Bakteriene snakker seg inn i en biofilm livsstil

Transkript

1 Bakteriene snakker seg inn i en biofilm livsstil anne aamdal scheie og fernanda cristina petersen Hva er dental biofilm? Tannbelegg kjenner vi som bakterier omgitt av en egenprodusert matriks som sitter fast på tannoverflaten. Dentalt plakk er tannbelegg. Men hva er egentlig biofilm? Ordet biofilm dukker stadig oftere opp i litteraturen, og antall publikasjoner som omhandler emnet har økt eksponentielt siden begrepet ble tatt i bruk på slutten av syttitallet (Costerton et al 1978). Dentalt plakk er en typisk biofilm. Tradisjonelt har bakterier blitt sett på som enkle, encellede organismer, og mikrobiologer har i årevis studert bakterier som vokser i flytende medier eller på bakterieskåler. Det har gitt oss nyttig kunnskap og forståelse av sammenhengen mellom bakterier og sykdom, men ved en slik tilnærming har vi gått glipp av informasjon om viktige sider av bakterienes liv. Det viser seg nemlig at bakterier i virkeligheten ikke lever isolert som encellede organismer. Som oftest lever de festet på overflater organisert i komplekse biofilmer, og da har bakteriene helt andre egenskaper. Dental biofilm er en organisert tredimensjonal struktur av orale bakterier omgitt av en selvprodusert matriks av biopolymerer som sitter fast på tannoverflaten. Matriksen, som holder bakteriene sammen, er en blanding av polysakkarider, proteiner og DNA som stammer hovedsakelig fra bakteriene (Sutherland 2001). Den tredimensjonale biofilmstrukturen muliggjør trans- Odontologi 2007 Munksgaard Danmark, København

2 port av blant annet næringssubstrater, avfallsprodukter og ulike signalmolekyler (Costerton 1965). Hvilke konsekvenser har det at de fleste bakterier i naturen velger å leve sammen i biofilm? Selv om vi først i de senere år er blitt klar over sider ved biofilmens natur, var Antonie van Leeuwenhoek den første til å studere dental biofilm allerede på slutten av det syttende århundre. Med sitt selvkonstruerte mikroskop beskrev han mikrofloraen i den dentale biofilmen, lenge før noen kjente til bakterier. Han oppdaget at han ikke kunne hemme bevegelsen til dyrene i tannbelegget hvis han skyllet munnen med sterk edikk. Hvis han derimot skrapte belegget fra tennene og rørte det sammen med eddiken var dyrene ikke lenger i stand til å bevege seg. I virkeligheten beskrev han en vesentlig egenskap ved bakterier i biofilm; biofilmbakterier er langt mer resistente mot antibakterielle midler og mot vertens forsvar enn sine slektninger som vokser i flytende medier. Bakteriene foretrekker et liv i biofilm Vi regner med at de aller fleste bakteriene i naturen organiserer seg i biofilmer. Å forstå hvordan biofilmer dannes og bakteriene organiserer seg vil være avgjørende for å kunne kontrollere og manipulere dem. Biofilmer dannes i trinnvise prosesser som starter med adhesjon av frittflytende bakterier til en film på en overflate, etterfulgt av kolonisering, koadhesjon, modning og løsning av enkelte bakterier (Fig. 1). Bakteriene i dental biofilm fester seg til en protein- og glykoproteindekket tannoverflate; pelikkelen. Proteinene og glykoproteinene i pelikkelen stammer fra saliva og er med på å modifisere tannoverflatens fysikalsk- kjemiske egenskaper. De første pionerbakteriene fester seg løst og reversibelt til pelikkelen. Bindingene blir etter hvert sterkere og bakteriene deler seg og øker i antall. Pionerbakteriene endrer de lokale miljøforhold og gir mulighet for andre bakterier til å feste seg på de allerede etablerte bakteriene. Den dentale biofilmen blir 100

3 Figur 1. Skjematisk illustrasjon av dental biofilmdannelse. etterhvert mer kompleks, og noen bakterier vil frigjøre seg og etablere seg på nye steder. I en biofilm dannes ulike mikromiljøer på grunn av gradienter av for eksempel næringsstoffer, avfallsprodukter, ph og oksygen. Dette registrerer bakteriene og tilpasser seg de varierende forhold ved å skru av og på gener etter sine egne behov. En slik tilpasning krever regulering av et stort antall gener. Nyere forskning har vist at bakteriene på denne måten endrer egenskaper når de befinner seg i en biofilm. Når for eksempel Streptococcus mutans vokser i biofilm blir ca 20% av dens proteiner enten oppregulert eller nedregulert i forhold til når de lever i flytende medium (Svensäter et al 2001). Tilsvarende fant Rathsam og medarbeidere at 48 av 242 gener var opp- eller nedregulert eller unike i S. mutans biofilm (Rathsam et al 2005a). Enzymene som S. mutans bruker til å lage polysakkarider, uttrykkes også mer i biofilm (Rathsam et al 2005b) og i forskjellig grad avhengig av om biofilmen er tykk og moden eller tynn og umoden (Burne et al 1997). Andre eksempler på endret genaktivitet i biofilm er enzymet urease i Streptococcus salivarius og sekretering av en rekke proteiner i Actinobacillus actinomycetemcomitans (Li et al 2000). Biofilmdannelse i Pseudomonas aeruginosa, som forårsaker alvorlig lungebetennelse hos pasienter med cystisk fibrose, er mye 101

4 studert. I biofilm sammenlignet med frittflytende bakterier og i ulike stadier av biofilmdannelsen, har man funnet mellom 40 og 50% forskjell i uttrykte gener hos denne bakterien (Sauer et al 2002). Bakterier i biofilm endrer seg også til å bli mer resistente overfor antimikrobielle stoffer og vertens immunforsvar enn når de lever fritt i flytende medium. Konsentrasjonen av et stoff som dreper frittflytende bakterier, må økes, gjerne fra ti til tusen ganger, for å ha tilsvarende effekt når bakteriene vokser i biofilm (Davies 2003). Dette er nettopp hva van Leeuwenhoek i sin tid observerte med vineddiken han testet. Denne tilsynelatende resistensen kan forklare hvorfor mange stoffer benyttet til oral profylakse har dårligere effekt klinisk enn forventet ut fra laboratorietester. En forklaring på den tilsynelatende resistensen har vært at strukturen i en biofilm hindrer diffusjon av aktive molekyler inn i dybden av biofilmen, eller at molekylene inaktiveres i overflaten av biofilmen. En annen forklaring på den tilsynelatende resistensen kan være bakterienes varierende veksthastighet i en biofilm. Det er slik at bakterienes sensitivitet er avhengig av deres veksthastighet. En bakteriekultur som vokser fort, vil være mest sensitiv overfor et hemmende stoff. Bakteriene vokser langsommere i biofilm enn i flytende medium. Derved blir bakteriene mindre sensitive. Er det noen andre her? Vi har nå holdepunkter for at bakteriene kommuniserer seg imellom og på den måten regulerer en rekke gener. Denne koordinerte genreguleringen er trolig vesentlig for at bakteriene skal overleve i skiftende miljøer, men også for deres evne til å gi sykdom. Mange bakterier, inkludert orale bakterier, kan regulere sin fysiologiske aktivitet ved et såkalt quorum-sensing kommunika- 102

5 Figur 2. Bakteriekommunikasjon ved quorum-sensing signal molekyler. Biofilm Virulens Toksin Andre sjonssystem. Ordet quorum betyr det minste antall medlemmer av en forsamling som må være tilstede for at forsamlingen skal være beslutningsdyktig. Via quorum-sensing signalmolekyler er bakteriene i stand til å registrere andre bakterier i omgivelsene ved at de selv produserer og reagerer på egne og andres signalmolekyler. Bakteriene benytter ulike molekyler som quorum-signaler. Ved at signalmolekylene produseres kontinuerlig vil konsentrasjonen av signalmolekyl være en funksjon av bakterietettheten. Ikke før konsentrasjonen av signalmolekyler har nådd en viss terskelverdi, quorum, vil bakterien være i stand til å registrere og respondere på signalet. Når for eksempel Streptococcus mutans vokser i biofilm blir ca 20% av dens proteiner enten oppregulert eller nedregulert i forhold til når de lever i flytende medium (Fig. 2). For bakteriene betyr dette at de kan skru av eller på viktige gener på en koordinert måte. Bakteriene er i stand til å telle seg selv og andre. De skrur av og på gener bare når et tilstrekkelig antall bakterier er til stede for at en aktivitet vil være effektiv. De lever som velorganiserte flokkdyr. Vi finner flere quorum signalsystemer som benytter ulike quorum signalmolekyler i både grampositive og gramnegative bakterier. Grampositive bakterier benytter oligopeptider, mens gramnegative bakterier benytter homoserin laktoner som signalmolekyler. Mange quorum-molekyler er svært spesifikke. Dette inne- 103

6 bærer at de kun kan benyttes til kommunikasjon mellom bakterier av samme spesies. Nylig avdekket man imidlertid et annet kommunikasjonssystem, det såkalte autoinduser-2-systemet (AI- 2). I motsetning til de fleste andre quorum-systemene som bakteriene benytter til å kommunisere med sine egne, kan bakteriene benytte AI-2-systemet som et mer generelt kommunikasjonssystem som kan benyttes også til kommunikasjon med andre typer bakterier. Enkelt kan man si at ved hjelp av det tidligere beskrevne quorum-systemet kan bakterien kommunisere med og kontrollere sine likemenn, mens AI-2 i tillegg kan benyttes til å kommunisere med andre (Bassler 1999). AI-2 ble først beskrevet å stimulere bioluminisens i marine bakterier slik som Vibrio harveyi. Senere studier har bekreftet at en rekke både grampositive og gramnegative bakterier har gener for å produsere AI-2 signalmolekyler (Frias et al 2001; Miller & Bassler 2001). Strukturen til AI-2 fra V. harveyi og Salmonella typhimurium er kjent og ligner ikke noen andre kjente signalmolekyler. For de fleste andre bakterier kjenner man ikke molekylstrukturen for AI-2. Man vet imidlertid at produksjonen av AI-2 avhenger av et enzym som kodes for av genet luxs. DNA- sekvensen for dette genet ser nokså lik ut i mange bakterier (Schauder et al 2001). Det er rimelig å anta at det foregår en livlig kommunikasjon mellom bakteriene i dental biofilm. I laboratoriet har man påvist evnen til kommunikasjon hos ulike orale bakterier. I Tabell 1 vises eksempler på sammenhengen mellom quorum-sensing kommunikasjon og biofilmdannelse i orale bakterier. Kommunikasjon via signalsystemer ble først vist i Streptococcus gordonii (Loo et al 2000). Ved å inaktivere et gen som regulerer evnen til naturlig transformasjon i S. gordonii, fant man også at de dannet mindre biofilm. Naturlig transformasjon innebærer en tilstand der bakteriene er i stand til å ta opp DNA fra omgivelsene, inkorporere det nye DNA i sitt eget genom, og derved få endrede egenskaper. Man tenker seg at streptokokkene ved slik naturlig transformasjon lett kan tilpasse seg skiftende miljøforhold ved å tilegne 104

7 Tabell 1. Quorum-sensing kommunikasjon regulerer biofilmdannelse i orale bakterier Signalmolekyl Kommunikasjon Bakterie CSP Intra-species Streptococcus S. mutans S. gordonii S. intermedius AI-2 Intra-species Streptococcus S. mutans S. anginosus Inter-species S. gordonii/porphyromonas gingivalis S. oralis/actinomyces naeslundii seg egenskaper fra andre bakterier. Naturlig transformasjon i S. gordonii og andre orale streptokokker reguleres av et quorum signalsystem. Signalmolekylet i dette systemet er et peptid, det såkalt kompetansestimulerende peptidet CSP (Håvarstein et al 1996). Ved å tilsette syntetisk CSP kunne vi stimulere S. intermedius og S. mutans til å danne mer biofilm (Petersen et al 2004; Petersen et al 2005). Ved å inaktivere gener knyttet til kompetanseutvikling, for eksempel genet som koder for CSP i S. mutans, fant man at bakteriens evne til å lage biofilm ble sterkt redusert (Bhagwat et al 2001; Yoshida & Kuramitsu 2002). Biofilmen laget av mutanter av S. gordonii og S. mutans, som ikke er i stand til å kommunisere, får en annen struktur (Li et al 2002). I Fig. 3 ser vi hvordan vi ved å tilsette CSP stimulerer S. mutans til å danne mer biofilm. I tillegg til å indusere naturlig transformasjon regulerer CSP også bakterienes evne til å tåle stress (Yother et al 2002). For eksempel er dette systemet involvert i evnen S. mutans har til å tilpasse seg et surt miljø (Li et al 2001). Det samme kommunikasjonssystemet stimulerer produksjon av bacteriociner. Bacteriociner er bakterienes egne antibiotika som de kan bruke til å drepe andre bakterier for å vinne fotfeste eller for eksempel til å skaffe seg DNA eller andre cellekomponeneter (Wang 105

8 S. mutans biofilm uten SCSP S. mutans biofilm med SCSP Figur 3. Effekt av CSP kommunikasjons molekyl på biofilmdannelse. Syntetisk CSP ble tilsatt S. mutans under biofilmdannelse. & Kuramitsu 2005). Det er også interessant at S. gordonii produserer en protease som kan bryte ned CSP produsert av S. mutans (Kreth et al 2005). På den måten kan S. gordonii hindre S. mutans i visse aktiviteter. Signaloverføring via AI-2-systemet og genet for AI-2 syntase, luxs, er påvist i flere orale bakterier, for eksempel i Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum, A. actinomycetemcomitans, S. mutans, S. gordonii og Streptococcus anginosus (Burgess et al 2002; Fong et al 2001; Fong et al 2003; McNab et al 2003; Petersen et al 2006). Betydningen av AI-2-signalering for biofilmdannelse i S. mutans (Merritt et al 2003; Wen & Burne 2002) og S. gordonii (Mc Nab et al 2003) er ikke avklart. Inaktivering av luxs-genet synes imidlertid å påvirke S. mutans i biofilmdannelsen når den har tilgang til sukker (Merritt et al 2003). I S. gordonii fører tilsvarende inaktivering til endret uttrykk av enzymer knyttet til karbohydrat-metabolismen (McNab et al 2003). P. gingivalis endrer uttrykk av virulensfaktorer slik som haemagglutinin og protease aktivitet når luxs-genet inaktiveres (Burgess et al 2002; Fong et al 2001). I A. actinomycetemcomitans stimuleres leukotoksin-produksjonen av AI-2 (Fong et al 2001). AI-2 er også involvert i bakteriens tilpassning til et miljø som har begrenset tilgang på jern (Fong et al 2001; Fong et al 2003). 106

9 Siden AI-2-systemet benyttes for interspesies-kommunikasjon, er studier av biofilmer med flere typer bakterier særlig viktig. S. gordonii og P. gingivalis danner normalt biofilm sammen. Interessant nok ble det nylig vist at inaktivering av luxs-genet i P. gingivalis og i S. gordonii førte til at biofilmdannelsen ble sterkt redusert (McNab et al 2003). AI-2-systemet ble også nylig vist å være viktig for biofilmdannelse mellom Actinomyces naeslundii og Streptococcus oralis (Rickard et al 2006). Sykdomsutvikling og Profylakse Vi har lett for å tenke at bakterier skal bekjempes, og vi glemmer ofte at vi er helt avhengige av den bakterielle normalfloraen vår. Hverken karies eller periodontitt kan ses på som infeksjonssykdommer i klassisk forstand (Fejerskov 2004), men som resultat av en uballanse i den orale mikrofloraen (Marsh 1994). Målet er derfor ikke å fjerne den orale floraen, men å sørge for at den ikke utvikler seg slik at den ikke fører til sykdom. Hvilke faktorer får bakteriene til å skru på gener som gjør dem til patogener? Har vi mulighet for å hindre en slik utvikling uten å drepe bakteriene? Bruk av antibiotiske stoffer utøver et selektivt press på bakteriene. De naturlig resistente bakteriene vil overleve og kan overføre resistensgener til andre bakterier. Den senere tids utvikling og spredning av multiresistente bakteriestammer og hyppige forekomst av behandlingsresistente biofilminfeksjoner gjør at man søker nye måter å bekjempe bakterielle infeksjoner på, måter som ikke vil føre til resistensutvikling. Tiden er inne for å gå fra bruk av antibakterielle til antipatogene stoffer. Det vil si; istedenfor å ta livet av bakteriene bør man søke å gjøre dem mindre farlige ved å regulere og begrense deres uttrykk av virulensfaktorer. For terapeutiske formål vil essensielle gener for bakterienes liv representere aktuelle mål. For profylaktiske formål er det rimelig å interferere med bakterienes muligheter for å forårsake sykdom uten at ballansen i normalfloraen forstyrres. 107

10 Figur 4. Tenkt effekt av å hemme kommunikasjon mellom bakterier i biofilm. En mulig vei i fremtiden vil kunne være å interferere med bakterienes kommunikasjonssystemer. For noen år tilbake oppdaget man at den australske rødalgen Delisea pulchra unngår å bli kolonisert av bakterier ved at den produserer såkalte furanoner som sekundære metabolitter. Furanon har en tilsvarende struktur som quorum-signalmolekylene som benyttes av gramnegative bakterier. Furanoner kan syntetiseres og er vist å kunne hemme biofilmdannelse i P. aeruginosa (Hentzer et al 2002). Nylig ble det vist at furanoner også kan påvirke AI-2-kommunikasjonssystemet i grampositive bakterier. Man har også funnet andre molekyler i naturen som kan forstyrre signaloverføringen mellom bakterier. En annen mulighet til å interferere med signaloverføring er å benytte syntetiske signalmolekylanaloger. I munnhulen kan man tenke seg å benytte slike mekanismer for eksempel for å etablere en økologisk balanse som opprettholder oral helse. 108

11 Perspektiv Dersom forebyggelse av oral sykdom skal basere seg på angrep på eller forebyggelse av biofilmdannelse, er det vesentlig å vite om bakteriene har utviklet spesifikke mekanismer for å leve et liv i biofilm. I så fall vil mekanismene som inngår i biofilmdannelsen være konserverte og egnede mål for intervensjon. Stadiene i biofilmdannelse synes å følge tilnærmet samme mønster i ulike bakterier, men biofilmarkitekturen og de molekylære mekanismer som er involvert, varierer. Mekanismene for biofilmdannelse i P. aeruginosa er vel karakterisert og tjener som modell for hypoteser om mekanismene i andre bakterier. Muligheten til å interferere med quorum-systemer i orale bakterier representerer en interessant mulighet til å forebygge oral sykdom i fremtiden. Imidlertid mangler vi fortsatt informasjon om de molekylære mekanismene og signalveiene som er involvert i dannelse av dental biofilm. Her ligger en viktig forskningsmessig utfordring. litteratur 1 Bassler Bl. How bacteria talk to each other: regulation of gene expression by quorum sensing. Curr Opin Microbiol 1999; 2: Bassler BL, Wright M, Silverman MR. Multiple signalling systems controlling expression of luminescence in Vibrio harveyi: sequence and function of genes encoding a second sensory pathway. Mol Microbiol 1994; 13: Bhagwat SP, Nary J, Burne RA. Effects of mutating putative twocomponent systems on biofilm formation by Streptococcus mutans UA159. FEMS Microbiol Lett 2001; 205: Burgess NA, Kirke DF, Williams P, Winzer K, Hardie KR et al. LuxSdependent quorum sensing in Porphyromonas gingivalis modulates protease and haemagglutinin activities but is not essential for virulence. Microbiology 2002; 148: Burne RA, Chen YY, Penders JE. Analysis of gene expression in Streptococcus mutans in biofilms in vitro. Adv Dent Res 1997; 11:

12 6 Costerton JW. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol 1995; 49: Costerton JW, Geesey GG, Cheng KJ. How bacteria stick. Sci Am 1978; 238: Davies D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov 2003; 2: Fejerskov O. Changing paradigms in concepts on dental caries: consequences for oral health care. Caries Res 2004; 38: Fong KP, Chung WO, Lamont RJ, Demuth DR. Intra- and interspecies regulation of gene expression by Actinobacillus actinomycetemcomitans LuxS. Infect Immun 2001; 69: Fong KP, Gao L, Demuth DR. luxs and arcb control aerobic growth of Actinobacillus actinomycetemcomitans under iron limitation. Infect Immun 2003; 71: Frias J, Olle E, Alsina M. Periodontal pathogens produce quorum sensing signal molecules. Infect Immun 2001; 69: Håverstein LS, Gaustad P, Nes IF, Morrison DA. Identification of the streptococcal competence-pheromone receptor. Mol Microbiol 1996; 21: Hentzer M, Riedel K, Rasmussen TB, Heydorn A, Andersen JB et al. Inhibition of quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa biofilm bacteria by a halogenated furanone compound. Microbiology 2002; 148: Kreth J, Merritt J, Shi W, Qi F. Co-ordinated bacteriocin production and competence development: a possible mechanism for taking up DNA from neighbouring species. Mol Microbiol 2005; 57: Li YH, Chen YY, Burne RA. Regulation of urease gene expression by Streptococcus salivarius growing in biofilms. Environ Microbiol 2000; 2: Li YH, Hanna MN, Svensäter G, Ellen RP, Cvitkovitch DG. Cell density modulates acid adaptation in Streptococcus mutans: implications for survival in biofilms. J Bacteriol 2001; 183: Li YH, Lau PC, Tang N, Svensäter G, Ellen RP, Cvitkovitch DG. Novel two-component regulatory system involved in biofilm formation 110

13 and acid resistance in Streptococcus mutans. J Bacteriol 2002; 184: Loo CY, Corliss DA, Ganeshkumar N. Streptococcus gordonii biofilm formation: identification of genes that code for biofilm phenotypes. J Bacteriol 2000; 182: Marsh PD. Microbial ecology of dental plaque and its significance in health and disease. Adv Dent Res 1994; 8: McNab R, Ford SK, El-Sabaeny A, Barbieri B, Cook GS, Lamont RJ. LuxS-based signaling in Streptococcus gordonii: autoinducer 2 controls carbohydrate metabolism and biofilm formation with Porphyromonas gingivalis. J Bacteriol 2003; 185: Merritt J, Qi F, Goodman SD, Anderson MH, Shi W. Mutation of luxs affects biofilm formation in Streptococcus mutans. Infect Immun 2003; 71: Miller MB, Bassler BL. Quorum sensing in bacteria. Annu Rev Microbiol 2001; 55: Petersen FC, Ahmed Naam, Naemi A, Scheie AAa. LuxS-mediated signaling in Streptococcus anginosus and its role in biofilm formation. Antonie van Leeuwenhoek 2006; 90: Petersen FC, Pecharki D, Scheie AAa. Biofilm mode of growth of Streptococcus intermedius favored by a competence-stimulating signaling peptide. J Bacteriol 2004; 186: Petersen FC, Tao L, Scheie AAa. DNA binding-uptake system: a link between cell-to-cell communication and biofilm formation. J Bacteriol 2005; 187: Rathsam C, Eaton RE, Simpson CL, Browne GV, Berg T et al. Up-regulation of competence but not stress-responsive proteins accompanies an altered metabolic phenotype in Streptococcus mutans biofilms. Microbiology 2005; 151: Rathsam C, Eaton RE, Simpson CL, Browne GV, Valova VA et al. Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoretic analysis of Streptococcus mutans biofilms. J Proteome Res 2005; 4:

14 29 Rickard AH, Palmer RJ, Jr., Blehert DS, Campagna SR, Semmelhack MF et al. Autoinducer 2: a concentration-dependent signal for mutualistic bacterial biofilm growth. Mol Microbiol 2006; 60: Sauer K, Camper AK, Ehrlich GD, Costerton JW, Davies DG. Pseudomonas aeruginosa displays multiple phenotypes during development as a biofilm. J Bacteriol 2002; 184: Schauder S, Shokat K, Surette MG, Bassler BL. The LuxS family of bacterial autoinducers: biosynthesis of a novel quorum-sensing signal molecule. Mol Microbiol 2001; 41: Sutherland IW. Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework. Microbiology 2001; 147: Svensäter G, Welin J, Wilkins JC, Beighton D, Hamilton IR. Protein expression by planktonic and biofilm cells of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol Lett 2001: 205: Wang BY, Kuramitsu HK. Interactions between oral bacteria: inhibition of Streptococcus mutans bacteriocin production by Streptococcus gordonii. Appl Environ Microbiol 2005; 71: Wen ZT, Burne RA. Functional genomics approach to identifying genes required for biofilm development by Streptococcus mutans. Appl Environ Microbiol 2002; 68: Yoshida A, Kuramitsu HK. Multiple Streptococcus mutans genes are involved in biofilm formation. Appl Environ Microbiol 2002; 68: Yother J, Trieu-Cuot P, Klaenhammer TR, De Vos WM. Genetics of streptococci, lactococci, and enterococci: review of the sixth international conference. J Bacteriol 2002; 184: