BRUKSOMRÅDE BACTEC PZA Test Medium Culture Vials Middlebrook 7H12 Medium ph 6,0 PP071JAA MA-0029 2007/06 Norsk BACTEC PZA-testmedium (Middlebrook 7H12-vekstmedium, ph 6,0), er spesielt utviklet for resistenstesting av Mycobacterium tuberculosis for pyrazinamid (PZA). Brukes hovedsaklig med BACTEC 460TB-instrumentet. SAMMENDRAG OG FORKLARING BACTEC radiometrisk teknikk brukes til å teste antimikrobiell resistenstesting for primære antimykobakterielle medisiner (streptomycin, isoniazid, rifampin og etambutol). 1-4 Med denne teknikken gjøres en kvantitativ måling av 14 CO 2, produsert av mykobakteriene, fra det 14 C-merkede substratet som finnes i BACTEC 12B-mediet. Hvis et antimikrobielt middel tilsettes mediet, vil det hemme isolater av mykobakterier som er sensitive for det antimikrobielle midlet, og mengden 14 CO 2 som produseres, vil være redusert. Butler og medarbeidere 5 foreslo en forbedret, konvensjonell metode for resistenstesting av PZA, som krever et spesielt 7H10- agarmedium med ph 5,5. En begrensning ved denne metoden er at ved ph 5,5, er det mange isolater av M. tuberculosis som enten ikke vokser, eller vokser dårlig. BACTEC 12B-mediet kan ikke brukes til resistenstesting av PZA, siden medikamentet bare er aktivt ved lavere ph-verdier. 5 Heifets m.fl. foreslo en radiometrisk metode for resistenstesting av PZA ved å bruke BACTEC 12B-medium ved ph 5,5. Denne metoden krevde senking av ph i hver enkelt flaske, fra 6,8 til 5,5 så snart veksten startet i ampullen. 6 Ved ph 5,5 var det flere isolater som ikke vokste i 12B-mediet, selv om resultatene som helhet var bedre ved bruk av 12B med ph 5,5 enn med 7H10 med ph 5,5. Senere ble det foreslått å tilsette eggeplommer for å forbedre veksten av mykobakterier. 7 Dette ga mer rapporterbare resultater, men tilsetting av ferske eggeplommer ble funnet å være tungvint og ikke praktisk for kliniske laboratorierutiner. Salfinger og Heifets rapporterte, etter ytterligere studier, at MIC for PZA økte, med en økning av ph-verdien i mediet fra 5,5 til 6,8. 8 Ved bruk av en modifikasjon av den radiometriske resistenstestingsprosedyren publisert ovenfor, anbefalte Salinger m.fl. bruk av BACTEC 12B-medium med ph-verdi på 5,9 til 6,0 (BACTEC PZA-testmedium), med en konsentrasjon av PZA som er høyere enn den som brukes ved den konvensjonelle metoden med fast medium (ph 5,5). 9 PRINSIPPER FOR PROSEDYREN BACTEC PZA-testmedium er et modifisert 7H12-medium med redusert ph-verdi på 6,0. Ved denne ph-verdien kan virkningen av PZA mot mykobakterier fastslås uten at veksten av de fleste isolater av M. tuberculosis blir hemmet. Det brukes en høyere konsentrasjon av PZA (100 µg/ml) i BACTEC-testen, sammenlignet med den konvensjonelle testen (25 50 µg/ml) for å kompensere for økningen i ph. PZA-testmediet inneholder et 14 C-merket substrat. Når mykobakterier vokser i dette mediet, metaboliserer de det merkede substratet og 14 CO 2 frigjøres i atmosfæren over mediet inne i den forseglede ampullen. BACTEC 460TB-instrumentet tester for tilstedeværelsen av 14 CO 2 ved å fjerne gassen fra ampullen og overføre den til et elektrometer hvor mengden av ionisering blir konvertert til en tallverdi som kalles vekstindeks (GI). Mengden og produksjonsraten av 14 CO 2 i mediet er direkte proporsjonal med mengden og vekstraten av bakterier i mediet. Når det antimykobakterielle medikamentet PZA tilsettes mediet, hemmes veksten av sensitive mykobakterier. Dette vises ved en reduksjon av 14 CO 2-produksjonen sammenlignet med en økende trend i kontrollen. Hvis organismene er resistente, blir det liten eller ingen veksthemming i ampullen. REAGENSER Innhold * pr ampulle (4 ml) PZA-testmedium (endelig ph 6,0 ± 0,2): 7H9-vekstmedium... 0,47 % w/v Hydrolysert kasein... 0,10 % w/v Bovint serumalbumin... 0,50 % w/v Katalase... 192 enheter 14 C substrat... 4 µci Avionisert vann (ml)... 4 q.s. * Tilført etter behov for å oppnå funksjonskriteriene. Advarsler og forsiktighetsregler: Ved in vitro-diagnostisk bruk. Dette produktet inneholder tørr naturgummi. Patogene mikroorganismer, blant annet hepatittvirus og humant immunsviktvirus, kan være til stede i kliniske prøver. Standard forsiktighetsregler 10-13 og institusjonelle retningslinjer skal følges ved håndtering av alle elementer som er kontaminert med blod og andre kroppsvæsker. = 1
Prosedyrene skal utføres i et egnet sikkerhetskabinett og tilstrekkelig utluftet område. Inokulerte ampuller må testes på et BACTEC 460TB-instrument utstyrt med BACTEC 460TB-hette som gir HEPA-filtrert luft og negativt lufttrykk i testområdet for instrumentet. Før bruk skal hver ampulle undersøkes for tegn på skade, forringelse eller forurensning, som uklarhet, bulende eller innpresset skillevegg. IKKE BRUK noen ampulle som viser tegn til forurensning. En forurenset ampulle kan inneha positivt trykk. Forurensning av ampullene trenger ikke å være åpenbar. Ampuller som viser tegn til skade, skal kasseres før inokulering. I sjeldne tilfeller kan det være sprekker i flasken, eller halsen kan brekke når korken tas av, eller ved håndtering. I tillegg kan det i sjeldne tilfeller forekomme at en ampulle ikke er tilstrekkelig forseglet. I begge tilfelle kan innholdet i ampullen lekke eller søles, særlig hvis ampullen snus på hodet. Hvis ampullen er inokulert, må søl eller lekkasje håndteres med varsomhet, ettersom patogene organismer eller agenser kan være til stede. Før de kasseres skal alle inokulerte ampuller steriliseres med autoklavering. Begrens muligheten for lekkasje under inokulering av prøve i kulturampullene til et minimum ved å bruke sprøyter med permanent festede nåler eller Luer-Lok-spisser. Forurensning Vær nøye med å unngå forurensning av prøven ved innsamling og ved inokuleringen i BACTEC-ampullen. En forurenset prøve vil gi en positiv avlesning, men vil ikke indikere et relevant, klinisk resultat. Slik forurensning kan skyldes feilaktig vedlikehold av BACTEC-nåler og -slanger, for dårlig rengjøring av skillevegger eller feilfunksjon av BACTECnålevarmerenheten (Se bruker- og vedlikeholdshåndboken). Vurderingen av dette må gjøres av brukeren på basis av slike faktorer som hvilken type organisme som finnes, forekomst av samme organisme i flere kulturer, pasienthistorikk, riktig kontroll av utstyret osv. Oppbevaringsinstruksjoner Ampuller med BACTEC PZA-testmedium skal oppbevares tørt og kjølig (2 25 C). Noter Brukes før -datoen på utsiden av hver pakning, og bruk de eldste først. Det er god praksis å skille ut radioaktive materialer ved oppbevaring i et eget kabinett som bare er tilgjengelig for autorisert personell. Kabinettet skal merkes med ordene Advarsel: Radioaktive materialer. Utsett ikke mediet for direkte, skarpt lys. Hver ampulle skal alltid testes innledningsvis på BACTEC 460TB-instrumentet for å fastslå en atmosfære med 5 10 % CO 2 inne i ampullen og luke ut ampuller med høye bakgrunnsavlesninger. Hvis en ampulle har GI 20 eller mer ved innledende screening, skal den kasseres. PRØVEPREPARERING Isolerte, rene kulturer av M. tuberculosis må være nydyrket i BACTEC 12B-medium og skal brukes til denne testen når de er i aktiv vekstfase. Bruk ikke gamle, avkjølte kulturer, eller kulturer som har vist optimal GI-avlesning i mer enn en dag. FRAMGANGSMÅTE Materialer som følger med: BACTEC PZA-testmedium Nødvendige materialer som ikke følger med: BACTEC PZA-medikament/rekonstitueringsvæskesett (50 tester) BACTEC 12B-medium } Se Tilgjengelighet BACTEC 460TB-instrument Tuberkulinsprøyte med permanent festet nål 5 ml sprøyte Desinfeksjonsoppløsning 70 % isopropylalkohol Preparering av medikamentmediet a. Lyofilisert PZA-medikament leveres separat sammen med en spesiell PZA-rekonstitueringsvæske (RF). b. Rengjør toppen på ampullen med en spritserviett. Tilsett 5 ml RF til det lyofiliserte PZA-ampullen med en sprøyte, med aseptisk teknikk. Bland godt. Når den er helt oppløst, vil dette gi en oppløsning på 4 000 µg PZA/mL. c. Før inokulering, og etter å ha rengjort toppen på ampullen med en spritserviett, tilsett 0,1 ml av standard PZA-oppløsning i hver PZA-mediumampulle med en 1 ml sprøyte. Den resulterende PZA-konsentrasjonen er 100 µg PZA/mL medium. Forholdsregler: PZA skal ikke gjøres i stand med vann eller noe annet fortynningsmiddel enn RF. Volumet av RF i ampullen kan variere. Mål nøyaktig 5 ml fra den medfølgende ampullen når PZA-pulveret rekonstitueres. Tilsetning av korrekt mengde av testmedikamentet til mediet er avgjørende for utførelsen av resistenstesten. Tilsett nøyaktig 0,1 ml standard oppløsning med en 1 ml tuberkulinsprøyte. Klargjøring av kontroll Et PZA-medium uten tilsatt legemiddel brukes som kontroll. Tilsett 0,1 ml RF til kontrollampullen før kulturen inokuleres. RF inneholder et vekstfremmende stoff, polyoksyetylenstearat (POES). Det er nødvendig å ha RF i alle inokulerte ampuller. = 2
Klargjøring av inokulat Bare kulturer i aktiv vekst skal brukes til å sette opp denne testen. Bruk ikke overvokste, oppbevarte kulturer, eller kulturer dyrket i andre medier. a. Testkulturen skal subkultiveres i en BACTEC 12B-medium ampulle (katalognr. 442004) tilsatt 0,1 ml RF pr ampulle. b. Inkuber ved 37 C ±1 C, og test ampullen daglig på BACTEC 460 TB-instrumentet. c. Så snart daglig GI kommer opp i 300 499, kan glasset brukes til inokulering av resistenstesten. d. Hvis GI er høyere enn 300 499, tilsett nytt 12B-medium i den opprinnelige vekstampullen i henhold til tabellen som er vist nedenfor. Hvis fortynnet, noter fortynningen som er brukt for senere referanse. GI 300 499: Ingen fortynning GI 500 599: Tilsett 1,0 ml 12B-medium GI 600 699: Tilsett 1,5 ml 12B-medium GI 700 799: Tilsett 2,0 ml 12B-medium GI 800 899: Tilsett 2,5 ml 12B-medium GI 900 998: Tilsett 3,5 ml 12B-medium Bland grundig før bruk. Unngå ampuller med avlesningen 999 som har passert høyeste GI. Inokulering av testen a. Rengjør toppen på alle kulturampullene med en 70 % spritserviett før en sprøyte settes inn. b. Bland testkulturen grundig i 12B-medium ved hjelp av en 1,0 ml tuberkulinsprøyte med permanent festet nål. c. Tilsett 0,1 ml av dette inokulatet til kontrollampullen og PZA-ampullen. KULTUREN FOR KONTROLLEN SKAL IKKE FORTYNNES som anbefalt for andre legemidler (dvs. isoniazid, streptomycin, etambutol, rifampin osv.) d. Desinfiser toppen av gummiskilleveggen med et egnet desinfeksjonsmiddel, og rengjør deretter med en 70 % spritserviett. MERK: Vær forsiktig ved håndtering av ampullene når testen utføres. Ampulleskilleveggene kan være kontaminert med kulturorganismer. Inkubering og testing a. Alle de inokulerte ampullene (inkludert kontrollampuller) skal testes på BACTEC 460 TB-instrumentet før inkubering, for å kontrollere at de har en 5 % CO 2-atmosfære. Hvis dette ikke ble gjort tidligere, kan ampullene testes umiddelbart etter inokuleringen. b. Inkuber ampullene ved 37 C ± 1 C. c. Test PZA og kontrollampullene daglig på BACTEC 460 TB-instrumentet inntil GI i kontrollampullen når 200 eller mer. Kvalitetskontroll Ampullene MÅ IKKE brukes etter utløpsdato. Bruk ikke ampuller som har sprekker eller defekter av noe slag. Kasser ampullene på egnet måte. For informasjon om kvalitetskontroll for BACTEC 460 TB-instrumentet, se bruker- og vedlikeholdshåndboken for BACTEC 460 TB og 460. Som ved andre resistenstester av legemidler, er kvaliteten på inokulatet svært avgjørende. Bruk bare aktivt voksende kulturer i 12B-medium med riktig fortynning. Under ideelle forhold skal kontrollen vise GI 200 innen 4 til 7 dager. Hvis en GI på 200 oppnås i kontrollen på mindre enn 4 dager, tyder dette på at inokulatet var for sterkt. Med mindre resultatet er tydelig, skal testen gjentas. Hvis en GI på 200 oppnås i kontrollen etter mer enn 7 10 dager, indikerer dette dårlig kvalitet på inokulatet (dvs. lav levedyktighet, lav innledende GIavlesning av inokulatet eller dårlig fortynning), og resultatene kan bli feilaktige. GI i kontrollen og medikamentampullene må følges nøye inntil det oppnås klare resultater. Gjenta testen dersom det er tvil. Hvis GI i medikamentampullene er svært nær 10 % av den i kontrollampullen, skal ampullene testes i ytterligere 1 3 dager. Dette vil være til hjelp for å bestemme resistensmønsteret i testkulturen. Hvis resultatene ikke er tolkbare, gjenta testen med et isolat som dyrkes i nytt BACTEC 12Bmedium (katalognr. 442004). Bruk alltid H37Rv (ATCC 27294) som sensitiv kontroll og H37Rv PZA-R (ATCC 35828) som en resistent kontroll. Kvalitetskontrollkrav må utføres i henhold til lokale og/eller nasjonale retningslinjer eller akkrediteringskrav og ditt laboratoriums standard kvalitetskontrollprosedyrer. Det anbefales at brukeren refererer til aktuelle NCCLS-retningslinjer og CLIA-regler for egnede kvalitetskontrollpraksiser. TOLKNING AV RESULTATENE Instrumentet viser direkte på en vekstindeksskala (GI Growth Index) på 0 999. Vekstindeksen er egentlig et mål på metabolsk aktivitet hos organismene i mediet. Når GI i kontrollampullen når 200 eller mer, tolkes resultatene som følger: GI i medikamentampullen er < 9 % av GI i kontrollampullen = Sensitiv GI i medikamentampullen er > 11 % av GI i kontrollampullen = Resistent GI i medikamentampullen er mellom 9 % og 11 % (inklusiv) av GI i kontrollampullen = Grenseverdi = 3
PROSEDYRENS BEGRENSNINGER Vekstindekstallet reflekterer mengde og rate av vekst som foregår i mediet, men kan ikke brukes til å kvantifisere koloniformende enheter pr ml. Kolonienes morfologi og pigmenteringsegenskaper kan bare bestemmes på faste medier. Den tilnærmede 10 % cutoff kan brukes som et omtrentlig estimat på resistens eller sensitivitet basert på GI-avlesningen. BACTEC PZAresistenstesten er bare anbefalt for M. tuberculosis-komplekse isolater. Nytten av PZA eller metoden for resistenstesting for andre mykobakterier enn tuberkulose (MOTT) er ikke kjent. FORVENTEDE VERDIER Det skal være en gradvis økning av GI i kontrollampullen. I testampullen, kan GI forbli den samme, eller kan øke eller minke avhengig av sensitiviten til testorganismene (se eksempel 1 og 2). Vanligvis vil BACTEC-resultater oppnås på 4 til 7 dager. Noen ganger kan saktevoksende kulturer bruke lenger tid. Resultatene skal ikke tolkes etter mindre enn 4 dager eller mer enn 21 dager. Eksempel nr 1: PZA-sensitivitet Daglige GI-avlesninger GI-medikament 1 2 3 4 5 GI-kontroll % Resultater: Kontroll 9 31 74 195 475 4 x 100 = 0,8 %= Sensitiv Medikament 6 9 9 9 4 < 9 % 475 Eksempel nr 2: PZA-resistens daglige GI-avlesninger Daglige GI-avlesninger GI-medikament 1 2 3 4 5 6 7 GI-kontroll-% Resultater: 244 Kontroll 7 28 41 70 120 177 282 x 100 = 86,5 Resistent 282= %= Medikament 17 29 40 68 92 157 244 > 11 % FUNKSJONSEGENSKAPER Basert på et modifisert 7H12-medium ved ph 6,0, er den radiometriske BACTEC 460TB-teknikken, til dato, den eneste kulturbaserte metode for testing av PZA-sensitivitet som er anbefalt av National Committee for Clinical Laboratory Standards (den amerikanske nasjonale komiteen for klinisk laboratoriestandard). 14,15 I en studie utført av Pfyffer med flere, ble det demonstrert mer enn 96 % overensstemmelse, når resistensen til M.tuberculosis overfor PZA ble sammenlignet ved BACTEC 460TB PZA-medium og -legemiddel og BACTEC MGIT 960 PZA-medium og - legemiddel. Den gjennomsnittlige rapporteringstiden for BACTEC 460 TB PZA-testen var 5,4 dager, ikke inkludert den tiden det tok å oppnå en radiometrisk subkultur med vekstindeks (GI) på 200. 14 Tilgjengelighet Kat. nr. Beskrivelse 442139 BACTEC PZA-testmedium-dyrkningsampuller, 4 ml, kart. med 10 442143 BACTEC PZA-medikament/rekonstitueringsvæskesett (50 tester) 442004 BACTEC 12B-medium 445203 BACTEC 460TB-instrument REFERANSER 1. Gross, W. M. and J.L. Hawkins, 1985. Radiometric selective inhibition test for differentiation of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacteria bovis, and other mycobacteria. J. Clin. Microbiol., 21:565-568. 2. Middlebrook, G. et al. 1977 Automatable radiometric detection of growth of Mycobacterium tuberculosis in selective media. Amer. Rev. Resp. Dis. 115:1066-1069. 3. Roberts, G.D. et al. Evaluation of the BACTEC radiometric method for recovery of mycobacteria and drug susceptibility testing of M. tuberculosis from acid-fast smear positive specimens. J. Clin. Microbiol. 18:689-696. 4. Siddiqi, S.H. et al. 1981. Evaluation of a rapid radiometric method for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 13:908-912. 5. Butler, W.R. and J.O. Kiburn. 1982 Improved method for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to pyrazinamide. J. Clin. Microbiol. 16:1106-1109. 6. Heifets, L.B. and M. D. Iseman, 1985. Radiometric method for testing susceptibility of mycobacteria to pyrazinamide in 7H12 broth. J. Clin. Microbiol. 21:200-204. 7. Woodley, C.L. and R. W. Smithwick, 1988. Radiometric method for pyrazinamide susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in egg yolk enriched BACTEC 12B medium. Antimicrob. Agents Chemother. 32:125-127. 8. Salfinger, M. and L. Heifets, 1988. Determination of pyrazinamide MICs for Mycobacterium tuberculosis at different ph s by the radiometric method. Antimicrob. Agents Chemother. 32:1002-1004. = 4
9. Salfinger, M. et al. 1989. Rapid radiometric method for pyrazinamide susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Res. Microbiol. 140:301-309. 10. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2001. Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, PA. 11. Garner, J.S. 1996. Hospital Infection control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17:53-80 12. U.S. Department of Health and Human Services. 1999. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 13. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p. 0021-0045. 14. Pfyffer, G.E., F. Palicova and S. Rüsch-Gerdes. 2002. Testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to pyrazinamide with the nonradiometric BACTEC MGIT 960 System. J. Clin. Microbiol. 40:1670-1674. 15. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2000. Tentative standard M24-T2. Susceptibility testing of mycobacteria, nocardia and other aerobic actinomycetes, 2nd ed. NCCLS, Wayne, PA. = 5
= 6