KJ2053 Kromatografi Kvanititativ analyse av nikotin v.h.a. gasskromatografi og bruk av intern standard-kalibreringskurve Rapport Pia Haarseth piakrih@stud.ntnu.no Audun Formo Buene audunfor@stud.ntnu.no Laboratorie: D2-152 Utført: 6. mars 2013
Innhold 1 Resymé 2 2 Teori [1] 3 3 Eksperimentelt 5 4 Resultater 5 4.1 Temperaturprogram.......................... 5 4.2 Standardløsningene........................... 6 4.3 Ekstern standard............................ 7 4.4 Ukjente prøver............................. 8 4.5 Usikkerhetsberegninger......................... 8 4.6 Retensjonsparametre.......................... 9 4.7 Make-up-gass.............................. 9 5 Diskusjon 10 6 Konklusjon 11 A Grafisk bestemmelse av innhold av nikotin 13 B Excelark 14 C Kromatogrammer 17 1
1 Resymé Denne laboratorieoppgaven ble gjennomført som del av det obligatoriske laboratorieopplegget i faget KJ2053 Kromatografi ved NTNU våren 2013. Hovedmålet med denne oppgaven var å analysere prøver kvantitativt med hensyn på nikotin v.h.a. kapillær-gasskromatografi med flammeioniseringsdetektor. Kvantifisering skulle gjennomføres med internstandard-metoden med kalibreringskurve laget fra kjente standarder. Ved intern standardmetoden ble den ukjente prøven A ble funnet til å inneholde 300 µl nikotin, mens den ukjente prøven B ble funnet til å inneholde 590 µl nikotin. 2
2 Teori [1] Teorien i denne rapporten er kun det som er nytt for denne laboppgaven, mer grunnleggende teori om gasskromatografi er beskrevet i første gasskromatografiforsøk. Kvantitative analyser baseres på sammenhengen mellom mengde stoff som passerer detektoren og detektorens respons for denne mengden. Toppareal eller topphøyde brukes som uttrykk for detektorens respons. Topphøyde måles fra grunnlinjen til toppens maksimum. Toppareal kan finnes ved å multiplisere topphøyden med bredden ved halve topphøyden, dette forutsetter at toppen er symmetrisk. Intern standard er et stoff i kjent mengde som tilsettes i prøveløsning for å korrigere for tap ved prøveopparbeidelsen, korrigere for forandringer i injisert volum og korrigere for forandringer under kromatografisk analyse. Det er visse kriterier til stoffet en velger som intern standard. Den interne standarden må kunne separeres fra analytten i prøven, og må ha retensjonstid nær stoffet som skal bestemmes. Intern standard skal tilsettes i en konsentrasjon som gir ca samme topphøyde eller areal som stoffet som skal bestemmes, det være stabilt og det må være tilgjengelig i ren form. En standardkurve kan settes opp etter analyse av løsninger med kjent mengde analytt og intern standard. Areal eller topphøyden til stoffet dividert med areal eller topphøyden av den interne standarden plottes mot mengdeforholdet mellom stoff og internstandard. Ved konstant mengde internstandard i prøvene kan det plottes mot mengde av stoffet. I prøver med ukjent mengde stoff kan den ukjente mengden finnes fra kalibreringskurven. Ekstern standard-metoden går ut på å lage en kalibreringskurve ved å plotte topphøyde eller areal av standardene mot kjent innhold av stoff i prøvene. Retensjonsfaktoren, k, til stoffer kan finnes fra k = t R t 0 t 0 (1) 3
der t R er retensjonstiden til analytten og t 0 er retensjonstiden til løsemiddeltoppen. Separasjonsfaktoren, α, bestemmes fra retensjonsfaktorene til de to båndene i kromatogrammet α = k 2 k 1, k2 > k1 (2) Den lineære vandringshastigheten for et stoff, u x, er gitt ved u x = u R (3) der u er den lineære mobilfasehastigheten og R er andelen av analytt som befinner seg i stasjonærfasen. R er gitt ved R = 1 1 + k (4) Den lineære vandingshastigheten til bæregassen er gitt ved der L er den totale lengden av kolonnen. u = L t 0 (5) 4
3 Eksperimentelt Apparatet ble skrudd på, og innstilt som beskrevet i apparaturbeskrivelsen som utdelt. I dette forsøket ble nitrogen brukt som make-up-gass. Først ble det gjennomført et temperaturprogram for å få en anelse om optimal elueringstemperatur, og for å kondisjonere kolonnen til bruk. Den sterkeste standardløsningen ble brukt. Temperaturprogrammet ble startet på 50 C, og steg med 10 C hvert minutt før det holdt 200 C i 10 minutter. Da den optimerte temperaturen var funnet ble de prøvene satt opp i tilfeldig rekkefølge, for å unngå periodiske trender. Det ble kjørt fire paralleller av hver prøveløsning, tre paralleller for den svakeste og sterkeste standarden og to paralleller for den mellomste standarden. Det ble også eluert to blindprøver. Til slutt ble make-up-gassen skrudd av og en standardprøve med 200 µl nikotin ble eluert, for å se om det endret forholdet mellom signal og støy. 4 Resultater 4.1 Temperaturprogram Fra temperaturprogrammet ble det funnet at de to komponentene i standardløsningen kom ut av kolonnen ved 115 C og 130 C. Det var da svært god separasjon mellom kinolin og nikotin, så 150 C ble forsøkt i første standard. Det viste seg da at båndene kom svært nærme løsemiddeltoppene. Derfor ble den optimale temperaturen funnet til å være 130 C, og alle løsningene ble eluert ved denne temperaturen. 5
4.2 Standardløsningene For å lage standardkurven ble løsninger med 200, 400 og 1000 µl nikotin eluert. I alle prøvene var det en intern standard, på 200 µl kinolin. Eluering av en ren nikotinstandard viste at nikotin var den tregest eluerte komponenten med en retensjonstid på omtrent 2.7 minutter. Kalibreringskurvene for intern standard er vist i Figur 1, og alle måledataene er vedlagt i Vedlegg B. Figur 1: Kalibreringskurve ved bruk av intern standard. På y-aksen er topphøydene til nikotin delt på topphøydene for kinolin plottet, mens på x-aksen er konsentrasjonen av nikotin plottet. Fra kalibreringsdataene ble lineær regresjon gjennomført. Dette gav en rett linje som kan beskrives med y = 0.0018x + 0.38 (6) 6
4.3 Ekstern standard Kalibreringskurve fra ekstern standard-metoden er vist i Figur 2, og måledataene er vist i Vedlegg B. Figur 2: Kalibreringskurve ved bruk av ekstern standard. På y-aksen er topphøydene til nikotin plottet, mens på x-aksen er konsentrasjonen av nikotin plottet. Lineær regresjon dataene for ekstern standard gav en rett linje beskrevet ved y = 0.11x + 26.76 (7) 7
4.4 Ukjente prøver De ukjente prøvenes innhold av nikotin ble bestemt ved å bruke likningen fra intern standard kalibreringskurven. Innholdet ble funnet til å være 300 µl nikotin i ukjent prøve A, og 590 µl nikotin i prøve B. Resultatene er vist i Tabell 1, og alle måledata er vist i Vedlegg B. Innholdet av nikotin i prøvene er også bestemt grafisk, dette er vist i Vedlegg A, og ble funnet til å være 300 for A og 590 for B. Tabell 1: Innhold av nikotin i de ukjente prøvene, bestemt ved intern standardmetoden. Ukjent prøve Innhold av nikotin [µl] A 300 B 590 4.5 Usikkerhetsberegninger Fra regresjonsprogrammet ble det funnet usikkerhet for skjæringspunkt med y- aksen, og stigningstallene. Dette er vist for både ekstern og intern standard i Tabell 2 Tabell 2: Usikkerhetesverdier for intern- og ekstern standard-metodene. Verdiene er funnet direkte fra regresjonsprogrammet. a er stigningstallet til lineærregresjonen, og b er skjæringspunktet med y-aksen. Metode Usikkerhet i a Usikkerhet i b Korrelasjonskoeffisient Intern standard 0.048 0.159 0.952 Ekstern standard 0.00024 0.159 0.965 Retensjonsvariasjonen for de to komponentene var svært liten. Dette betyr at elueringstiden var svært konstant mellom de forskjellige parallellene. 8
4.6 Retensjonsparametre Retensjonsparametrene for de forskjellige komponentrene er vist i Tabell 3. Formlene for utregningene av verdiene er vist i Teori, Avsnitt 2. Tabell 3: Oversikt over utregnede parametere for kvalitativ analyse av nikotin. Retensjonsfaktorene for nikotin og kinolin, k1 og k2, separasjonsfaktoren α mellom de to komponentene og den lineære vandringshastigheten til bæregassen u og nikotin u x. Parameter Verdi k 1 1.79 k 2 3.03 α 1.69 u u x 71.43 cm/sek 25.56 cm/sek 4.7 Make-up-gass Ved å stenge av make-up-gassen ble det observert en halvering av topphøyden, og bredere bånd. Forholdet mellom toppene til kinolin og nikotin var omtrent uendret fra de parallellene som ble kjørt med make-up-gass. Støynivået er vanskelig å bestmme fra kromatogrammene, men det er nærliggende å si at signal-til-støyforholdet er lavere med avstengt make-up-gass siden toppene er lavere. 9
5 Diskusjon Retensjonsvariasjonen mellom de ulike parallellene var minimal, standardavvik på 0.024 % i eksterne standardkalibreringskurven henspeiler dette. I prøven vi ser på elueres den interne standarden, kinolin, raskest. Dette er på grunn av at nikotin har to heteroatom, nitrogen, kontra kinolin som kun har ett. Kinolin vil ikke bli retardert i samme grad som nikotin av det polare kolonnematerialet silika. Separasjonsfaktoren α på 1.69, tilsier en god separasjon mellom nikotin og kinolin. Utregnet verdi for den lineære vandringshastigheten for bæregassen ble funnet til å være 71.4 cm/sek, noe som passer veldig bra med oppgitt verdi på 70 cm/sek. Usikkerheten i regresjonen for den interne standarden er noe større med en korrelasjonskoeffesient på 95.2 % sammenliknet med den eksterne standarden der korrelasjonskoeffesienten er 96.5 %. Regresjonslinjen for den eksterne standarden passer marginalt bedre til måledataene enn det regresjonslinjen for den interne standarden gjør. Standardfeilen i stigningstallet for regresjonslinjen til den eksterne standarden, 0.024 %, er også lavere enn for den interene standarden som har standardfeil på 0.024 %. De to kalibreringskurvene har lik standardfeil i skjæringspunktet, på 15.9 %. Både regresjonen for ekstern og intern standard er linærefunksjoner med både positivt stigningstall og skjæringspunkt. I kalibreringskurven for intern standard er verdiene på y-aksen et forholdstall mellom topphøydene til kinolin og nikotin, mens de i den eksterne standardkalibreringskurven er høyden av nikotin, gitt i mm avlest kromatogrammet. I begge kalibreringskurvene er x-aksen angitt i konsentrasjon av nikotin i µl. Ved å bruke make-up-gas får vi et bedre spekter å analysere og større sensitivitet, med smalere topper og en større forhold mellom signal og støy. Dette gjør det lettere å tolke spekteret og gir mer nøyaktige tallverdier. Grunnen til at det blir smalere bånd er fordi make-up-gassen hjelper til å transportere prøven raskere gjennom detektoren. 10
Valget av kinolin som intern standard er basert på kriteriene for hva en god intern standard er, som beskrevet i teoridelen. Kinolin oppfyller disse kriteriene da det var nikotin som var stoffet vi skulle kvantifisere. Fra blindprøvene, vist i Vedlegg C, ser vi at løsemiddelet ikke har noen karakteristiske topper som kan påvirke toppene fra kinolin og nikotin under analyseringen. Dette er dermed et bra valg av løsemiddel, og det er rent. Alle prøvene ble gjennomført i en tilfeldig rekkefølge for å unngå trender for noen av forsøksparameterene og ikke andre, dersom noen parametre skulle forandre seg i løpet av forsøksserien. 6 Konklusjon Fra kvantitativ analyse med kinolin som intern standard ble det funnet å være 300 µl nikotin i prøve A, og 590 µl nikotin i prøve B. 11
Trondheim, 16. oktober 2014 Referanser [1] Greibrokk, Lundanes, Rasmussen, ed. 1998. Kromatografi-Separasjon og deteksjon. [2] Asmussen, J., Schmid, R. Oppgave 4: Kvantitativ analyse av nikotin v.h.a. gasskromatografi og bruk av intern standardkalibreringskurve., versj. 04.03.2013. 12
A Grafisk bestemmelse av innhold av nikotin Ukjent prøve A var hadde et gjennomsnittlig topphøydeforhold med intern standard på 0.91, og ukjent prøve B hadde et topphøydeforhold på 1.44 i gjennomsnitt. Avlesningene er plottet i Figur 3 som piler. Figur 3: Grafisk bestemmelse av mengde nikotin i prøvene. Disse stemte god overens med de utregnede verdiene. Verdien for prøve A er funnet med heltrukken pil, men verdien for prøve B er vist med stiplet pil. 13
B Excelark GC 2 kvantitativ analyse av (-)-Nikotin - Pia og Audun Splittfaktor: Gasshastighet: 4 ml/min 1:15 Detekto Make-up-gass: Nitrogen r: FID Gass.ha 72.5 Make-up-hast: 30 ml/min stighet: cm/s Intern standard: Kinolin Injektor: Hot-Needle 1 μl Prøve 200 μl_1 200 μl_2 200 μl_3 400 μl_1 400 μl_2 1,0 ml_1 1,0 ml_2 Høyde kinolin Høyde nikotin Hn/Hk Kons. N Kons K Kn/Kk μl μl 69 45 0,652174 200 200 1 63 41 0,650794 200 200 1 70 47 0,671429 200 200 1 74 94 1,27027 400 200 2 48 63 1,3125 400 200 2 70 139 1,985714 1000 200 5 47 123 2,617021 1000 200 5 71 140 1,971831 1000 200 5 Gj.snitt A 1,0 ml_3 A_1 72 65 0,902778 293,543 200 1,46772 Gj.snitt Hn/Hk A_2 48 45 0,9375 312,833 200 1,56417 299,8132667 0,9140638801 A_3 68 61 0,897059 290,366 200 1,45183 A_4 74 68 0,918919 302,511 200 1,51255 B_1 72 103 1,430556 586,753 200 2,93377 Gj.snitt B Gj.snitt Hn/Hk B_2 75 106 1,413333 577,185 200 2,88593 590,0802252 1,4365444053 B_3 64 92 1,4375 590,611 200 2,95306 B_4 71 104 1,464789 605,772 200 3,02886 200 µl nomakeup 30 19 0,633333 200 200 1 150 ºC 1,0 ml 70 139 1,985714 1000 200 5 Topphøyde nikotin/kinolin [-] 3 2,5 2 1,5 1 0,5 200 400 600 800 1000 100 300 500 700 900 1100 Konsentrasjon nikotin [µl] Topphøyde nikotin [ml] 160 140 120 100 80 60 40 100 200 400 600 800 1000 300 500 700 900 1100 Konsentrasjon nikotin [µl] 14
SUMMARY OUTPUT Ekstern std Regression Statistics Multiple R 0,9516605783 R Square 0,9056578562 Adjusted R Square 0,8899341656 Standard Error 0,2452879449 Observations 8 df SS MS F Significance F Regression 1 3,4654694738 3,4654694738 57,598300403 0,0002722479 Residual 6 0,3609970554 0,0601661759 Total 7 3,8264665293 Coefficients Standard Error t Stat P-value Lower 95% Intercept 0,3776867983 0,159261333 2,3714908768 0,055407813-0,0120116449 X Variable 1 0,001843236 0,0002428713 7,5893544128 0,0002722479 0,0012489515 Upper 95% Lower 95,0% Upper 95,0% 0,7673852415-0,012011645 0,7673852415 0,0024375206 0,0012489515 0,0024375206 SUMMARY OUTPUT Intern std Regression Statistics Multiple R 0,9516605783 R Square 0,9056578562 Adjusted R Square 0,8899341656 Standard Error 0,2452879449 Observations 8 df SS MS F Significance F Regression 1 3,4654694738 3,4654694738 57,598300403 0,0002722479 Residual 6 0,3609970554 0,0601661759 Total 7 3,8264665293 Coefficients Standard Error t Stat P-value Lower 95% Intercept 0,3776867983 0,159261333 2,3714908768 0,055407813-0,0120116449 X Variable 1 0,3686472076 0,0485742512 7,5893544128 0,0002722479 0,2497902967 Upper 95% Lower 95,0% Upper 95,0% 0,7673852415-0,012011645 0,7673852415 0,4875041185 0,2497902967 0,4875041185 15
Retensjonsfaktorer Funnet fra parallell A_4 Kinolin t0 tr k(kinolin) Nikotin t0 tr k(nikotin) 0,7 min 2,823 min 3,032857143 0,7 min 1,956 min 1,794285714 Separasjonsfaktor alfa alpha 1,690286624 Gasshastighet u 4285,714286 cm/min 71,42857143 cm/sek u(nikotin) 25,56237219 cm/sek Andel nikotin i mobil fase R 0,357873211 16
C Kromatogrammer 17