Elucigene CF-EU2v1 Bruksanvisning

Elucigene CF-EU2v1 Bruksanvisning Kat.kode: CF2EUB2 50 tester CF2EUBX 10 tester Til in vitro-diagnostisk bruk Fremstilt av: Elucigene Diagnostics Greenheys House Pencroft Way Manchester Science Park Manchester M15 6JJ Salg, kundetjeneste og teknisk støtte: T: +44 (0) 161 669 8122 F: +44 (0) 161 669 8129 E: enquiries@elucigene.com E: techsupport@elucigene.com Elucigene Diagnostics is the trading name of Delta Diagnostics (UK) Limited., a company registered in England and Wales, registration number 8696299. CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 1 av 23

Elucigene CF-EU2v1 Beregnet bruk Til samtidig in vitro kvalitativ påvisning av følgende human cystisk fibrose trans-membran konduktansregulator (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator, CFTR) genemutasjoner i DNA ekstrahert fra helblod (EDTA-konservert) og tørket blodprøver (DBS-prøver): Tradisjonell I henhold til HGVS-retningslinjer * cdna name Protein name CFTRdele2,3 c.54-5940_273+1025del Protein (c.54-5940_273+10250del21080) name E60X c.178g>t p.glu60x P67L c.200c>t p.pro67leu G85E c.254g>a p.gly85glu 394delTT c.262_263del (c.262_263deltt) p.leu88ilefsx22 444delA c.313del (c.313dela) p.ile105serfsx2 R117C c.349c>t p.arg117cys R117H c.350g>a p.arg117his Y122X c.366t>a p.tyr122x 621+1G>T c.489+1g>t 711+1G>T c.579+1g>t L206W c.617t>g p.leu206trp 1078delT c.948del(c.948delt) p.phe316leufsx12 R334W c.1000c>t p.arg334trp R347P c.1040g>c p.arg347pro R347H c.1040g>a p.arg347his A455E c.1364c>a p.ala455glu I507del c.1519_1521del (c.1519_1521delatc) p.ile507del F508del c.1521_1523del (c.1521_1523delctt) p.phe508del 1677delTA c.1545_1546del (c.1545_1546delta) p.tyr515x V520F c.1558g>t p.val 520Phe 1717-1G>A c.1585-1g>a G542X c.1624g>t p.gly542x S549R(T>G) c.1647t>g p.ser549arg S549N c.1646g>a p.ser549asn G551D c.1652g>a p.gly551asp R553X c.1657c>t p.arg553x R560T c.1679g>c p.arg560thr 1811+1.6kbA>G c.1680-886a>g 1898+1G>A c.1766+1g>a 2143delT c.2012del (c.2012delt) p.leu671x 2184delA c.2052del (c.2052dela) p.lys684asnfsx38 2347delG c.2215del (c.2215delg) p.val739tyrfsx16 W846X c.2538g>a p.trp846x 2789+5G>A c.2657+5g>a Q890X c.2668c>t p.gln890x 3120+1G>A c.2988+1g>a CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 2 av 23

Tradisjonell I henhold til HGVS-retningslinjer * cdna name Protein name 3272-26A>G c. 3140-26A>G Protein name R1066C c.3196c>t p.arg1066cys Y1092X(C>A) c.3276c>a p.tyr1092x M1101K c.3302t>a p.met1101lys D1152H c.3454g>c p.asp1152his R1158X c.3472c>t p.arg1158x R1162X c.3484c>t p.arg1162x 3659delC c.3528del (c.3528delc) p.lys1177serfsx15 3849+10kbC>T c.3718-2477c>t S1251N c.3752g>a p.ser1251asn 3905insT c.3773dup (c.3773dupt) p.leu1258phefsx7 W1282X c.3846g>a p.trp1282x N1303K c.3909c>g p.asn1303lys * with reference to Mutation Nomenclature in Practice: Findings and Recommendations from the Cystic Fibrosis External Quality Assessment Scheme. Berwouts S, Morris M, Girodon G, Schwarz M, Stuhrmann M and Dequeker E. Human Mutation, Vol.00, No. 0, 1-7 (2011) CF-EU2v1 kan skjelne mellom personer som er heterozygotiske og homozygotiske for alle ovennevnte mutasjoner og varianter, med unntak av S549R(T>G) se avsnittet om kryssreaktivitet i dette dokumentet. Oppsummering og forklaring Cystisk fibrose (CF) er den mest vanlige livsbegrensende autosomale recessive lidelsen i den hvite befolkningen. Sykdomsinsidensen er 1:3200 levendefødte i den hvite befolkningen (1). I den hvite befolkningen er frekvensen for heterozygotiske omtrent 1:25. Cystisk fibrose innvirker på epitelet i flere organer. Dette resulterer i en komplisert sykdom i flere systemer, inkludert eksokrine bukspyttkjertel, tarmer, luftveier, mannlig genitalkanal, hepatobiliære system og eksokrine svettekjertler. Sykdomsbildet varierer etter alvorlighetsgraden ved CFTR-mutasjoner (2), genetiske modifikatorer (3) og miljøfaktorer (4). Rekkevidden strekker seg fra tidlig barndomsdød som et resultat av progressiv obstruktiv lungesykdom med bronkiektasi, til bukspyttkjertelinsuffisiens med gradvis progressiv obstruktiv lungesykdom i ungdommen og økende sykehusinnleggelsesfrekvens for lungesykdom i tidlig voksen alder, til tilbakevendende sinusitt og bronkitt eller mannlig infertilitet i ung voksen alder. Som oftest er diagnosen cystisk fibrose etablert i personer med en eller flere karakteristiske fenotypiske funksjoner av CF, pluss tegn på en abnormalitet i CFTR-funksjonen, basert på én av de to følgende: nærvær av to sykdomsfremkallende mutasjoner i CFTR-genet eller to abnormale kvantitative pilokarp-iontoforese svettekloridverdier (>60 meq/l) eller transepitelial nasal potensialforskjell (NPD) målinger som er karakteristiske for CF. CFTR mutasjonspåvisningsfrekvensen varierer etter testmetode og etnisk bakgrunn. Hos enkelte symptomatiske personer, er bare én eller ingen sykdomsfremkallende mutasjon påvisbar. Hos enkelte bærere er sykdomsfremkallende mutasjoner ikke påvisbare. CFTR-relaterte sykdommer er arvelige på en autosomal recessiv måte. Søsken til en proband med cystisk fibrose har 25 % sjanse for å bli angrepet, 50 % sjanse for å være asymptomatiske bærere og en 25 % sjanse for å være upåvirket og ikke bærere. Molekylær genetisk testing for sykdomsfremkallende mutasjon (en) i CFTR genet brukes til påvisning av bærer i populasjonsscreeningsprogrammer. Prenatal testing er tilgjengelig for graviditeter som har økt risiko for CFTR-relaterte sykdommer hvis sykdomsfremkallende mutasjoner i familien er kjente. Siden oppdagelsen av CFTR-genet i 1989 (5), har over 1700 mutasjoner og varianter i genet blitt beskrevet (6). Mange av disse mutasjonene er private, og har bare blitt beskrevet i én pasient og/eller familie. Rutinetesting for alle mulige mutasjoner er verken gjennomførbart eller kostnadseffektivt, og er derfor CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 3 av 23

begrenset til testing for de mest vanlige mutasjonene. CF-EU2v1 er et cystisk fibrose-testsett, utformet spesielt for de mest vanlige mutasjonene som finnes i populasjoner av europeisk opprinnelse. Analysen identifiserer 50 mutasjoner totalt, og analyserer også intron 9 poly-t-kanal med nøyaktige mål for den tilliggende TG-repetisjonen. Den polymorfe tymidinkanalen ved overgangen mellom intron 9 og ekson 10 har innflytelse på transkripsjonen. Antallet restkonsentrasjoner av tymidin (5T, 7T eller 9T) innvirker på spleisingseffektiviteten i ekson 10. Hvis 5T-allelener tilstede, vil en del av ekson 10-transkriptene være fraværende og resultere i ufunksjonelt protein og variable CF-symptomer. Det er rapportert at antallet TG repeterer 5 (5 henviser til basis på enden til PCR-primeren) til polytymidkanalen kan også influere på spleising av ekson 10 (7). Hvis tilstede på samme allele som 5T-varianten jo lenger antallet TG repeteres, jo høyere er delen av CFTRtranskripter som mangler ekson 10. Antallet TG-repetisjoner kan bestemmes ved bruk av CF-EU2v1, og bestemme størrelsen på 5T-amplikontoppene. Prinsipper for prosedyren Metoden som brukes av Elucigene CF-EU2v1-settet bruker fluorescent ARMS (Amplification Refractory Mutation System) allelespesifikk amplifkasjonsteknologi, som påviser punktmutasjoner, insersjoner eller delesjoner i deoxyribonukleinsyre (DNA) (8). ARMS-prinsippet består i at oligonucleotider med 3 ulik restkonsentrasjon, ikke vil fungere som primere for polymerasekjedereaksjon (PCR) under spesifiserte forhold. Valg av passende oligonukleotider gjør det mulig for spesifikke mutanter eller normale DNA-sekvenser å bli amplifisert og påvist. Amplifiserte sekvenser (amplikoner) blir atskilt med kapillærelektroforese ved bruk av et genetisk analyseinstrument fra Applied Biosystems. Analyseprogramvaren gjør det mulig å identifisere og merke amplikonene i henhold til størrelse og farge. Elucigene CF-EU2v1 er en høyt multipleks analyse, bestående av to PCR-reaksjoner (A og B). Femti mutantsekvenser i CFTR-genet oppdages i A-blandingen og visualiseres som blå amplikontopper. Tilsvarende ikke-muterte normale sekvenser (villtype) blir påvist i B-blandingen og visualiseres som grønne amplikontopper. A-blandingen påviser også normal sekvens for den mest vanlige observerte mutasjonen som forårsaker cystisk fibrose i den hvite befolkningen, kalt F508del, og visualiseres som en grønn amplikontopp. Flere polyt-gjentatte sekvenser påvises i A-blandingen og visualiseres som svarte amplikontopper. Interne amplifikasjonskontrollmarkører (ikke-cystisk fibrose) er inkludert både i A- og B-blandingen for å overvåke effektiviteten ved prøveamplifiseringen og visualiseres som røde amplikontopper. CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 4 av 23

Advarsler og forholdsregler 1. DNA-kontrollen som følger med dette settet er av human opprinnelse og har blitt testet uavhengig i en PCR-basert analyse og funnet å være negativ for hepatitt B-virus (HBV), hepatitt C-virus (HCV) og Human Immundefekt Virus 1 (HIV1). 2. Vær forsiktig ved håndtering av materiale av human opprinnelse. Alle prøver skal anses å være infeksiøse. Ingen testemetoder kan gi full garanti for at HBV, HCV, HIV 1 eller andre infeksiøse agenser er fraværende. 3. Håndtering av prøver og testkomponenter, samt bruk, oppbevaring og avhendig av disse, skal gjøres i samsvar med fremgangsmåtene som fremgår av gjeldende nasjonale retningslinjene eller regler for biologisk sikkerhet. 4. I overensstemmelse med gjeldende god laboratoriepraksis, skal laboratoriene behandle sine egne interne kvalitetskontrollprøver av kjent genotype i hver analyse, slik at validiteten av prosedyren kan vurderes. 5. Hvis esken med settet er skadet, kan det finnes skade på innholdet. Ikke bruk settet. Kontakt kundeservice. CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 5 av 23

Symboler brukt på etiketter Symbolene brukt på alle etiketter og emballasje oppfyller den harmoniserte standardarden ISO15223 Produsent Antall tester Se bruksanvisningen X C Oppbevares under angitt temperatur Brukes før angitt dato Katalogkode Parti- eller batchnummer In vitro-diagnostisk medisinsk anordning CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 6 av 23

Vedlagte materialer Reagensene skal oppbevares på et sted som er fritt for kontaminerende DNA- eller PCR-produkter. Alle reagenser som leveres er klar til bruk. Oppbevares uåpnet, og åpnede reagenser oppbevares ved -20 C. Åpnede reagenser kan oppbevares i opp til 3 måneder. Tilstrekkelig materiale for 50 (10) tester er levert: 2 x 120µl (50µl) hetteglass med CF-EU2v1 A primerblanding som inneholder primere til amplifisering av følgende mutantalleler R347H, R347P, 2789+5G>A, 3120+1G>A, 711+1G>T, R334W, I507del, F508del, 3849+10kbC>T, 1677delTA, 1078delT, V520F, L206W, W1282X, R560T, 2347delG, Q890X, R553X, G551D, S549N, M1101K, G542X, 3905insT, Y1092X(C>A), S1251N, 444delA, 1811+1.6kbA>G, 1717-1G>A, R117H, R117C, N1303K, Y122X, 394delTT, G85E, R1066C, 1898+1G>A, W846X, 2184delA, D1152H, CFTRdele2,3, P67L, 2143delT, E60X, 3659delC, 3272-26A>G, 621+1G>T, A455E, R1162X og R1158X. Denne blandingen inneholder også villtypeprimere til påvisning av normal F508del-allele, primere til påvisning av polytymidinvarianter, IVS8-5T, IVS8-7T, IVS8-9T og primere til identifikasjon av 2 hypervariable STR-markører 404473 (450043). 2 x 120µl (50µl) hetteglass med CF-EU2v1 B primerblanding som inneholder villtypeprimere til amplifisering av de normale allelene fra mutantene som er amplifisert av A-primerblandingen, med unntak av F508del, den normale allelen som er amplifisert av primere inkludert i A-primerblandingen. Denne blandingen inneholder også primere til identifikasjon av 2 hypervariable STR-markører 404474 (450044). 2 x 400µl (75 l) hetteglass med PCR hovedblanding som inneholder HotStart Taq DNA polymerase og deoxynukleotide trifosfater i buffer 404480 (450045). 1 x 50 µl hetteglass DNA-kontroll på 6 ng/µl normalt for mutasjoner påvist av Elucigene CF-EU2v1 404489. Nødvendigematerialer som ikke leveres Forbruksvarer for laboratoriet hansker, mikrofugerør med skrulokk, 0,2 ml PCR-hetteglass eller mikrotiterplater, anbefalt av produsenten av den termale variatoren som brukes, pipettespisser. DNA-klargjøring QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Cat No 51304/51306) eller tilsvarende. Kapillærelektroforese GeneScan 600 LIZ standard størrelse (ABI Cat No 4366589), GeneScan 600v2 LIZ standard størrelse (ABI Cat No 4408399), Multikapillær DS-33 (fargesett G5) matrisestandard (ABI Cat No 4345833), POP-7-polymer (ABI Cat No 4352759), 10x buffer for genetisk analysator (ABI Cat No 402824) og Hi-Di-formamid (ABI Cat No 4311320). Merknad: Sørg for at alle materialer som brukes ligger innenfor produsentens stabilitetsdatering. Nødvendig utstyr Laboratorieutstyr presisjonspipetter (2 sett: 1 til håndtering av preamplifisering og 1 til postamplifisering), verneklær, vorteksblander, mikrofuge, sentrifuge for 96-brønners mikrotiterplate. PCR-amplifikasjon termisk variator som rommer 96-brønners mikrotiterplater, eller 0,2 ml hetteglass med en minimum temperaturnøyaktighet på +/- 1 C mellom 33 C and 100 C og statisk temperaturensartethet på +/- 1 C. Merknad: Termisk variatorutstyr skal vedlikeholdes regelmessig i samsvar med produsentens instruksjoner, samt kalibreres for å sikre nøyaktig PCR-syklus og optimal ytelse. Elucigene CF-EU2v1-analysen ble utviklet på 9700 termiske variatorer fra Applied Biosystems. Andre merker og modeller skal være fullstendig testet og evaluert for optimal ytelse av brukeren før resultatene rapporteres med CF-EU2v1. Kapillærelektroforese ABI 3130/3500 genetisk analysator (med GeneMapper programvare for fragmentanalyse), 36 cm eller 50 cm (ABI 3500) kapillærarray, 96-brønners optiske plater, 96-brønners septa, 96-brønners kassetter. Merknad: Kapillærelektroforeseutstyr skal vedlikeholdes regelmessig i samsvar med produsentens instruksjoner, samt kalibreres for å sikre optimal ytelse. CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 7 av 23

Prøvetaking og -oppbevaring Fullblodsprøver (EDTA) og tørre blodflekker har blitt evaluert og funnet kompatible med denne testen. Prøveoppsamlingsanordninger har sporadisk vært rapportert å være skadelige for integriteten ved visse analytter og kan innvirke på enkelte metodeteknologier (9). Det anbefales at hver bruker påser at den valgte anordningen brukes i samsvar med produsentens instruksjoner og at prøveoppsamlingsanordningene er kompatible med denne testen. Blodprøver skal oppbevares ved -20 C før DNA klargjøring. Unngå gjentatt frysing og tining. Klargjøring av DNA fra fullblodsprøver (EDTA) Resultatene blir konsekvent innhentet med DNA ekstrahert ved bruk av QIAamp 96 DNA Blod testsettet (eller QIAamp DNA Mini Kit ved bruk av proteinase K) i henhold til protokollen slik det beskrives i QIAamphåndboken, og begynner med 200 µl flytende fullblod og eluert i 200 µl vann av molekylærbiologi-klasse. Klargjøring av DNA fratørkede blodflekker Resultatene blir konsekvent innhentet med DNA ekstrahert ved bruk av QIAamp DNA Mini Kit i henhold til protokollen slik det beskrives i QIAamp-håndboken, men begynner med 2 x 3 mm plater fra en tørket blodflekk og eluert i 100 µl vann av molekylærbiologisk klasse. Det anbefales at det brukes alternative DNA-ekstraksjonsmetoder og at prøvetypene blir grundig evaluert med Elucigene CF-EU2v1-testen før resultatene brukes til diagnostiseringsformål. Viktige hensyn DNA-mengde Under optimale PCR-forhold, og bruk av anbefalte prøveinjeksjonsinnstillinger (se merknad i avsnittet Kapillærelektroforese), gitt i kapillærkolonnens kjøringsmoduler, harakseptable resultater rutinemessig blitt oppnådd fra DNA ekstrahert med ovennevnte metoder i konsentrasjoner mellom 1,5 ng/µl og 25 ng/µl. Kvantifiseringen av DNA er svært viktig, konsentrasjonen av hver DNA-prøve som skal testes, skal måles for å sikre optimale resultater. Teknikker, for eksempel PicoGreen-fluorescens eller UV-absorbans er akseptable. På grunn av variasjonene i DNA-kvantifiseringsteknikker, skal brukeren vurdere følgende veiledning: Innsetting av svært høye DNA-mengder vil øke sannsynligheten for at bakgrunnstoppene blir merket av analyseprogramvaren. Følgende trinn kan tas for å redusere sannsynligheten for at bakgrunnstoppene blir merket. Fortynn DNA og amplifiser på nytt Reduser injeksjonstiden se avsnittet Kapillærelektroforese Øke minimum toppamplitudeterskel se Elucigene CF-EU2v1 veiledning om analyseprogramvare Innsetting av lave DNA-mengder vil øke sannsynligheten for at diagnostikktoppene blir svake og ikke merket av analyseprogramvaren. Følgende trinn kan tas for å øke signalet. Øke injeksjonstiden til 36 sekunder (anbefales sterkt for blodflekkekstraksjoner) se avsnittet Kapillærelektroforese Ekstraher blodflekkprøven på nytt og vask ut i redusert vannvolum (50 µl) Øk antallet blodflekker for ekstraksjon til 4 x 3 mm skiver Viktige hensyn DNA-kvalitet CF-EU2v1 er en høyt multiplekset analyse og krever effektiv PCR-amplifikasjon for å fungere optimalt. DNAkvaliteten kan bestemme effektiviteten ved PCR-prosessen Inhibitorer som er ko-ekstrahert med DNA-prøven kan resultere i en suboptimal amplifikasjon, som fører til svake og dårlig balanserte topper. Elucigene Diagnostics har validert bruken av QIAamp 96 DNA-blodsettet og QIAamp DNA-minisettet (QIAGEN GmbH) med CF-EU2v1-settet. Andre DNA-ekstraksjonssett eller metoder skal valideres og optimaliseres for bruk med CF-EU2v1. Merknad: Se feilsøkingsveiledningen for CF-EU2v1 for å finne mer informasjon. CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 8 av 23

Testprotokoll Kontroll av PCR-kontaminasjon PCR-prosessen genererer et stort antall amplifiserte produkter (amplikoner) og innebærer en høy risiko for kontaminering, som kan føre til falske resultater. Kontaminering kan oppstå fra to kilder: Krysskontaminering kontaminering av prøven med uamplifisert materiale fra omgivelsene, eller andre prøver som inneholder målsekvensen. Sluttproduktkontaminering kontaminering av prøven med amplikoner fra tidligere PCRer som fører til amplifikasjon av både mål- og kontaminantamplikoner. Laboratoriene som utfører PCR bør være oppmerksom på disse kontamineringskildene og ha prosedyrer på plass som gir betydelig reduksjon av risikoen for kontaminering. Metoder for kontamineringskontroll er godt dokumentert (10) og inkluderer den fysiske utforming av laboratorier, arbeidsflyt, prøvehåndteringsprosedyrer og kjemiske og enzymatiske metoder. Veldefinerte og gode laboratorieprosedyrer er vesentlige for å kontrollere PCR-kontaminering og skal iverksettes før kliniske prøver blir testet. Amplifikasjonsprosedyre Merknad: Trinn 3-5 skal utføres på et sted fritt for PCR-produkter, slik at risikoen for kontaminasjon minimeres, fortrinnsvis i et laminær flyt-kabinett. 1. Programmer den termiske variatoren for ett enkelt syklustrinn for å aktivere HotStart Taq ved 94 C i 20 minutter, forbundet til et amplifikasjonssyklusprogram på 1 minutt ved 94 C (denaturering), 2 minutter ved 58 C (annealing) og 1 minutt ved 72 C (forlengelse) i 30 sykler. Dette bør forbindes til en 20 minutters tidsforsinkelsesfil ved 72 C (forlengelse) i den siste syklusen. 2. En negativ kontroll skal inkluderes i hver PCR-kjøring. 3. Tin primerblandingene og PCR-hovedblandingen og sentrifuger i kort tid slik at innholdet samles på bunnen av hetteglassene. Bland forsiktig ved å vorteksere og sentrifugere hetteglassene igjen en kort tid. Tilbered tilstrekkelig reaksjonsblanding til antallet prøver og kontroller som skal testes (Tabell 1). Merknad: PCR-hovedblandingen er viskøs og det må påses at riktige mengder blir håndtert. Det anbefales å tilsette PCR-hovedblandingen til de tidligere dispenserte primerblandingene for derved å sørge for at all væske er dispensert fra pipetten og inn i primerblandingen. Merknad: Ikke bruk forskjellige blandinger eller komponenter fra forskjellige partier i CF-EU2v1-settet. Enzymaktiveri ng Sykling Endelig forlengelse 94 C 94 C 20 min. 1 min. 72 C 72 C 58 C 1 min. 20 min. Omgivelsestemperatur 2 min. 30 sykler CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 9 av 23

Tabell 1: Reaksjonsblandingsformel Antall prøver som skal testes 1 10 25 50 Primerblanding (μl) 4,5 45 112,5 225 PCR-hovedblanding (μl) 7,5 75 187,5 375 Totalt (μl) 12 120 300 600 4. Pipetter 10 μl av hver reaksjonsblanding inn på bunnen av de riktig etiketterte 0,2 ml PCR-hetteglassene eller platene. 5. Bruk separate pipettespisser og tilsett 2,5 μl test-dna-prøve til hvert av hetteglassene og sett på hettene. DNA skal ikke tilsettes hetteglasset for negativ kontroll, erstatt med 2,5 µl sterilt avionisert vann. 6. Sentrifuger PCR-hetteglassene i kort tid slik at innholdet samles på bunnen av hetteglassene. 7. Sett hetteglassene fast på plass i blokken på den termiske variatoren. Start enkelttrinnssyklusen på 94 C, fulgt av amplifiseringssyklusprogrammet. 8. Når amplifiseringssyklusprogrammet er ferdig, kan prøvene oppbevares i romtemperatur over natten, eller ved 2-8 C i opp til 7 dager i mørke omgivelser før de analyseres med kapillærelektroforese. Kapillærelektroforese Det anbefales at hver bruker påser at det valgte kapillærelektroforeseutstyret brukes i henhold til produsentens instruksjoner, og er kompatibelt med testen. I denne sammenhengen er nøkkelparametrene polymeret og kapillærarrayet. Optimale resultater kan oppnås med følgende forhold for kapillærelektroforesen: 1. Bland 6,8 μl av GS600v2 LIZ standardsstørrelse med 250 μl Hi-Di formamid og bland grundig (tilstrekkelig blanding til 16 brønner). Fordel 15 μl av blandingen i hver brønn på en 96-brønners PCRplate. 2. Tilsett 3 µl PCR-produkt fra hver av A- og B-blandingsamplifikasjonene i separate brønner som inneholder standard størrelse/formamidblanding (fra trinn 1) som allerede er dispensert inn på platen. 3. Denaturer PCR-produktet som er fordelt på den optiske platen på en termisk variator med følgende parametre: 94 C i 3 minutter forbundet med 4 C i 30 sekunder. 4. Sentrifuger platen i kort tid slik at innholdet samles på bunnen av hetteglassene og for å fjerne eventuelle bobler i brønnene og sett dem straks på den genetiske analysatoren. Merknad: Innstillingene for prøveinjeksjon kan endres slik at de tilpasses mengden amplikon som produseres under PCR, som kan variere på grunn av mengden av genomisk DNA som tilsettes. Mindre amplikon kan brukes i kolonnen til analyse ved å redusere enten tiden eller spenningen ved injeksjonen. Omvendt kan mer amplikon brukes i kolonnen til analyse ved å øke enten tiden eller spenningen ved injeksjonen. Tidligere amplifiserte prøver kan injiseres på nytt flere ganger for ny analyse se feilsøkingsveiledningen for Elucigene CF-EU2v1 hvis du vil ha mer informasjon. CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 10 av 23

ABI 3130-instrumenter: Det er nødvendig å opprette en CF-EU2-kjøringsmodul og protokoll, som kan brukes til hver CF-EU2-kjøring. Opprett CF-EU2-modulen i Module Manager (Kjøringsmodulstyring) i programvaren for 3130 dataoppsamling. Påse at følgende er valgt: Type: Regular (Vanlig) Template (Mal): FragmentAnalysis36_POP7 Oppfør innstillingene vist i tabellen nedenfor: 36 cm kapillærmodul # Parameternavn Verdi Verdiområde 1 Oven Temperature 60 int 18 65 C (Ovnstemperatur) 2 Poly_Fill_Vol. 6500 6500 38000 trinn (Poly Fyll Vol.) 3 Current Stability 5,0 int 0 2000 ua (Strømstabilitet) 4 PreRun_Voltage 15,0 0 15 kv (Prekjøringsspenning) 5 Pre_Run_Time 180 1 1000 s (Prekjøringstid) 6 Injection_Voltage 3,0 1 15 kv (Injeksjonsspenning) 7 Injection_Time 12,0** 1 600 s (Injeksjonstid) 8 Voltage_Number_Of_Steps 20 1 100 nk (Spenning_Antall_Trinn) 9 Voltage_Step_Interval 15 1 60 s (Spenningstrinnintervall) 10 Data_Delay_Time 60 1 3600 s (Dataforsinkelsestsid) 11 Run_Voltage 15,0 0 15 kv (Kjøringsspenning) 12 Run_Time (Kjøringstid) 1200 300 14000 s **Øke injeksjonstiden til 36 sekunder for analyse av DNA som er ekstrahert fra blodflekker Merknad: Påkrevd kjøringstid vil variere, avhengig av omgivelsestemperaturen på steder der den genetiske analysatoren er installert. For mer informasjon om opprettelse av kjøringsmoduler, se brukerhåndboken for den genetiske analysatoren fra Applied Biosystems 3130.. Opprett CF-EU2-protokollen i Protocol Manager (Protokollstyringen) og sørg for at følgende er valgt: Type: Regular (Vanlig) Run Module (Kjøringsmodul): CF-EU2 (se kjøringsmodul ovenfor) Dye Set (Fargesett): G5 Opprett et prøveark med Plate Manager (Platestyringen) for å kjøre prøvene, og sørg for at riktig protokoll for CF-EU2v1 har blitt valgt for instrumentprotokollen (se ovenfor). Merknad: Det finnes mer informasjon om instrumentoppsett, betjening og feilsøking i brukerhåndboken for den genetiske analysatoren fra Applied Biosystems 3130. CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 11 av 23

ABI 3500-instrumenter: Det er nødvendig å opprette en CF-EU2 Instrument Protocol (Instrumentprotokoll) som kan brukes ved hver CF-EU2v1-kjøring. Opprett CF-EU2 Instrument Protocol (Instrumentprotokoll) via 3500 Instrumentprotokoll-biblioteket. Påse at følgende er valgt: Run Module (Kjøringsmodul): FragmentAnalysis50_POP7 Før opp innstillingene beskrevet i bildet nedenfor: ** **Øke injeksjonstiden til 36 sekunder for analyse av DNA som er ekstrahert fra blodflekker. Prøvene kjøres ved å opprette en prøveplate ved å klikke på Create Plate from Template (Opprett plate fra mal) i Dashboard (Instrumentbord), og sørg for at riktig instrumentprotokoll for CF-EU2v1 har blitt tilordnet (se ovenfor). Prøvearkoppsett for GeneMarker: Programvaren for GeneMarker muliggjør direkte sammenligning mellom A- og B-data fra samme person. For å gjøre dette mulig er det viktig at navnet på FSA-filen er den samme i alle prøver og blandinger. Prøvearket skal inneholde det unike prøvenavnet for hver prøve som blir testet, enten med suffikset _A eller _B, avhengig av hvilken blanding som testes. Hvis plate-iden skal inkluderes i FSA-navnet, skal det brukes et fast format hver gang, for eksempel CFEU2 DDMMÅÅÅÅ. På 3130 Results Destination (Resultatdestinasjon) skal parametrene innstilles slik at prøvenavnet er inkludert i FSA-filnavnet, for eksempel CFEU2 DDMMÅÅÅÅ_1234,5_A_A01. CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 12 av 23

På 3500 skal filnavnkonvensjonen stilles inn slik at prøvenavnet er inkludert i FSA-filnavnet, for eksempel CFEU2 DDMMÅÅÅÅ_1234,5_A_A01. Tolking av resultater Under dataoppsamlingen, blir PCR-fragmentene observert som enten blå (mutant) eller grønne (villtype) topper på elektroferogrammet for rådata. Et menneske har to kopier av CFTR-genet. Der disse kopiene har samme sekvens for et gitt sted, blir personen beskrevet som homozygotisk for dette stedet. Hvis kopiene er forskjellige i sekvens på et gitt sted, blir personen beskrevet som heterozygotisk for dette stedet. Når dataoppsamlingen er ferdig, skal CF-EU2v1 PCR-fragmentenes størrelse sammenlignes med GS600v2 LIZ standardstørrelse ved bruk av programvaren for fragmentanalyse. CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 13 av 23

Dokumentet Elucigene CF-EU2v1 Veiledning for analyseprogramvaren har flere detaljerte retningslinjer for programvareinnstillinger, analyse og tolking. Prosedyrene i Veiledning for analyseprogramvaren er tilgjengelig for GeneMapper- og GeneMarker-programvaren fra Elucigene Diagnostics nettsted: www.elucigene.com/products Resultater fra A-blandingen (mutant) bestemmer hvorvidt en person bærer en mutasjon og vises med en blå topp. Mutantblandingen inneholder også primere for den normale F508-allelen. Denne blandingen kan derfor bestemme om en person er normal for F508del (bare grønn topp), homozygotisk for F508del (bare blå topp), eller heterozygotisk for F508del (blå og grønn topp). Hvis en annen mutasjon observeres, kan resultatene fra B-blandingen (villtype) analyseres for å bestemme homozygotisk eller heterozygotisk status. Hvis en grønn topp vises for den spesielle allelen i villtypeblandingen, angir dette at personen er heterozygotisk, og fravær av grønn topp angir at personen er homozygotisk for den spesielle mutasjonen. Hypervariable STR-markører (røde) er inkludert i begge blandingene. Dette muliggjør sammenligning mellom den amplifiserte prøven med mutantblandingen og prøven som er amplifisert med villtypeblandingen slik at muligheten for prøveforveksling reduseres. Forskjellig STR-profil i hver av de to blandingene angir prøveforveksling. Fravær av disse STR-markørene angir at prøven er mislykket. Nærvær av STR-markører ved svært lav RFUS angir en svak prøve, som bør analyseres med forsiktighet. Merknad: Se feilsøkingsveiledningen for mer informasjon. CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 14 av 23

Påviste markører Tabellen nedenfor oppsummerer markørene påvist med CF-EU2v1-blanding. Markørene er oppført i henhold til størrelsesområdet for PCR-produktet som observeres. Markør (Topp nr.) Påviste markører Markør Produktets bp størrelsesområde (3130/POP7 data) 01 R347H 110.5-116.5 02 R347P 117-123 03 2789+5G>A 124-130 04 3120+1G>A 132.5-138.5 05 711+1G>T 141.5-147.5 06 R334W 147.5-154 07 I507del 156-162.5 08 F508del 163-169 09 3849+10KbC>T 172-178 10 1677delTA 180-188.5 11 1078delT 193-199 12 V520F 206-211.5 13 L206W 215-220 14 W1282X 224.5-230.5 15 R560T 234.5-240.5 16 2347delG 242-246 17 Q890X 250-252 18 R553X 255.5-261.5 19 G551D 265-267 20 S549R(T>G)* 267.5-269.5 21 S549N 275-280 22 M1101K 282-288 23 G542X 289-295.5 24 3905insT 297-303.5 25 Y1092X(C>A) 308-314 26 S1251N 315-321 27 444delA 323-326 28 1811+1.6kbA>G 332-338 29 1717-1G>A 341.5-347.5 30 R117H 349-355 31 R117C 357-360 32 N1303K 360-366.5 33 Y122X 367-373 34 394delTT 377-383 35 G85E 384-390 36 R1066C 391-397 37 1898+1G>A 398.5-404.5 38 W846X 406-411 39 2184delA 413-418 40 D1152H 423-429 41 CFTRdel2,3 433-439 42 P67L 439.5-445.5 43 2143delT 446-450.5 44 E60X 453.5-460.5 45 3659delC 461-465.5 46 3272-26A>G 470-476 47 621+1G>T 485.5-491.5 CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 15 av 23

Markørnummer (3130/POP7 data) Markør Produktets bp størrelsesområde 48 A455E 496-503 49 R1162X 506-512 50 R1158X 516.5-524.5 5T** IVS8-5T 110-130 7T IVS8-7T 140-160 9T IVS8-9T 175-195 *S549R(T>G) Topp 20 er bare tilstede i A-blandingen. ** 5T allelestørrelser Produktets bp Markør størrelsesområde (3130/POP7 data) 5T (9) 117.25 118.75 5T (10) 119.25 120.75 5T (11) 121.25 122.75 5T (12) 123.25 124.75 5T (13) 125.25 126.75 MERK: Markørstørrelsene kan variere, avhengig av instrumentet og polymeret som brukes. Eksempler på tolking I507del På grunn av plasseringen av I507del-delesjonen i CFTR-genet er det mulig å påvise nærvær av denne markøren gjennom et 3 bp-forskyvning i størrelsen på F508del-toppen, i tillegg til en I507del mutantspesifikk topp. Hvis en enkel I507del mutantallele er tilstede, blir I507del mutanttopp observert som en blå topp ved omtrent 159 bp. En villtypetopp for F508del blir observert som nærværende, men ved omtrent halve topphøyden blir den vanligvis assosiert med en homozygotisk genotype av villtypen. Dette vises som en grønn topp på omtrent 167 bp. Det vil også være en ekstra grønn topp observert ved omtrent 164 bp. I507del heterozygot-prøve En I507del/F508del-prøve vil gi en forskjøvet grønn F508del WT-topp ved omtrent 164 bp (3 bp mindre enn normalt), en blå F508del M-topp ved 166 bp og en blå I507del M-topp ved omtrent 159 bp. En I507del/I507del-prøve gir en blå topp ved omtrent 159 bp og en enkel grønn topp ved omtrent 164 bp (3 bp mindre enn den normale F508del-toppen som observeres når I507del ikke er tilstede. CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 16 av 23

F508del Nærvær av en F508del-mutasjon forhindrer I507del WT-primeren i å fungere. En person som er homozygotisk for nærvær av en F508del-mutasjon, forhindrer derfor I507del WT (se nedenfor). En redusert høyde I507del WT-topp og 2 topper med 3 bp mellomrom i posisjon 10 og 12 i WT-blandingen (se nedenfor) vil bli observert i B-blandingsresultatene fra en person som er heterozygotisk for F508del. Innsettinger og delesjoner På grunn av utformingen av CF-EU2v1-settet, vil nærværet av innsettinger eller delesjoner mellom to motsatte primere resultere i størrelsesendringer for alle amplikonen produsert mellom disse to primerne. I tillegg til de 50 mutasjonene, påvist av CF-EU2v1-settet, vil derfor eventuelle innsettinger og delesjoner i de amplifiserte målsekvensene, bli påvist av endringen i forventet amplikonstørrelse i B-blandingen (villtype). Disse har blitt tabulert og er tilgjengelige i et separat dokument fra Elucigene Diagnostics nettsted: www.elucigene.com/products Eksempler på innsettinger og delesjoner, påvist av settet og innvirkningen de har på B-blandingsprofilen vises nedenfor: F508del/1677delTA To topper med 1 bp mellomrom ved posisjon 12 (V520F WT) vil bli observert i B-blandingsresultatene fra en heterozygotisk person for F508del/1677delTA-mutasjonene. CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 17 av 23

V520F En villtypetopp med redusert høyde ved posisjon 10 (1677delTA WT) vil bli observert i B-blandingsresultatene fra en heterozygotisk person for V520F-mutasjon, fordi dette forhindrer at 1677delTA WT-primeren i å fungere. Topp 10 og 12 faller ut i resultatet for en person som er homozygotisk for V520Fmutasjonen. 394delTT To topper med 2 bp mellomrom ved posisjon 35 (G85E WT), 42 (P67L WT) og 44 (E60X WT), vil bli observert i B-blandingsresultatene fra en person som er heterozygotisk for 394delTTmutasjonen. Topp 34 faller ut og toppene 35, 42 og 44, vil ha forventet høyde, men forskjøvet til 2 bp mindre enn forventet størrelse i resultatene fra en person som er homozygotisk for 394delTT-mutasjonen. F508del/CFTRdele2,3 Reduserte topphøyder i posisjonene 34 (394delTT), 35 (G85E WT), 41 (CFTRdele2,3 WT), 42 (P67L WT) og 44 (E60X WT), blir observert i B-blandingsresultatene fra en person som er heterozygotisk for CFTRdele2,3- mutasjonen. Toppene 34, 35, 41, 42 og 44 faller ut i resultater fra en person som er homozygotisk for CFTRdele2,3-mutasjon. CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 18 av 23

444delA To topper med 1 bp mellomrom i posisjon 30 (R117H WT), 31 (R117C WT), 33 (Y122X WT) og 47 (621+1 WT), vil bli observert i B-blandingsresultatene fra en person som er heterozygotisk for 444delA -mutasjonen. Topp 27 faller ut og toppene 30, 31, 33 og 47, vil ha forventet høyde, men forskjøvet til 1 bp mindre enn forventet størrelse i resultatene fra en person som er homozygotisk for 444delA-mutasjonen. 2347delG To topper med 1 bp mellomrom i posisjon 39 (2184delA WT) og 43 (2143delT WT), vil bli observert i B- blandingsresultatene fra en person som er heterozygotisk for 2347delG-mutasjonen. Topp 16 faller ut og toppene 39 og 43 vil ha forventet høyde, men forskjøvet til 1 bp mindre enn forventet størrelse i resultatene fra en person som er homozygotisk for 2347delG-mutasjonen. 3905insT To topper med 1 bp mellomrom i posisjon 26 (S1251N WT), vil bli observert i B-blandingsresultatene fra en person som er heterozygotisk for 3905insT-mutasjonen. Topp 24 faller ut og topp 26 vil ha forventet høyde, men forskjøvet med 1 bp større enn forventet størrelse i resultatene fra en person som er homozygotisk for 3905insT-mutasjonen. CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 19 av 23

R1158X Redusert topphøyde i posisjon 49 (R1162X WT) vil bli observert i B-blandingsresultatene fra en person som er heterozygotisk for R1158X-mutasjonen. Topp 49 faller ut i resultater fra en person som er homozygotisk for R1158X-mutasjonen. Polymorfisme rs4148721 (delat) i intron 22 To topper med 2 bp mellomrom i posisjon 45 (3659delC WT), 49 (R1162X WT) og 50 (R1158X WT) vil bli observert i B-blandingsresultater fra en person som er heterozygotisk for polymorfismen rs4148721 (delesjon av AT) i intron 22. Topp 45, 49 og 50 vil ha forventet høyde, men forskjøvet til 2 bp mindre enn forventet størrelse i resultatene fra en person som er homozygotisk for polymorfismen rs4148721. Andre observasjoner V520F Polymorfisme 1584G>A i exon 12 1584G>A polymorfisme har blitt funnet som interfererer med amplifikasjonen av V520F mutanten og villtypesekvensen. Redusert topphøyde i posisjon 12 (V520F) vil bli påvist i B-blandingen i en person som er heterozytgotisk for 1584G>A polymorfisme. Topp 12 vil falle ut av B-blandingen hos en person som er homozygotisk for 1584G>A polymorfisme. En person som er heterozygotisk for F508del-mutasjonen og også heterozygotisk for 1584G>A-mutasjonen, vil vise bare én topp 12 i B-blandingen i stedet for de forventede to toppene i posisjon 12 som vanligvis ses i en F508del-heteozygote se eksempel nedenfor. Topp 12 vil falle ut av A-blandingen hos en person som er heterozygotisk for V520F-mutasjonen og 1584G>A polymorfisme på samme allele. Et slikt resultat har ikke blitt observert til dato, og er sannsynligvis en sjelden kombinasjon. CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 20 av 23

Kryssreaktivitet Vi gjorde alt vi kunne under testutviklingen for å unngå interferens i testefunksjonen ved nærvær av andre rapporterte polymorfismer og mutasjoner i CFTR-genet. Den sjeldne mutasjonen R1283M har blitt evaluert for kryssreaktivitet, og ble ikke påvist av Elucigene CF-EU2v1-settet. Dessuten ble følgende polymorfismer ikke påvist av testen: 1655T/G (F508C), 1651A/G. Evaluering av kjente mutasjoner og polymorfismer i CFTR-genet har fremhevet følgende virkninger på resultatene fra Elucigene CF-EU2v1-settet: 1. G551D-mutantprimeren i A-blandingen vil også påvise S549RT>G-mutasjonen. Programvaren vil merke dette som topp 20. Det vil ikke være noen tilsvarende villtypetopp i B-blandingen. 2. 2184delA mutantprimeren i A-blandingen vil kryssreagere med 2183AA>G-mutant DNA-sekvensen og resultere i en mutanttopp i 2184delA-posisjonen. 3. 1078delT mutantprimeren i A-blandingen vil kryssreagere med F316L-mutant DNA-sekvensen og resultere i en mutanttopp i 1078delT-posisjonen. 4. R347P mutantprimeren i A-blandingen vil kryssreagere med R347H mutant DNA-sekvensen og resultere i en mutanttopp i R347P-posisjonen med redusert høyde, sammenlignet med en reell R347P-topp. 5. Nærværet av F508C (1655T>G) polymorfismen vil resultere i reduksjon i høyden på I507del-toppen i CF- EU2v1 B-blandingen. 6. Nærværet av R117H vil resultere i reduksjon i høyden på R117C-toppen i CF-EU2v1 B-blandingen. I en prøve som er homozygotisk for R117H vil R117C-toppen være fraværende. 7. Nærværet av G85E vil resultere i reduksjon i høyden på 394delTT-toppen i CF-EU2v1 B-blandingen. I en prøve som er homozygotisk for G85E vil 394delTT-toppen være fraværende. 8. En svært liten artefakttopp i I507del-posisjonen kan iblant observeres i resultatene fra en F508del heterozygot og spesielt i en F508del homozygotisk prøve. 9. Følgende mutasjoner, som ikke har blitt kontrollert for mulig kryssreaktivitet på grunn av utilgjengelige relevante prøver, og kan interferere med testfunksjonen: R117P, R117L, 1717-2A>G, 621+2T>C, 621+2T>G, R553G, R553Q, R347L, I506T, I506S, I506V og den sjeldne kombinasjonen I507del med polymorfismen 1651A/G. Ytelseskarakteristikker Ett hundre og ti DNA-prøver ekstrahert fra væskefullblod (EDTA) ble blindtestet med Elucigene CF-EU2v1. Fem prøver mislyktes etter PCR som korrelerte med lav DNA-konsentrasjon (mindre enn 1,5 ng/μl). Av de som ga fortolkbare resultater, var 96 normale, 5 var heterozygotiske for F508del, 1 var heterozygotisk for 1717-1G>A, 1 var heterozygotisk for G551D, 1 var heterozygotisk for 621+1G>T, 1 var heterozygotisk for G542X og 1 var en sammensetning heterozygotisk for G542X/F508del. Nittien DNA-prøver ekstrahert fra tørkede blodflekker ble blindtestet med Elucigene CF-EU2v1. Amplifisering av fem prøver mislyktes. Av de prøvene som faktisk amplifiserte, mislyktes 20 prøver i å oppfylle analysekriteriene for tolking etter en 12-sekunders injeksjon på en 3500 genetisk analysator. Alle mislykte prøver korrelerte med lav DNA-konsentrasjon (under 1,5 ng/μl). De 20 mislykkede prøvene ble injisert på nytt i 36 sekunder på 3500 genetisk analysator og analysert, 7 prøver oppfylte ikke analysekriteriene for tolking. Av de 79 prøvene som ga fortolkbare resultater, var 38 normale, 5 var heterozygotiske for F508del, 3 var heterozygotiske for G551D, 3 var heterozygotiske for W1282X, 2 var heterozygotiske for D1152H og 2 var heterozygotiske for G542X. Fire sammensatte heterozygoter, 3120+1G>A/F508del, R117H/F508del, R1162X/F508del og R553X/F508del ble også bestemt. Dessuten ble hver av følgende heterozygotiske prøver påvist ved én enkel anledning, E60X, G85E, 394delTT, Y122X, CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 21 av 23

621+1G>T, 1078delT, R334W, R347P, A455E, I507del, 1717-1G>A, R553X, 1811+1.6kbA>G, 1898+1G>A, 2184delA, W846X, 3272-26A>G, Y1092X, 3659delC, 3849+10kbC>T, S1251N og N1303K. Førtiseks DNA-prøver, som representerte alle 50 mutasjoner påvist av CF-EU2v1-settet, ble amplifisert ved fem separate anledninger. Alle prøvene ga de forventede resultatene uten falske negative eller falske positive resultater, som viste 100 % klinisk spesifisitet og sensitivitet. Feilsøking Disse bruksinstruksjonene er vedlagt for å sikre optimal ytelse av analysen. Brukere skal ikke avvike fra de vedlagte prosedyrene. Eventuelle avvik kan resultere i suboptimal ytelse som gir dårlig datakvalitet. En feilsøkingsveiledning er tilgjengelig fra Elucigene Diagnostics på forespørsel, og gir eksempler og løsninger på noen av de vanligste påvisningene utført av Elucigene CF-EU2v1. Disse inkluderer: Ingen diagnostiske eller STR-topper Svake diagnostiske eller STR-topper For store gjennombrudd /bakgrunnstopper Umerkede topper Svake FAM-topper (mutant) Ubalansert A-blandingsprofil Ubalansert B-blandingsprofil Splittede topper i B-blandingsprofil For å få et eksemplar av feilsøkingsveiledningen for Elucigene CF-EU2v1, ta kontakt med vår teknisk støttegruppe: T: +44 (0) 161 669 8122 F: +44 (0) 161 669 8129 E: enquiries@elucigene.com E: techsupport@elucigene.com Begrensninger ved prosedyren 1. Resultatene innsamlet fra denne eller eventuelle andre diagnostiske tester skal brukes og tolkes bare i sammenheng med det generelle kliniske bildet. Elucigene Diagnostics er ikke ansvarlig for eventuelle kliniske avgjørelser som tas. 2. Fravær av mutasjoner, påvist med dette settet, er ingen garanti for at andre mutasjoner i CFTR-genet ikke er tilstede. Andre mutasjoner er mulige, og blir ikke påvist av dette settet. 3. Mutasjonene varierer i frekvens mellom ulike populasjoner. Data fra populasjoners mutasjonsfrekvens er tilgjengelig fra The Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium (6). Brukeren av dette settet skal legge vekt på disse punktene når resultatene blir rapportert til den kliniske/genetiske rådgiveren som foretar diagnosen. Ansvarsfraskrivelse Resultatene fra denne eller andre diagnostiske analyser skal tolkes i sammenheng med andre laboratorie- og kliniske data som er tilgjengelig for klinikeren. Disse Elucigene-reagensene leveres for in vitro-diagnostisk testing. Ytterligere detaljer for datatolking er tilgjengelig i Elucigene CF-EU2v1 Veiledning for prosedyrer i analyseprogramvaren: www.elucigene.com/products CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 22 av 23

Referanser 1. Rosenstein BJ, Cutting GR. The diagnosis of cystic fibrosis: a consensus statement. Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel. J Pediatr. 1998;132:589 95. 2. De Braekeleer M, Allard C, Leblanc JP, Simard F, Aubin G. Genotype-phenotype correlation in cystic fibrosis patients compound heterozygous for the A455E mutation. Hum Genet. 1997;101:208 11 3. Drumm ML, Konstan MW, Schluchter MD, Handler A, Pace R, Zou F, Zariwala M, Fargo D, Xu A, Dunn JM, Darrah RJ, Dorfman R, Sandford AJ, Corey M, Zielenski J, Durie P, Goddard K, Yankaskas JR, Wright FA, Knowles MR. Genetic modifiers of lung disease in cystic fibrosis. N Engl J Med. 2005;353:1443 53 4. Goss CH, Newsom SA, Schildcrout JS, Sheppard L, Kaufman JD. Effect of ambient air pollution on pulmonary exacerbations and lung function in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 2004;169:816 21 5. Kerem B, Rommens JM, Buchanan JA, Markiewicz D, Cox TK, Chakravarti A, Buchwald M, and Tsui LC. Identification of the Cystic Fibrosis Gene: Genetic Analysis. Science 1989; 245 (4922): 1073-8 6. Cystic Fibrosis Mutation Database, www.genet.sickkids.on.ca/cftr/app 7. Joshua D. Groman et al. Variation in a Repeat Sequence Determines Whether a Common Variant of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene Is Pathogenic or Benign. Am J Hum Genet. 2004; 74(1): 176 179. 8. Newton CR et al. Analysis of any point mutation in DNA. The Amplification Refractory Mutation System (ARMS). Nucleic Acid Res 17: 2503-2516 (1989). 9. Satsangi J et al. Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet 343:1509-1510 (1994). 10. PCR Primer: A Laboratory Manual, 2 nd edition. ColdSpring Harbour Laboratory Press: Section 1 ELUCIGENE is a trademark of Delta Diagnostics (UK) Ltd. ARMS er et varemerke for AstraZeneca UK Ltd. QIAAMPer et varemerke for Qiagen GmbH. PICOGREENer et varemerke for Molecular Probes Inc. GENEMARKER er et varemerke for SoftGenetics Corporation. GENEMAPPER, NED, VIC, PET, POP-7, LIZ og HI-DI er varemerker for Life Technologies Corporation. MELDING TIL KJØPER: BEGRENSET LISENS Polynukleotider merket med VIC, NED og PET farger og/eller bruk av disse kan være dekket av en eller flere patenter som eies av Life Technologies Corp. Kjøpesummen for dette produktet inkluderer begrensede, uoverførbare rettigheter under visse krav i visse patenter tilhørende Life Technologies Corp. om å bruke kun denne produktmengden kun for kjøperens aktiviteter i forbindelse med påvisning av mål innen human diagnostikk-feltet. Ingen andre rettigheter er overført. Mer informasjon om kjøp av lisenser i forbindelse med fargene nevnt ovenfor, kan fås ved å kontakte Director of Licensing, outlicensing@lifetech.com. Copyright 2014 Delta Diagnostics (UK) Ltd. CF2EUBYNO 002 Sep-2014 Side 23 av 23