiose-assosiert DNA reparasjon Pol (my) 55 Somatisk hypermutering 4
Vil helikasen fortsette å åpne DNA-heliksen om polymerasen stopper? Flere faktorer kan forsinke eller stoppe DNA-polymeriseringen, blant annet mangel på DNA-byggesteiner (eks: Hydroxyurea (Droxia); hemmer ribonukleotid reduktase). For å unngå at helikasekomplekset fortsetter å spole ut ssdna, er polymerasene koblet fysisk sammen med helikasene via et Fork protection complex, FPC, Som består av 4 proteiner. FPC-komplekset danner også en plattform for DNA-skade signalisering, og binder kinaser som medierer intrascellesyklusarrest 5