Hvordan standardisere en metode for isolering av plasmid til syntese av diabetes antigener? Ranveig Østrem, Bioingeniør Hormonlaboratoriet, Aker Oslo Universitetssykehus Bakgrunn for analysen Pasienter med type 1 diabetes utvikler tidlig i sykdomsforløpet autoantistoffer mot egne proteiner. Ved Hormonlaboratoriet, Aker (OUS) gjøres det flere målinger av slike antistoffer. anti-gad (glutaminsyredekarboksylase) anti-iaa( insulin) anti- ZnT8 (Sinktransportør) anti-ia2 (proteintyrosinfosfatase) Brukes til å stille en sikker diagnose. 1
Metoden For å måle disse antistoffene får vi plasmidet til å produsere det aktuelle proteinet (= antigenet). Dette gjøres ved hjelp av en koblet in vitro transkripsjon/- translasjonreaksjon av plasmidet til aktuelt protein. Vi har ønsket å standardisere denne produksjonen ved å legge inn 4 kontrollpunkter. Kontrollpunkter 1. Kutting med restriksjonsenzymer og gel- elektroforese 2. Verifiseres ved Sanger sekvensering 3. Western blot 4. Parallellkjøring i rutine mot tidligere batcher 2
Plasmider Hva er et plasmid? Dobbelttrådig sirkulært DNA Finnes naturlig i bakterier Bruker bakteriens synteseapparat til proteindannelse og formering Inkorporeres vanligvis ikke i bakteriens DNA Formerer seg uavhengig av denne Vektorer Hva er en vektor? Bærer av DNA fragment Vektorene vi bruker er sirkulære plasmider For å klone et DNA-fragment inn i ei bakteriecelle må det være koblet til en vektor = en bærer 3
Vektorer Nødvendige egenskaper til en vektor Replikasjonsorigo Gjenkjennelsessekvens for restriksjonsenzymer. Her er område hvor restriksjonsenzymene kutter = Kloningssete Et gen som koder for antibiotikaresistens Gjør det mulig å replikere seg selv uavhengig av vertsorganismen (=bakterien) Gjør det mulig å skille hvilke bakterier som har tatt opp plasmidvektor Restriksjonsenzymer Et restriksjonsenzym gjenkjenner en bestemt DNA sekvens og kutter DNA et på en bestemt måte. 4
Flytting av DNA fragment IA2 i pgem 4Z vektor ptnt vektor uten fragment Vi har ønsket å flytte DNA fragmentet til en ny vektor Mer stabil vektor Produserer mer protein Kutting med restriksjonsenzymer IA2 i pgem 4Z vektor ptnt vektor uten fragment Kuttested for Sal I Kuttested for XhoI 5
Ligering IA2 i pgem 4Z vektor ptnt vektor uten fragment Ligering DNA fragment i ny vektor Ligering IA 2 i ptnt vektor 6
Transformasjon og oppkonsentrering IA 2 i ptnt vektor Sår ut på skål Transformasjon av plasmid inn i kompetente E.coli celler Enkeltkoloni plukkes og oppkonsentreres i en overnattkultur Kontrollpunkt 1. Gel- elektroforese Kuttet med begge enzymene Kuttet med Bgl II Kuttet med Not I Produkt ukuttet Størrelsesmarkør Klonen kuttes med restriksjonsenzymer Korrekt klon har 2 DNA fragmenter ved testkutting 3000 1500 1000 500 IA2 fragmentet er på 1100 basepar ptnt vektoren er på 2800 bp 7
Kontrollpunkt 2. Sekvensering Rekkefølgen på nukleotidene er avgjørende for å få dannet riktig protein. Sekvensen kontrolleres mot en referansesekvens. Guanin = svart G Tymin= rød T Adenin= grønn A Cytosin= blå C Elektroferogram Datamaskinen tolker rådata og lager et elektroferogram med fargede topper som representerer de ulike nukleotidene. Kontrollpunkt 3. Western blot Western Blot settes opp etter at proteinet er translatert Blottet inkuberes med et spesifikt antistoff rettet mot IA2 og et merket sekundær antistoff Bildet fremkalles og viser et protein med en masse på ca 42 kda 75 kda 48 kda 35 kda Stige Neg. Ktr. Gml batch Ny batch 8
Kontrollpunkt 4. Kjøring mot gammel batch Gammel og ny batch med plasmid DNA settes opp parallelt. Konsentrasjon av antistoff regnes ut på bakgrunn av en kjent positiv standard minus negativ standard. (cpm ukjent prøve cpm neg st ). (cpm pos st cpm neg st.) = konsentrasjon prøve Begge batchene settes opp med lav og høy kontroll i samme oppsett. Batcher som tilfredstiller kravene som er satt til analysen kan godkjennes. 9