Quorum sensing inhibitorer åpner for muligheter til å bekjempe sykdommer. også i akvakultur. 458 FAGARTIKKEL

Transkript

1 458 FAGARTIKKEL Quorum sensing inhibitorer åpner for muligheter til å bekjempe sykdommer også i akvakultur Problemene med antibiotikaresistens hos bakterier har ført til en intensivering av forskning for å finne alternative tiltak mot bakterielle sykdommer. Quorum sensing inhibitorer er et av de alternativene som nå undersøkes mot flere alvorlige humanpatogener. I denne artikkelen ønsker vi å gi en kort innføring i dagens kunnskaper innen fagfeltet bakteriell quorum sensing og diskutere fremtidige muligheter dette kan gi for forebygging og bekjempelse av bakterielle infeksjoner i akvakultur. Renate Johansen Seksjon for mikrobiologi, immunologi og parasittologi Norges veterinærhøgskole Postboks 8146 Dep 0033 Oslo E-post: renate.johansen@veths.no Live L. Nesse Seksjon for bakteriologi Veterinærinstituttet Lone Gram Afdeling for Fiskeindustriel Forskning Danmarks Fiskeriundersøgelser Nils-Peder Willassen Avdeling for molekylær bioteknologi Universitetet i Tromsø Henning Sørum Seksjon for mikrobiologi, immunologi og parasittologi Norges veterinærhøgskole Key words: Quorum sensing, aquaculture, bacterial infections, winter ulcer disease Innledning De fleste bakterielle infeksjonssykdommer innen norsk akvakultur er heldigvis under kontroll ved hjelp av vaksiner og forebyggende driftsrutiner. Bruken av antibiotika er derfor minimal i dag i forhold til på og 1990-tallet. Men fremdeles har vi sykdomsutbrudd med blant annet vintersår hos laks og vibriose hos torskeyngel som ikke lar seg forebygge eller behandle med dagens vaksiner og antibiotika. Vaksinebivirkninger er et annet problem som det gjenstår forskningsinnsats for å løse. Og hvem vet hvilke utfordringer fremtidens store torskeoppdrettsnæring vil bringe? Det er derfor viktig at fiskeforskere utnytter de nye kunnskapene som kommer frem i forskning på pattedyr og mennesker, i utvikling av nye metoder for sykdomsbekjempelse også i akvakultur. Quorum sensing Quorum er en latinsk betegnelse for det minimum av representanter som må være til stede for at en forsamling skal være beslutningsdyktig. Betegnelsen quorum sensing (QS) hos bakterier brukes om det fenomen at bakterier kan registrere og respondere på tettheten av bakterier i sin nærhet. Når tettheten av bakterier øker over et bestemt nivå, registreres dette slik at alle bakteriene kan endre egenskaper (fenotype) samtidig. Kommunikasjonen foregår via molekyler (QS-signalstoffer, Figur 1) som bakteriene produserer og eventuelt kan respondere på. Effekten av QS kan være så fredelig som at alle bakteriene slår på lyset (luminescens) samtidig, eller så krigersk at alle bakteriene aktiverer virulensfaktorer samtidig. QS-systemer (signalmolekyler og gener) er påvist hos mange både gram-positive og gramnegative bakterier, men fagfeltet er relativt nytt, og det er fremdeles mange bakterier som ikke er undersøkt. Hos de fleste av de undersøkte bakteriene er det angitt flere mulige QS-systemer som er mer eller mindre sammenflettet med både positive og negative reguleringsmekanismer. Det er derfor mye forskning som skal til for å få en oversikt over det totale QS-systemet hos en bakterieart, og ingen bakterier er ennå fullt ut kartlagt. Det er påvist store variasjoner mellom bakterier i samme gruppe, og i tillegg kan det være variasjoner mellom ulike stammer av samme bakterie. Som eksempel kan det nevnes at hos fem undersøkte vibrioarter er det påvist like mange varianter av QS-systemer (1). QS ble først beskrevet hos den marine bakterien Vibrio fischeri som kan leve i symbiose med blant annet blekkspruten Euprymna scolopes. Bakterien utsender lys som gir blekkspruten kamuflasje ved å etterligne månelyset når den jakter etter føde, og som takk får bakterien næring

2 FAGARTIKKEL 459 (2). Ved høy tetthet lager bakteriene et lys, og dette oppnåes i trange ganger og krypter i blekksprutens spesielle lys-organ. Bakteriene anvender et enkelt QS-system for å registrere tettheten av bakterier slik at de vet når lyset skal slås av og på. Hos andre bakterier er QS-systemene langt mer kompliserte, og det er derfor ennå et mysterium hva de fleste bakterier kommuniserer om. Selv om ikke alle QS-systemer som i dag er påvist er knyttet til registrering av bakterietetthet, er begrepet quorum sensing beholdt. Som eksempel kan nevnes at Escherichia coli og Salmonella enterica mistenkes for å kunne utnytte QS-systemer til å detektere tarmflora slik at de kan omregulere gener når de kommer inn i tarmen (3). Dette kan være avgjørende for bakterienes evne til å gi diaré, og QS-blokkering er derfor av stor interesse. For videre lesning om QS anbefaler vi oversiktsartikler av Milton (1), Whitehead og medarbeidere (4) og Reading og Sperandio (5). Quorum sensing inhibitorer Hvis virulensfaktorer hos bakterier er QS-regulerte, åpner det for muligheter til å unngå sykdommer ved å blokkere QS-systemer med såkalte quorum sensing inhibitorer (QSI). Dette er stoffer som kan blokkere bakterienes kommunikasjonslinjer enten ved å hemme dannelsen av QS-signalmolekyler, bryte ned signalmolekyler som allerede er dannet, eller hemme andre trinn i QS-prosessen, for eksempel med enzyminhibering eller konkurrerende blokkering av reseptorer (6). Avgjørende for å kunne utnytte QSI mot bakterielle infeksjoner er altså at man kjenner bakterienes virulensfaktorer, det vil si hvordan bakterien faktisk infiserer verten. QS-regulering av virulensfaktorer er studert i relasjon til blant annet adhesjon, bevegelighet, biofilmdannelse samt produksjon av enzymer og toksiner (7). Slike studier gjøres ofte ved å sammenligne native bakterier med mutanter som mangler et eller flere QS-gener. Det er for eksempel vist at mutanter av Vibrio vulnificus, som mangler evne til dannelse av QS-signalstoffer, gir nedsatt dødelighet ved testing på mus sammenlignet med native bakteriestammer (8). Ved å hemme bakterienes patogene effekt på verten i stedet for å hemme bakterienes vekst er QSI antatt å gi mindre resistensproblemer enn antibiotika. Man minimerer seleksjonspresset som favoriserer utvikling av resistente bakterier. Men QSI kan gi andre problemer. Det vil blant annet bli en stor utfordring å kartlegge hvilke effekter QSI kan ha på tarmfloraen eller på den totale bakterielle mikrofloraen i miljøet. De mest kjente stoffer med QSI-effekt er isolert fra havalgen Delisea pulchra som vokser på barriererevet i Australia. Denne algen koloniseres i mindre grad av bakterier enn andre alger i havet og ble derfor undersøkt for naturlige antibakterielle Bilde viser to positive og to negative prøver i en test med indikatorbakterien Chromobacterium violaceum som danner fiolett farge når prøven innholder visse QS-signalstoffer. faktorer inkludert QSI. Det er fremstilt en rekke analoge stoffer på basis av molekyler fra denne algen, og ett av disse har fått betegnelsen C-30. Studier med Vibrio harveyi viser for eksempel at C-30 tilsatt under oppformering av bakterien gir mindre toksinproduksjon, men har ingen effekt på toksin som allerede er dannet (9). C-30 må altså være til stede i det medium eller organ der oppformeringen av V. harveyi finner sted for å motvirke toksindannelse. Dette vil være en betydelig hindring når det kommer til kommersiell utnyttelse av produktet for bekjempelse av sykdommer. QS i akvakultur Produksjon av QS-signalmolekyler har blitt påvist hos mange fiskepatogener inkludert Vibrio anguillarum (1, 10) og Vibrio salmonicida (11, 12), som er årsak til henholdsvis vibriose og kaldtvannsvibriose. I et smitteforsøk med V. anguillarum gav tilsetting av QSI (C-30) signifikant mindre dødelighet (13). Mutanter av V. anguillarum, der deler av QS-systemet var fjernet, gav derimot ingen reduksjon i virulens (14). Videre studier er derfor nødvendig for å finne ut om QS-systemet hos denne bakterien er direkte knyttet til sykdomsutvikling (1, 15). Yersinia ruckeri forårsaker sykdommen yersiniose, også kalt rødmunnsyke da den kan gi blødninger i munn og kjeveregionen på regnbueørret i ferskvann. Bakterien kan produsere QS-signalmolekyler (16), og de samme molekylene er identifisert direkte fra fisk med yersiniose (12). Men hva

3 460 FAGARTIKKEL Vintersår hos atlantisk laks. Ofte sees et enkelt sår bak på siden av fisken, men det kan også utvikles flere sår over hele fiskens overflate. Foto: Brit Tørud. bakterien bruker denne evnen til er ikke klarlagt. Dette illustrerer at QS-systemer kan være relativt enkle å påvise, men effekten av dem er ofte vanskelig å kartlegge. Hos de fiskepatogene bakterieartene Aeromonas hydrophila og Aeromonas salmonicida er det påvist QS (17). En mutert stamme av A. hydrophila, som anvendes til produksjon av levende vaksiner til regnbueørret, ble spesielt undersøkt for QS-regulering (18). Det ble ikke påvist noen korrelasjon mellom produksjonen av proteaser, som er den viktigste antigene faktoren i vaksinen, og konsentrasjonen av QS-signalstoffer. Selv om denne første undersøkelsen ikke gav noen klare resultater, er kunnskaper om QS-mekanismer i bakteriestammer brukt til vaksineproduksjon forventet å bli viktige for optimalisering av effekten av vaksiner i fremtiden. Også ved oppdrett av skjell, reker og varmtvannsfisk skaper bakterier store problemer, og flere forskergrupper, blant annet i Asia, fokuserer nå på kartlegging av QS hos disse bakteriene i håp om å utvikle QSI til kommersielt bruk (19, 20). Den internasjonale forskningsinnsatsen på dette området er forventet å kunne gi en rask heving av kunnskapsnivået rundt mulighetene for bruk av QSI i akvakultur. QS hos vintersår-bakterier? Vintersår er, som navnet tilsier, en sykdom som oftest registreres om vinteren med utvikling av sår i fiskens hud (Figur 2). I tillegg til betydelige tap på grunn av forhøyet dødelighet resulterer sykdommen også store negative økonomiske konsekvenser på grunn av nedklassifisering på slaktelinjen. Bakterien Moritella viscosa (tidligere Vibrio viscosus) er regnet for å være hovedårsak til sykdommen, og vaksinering mot denne bakterien gir god beskyttelse i eksperimentelle studier (21). Men under feltbetingelser gir ikke vaksinering mot M. viscosa fullgod beskyttelse (22), og sykdommen er vanskelig å behandle med antibiotika (23). Sykdommen er først og fremst et problem ved oppdrett av atlantisk laks, og en del utbrudd registreres også på regnbueørret. M. viscosa er påvist hos oppdrettstorsk (24), og smitteforsøk viser at denne arten i høy grad er mottagelig for M. viscosa fra laks (25). Piggvar og kveite er også vist å være mottagelig i smitteforsøk, men i mindre grad enn torsk (25, 26). En økning av oppdrett av marine fiskearter i nær tilknytning til lakseoppdrett gir derfor grunnlag for å frykte smitte mellom disse artene og dermed økte problemer med vintersår. På fisk med vintersår påvises ofte bakterien Vibrio wodanis i tillegg til M. viscosa, men betydningen av denne bakterien i sykdomsforløpet er ukjent (27). Smittemodeller med begge bakteriene har ikke avdekket noen betydning av V. wodanis, og smittemodeller med denne bakterien alene har så langt ikke gitt utvikling av vintersår (27). Likevel er det et faktum at V. wodanis ofte påvises på flere fisk enn M. viscosa ved utbrudd av vintersår (27-29). Ved flere laboratorier er det vist at V. wodanis under visse forhold kan ha en hemmende effekt på M. viscosa når de dyrkes i blan-

4 FAGARTIKKEL 461 dingskultur, og dette kan delvis forklare hvorfor M. viscosa er vanskelig å påvise hos fisk som er infisert med begge bakterier (29, 30). For å utvikle bedre vaksiner, eller bekjempe sykdommen på andre måter, er det viktig å få frem mer utfyllende kunnskaper om hvordan vintersår oppstår og virulensfaktorer hos bakteriene som er involvert. Mulige interaksjoner hos involverte bakterier er fokus for et nylig oppstartet forskningsprosjekt ved Norges veterinærhøgskole i samarbeid med Universitetet i Tromsø og Danmarks Fiskeriundersøgelser. Fokus for prosjektet vil være å avdekke om V. wodanis har noen effekt på M. viscosa direkte, eller på andre måter virker inn på sykdomsforløpet ved utviklingen av vintersår. QSsystemer og andre egenskaper ved bakteriene vil bli kartlagt. Fremtidig sykdomsbekjempelse i akvakultur Optimalisering av vaksiner er allerede nevnt som et viktig punkt som kan oppnåes ved bedre forståelse av bakteriers virulensmekanismer inkludert eventuelle QS-reguleringer. Hvis QS-mekanismer for eksempel er involverte i marine bakteriers evne til å danne biofilm og dermed feste seg til overflater i karene og til fiskens hud, åpner dette for bruk av QSI for å motvirke oppvekst og overlevelse av bakterier i fiskens miljø. Dette kan i så fall utnyttes til å oppnå bedre effekt av desinfeksjonsmidler og til bekjempelse av bakterielle infeksjoner. Alger og bakterier med evne til hemming eller inaktivering av QS-signalstoffer kan tenkes anvendt til for eksempel vannbehandling eller fôrtilsetninger (6). Eventuelle effekter av QSI på den vanlige bakteriefloraen i fiskens tarm, hud og miljø må i så fall kartlegges, og her er det mange ubesvarte spørsmål. En annen spennende teori for å utnytte QS til bekjempelse av sykdommer bygger på det motsatte prinsippet, nemlig å tilføre molekyler som gjør at bakteriene blir virulente selv i små mengder (6). Dette prinsippet bygger på teorien om at bakterier fester seg på eller trenger inn i fisken i små mengder. Når så bakterietettheten har nådd et visst nivå, utvikler alle bakteriene virulens samtidig gjennom QS-regulering. Videre baseres teorien på at bakteriene først etter aktivering av virulensgenene utvikler antigener som stimulerer fiskens immunsystem. Denne teorien brukes blant annet for å forklare hvordan fisk kan være bærere av små mengder patogene bakterier uten å bli syk. Tilføring av QS-signalstoffer vil dermed kunne stimulere bakteriene til å utvikle antigener på et tidligere stadium og dermed stimulere immunsystemet før bakterieantallet er stort nok til å gi sykdomsutbrudd. De første bakteriene som infiserer fisken, vil på denne måten kunne beskytte fisken mot en videre infeksjon på samme måte som en vaksine. Et noe tilsvarende forsvarssystem er allerede påvist hos planter som danner QS-signalstoffer som ligner molekylene som de patogene bakteriene kommuniserer med, noe som får bakteriene til å sverme i stedet for å infisere planten (31). Sammendrag Veien frem til ferdig utviklede quorum sensing inhibitorer (QSI) til bruk i akvakultur er lang, men den er påbegynt, og mulighetene er mange. Arbeidet med å kartlegge quorum sensing (QS) hos flere fiskepatogener er i gang, men det er fortsatt uklart hva bakteriene anvender disse systemene til. Økt kunnskap om virulensfaktorer hos fiskepatogener er av avgjørende betydning hvis man skal ha muligheter til å utnytte QSI og andre nye medikamenter i fremtiden. Et forskningsprosjekt ledet av Norges veterinærhøgskole skal nå kartlegge mulige QS-systemer hos bakterier som er involvert i utviklingen av vintersår. Summary QUORUM SENSING INHIBITORS OPEN POSSIBILITIES FOR TREATMENT OF BACTERIAL PROBLEMS IN AQUACULTURE It is still a long way to go before quorum sensing inhibitors for controlling of bacterial problems in aquaculture may be available for commercial use. Increased knowledge of virulence mechanisms in fish bacteria is needed, and the investigation of their quorum sensing (QS) systems has just started. A research project led by the Norwegian School of Veterinary Science will look into QSmechanisms possibly involved in bacteria causing winter ulcer disease. Referanser 1. Milton DL. Quorum sensing in vibrios: complexity for diversification. Int J Med Microbiol 2006; 296: Visick KL, McFall-Ngai MJ. An exclusive contract: specificity in the Vibrio fischeri-euprymna scolopes partnership. J Bacteriol 2000; 182: Xavier KB, Bassler BL. LuxS quorum sensing: more than just a numbers game. Curr Opin Microbiol 2003; 6: Whitehead NA, Barnard AML, Slater H, Simpson NJL, Salmond GPC. Quorum-sensing in Gramnegative bacteria. FEMS Microbiol Rev 2001; 25: Reading NC, Sperandio V. Quorum sensing: the many languages of bacteria. FEMS Microbiol Lett 2006; 254: Defoirdt T, Boon N, Bossier P, Verstraete W. Disruption of bacterial quorum sensing: an unexplored strategy to fight infections in aquaculture. Aquaculture 2004; 240: Donabedian H. Quorum sensing and its relevance to infectious diseases. J Infect 2003; 46:

5 462 FAGARTIKKEL 8. Kim SY, Lee SE, Kim YR, Kim CM, Ryo PY, Choy HE et al. Regulation of Vibrio vulnificus virulence by the LuxS quorum-sensing system. Mol Microbiol 2003; 48: Manefield M, Harris L, Rice SA, de Nys R, Kjelleberg S. Inhibition of luminescence and virulence in the black tiger prawn (Penaeus monodon) pathogen Vibrio harveyi by intercellular signal antagonists. Appl Environ Microbiol 2000; 66: Milton DL, Hardman A, Camara M, Chhabra SR, Bycroft BW, Stewart G et al. Quorum sensing in Vibrio anguillarum: characterization of the vani/vanr locus and identification of the autoinducer N-(3-oxodecanoyl)-L-homoserine lactone. J Bacteriol 1997; 179: Fidopiastis PM, Sørum H, Ruby EG. Cryptic luminescence in cold-water fish pathogen Vibrio salmonicida. Arch Microbiol 1999; 171: Bruhn JB, Dalsgaard I, Nielsen KF, Buchholtz C, Larsen JL, Gram L. Demonstration of quorum sensing signal molecules (acylated homoserine lactones) in Gram-negative fish pathogenic bacteria. Dis Aquat Org 2005; 65: Rasch M, Buch C, Austin B, Slierendrecht WJ, Ekmann KS, Larsen JL et al. An inhibitor of bacterial quorum sensing reduces mortalities caused by vibriosis in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum). Syst Appl Microbiol 2004; 27: Croxatto A, Chalker VJ, Lauritz J, Jass J, Hardman A, Williams P et al. VanT, a homologue of Vibrio harveyi LuxR, regulates serine, metalloprotease, pigment, and biofilm production in Vibrio anguillarum. J Bacteriol 2002; 184: Croxatto A, Pride J, Hardman A, Williams P, Camara M, Milton DL. A distinctive dual-channel quorum-sensing system operates in Vibrio anguillarum. Mol Microbiol 2004; 52: Temprano A, Yugueros J, Hernanz C, Sanchez M, Berzai B, Luengo JM et al. Rapid identification of Yersinia ruckeri by PCR amplification of yrui-yrur quorum sensing. J Fish Dis 2001; 24: Swift S, Karlyshev AV, Fish L, Durant EL, Winson MK, Chhabra SR et al. Quorum sensing in Aeromonas hydrophila and Aeromonas salmonicida: identification of the LuxRI homologs AhyRI and AsaRI and their cognate N-acylhomoserine lactone signal molecules. J Bacteriol 1997; 179: Vivas J, Razquin BE, Lopez-Fierro P, Naharro G, Villena A. Correlation between production of acyl homoserine lactones and proteases in an Aeromonas hydrophila aroa live vaccine. Vet Microbiol 2004; 101: Morohoshi T, Inaba T, Kato N, Kanai K, Ikeda T. Identification of quorum-sensing signal molecules and the LuxRI homologs in fish pathogen Edwardsiella tarda. J Biosci Bioeng 2004; 98: Nakayama T, Nomura N, Matsumura M. Analysis of the relationship between luminescence and toxicity of Vibrio carchariae pathogenic to shrimp. Fish Sci 2005; 71: Greger E, Goodrich T. Vaccine development for winter ulcer disease, Vibrio viscosus, in Atlantic salmon, Salmo salar L. J Fish Dis 1999; 22: Jensen F. Overraskende mye vintersår. Nor Fiskeoppdr 2003; 28: Coyne R, Bergh Ø, Samuelsen OB, Andersen K, Lunestad BT, Nilsen H et al. Attempt to validate breakpoint MIC values estimated from pharmacokinetic data obtained during oxolinic acid therapy of winter ulcer disease in Atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture 2004; 238: Colquhoun DJ, Hovland H, Hellberg H, Haug T, Nilsen H. Moritella viscosa isolated from farmed Atlantic cod (Gadus morhua). Bull Eur Assoc Fish Pathol 2004; 24: Gudmundsdottir BK, Bjørnsdottir B, Gudmundsdottir S, Bambir SH. A comparative study of susceptibility and induced pathology of cod, Gadus morhua (L.), and halibut, Hippoglossus hippoglossus (L.), following experimental infection with Moritella viscosa. J Fish Dis 2006; 29: Bjørnsdottir B, Gudmundsdottir S, Bambir SH, Magnadottir B, Gudmundsdottir BK. Experimental infection of turbot, Scophthalmus maximus, by Moritella viscosa, vaccination effort and vaccineinduced side-effects. J Fish Dis 2004; 27: Lunder T, Evensen O, Holstad G, Håstein T. "Winter ulcer" in the Atlantic salmon Salmo salar. Pathological and bacteriological investigation and transmission experiments. Dis Aquat Org 1995; 23: Whiteman KA, Backman S, Benediktsdottir E, Coles M, Johnson G. Isolation and characterization of a new Vibrio spp. (Vibrio wodanis) associated with 'Winter ulcer disease' in sea water raised Atlantic salmon (Salmo salar L.) in New Brunswick. Aquac Assoc Can Spec Publ 2000; (4): Heidarsdottir KJ, Benediktsdottir E. Culture media for optimal isolation of Moritella viscosa from Atlantic salmon (Salmo salar) with winter ulcers. Reykjavik: University of Iceland, Thorarinsson R, Lystad Y. Vintersår: Ny kunnskap skaper optimisme. Nor Fiskeoppdr 2003; 28: Mathesius U, Mulders S, Gao M, Teplitski M, Caetano-Anolles G, Rolfe BG et al. Extensive and specific responses of a eukaryote to bacterial quorum-sensing signals. Proc Natl Acad Sci US 2003; 100: