ENZYMOLOGI. Geir Slupphaug. Stadium 1A Det Medisinske Fakultet NTNU

Transkript

1 ENZYMOLOGI Geir Slupphaug Stadium 1A Det Medisinske Fakultet NTNU

2 1 FORORD Uten enzymer ville livet på jorden slik vi kjenner det, være umulig. Enzymer er biologiske nøkkelmolekyler som katalyserer og regulerer et utall biokjemiske reaksjoner, og har en fundamental betydning for vår helse. I menneskekroppen er enzymer involvert i reguleringen av alle metabolske prosesser, og utgjør derfor en meget stor gruppe av proteinene i kroppen. Kartleggingen av det humane genom har vist at vi har ca gener, og selv om vi langt fra kjenner funksjonen av alle disse genproduktene, er det rimelig å anta at mellom en tredjedel og halvparten koder for enzymer. Antallet ulike enzymer ligger imidlertid sannsynligvis adskillig høyere, da hvert gen ofte kan kode ulike subtyper av proteiner. En ytterligere grad av kompleksitet skyldes at disse igjen kan modifiseres på ulike måter inne i cellene. Klassifisering humane proteiner i forhold til kjent funksjon. Enzymgruppene er understreket I diagnosesammenheng har målinger av aktiviteten av bestemte enzymer en sentral rolle. For lave verdier av et bestemt enzym kan bety at reguleringen av enzymet er forstyrret, eller også at pasienten har genetiske (arvelige) skader som gjør at aminosyresammensetningen i enzymet er endret i forhold til det normale. Arvelige feil kan i dag detekteres direkte på gennivå, men for å avgjøre hvilken funksjonell betydning i enzymet slike skader forårsaker, må enzymologiske undersøkelser i prøver fra den aktuelle pasienten foretas. En grunnleggende forståelse av enzymets funksjon og virkningsmekanisme er derfor avgjørende ved vurderingen av hvilken behandling som skal settes inn. For høye verdier av bestemte enzymer kan også gi en indikasjon på sykdom, da en

3 2 ved mange sykdomstilstander får en en lekkasje av enzymer fra bestemte organer til blodet. Kontroll av nivået av en rekke viktige enzymer inngår derfor rutinemessig ved analyser av blodprøver ved sykehuslaboratoriene. Enzymer spiller også en viktig rolle ved målinger av lavmolekylære forbindelser i blod- urinprøver (f. eks. glukose og kolesterol) idet disse forbindelsene tjener som substrat for enzymer som inngår i analysene. I dette kompendiet vil jeg gi en kort oversikt over hva enzymer er, og hvordan de fungerer. Ulike metoder for deteksjon og analyse av enzymer vil bli kort beskrevet, og en del eksempler på biomedisinsk betydning av ulike enzymer vil bli gitt.. For studentenes egen del er det viktig at en allerede på et tidlig tidspunkt i studiet erverver seg en viss basiskunnskap innen enzymologi, da dette feltet vil gripe inn i svært mange av de emnene som vil bli gjennomgått senere. Kompendiet er ment å gi en grunninnføring i emnet, og studentene oppfordres selv til å konsultere en rikholdig litteratur for en videre fordypning innen feltet. For å lette dette, er det gitt en litteraturliste helt til slutt. Studier i enzymologi vil ofte være både underholdende og fascinerende. For, slik som den kjente medisiner og nobelprisvinner Arthur Kornberg har sagt: "There is no such thing as a dull enzyme!" Geir Slupphaug

4 3 HVA ER ET ENZYM? Definisjon De aller fleste enzymer er proteiner som kan katalysere en biokjemisk reaksjon hvor ett eller flere substrat overføres til ett eller flere produkt via dannelsen av et intermediært enzymsubstratkompleks. Enzymer har evnen til å øke hastigheten i kjemiske reaksjoner uten selv og forbrukes (med noen unntak). De er også spesifikke, i det ett enzym bare virker på en bestemt type substrat(er) og produserer bare en type produk(er). Historikk Frem til 1800-tallet ble det antatt at prosesser som gjæring av sukker til alkohol og syrning av melk bare kunne skje ved hjelp av levende organismer. I 1833 ble den aktive forbindelsen som kunne bryte ned sukker delvis isolert, og ble gitt navnet diastase. Noe senere ble et stoff som kunne bryte ned protein funnet, og gitt navnet pepsin. Det oppsto imidlertid en sterk diskusjon om det virkelig var de frie forbindelsene i preparatene som utførte reaksjonene, eller om disse skyldtes rester av levende celler. Under denne diskusjonen oppsto betegnelsen enzym for disse aktive preparatene, et navn som stammer fra det greske enzumè som betyr "i gjær". Først i 1897 ble denne diskusjonen avsluttet, da Büchner viste at et cellefritt ekstrakt fra gjær kunne utføre gjæring av sukker. I 1926 renset og krystalliserte Sumner det første enzymet, urease, fra bønner, og i årene som fulgte ble en rekke andre enzymer også renset og karakterisert. I dag er enzymer fremdeles et område hvor det foregår en enorm forskningsinnsats. Nye forskningsverktøy har gjort et mulig å studere uttrykket av tusenvis av ulike proteiner (deriblant enzymer) fra celler (proteomikk), og det oppdages omtrent daglig nye enzymer som viser deregulert uttrykk ved bestemte sykdomstilstander. Kartlegging av disse enzymenes cellulære funksjoner, kombinert med studier av deres tredimensjonale struktur, vil etter hvert legge grunnlaget for en helt ny generasjon legemidler som griper spesifikt inn i enzymenes virkningsmekanisme. Enzymer har også en helt sentral rolle blant annet som analytiske forskningsverktøy, i industrielle prosesser og i klinisk diagnose. Struktur De aller fleste enzymer er proteiner (noen unntak vil bli nevnt senere). Det vil si at de er polypeptider dannet av lange kjeder av aminosyrer. Denne aminosyrerekkefølgen utgjør enzymenes primærstruktur. Det finnes 20 vanlige aminosyrer som inngår som byggesteiner i enzymene, og i tillegg finnes av og til enkelte spesielle aminosyrer i tillegg. Den generelle strukturformelen til en aminosyre er som følger:

5 NH R C α H C O - O Kiralt senter Unntak: glysin Den generelle strukturen av en aminosyre Gruppen R kalles aminosyrens sidekjede, og det er denne gruppen som bestemmer de spesifikke kjemiske egenskapene til aminosyren i enzymet. I det aktive setet finner en gjerne aminosyrer med polare sidekjeder, som kan inngå kjemiske bindinger med substratet. Nedenfor er sidegruppene i de 20 vanlige aminosyrene vist, sammen med de kjemiske egenskapene til disse gruppene. Sidegruppene til de 20 aminosyrene som vanligvis finnes i proteiner

6 5 Aminosyrene i polypeptidkjeden er bundet sammen med peptidbindinger mellom α- karboksylgruppen i en aminosyre og α-aminogruppen i neste. En kan således tenke seg polypeptidet som en lang kjede hvor R-gruppene stikker ut på sidene. Kjeden vil følgelig også ha en fri amino-ende (N-terminus) og en fri karboksyl-ende (C-terminus). Når en angir primærstrukturen til et enzym (eller andre proteiner) starter en alltid fra N-enden. O - O C R H O C α NH + C NH C α 3 O H R H 2 O O - O C R O H C α N C NH + 3 C α H H R Peptidbinding Dannelse av en peptidbinding i et dipeptid Sidekjedene i de ulike aminosyrene kan ofte danne kjemiske bindinger med hverandre (hydrogenbindinger, elektrostatiske bindinger, hydrofob interaksjon og kovalente bindinger). Dette, i tillegg til at peptidbindingen er bevegelig, gjør at det ofte dannes typiske, lokale strukturer med repeterende mønster innen kjeden. Slike områder utgjør enzymets sekundærstruktur. Den mest vanlige av disse sekundærstrukturene er α-heliksen, hvor peptidkjeden lokalt danner en høyredreid spiral som er stabilisert via hydrogenbinding mellom nitrogen i en aminosyre og oksygen (fra en karbonylgruppe) fire aminosyrer lenger opp i kjeden. I enzymer er vanligvis ca. 1/4 av alle aminosyrene lokalisert i α-helikser. En annen viktig struktur er såkalt β-konformasjon. Her danner peptidkjeden en "sikk-sakk"-struktur, hvor flere deler av polypeptidet med en tilsvarende struktur kan legge seg inntil hverandre som et "teppe" kalt β-sheet. α-helikser er stabilisert med hydrogenbindinger mellom NH og C-O i hovedkjeden Heliksene kan være høyredreid eller venstredreid Prolin eller glycin er ikke forenlig med α-helikser 3.6 aminosyrer pr runde Sidegruppene peker utover, og vil avgjøre heliksens egenskaper α-heliks-struktur β -sheet

7 6 Disse områdene er igjen satt sammen som "blokker" til en endelig tredimensjonal struktur, enzymets tertiærstruktur. Mange enzymer består også av flere like eller ulike polypeptidkjeder (oligomere enzymer), og dette kalles enzymenes kvartenærstruktur. (bare atomene i hovedkjeden er vist) (pilene angir retningen i hver peptidkjede) β-sheet-struktur En vanlig måte å angi enzymers tertiærstruktur på er en oversikt over alle områdene med sekundærstrukturer, og hvordan disse er plassert i forhold til hverandre. Eksemplene over viser tydelig at naturen ofte gjenbruker kombinasjoner av sekundærstrukturer i stedet for å finne opp nye Det aktive setet Oftest har enzymene en globulær struktur, og substratene enzymene virker på er som regel mye mindre enn enzymene selv. Hvert enzym har en unik tertiærstruktur, og på enzymets overflate finnes et mindre område (eller av og til flere) som kalles det katalytiske setet. I dette setet sitter nøkkelen til enzymets spesifisitet, i det det har en form som er tilpasset substratet omtrent på samme måte som et nøkkelhull passer til en bestemt nøkkel. Dette er kjent som "key and lock-modellen". Det katalytiske setet utgjør som regel en fordypning i enzymets overflate, og inne i denne fordypningen sitter det aminosyrer med kjemiske egenskaper som gjør det mulig å katalysere endringer i substratet. Disse aminosyrene behøver ikke å sitte i nærheten av hverandre langs

8 7 enzymets polypeptidkjede, men er oftest bragt inn i en korrekt orientering i forhold til hverandre ved folding av den samme kjeden. I tillegg til det aktive setet finner en i tillegg gjerne ett eller flere substratbindingsseter, som sørger for å binde substratet og holde det på plass i en korrekt orientering mens katalysen skjer. Regionen som inneholder det katalytiske setet og substratbindingssetet, kalles med en fellesbetegnelse det aktive setet. Det er viktig å merke seg at i mange enzymer har ikke det katalytiske setet en korrekt struktur før selve bindingen har skjedd. Bindingen av substratet medfører derimot en konformasjonsendring i enzymet, slik at det katalytiske setet bringes i korrekt orientering i forhold til den reagerende gruppen i substratet. Dette kalles "induced-fit"-modellen. Slik unngås det at molekyler og reaktive grupper som ligner substratet skal kunne reagere med det aktive setet på en uspesifikk måte. Skjematisk fremstilling av "induced-fit"- og lock and key -modellene. RG = reagerende gruppe i substratet, BG = bindende gruppe i substratet, KS = katalytisk sete, BS = substratbindingssete. NAVNGIVING AV ENZYMER For ca. 100 år siden, da bare en håndfull enzymer var kjent, ble disse navngitt ved å føye endelsen - ase til navnet på substratet enzymet virket på. Slik ble enzymer som hydrolyserte fett, stivelse og proteiner kalt henholdsvis lipaser, amylaser og proteaser. Siden den tid har imidlertid flere tusen nye enzymer blitt identifisert, og det oppsto snart et behov for en mer nøyaktig klassifisering av de ulike enzymene. Fremdeles benyttes endelsen -ase, men dagens navngiving angir i tillegg den type kjemisk reaksjon enzymet katalyserer. Følgelig kalles for eksempel enzymer som fjerner hydrogen, dehydrogenaser, og enzymer som katalyserer overføringsreaksjoner, transferaser. I 1964 publisterte en enzymkommisjon opprettet av den internasjonale biokjemiunionen (IUB) et klassifiseringssystem som danner basis for den klassifisering vi bruker i dag. Her er enzymene gitt to navn. Det første angir substratet, og det andre (som ender på -ase), angir typen reaksjon som katalyseres. Hvert enzym er her også gitt et nummer bestående av 4 tall, f eks E.C (E.C. = Enzyme Commission). Det første tallet angir hvilken hovedklasse enzymet tilhører, og kan angi en av følgende 6 hovedklasser: 1. Oksydoreduktaser Oksydasjons- og reduksjonsreaksjoner 2. Transferaser Overføring av et atom eller en kjemisk gruppe mellom to molekyler (når reaksjonen ikke faller inn i en av de andre gruppene)

9 8 3. Hydrolaser Hydrolytiske reaksjoner (inngår reaksjon med vann) 4. Lyaser Fjerning av en gruppe fra et substrat (unntatt hydrolyse) 5. Isomeraser Isomeriseringsreaksjoner 6. Ligaser Binding av to molekyler (koblet til en avspalting av pyrofosfat fra et nukleosid trifosfat - en prosess som frigjør energi) De tre neste tallene har noe ulik betydning alt etter hvilken hovedklasse enzymet tilhører, og kan f. eks. angi type reaksjon (for isomeraser), type substrat, hvilke bindinger som brytes osv. Likevel gir ikke dette systemet en helt perfekt angivelse, da det i mange tilfeller finnes ulike enzymer (isoenzymer) som kan utføre den samme reaksjonen. Et eksempel på dette er enzymet laktat dehydrogenase, hvor det i mennesket finnes 5 ulike isoenzymer. I slike tilfeller må en derfor føye til en benevnelse for type isoenzym til E.C.-nummeret. Selv om E.C.-klassifiseringen gir en nøyaktig beskrivelse av de ulike enzymene, blir ofte navngivingen så komplisert at en til daglig bruker trivialnavn på en rekke enzymer. Laktat dehydrogenase er et slikt eksempel, som ifølge E.C.-klassifiseringen heter L-laktat NAD + oksydoreduktase (E.C ). COENZYMER Svært mange enzymer krever, i tillegg til et substrat, et ekstra molekyl for å kunne ha katalytisk funksjon. Disse molekylene er ofte små, organiske forbindelser som sitter relativt løst bundet til enzymet, og kalles coenzymer (enkelte kan også danne kovalente bindinger med enzymet, og kalles da en prostetisk gruppe). På mange måter kan det være riktig å betrakte et coenzym som et substrat nummer to, da det oftest deltar i selve reaksjonen og kan omdannes til en biologisk viktig form i løpet av reaksjonen. Et godt eksempel er reaksjonen som overfører pyrodruesyre (pyruvat) til melkesyre (laktat) når muskler arbeider anaerobt (ved liten tilgang på oksygen). Ved anstrengelse foregår det en aerob omsetning i musklene inntil all O 2 er forbrukt. Deretter skjer det en anaerob omsetning hvor det dannes laktat. Laktat diffunderer ut av musklene og transporteres med blodet til leveren hvor det oksyderes tilbake til pyruvat som omsettes videre aerobt. Dette kalles Cori-syklus. Glukose Glukose Pyrodruesyre Muskel Pyrodruesyre Lever NADH + H + NADH + H + NAD + NAD + Melkesyre Melkesyre

10 9 Reaksjonen i både muskler og lever katalyseres av det tidligere nevnte enzymet laktat dehydrogenase. Laktat dehydrogenase i muskler har en relativt lav affinitet for pyruvat, men i og med at produktet laktat diffunderer ut til blodet, vil denne reaksjonen likevel drives i retning laktat (pyruvat nedbrytes). Samtidig med at pyrodruesyren reduseres til melkesyre, oksyderes et coenzym, NADH til NAD + (NAD + /NADH = oksydert/redusert form av nikotinamid adenin dinukleotid). NAD + kan igjen brukes under den energigivende nedbrytningsprosessen av glukose (glykolysen), som ellers ville ha stoppet opp under anaerobe forhold. Denne enzymprosessen har derfor som hovedformål å produsere oksydert coenzym. Selve reaksjonen er skissert under. Eksempel på coenzym. Idet laktat dehydrogenase reduserer pyrodruesyre til melkesyre, oksyderes coenzymet NADH til NAD +. I leveren vil en ikke ha en diffusjon av laktat. her vil derfor reaksjonen gå mot pyruvat (nedbrytning av laktat). Denne reaksjonen drives også ved at pyruvat etter hvert omsettes til glukose. ISOENZYMER Laktat dehydrogenase er et eksempel på at enzymer som katalyserer samme kjemiske reaksjon kan ha noe forskjellig struktur. Dette kalles isoenzymer. Laktat dehydrogenase består av 4 underenheter, som hver kan være av H- eller M- type. dermed oppstår mulighet for 5 ulike isoenzymer, H 4, H 3 M, H 2 M 2, HM 3 og M 4 (Disse kalles LD1-5 til vanlig). I skjelettmuskulatur og lever finnes hovedsakelig LD5, mens LD1 dominerer i hjertemuskulatur. LD1 har høy affinitet (lav K M ) for pyruvat, og inhiberes i tillegg av høye konsentrasjoner av pyruvat. I motsetning til i skjelettmuskulaturen vil det i hjertet være den aerobe omsetningen som dominerer. En vil ikke få vesentlig dannelse av laktat selv ved kraftig økt belastning, siden opphopning av pyruvat vil hemme LD1 slik at laktat ikke dannes. Mange av kroppens enzymer opptrer som isoenzymer i ulike organ. Hvis forhøyete mengder av et enzym oppdages i f. eks. blodprøver, kan en nærmere analyse av hvilket isoenzym som er endret, gi en indikasjon på hvilket organ som er sykt eller skadd.

11 10 FYSIOLOGISKE FORHOLD SOM PÅVIRKER ENZYMERS AKTIVITET Siden aktiviteten i enzymer er avhengig av en korrekt tredimensjonal folding av polypeptidkjeden, kan faktorer som påvirker denne foldingen ha alvorlige konsekvenser for enzymaktiviteten. Høye konsentrasjoner av f. eks. Na + - eller Cl - - ioner kan bryte ionebindingene som opprettholder enzymets tredimensjonale struktur, og derved påvirke den katalytiske aktiviteten i det aktive setet og/eller enzymets evne til å gjenkjenne og binde til substratet. ph-verdien i det omgivende mediet kan også påvirke strukturen, og de fleste enzymer har derfor høyest aktivitet innen et bestem phområde - enzymets ph-optimum. Pepsin, et fordøyelsesenzym som finnes i magesekken hos mennesker (der ph er lav), har for eksempel optimum nær ph 2, mens et annet fordøyelsesenzym, trypsin, som finnes i tynntarmen (der ph er høy), har optimum ved ph 8. Slik er enzymene spesialtilpasset forholdene i de organene de har sin funksjon. Levende celler og organismer har også en rekke mekanismer for å opprettholde salt- og H + -konsentrasjonene innen bestemte områder for å beskytte strukturen og funksjonen til viktige enzymer. Temperatur kan også ha en dramatisk virkning på enzymer, og store temperaturvariasjoner kan verste fall ødelegge strukturen (enzymene denatureres). Slike ekstreme variasjoner opptrer vanligvis ikke i organismen, men f. eks. i industrielle enzymatiske prosesser er dette av stor betydning. Likevel kan endringer i kroppstemperaturen, som ved feber, endre hastigheten i mange enzymkatalyserte reaksjoner. Dette kan en også benytte seg av i klinisk øyemed. Ved å senke kroppstemperaturen, vil en også nedsette hastigheten i enzymreaksjonene, og dermed også nedsette den metabolske omsetningen i forbindelse med f. eks. hjerteoperasjoner eller organtransplantasjoner. REGULERING AV ENZYMAKTIVITET Enzymer sørger for å styre de metabolske prosessene i alle celler, og en unormal endring i mengden eller aktiviteten av et enzym vil raskt kunne få katastrofale følger. Svært mange sykdommer karakteriseres da også av en abnormal regulering av bestemte enzymereaksjoner. En skiller ofte mellom 3 hovedmekanismer celler benytter seg av for å regulere hastigheten i enzymkatalyserte reaksjoner. Disse er: 1. Endring av mengden av det aktuelle enzymet 2. Endring av mengden av andre reaktanter i enzymreaksjonen (substrat, produkt, coenzym mm.) 3. Endring av den katalytiske effektiviteten i enzymet

12 11 Endring av enzymmengde Enzymer produseres og brytes ned kontinuerlig i cellen. Disse to prosessene er uavhengig av hverandre, og styres igjen av andre enzymer. Syntesen av et bestemt enzym starter ofte ved at et bestemt molekyl, en "inducer", aktiverer genet som koder for enzymet. Induceren kan være substratet for enzymet, et molekyl som ligner på substratet, eller også noe annet. Ofte kan inducere binde til repressorer, molekyler som er bundet til "styringssekvenser" i genene som koder for enzymene, og som hindrer produksjon av enzymet. Når induceren binder til repressoren, vil repressoren løsne, og genet avskrives slik at nytt enzym dannes. Enzymer som induseres på denne måten, kaller vi induserbare enzymer. Andre enzymer, gjerne de som har de mest sentrale funksjonene i cellen, produseres imidlertid kontinuerlig uten nærvær av en inducer og kalles konstitutive enzymer. Det viser seg imidlertid at selv i fravær av inducer vil det finnes et visst basalnivå av induserbare enzymer i cellen. Begrepene induserbar og konstitutiv må derfor betraktes som relative. Produksjonen av et bestemt enzym kan videre nedsettes via en prosess kalt represjon. Et vanlig tilfelle har en når produktet av en bestemt enzymreaksjon sørger for å nedsette produksjonen av enzymet. Slik represjon kalles "feedback" represjon. Enzymer er, som andre proteiner, utsatt for nedbryting via proteaser, som spalter peptidkjeden. Noen enzymer er svært utsatte for nedbrytning, og har derfor en kort halveringstid (t 1/2 ). Halveringstiden for ulike enzymer kan variere svært, fra noen minutter til mange døgn. Dette avhenger av hvilken funksjon enzymene har. Regulatorenzymer som kun skal være aktive i helt bestemte faser i cellesyklus (f. eks. mange kinaser) må derfor ha en nøye regulert levetid. Halveringstiden påvirkes også av en rekke faktorer i cellen. Felles for disse er at de påvirker enzymets konformasjon, slik at det gjøres mer eller mindre mottakelig for angrep fra proteaser. Både substrat, coenzymer og metallioner kan således påvirke enzymers halveringstid. En vanlig nedbrytningsvei for enzymer er ubiquitin-proteasom-veien. Her merkes et protein som skal nedbrytes med en kjede av flere ubiquitin-molekyler (ubiquitin = lite protein på 75 aminosyrer). Deretter transporteres det til såkalte proteasomer for proteolytisk nedbrytning. Proteasomene er store molekylære søppelkasser som fins både i cellekjernen og i cytoplasma. Endring av katalytisk aktivitet Mange enzymer foreligger ikke i sin mest aktive form i kroppen til vanlig, men kan raskt modifiseres til en aktiv form ved behov. Eksempler på dette er såkalte proenzymer, som kan gjennomgå en begrenset proteolyse slik at det aktive setet blir mottakelig for substratet. Typiske eksempler på slike enzymer finner vi blant fordøyelsesenzymene og enzymer som deltar i blodkoaguleringsprosessen.

13 12 Protease Substrat Proenzym (Aktivt sete ikke tilgjenge li ) Modent enzym (aktivt sete tilgjengelig) Proteolytisk spalting av et proenzym til katalytisk aktivt enzym Enzymers aktivitet kan også påvirkes ved kovalent modifikasjon. Det vil si at nye molekyler bindes kovalent til enzymet og endrer dets aktivitet. En typisk mekanisme for slik regulering i mammalske celler, er addisjon av fosfatgrupper til bestemte aminosyrer (spesielt serin, treonin og tyrosin) langs polypeptidkjeden. Karbohydrat-, lipid- og acetylgrupper kan også bindes kovalent til enzymet og endre aktiviteten. Flere enzymer oppnår først katalytisk aktivitet når de foreligger som en oligomer. Dvs. flere separate enzymmolekyler settes sammen til et kompleks. Underenhetene kan enten være like, eller ha forskjellig struktur. Laktat dehydrogenase er et eksempel på sistnevnte. Dette enzymet foreligger i sin monomere form i to forskjellige typer, H- og M-formen, og ingen av disse er katalytisk aktive. Kombineres derimot 4 enheter til en tetramer, oppnås full enzymaktivitet. Alle kombinasjoner av H- og M-formen er imidlertid mulige, slik at dette enzymet kan foreligge som 5 ulike isoenzymer. Et annet eksempel er enzymet fettsyre-syntase. Dette enzymet består av to like underenheter, som hver katalyserer en rekke av de kjemiske reaksjonene som inngår i syntesen av fettsyrer. For cellen er dette et meget effektivt og økonomisk system, hvor substratet raskt kan omsettes gjennom flere trinn uten å måtte transporteres rundt i cellen. En egen klasse enzymer som kan påvirkes av andre molekyler er såkalte regulatorenzymer. Slike finner vi ofte i nøkkelposisjoner i metabolske prosesser i cellene. I cellemetabolismen virker ofte grupper av enzymer sammen for å katalysere mange sekvensielle trinn i en metabolsk prosess. I slike reaksjoner fungerer reaksjonsproduktet i ett enzymatisk trinn som substratet i neste trinn osv. Den totale hastigheten i prosessen vil her være begrenset av det reaksjonstrinnet som har lavest hastighet, og dette trinnet styres av regulatorenzymet i prosessen. Dette enzymet vil ofte kunne påvirkes av såkalte signalmolekyler eller allosteriske effektorer, som enten øker eller senker katalysehastigheten. Disse signalmolekylene kan f. eks. være cofaktorer eller mellomprodukter i den samme enzymatiske prosessen. Enzymer som har bindingsseter for slike modulatorer kalles også allosteriske enzymer (og bindingssetet for modulator kalles allosterisk sete).

14 13 I noen metabolske prosesser vil regulatorenzymet kunne inhiberes av endeproduktet i reaksjonen. Dette er økonomisk for cellen, i det den slipper å bruke energi på å produsere unødvendig store mengder av produktet. En slik mekanisme kalles allosterisk feedback inhibering, og må skilles fra den tidligere omtalte feedback represjon av selve enzymproduksjonen. Enzymer er ofte lokalisert til bestemte organeller inne i cellen En viktig mekanisme for intracellulær regulering av enzymaktivitet er lokalisering av enzymet til de deler av cellen hvor de aktuelle reaksjonene skal utføres. Enzymer som f. eks. reagerer med DNA, vil først dannes i cytoplasma, for deretter raskt å transporteres til kjernen (eller til mitokondriene, som også inneholder DNA). Mange enzymer kan ha en skadelig effekt på cellen hvis de "flyter fritt" omkring. En rekke fordøyelsesenzymer er i cellen lokalisert til bestemte organeller kalt lysosomer, omsluttet av en egen membran slik at resten av cytoplasma ikke angripes av disse enzymene. Næringspartikler eller bakterier som tas opp av cellen vil imidlertid kunne smelte sammen med lysosomene, slik at de lysosomale enzymene kan bryte ned de ulike komponentene i partikkelen. Et sentralt spørsmål er hvordan cellen kan vite hvilke enzymer som skal transporteres hvor. En har oppdaget at enzymer som skal transporteres til bestemte organeller, inneholder bestemte signalelementer som starter denne transporten. Signalet kan for eksempel være en helt spesiell aminosyresekvens i polypeptidkjeden, eller karbohydratgrupper som sitter på enzymets overflate. Ofte skjer selve transporten mens enzymet fremdeles er inaktivt. I det enzymet transporteres over membranen i målorganellen, kan det imidlertid spaltes av en mindre sekvens slik at enzymet blir aktivt. ENZYMKINETIKK Aktiveringsenergi Biokjemiske reaksjoner kan bare foregå spontant på en slik måte at den frie energien i systemet (ΔG = den energien som er i stand til å utføre arbeid) nedsettes. Slike reaksjoner krever likevel ofte at en viss aktiveringsenergi overskrides før reaksjonen kan skje. Denne energien må tilføres fordi reaksjonene ofte skjer gjennom dannelsen av ustabile mellomprodukter eller transisjonstilstander. Enzymenes funksjon i denne sammenhengen er at de kan bidra til å danne alternative og mer stabile transisjonstilstander, slik at aktiveringsenergien nedsettes. I praksis vil dette si at likevektskonstanten i en reaksjon forblir uforandret, men at likevekten nås mye raskere i en katalysert reaksjon. En skal merke seg at bare en liten nedsettelse av aktiveringsenergien kan føre til at reaksjonen foregår flere tusen ganger raskere.

15 14 Forandringer i den frie energien (ΔG) i en reaksjon, og effekten av enzymer på aktiveringsenergien Utledning av Michaelis-Menten ligningen Michaelis og menten utledet i 1913 et matematisk uttrykk for sammenhengen mellom substratkonsentrasjon [S], reaksjonens utgangshastighet (V o ) og reaksjonens maksimale hastighet (V max ). De antok videre at en stabil transisjonstilstand i en enzymreaksjon dannes ved at enzymet (E) og substratet (S) danner et enzym-substrat-kompleks (ES), som så igjen kan spaltes til fritt enzym og produkt (P). Denne reaksjonen kan skrives som følger (hvor k er hastighetskonstanten for de ulike reaksjonene): k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 k -2 Helt i starten av reaksjonen vil konsentrasjonen av P være så lav at den kan neglisjeres. Ligningen forenkles derfor til: k 1 k 2 E + S ES E + P k -1

16 15 Reaksjonshastigheten i starten på reaksjonen (V o ) vil her være lik hastigheten av nedbrytning av ES til E+P: V o = k 2 [ES] 1) Siden enzym-substratkomplekset (ES) er svært vanskelig å måle eksperimentelt, kan en i stedet benytte den totale enzymmengden i reaksjonen, E t. mengden fritt enzym kan derfor skrives som [E t ] - [ES]. Videre, siden substratkonsentrasjonen [S] normalt er mye større enn den totale enzymkonsentrasjonen [E t ], kan en anta at mengden substrat bundet til enzymet vil være neglisjerbart i forhold til den totale substratkonsentrasjonen. Utledning av et uttrykk for V o kan derved gjøres ut fra verdier som er lett målbare på følgende måte: Først settes hastighetene for dannelse og nedbrytning av ES opp som følger: Hastigheten for dannelse av ES = k 1 ([E t ] - [ES]) [S] 2) Hastigheten for nedbryting av ES = k -1 [ES] + k 2 [ES] 3) En antar videre at i begynnelsen av reaksjonen har en en tilstand hvor hastighetene for nedbrytning og dannelse av ES er like. Dette kalles "steady-state" antakelsen. Derved får en: k 1 ([E t ] - [ES]) [S] = k -1 [ES] + k 2 [ES] 4) Løser en denne ligningen med hensyn på [ES], får en: [ES] = k 1 [E t ][S] k 1 [S] + k -1 + k 2 5) Uttrykket (k 2 + k -1 )/k 1 kalles Michaelis-Menten konstanten (K m ), og når denne settes inn i ligningen over, får en: [ES] = [E t ][S] K m + [S] 6) Setter vi dette uttrykket for [ES] inn i ligning 1), får vi nå: k 2 [E t ][S] Vo = Km + [S] 7) Siden reaksjonen vil oppnå sin maksimale hastighet V max når enzymet er mettet med substrat, dvs. når [Et ] = [ES], kan en sette Vmax = k 2 [E t ] inn i ligning 7, og får:

17 16 Vmax[S] Vo = Km + [S] 8) Som kalles Michaelis-Menten ligningen, og er hastighetsligningen for en enzymreaksjon med ett substrat. En ser her at når V o = V max /2, er K m = [S]. En ser altså at K m er den substratkonsentrasjonen (mol/liter) som gir halvparten av den maksimale reaksjonshastigheten. Dette illustreres av figuren nedenfor: Effekten av substratkonsentrasjonen på hastigheten i en enzymkatalysert reaksjon Når substratkonsentrasjonen [S] økes mens alle andre parametre holdes konstant, vil reaksjonshastigheten (V o ) til å begynne med øke proposjonalt med [S], og en sier at en har 1. ordens kinetikk. Økes [S] ytterligere, vil V o etter hvert øke inntil en maksimalverdi (V max ), og en sier da at enzymet er "mettet" med substrat og en har 0. ordens kinetikk. Selv om en nå øker [S] ytterligere, vil ikke hastigheten øke, siden substratet som regel er tilstede i stort molart overskudd i forhold til enzymet. NB! Det er viktig å være klar over at over hele konsentrasjonsområdet av [S], vil den initielle reaksjonshastigheten alltid være proposjonal med enzymkonsentrasjonen. K m kan variere sterkt mellom ulike enzymer, og nedenfor er det gitt noen eksempler på ulike K m - verdier for noen enzymer. Legg merke til at ett enzym kan ha svært ulik K m for katalyse av ulike substrat: Enzym Substrat K m (mm) Katalase H 2 O 2 25 Heksokinase (hjerne) ATP 0.4 D-glukose 0.05 D-fruktose 1.5 Chymotrypsin Glycyltyrosinglycin 108 N-bensoyltyrosinamid 2.5 β-galaktosidase Laktose 4.0

18 17 V max vil også variere for ulike enzymer. I enzymreaksjonen vi brukte for å utlede Michaelis-Menten ligningen, ser vi at det hastighetsbegrensende trinnet er dissosiasjon av ES til E+P (k 2 er begerensende) Mange enzymreaksjoner følger imidlertid ikke en slik mekanisme, og ofte kan flere substrat og produkt inngå i reaksjonen. I slike tilfeller kan kinetikken bli svært komplisert. For å gjøre bildet litt klarere, har en innført begrepet k cat for å beskrive hvilke trinn i en enzymreaksjon som er hastighetsbegrensende. I vårt eksempel er altså k cat = k 2, og sammenhengen mellom V max og kcat vil være V max = k cat [E t ]. For mange enzymreaksjoner kan k cat være sammensatt av hatighetskonstantene for flere delvis hastighetsbegrensende trinn. k cat kalles også ofte enzymets turnovertall. Dette tallet angir hvor mange molekyler substrat ett enzymmolekyl kan omsette til produkt pr sekund. Nedenfor er det gitt eksempler på turnovertallet for noen enzymer: Enzym Substrat k cat (sek -1 ) Katalase H 2 O Acetylcholinesterase Acetylcholin b-laktamase Benzylpenicillin RecA protein (ATPase) ATP 0.4 Når den katalytiske effektiviteten av et enzym skal beskrives, er hverken K m eller k cat helt tilfredsstillende. En har imidlertid funnet at forholdet mellom disse to (k cat / k m ) gir et brukbart mål ved sammenligning av katalytisk effektivitet mellom ulike enzymer. Verdien for k cat / k m er vanligvis i størrelsesorden M -1 sek -1. Verdien er begrenset av hvor raskt enzym og substrat kan diffundere og oppnå kontakt i en vandig løsning. Denne diffusjons-kontrollerte grensen ligger vanligvis mellom M -1 sek -1 (avhengig av type molekyler, temperatur, løsningens sammensetning mm), og en ser at k cat / k m ofte vil ligge tett opp til denne grensen. Bestemmelse av Km K m er et mål for et enzyms affinitet til substratet ved en bestemt temperatur, ph og ionekonsentrasjon, og er derfor viktig å bestemme under karakteriseringen av et bestemt enzym. Ved å overføre Michaelis-Menten-ligningen på en annen form, kan en benytte denne til å bestemme K m på en enkel måte: 1 1 K m 1 V o = V max + V max [S] Denne ligningen kan uttrykkes grafisk ved å plotte 1/Vo mot 1/[S] som vist under:

19 18 1 V 0 1 V max 1 K m 1 [S] Lineweaver-Burk plot for enzymkatalyserte reaksjoner Ved ekstrapolering av denne kurven finner en at den skjærer ordinaten i 1/V max og abscissen i - 1/K m. Begge disse størrelsene kan derfor bestemmes uten at det er nødvendig å bruke så store substratkonsentrasjoner at reaksjonshastigheten når V max. En nøyaktig bestemmelse av K m forutsetter imidlertid at målingene foretas over et stort konsentrasjonsområde. Inhibitorer En rekke stoffer kan reagere med enzymer og derved nedsette hastigheten i reaksjonen. Slike forbindelser kaller vi inhibitorer. Inhibitorer kan virke på enzymet på forskjellig måte, og de vanligste mekanismene er 1.Kompetitiv inhibering: Inhibitoren konkurrerer her med substratet om det aktive setet i enzymet. Normal reaksjonshastighet kan igjen oppnås ved å øke substratkonsentrasjonen. Slik inhibering har ingen effekt på V max, mens K m vil øke. 2.Non-kompetitiv inhibering. Inhibitoren binder enten irreversibelt til det aktive setet, eller den virker på et allosterisk sete i enzymet (et sete utenfor det aktive setet, og som har betydning for enzymets aktivitet). Normal reaksjonshastighet kan ikke gjenopprettes ved å øke substratkonsentrasjonen. Slik inhibering har ingen effekt på K m, mens V max vil reduseres. Ser vi på et Lineweaver-Burk plot av inhibierte reaksjoner, vil disse ha et typisk mønster avhengig av type inhibering:

20 19 1 V 0 Non-kompetitiv inhibering Kompetitiv inhibering 1 K m 1 V max Uten inhibitor 1 [S] Lineweaver-Burk plot ved inhibering av enzymreaksjonen Ved kompetitiv inhibering vil kurven skjære kurven for ikke-inhibert reaksjon ved uendelig stor substratkonsentrasjon (1/[S] = 0), og K m vil tilsynelatende bli høyere. Den non-kompetitivt inhiberte reaksjonen vil imidlertid ha samme K m som den ikke-inhiberte reaksjonen (1/V o = 0). Et forsøk med inhibering av enzymaktivitet vil også bli gjennomført på kurset En skal deretter prøve å bestemme type inhibering ut fra et Lineweaver-Burk plot. Substratanaloger som binder reversibelt til det katalytiske setet og virker som kompetitive inhibitorer, har stor betydning i klinisk sammenheng. Eksempler på slike inhibitorer er arac (Cytosar) som brukes mot visse typer leukemi og virusinfeksjoner. AraC er en analog til nukleosiden deoksycytidin, som i sin fosforylerte form (dctp) er en av de 4 byggesteinene i DNA. Forskjellen på disse er at ribosegruppen er skiftet ut med en arabinosegruppe). AraC virker blant annet som kompetitiv inhibitor på DNA-polymerase, slik at DNA-replikasjonen hemmes. Denne effekten vil ha størst konsekvenser for de celler som er i raskest vekst (DNA-et skal replikeres en gang pr cellegenerasjon), som kreftceller, og virus. En annen nukleosidanalog er AZT (analog til deoksytymidin) som brukes mot AIDS. MÅLING AV ENZYMAKTIVITET For å kunne angi hvor mye det finnes av et bestemt enzym i en løsning (f. eks. blod, urin eller cellehomogenat) er en avhengig av å ha en bestemt målemetode (enzymassay) for enzymet. Det finnes et utall målemetoder for ulike enzymer, men de fleste metodene har vanligvis en del likhetstrekk: 1. Målingene må utføres under nøye kontrollerte betingelser mhp. temperatur, ionestyrke, ph, og løsningens øvrige sammensetning. De fleste assay utføres enten ved 25 o C, 30 o C eller 37 o C.

21 20 2. Konsentrasjonen av substrat holdes konstant. Ideelt bør en ligge på substratkonsentrasjoner som gir metning av enzymet, men dette lar seg vanligvis ikke gjennomføre i praksis 3. Hvis målingen foretas som en enkeltmåling, må en være sikker på at enzymreaksjonen (dannelsen av P) har et lineært forløp i tiden frem til måling foretas. 4. Hvis produktet som dannes har distinkte egenskaper (farge eller UV-absorbsjon) kan mengden produkt måles direkte i et spektrofotometer. En har da et kontinuerlig assay. Det kan også være nødvendig å skille produktet fra substratet (f. eks. ved felling) før måling foretas. En har da et diskontinuerlig assay. Hvis produktet ikke har egenskaper som gjør at målinger kan foretas på en enkel måte, kan et alternativ være å koble reaksjonen til en sekundær indikatorreaksjon. Dette kalles et koblet assay. Koblete enzymassay Hvis produktene i en enzymreaksjon ikke lar seg måle direkte, kan en koble reaksjonen til en indikatorreaksjon. Et slikt eksempel er et enzymassay for alanin aminotransferase (ALAT). Dette enzymet katalyserer følgende reaksjon: ALAT Laktat dehydrogenase L-alanin + 2-oksoglutarat L-glutamat + pyrodruesyre Laktat NADH + H + NAD + I det første reaksjonstrinnet dannes det ikke noe farget produkt, og ingen av produktene har særlig høy absorbsjon av UV-lys. Reaksjonen kan likevel følges spektrofotometrisk hvis produktet pyrodruesyre blir brukt som substrat for enzymet laktat dehydrogenase i en indikatorreaksjon. Coenzymet NADH omdannes her (som tidligere beskrevet) til NAD +. Idet NADH absorberer lys ved 340 nm, mens NAD + ikke absorberer ved denne bølgelengden, kan reaksjonen følges som fall i absorbsjon ved 340 nm. For at indikatorreaksjonen skal gi et riktig bilde av den primære reaksjonen kreves imidlertid at laktat dannes effektivt. Dette kan gjøres ved å velge en av isoenzymene av laktat dehydrogenase som har større affinitet for pyruvat enn laktat (som diskutert tidligere). Slike koblete reaksjoner har fått stadig større utbredelse med utviklingen av hurtigtester for klinisk analyse av enzymer. For flere enzymer er det også laget såkalte teststrips, hvor denne kan dyppes i f. eks blod eller urin, og enzymaktiviteten avleses som en fargereaksjon etter et bestemt tidsrom. Selv om en slik reaksjon tilsynelatende virker enkel, er det ofte en komplisert biokjemisk prosess som ligger til grunn for resultatet som avleses. I en av øvingsoppgavene på kurset vil bruk av slike teststrips for blant annet måling av glukose i urin bli demonstrert. Her er det ikke et enzym som kvantifiseres. Glukosenivået bestemmes imidlertid fra en fargereaksjon som fremkommer etter en enzymatisk reaksjon inne i selve teststripen.

22 21 Angivelse av enzymaktivitet Enzymaktivitet angis som mengde omsatt substrat eller dannet produkt pr tidsenhet. IUB definerte i 1961 en enhet enzym (U) som den mengden enzym som forårsaker tap av 1 μmol substrat pr min under spesifiserte betingelser. I 1973 ble det imidlertid innført ytterligere en betegnelse, katal, som angir den mengden enzym som forårsaker tap av 1 mol substrat pr sekund under spesifiserte betingelser. Katal er i dag den offisielle SI-enheten, men begge betegnelsene er i vanlig bruk. Spesifikk aktivitet Når en f. eks. tar vevsprøver for måling av enzymaktivitet, vil en ofte få svært varierende verdier alt etter hvilken del av et bestemt vev som tas ut. Dette kommer av at ulike deler av vevet kan inneholde ulike mengder protein. Enzymaktivitet pr gram vev er derfor en høyst uspesifikk angivelse. For å unngå dette problemet, kan enzymaktiviteten angis pr mengde totalprotein i den aktuelle prøven. Dette målet kalles den spesifikke enzymaktiviteten, og har benevnelsen units/mg protein. Det totale proteininnholdet kan måles på en rekke ulike måter, som UV-absorbans i et spektrofotometer, eller ved spesielle kjemiske reaksjoner (flere slike proteinassays finnes kommersielt tilgjengelig). Spesifikk aktivitet er også en uvurderlig betegnelse når en arbeider med rensing av enzymer. En økende grad av renhet (samt utbytte) kan således følges gjennom flere rensetrinn inntil helt rent enzym. ENZYMER SOM IKKE ER NATURLIGE PROTEINER Inntil for få år siden mente en at alle kjente enzymer var proteiner. Under studier av cellulær prosessering av RNA, ble det imidlertid oppdaget en gruppe RNA-molekyler som hadde enzymatisk aktivitet. Disse RNA-molekylene har fått navnet ribozymer. Oppdagelsen av disse molekylene har ført til en revurdering av den biologiske verden i de tidligste tider. De første celler kan faktisk ha bestått av RNA, protein og andre små molekyler nødvendig for å danne en cellevegg og for å transportere energi. DNA og protein-enzymer kan ha blitt utviklet senere i evolusjonen. De ribozymene en kjenner til foreløpig, er alle forbundet med kutting og spleising av RNAmolekyler. Det er også verdt å nevne en annen type enzymer, som riktignok er proteiner, men likevel klart skiller seg fra naturlige enzymer i sitt opphav. Utviklingen av teknologien for produksjon av monoklonale antistoffer har muliggjort syntesen av antistoffer som kan gjenkjenne overgangstilstanden i kjemiske reaksjoner. Vanligvis er overgangstilstandene svært ustabile, men en har lykkes å fremstille syntetiske, stabile analoger til slike overgangstilstander. ved å bruke disse syntetiske molekylene til immunisering av dyr og fremstilling av avtistiffer, har en faktisk oppnådd antistoffer som kan øke reaksjonsharigheten i kjemiske reaksjoner flere tusen ganger. Slike monoklonale antistoffer kalles mabzymer, og kan vise seg å få stor betydning innen både medisin og industri.

23 22 RENSING AV ENZYMER Celler inneholder flere tusen ulike enzymer og andre proteiner. For å kunne studere grunnleggende biologiske funksjoner til et enzym på en meningsfull måte, er det derfor oftest nødvendig å fjerne andre forbindelser i enzymløsningen som kan virke forstyrrende på undersøkelsene. I de tilfeller hvor enzymer skal produseres til medisinsk bruk i pasienter, er det også uhyre viktig å kunne produsere et enzym fritt for potensielle skadelige komponenter. Det eksisterer i dag et utall ulike metoder for rensing av enzymer og andre proteiner, men felles for disse er at de baserer seg ulikheter i bestemte egenskaper hos proteiner og andre makromolekyler. De viktigste av disse er ulikheter i løselighet, molekylvekt, konformasjon og ladning, samt om enzymet inneholder bestemte grupper som kan gjenkjennes spesifikt (av f. eks. antistoffer). Valg av rensemetode Når en renseprosedyre for et bestemt enzym planlegges, er det mange faktorer som vil påvirke valg av metoder. Under planleggingen må hvert av følgende punkter vurderes: 1. Hva skal enzymet brukes til? - Hvor mye trengs av sluttproduktet? - Hvor rent skal enzymet være? - Må aktiviteten bevares? 2. Har en utarbeidet en egnet målemetode for enzymaktiviteten? - Aktiviteten må oftest følges nøye under rensingen 3. Hva skal bufferene inneholde? - Viktig for enzymets løselighet, bindingsegenskaper til separasjonsmedier samt stabilitet. 4. Hvilket utgangsmateriale skal velges? - Hvor mye enzym finnes i utgangsmaterialet? - Må materiale dyrkes opp (cellekulturer) må optimale dyrkingsbetingelser utarbeides 5. Hvordan skal råekstraktet prepareres? 6. Hvordan skal ikke-proteiner som DNA, RNA, karbohydrater, lipider mm. fjernes? 7. Hvilke høy-kapasitets rensetrinn skal inngå? - Tjener til å oppkonsentrere materialet tidlig i prosedyren 8. Medium-kapasitets rensetrinn 9. Lav kapasitets rensetrinn - Utgjør den siste finrensingen av proteinet når det nærmer seg 100% renhet (homogenitet). Av dette ser en at valg av strategi for rensing kan være en svært omstendelig prosess, spesielt hvis det er første gang enzymet renses. Som oftest vil en imidlertid kunne finne eksempler på rensing av det aktuelle enzymet (eller nært beslektede enzym) i litteraturen, da flere tusen rensprosedyrer allerede er publisert. Dette vil ofte forenkle planleggingen betraktelig.

24 23 Preparering av råekstrakt Hvis en antar at en egnet kilde til rensing av enzymet er funnet, er det første trinn å fremstille et råekstrakt. Er det snakk om et vannløselig enzym som finnes fritt i cytoplasma, kan en mild "åpning" av cellene ved osmotisk sjokk, eller bruk av detergenter som destabiliserer cellemembranen, være tilstrekkelig. Finnes enzymet i bestemte organeller (som mitokondrier eller lysosomer), kan en betydelig rensing oppnås ved å separere sisse organellene via ulike sentrifugetrinn først. Enkelte enzymer kan også være membranbundet. Slike enzym har gjerne en hydrofob (ikke vannløselig) del som ligger "begravd" inne i cellemembranen. Her kan det ofte være snakk om å bruke sterke detergenter for å løse opp lipid/proteinkompleks, samt ekstraksjon med organiske løsningsmidler. Kromatografiske metoder Etter at et råekstrakt er fremstilt, vil det ofte være aktuelt å inkludere ett eller flere kromatografiske renstrinn. Her skal vi kort nevne prinsippene bak de viktigste av disse metodene: Ionebytterkromatografi Proteiner kan binde til ionebyttere via ladde grupper på proteinets overflate og grupper med motsatt ladning på ionebytteren: Anionbytter med utbyttbare motioner Kationbytter med utbyttbare motioner De ladde gruppene på ionebytteren er koblet til ulike materialer som agarose, cellulose og dextran. Disse er laget som partikler med et bestemt volum og porestørrelse. Det er vanlig å plassere ionebytteren i en kolonne (derav fellesbetegnelsen kolonne-kromatografi) suspendert i en buffer med bestemt ph og saltkonsentrasjon. Den vanligste anionbytteren er DEAE-cellulose (DEAE=dietylaminoetyl), som er positivt ladd ved ph 6-8. Hvis en passerer en enzymblanding (i en buffer med samme ph) over kolonnen, vil enzymer som er negativt ladd ved denne ph-verdien binde til ionebytteren i kolonnen, mens andre proteiner og makromolekyler vil passere. De bundete proteinene kan deretter elueres fra kolonnen ved f. eks. gradvis å endre ph eller saltkonsentrasjon i bufferen som pumpes over kolonnen. Tilsetter en en økende mengde salt, vil Cl - -ionene etter hvert "utkonkurrere" proteinene slik at disse slipper kolonnen og elueres ut. Øker en imidlertid ph-verdien i bufferen, avtar proteinenes negative ladning ved at H + -ioner tas opp i bestemte aminosyrer i proteinet. Når proteinets netto

25 24 overflateladning nærmer seg 0 (den ph dette skjer ved kalles proteinets isoelektriske punkt) vil proteinet løsne fra kolonnen og elueres. Tilsvarende prinsipp kjelder også for kationbyttere, men her er det en negativt ladd gruppe som sitter på cellulosen (oftest karboksymetyl). I ionebytterkromatografi kan relativt store volum ekstrakt påsettes, da det aktuelle enzymet vil binde til kolonnen etter hvert. Slike trinn kan derfor med fordel inngå på et tidlig stadium i en renseprosess. Gelfiltrering Dette er en annen svært viktig metode innen enzym- og proteinrensing. Her benyttes kolonner pakket med "kuler" med bestemt porestørrelse slemmet opp i en buffer. På sin vei gjennom kolonnen vil små molekyler kunne trenge inn i porene i kulene og derved bruke lang tid gjennom kolonnen. Større molekyler vil derimot i mindre grad kunne trenge inn i porene, og vil vandre raskt gjennom kolonnen. Ved å velge kuler med bestemt porestørrelse, kan en lage kolonner som er spesialtilpasset ulike størrelsesklasser av proteiner, og derved være egnet for det aktuelle enzymet som skal renses. I gelfiltrering kan bare mindre volum ekstrakt påsettes for å oppnå en god separasjon (da det aktuelle enzymet ikke bindes til kolonnen), og egner seg derfor til forholdsvis sene trinn i renseprosessen. Affinitetskromatografi Affinitetskromatografi baserer seg som ionebytterkromatografi, på binding til en matriks. Her er det imidlertid snakk om en biospesifikk binding, da bestemte grupper på matriksen (såkalte ligander) gjenkjenner og binder til bestemte regioner på enzymet. Den mest spesifikke bindingen får en innen immunoaffinitetskromatografi, hvor spesifikke antistoffer som kan gjenkjenne enzymet, kobles på en matrix. I slike tilfeller kan en i beste fall rense ut relativt rene enzymfraksjoner fra et stort volum urent råekstrakt som inneholder svært små mengder av det aktuelle enzymet. HPLC, FPLC mm I de senere år har stadig nye og forbedrete kolonner og kolonnematerialer blitt produsert, som har meget gode separasjonsegenskaper og i tillegg tillater rask separasjon. I HPLC (High Performance Liquid Chromatography) og FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) benyttes kolonner av rustfritt stål eller glass, fylt med partikler på 10 μm eller mindre som kan motstå høyt trykk. Hovedprinsippene for separasjonen er oftest som forklart i de foregående avsnitt, men det er utforming av kolonner og nye typer partikler i kolonnematriksen som gir økte separasjonsegenskaper. Ofte er det monodisperse partikler (sk. Ugelstad-kuler med helt lik størrelse) som benyttes, da dette gir helt uovertrufne egenskaper. I tillegg vil moderne HPLC/

26 25 FPLC-utstyr ha svært nøyaktige pumpe- og analyseutstyr inkorporert, som gjør det mulig å eluere proteiner med nøyaktig forhåndskalkulerte gradienter med f. eks. salt- eller ph. I begge disse kromatograferingsmetodene er det relativt små volum enzymekstrakt som kan påsettes, så metodene brukes gjerne som det avsluttende trinn i en renseprosedyre. KARAKTERISERING AV ENZYMER Har en renset et enzym, er en ofte interessert i å kartlegge enzymets biokjemiske egenskaper. Til dette finnes et utall ulike metoder, og vi skal her kort bare nevne noen av de viktigste. Polyakrylamid Gelelektroforese (PAGE) Hvis en blanding av proteiner settes på en gel av den kryssbundede polymeren polyakrylamid, og et elektrisk spenningsfelt deretter settes over gelen, vil ladde proteiner kunne vandre gjennom gelen mot polen med motsatt ladning. Jo sterkere ladning proteinet har, jo raskere vil det vandre. I tillegg vil størrelsen på proteinet påvirke vandringshastigheten, da små proteiner vil hindres mindre av friksjon gjennom gelen enn store molekyler. Ofte behandles proteinblandingen med SDS (natriumdodecylsulfat) før påsetting. SDS er en ionisk detergent som vil legge seg rundt proteinmolekylene slik at disse får en netto negativ ladning som er proposjonal med proteinets molekylvekt. Samtidig vil proteinene "strekkes ut" slik at de alle får tilnærmet samme form. Derved vil vandringshastigheten gjernnom gelen bli tilnærmet lik proteinenes molekylvekt. Etter at proteinene i blandingen har fått vandre en bestemt tid gjennom gelen, tas gelen ut og farges med et fargestoff for proteiner (f. eks. sølvsalter eller coomassieblått). En vil således kunne synliggjøre bånd av ulike proteiner i gelen. ved å sammenligne vandringen av proteinene i en kjent standardblanding, kan en på denne måten fastslå proteinets molekylvekt. På figuren under er det vist hvordan en slik gel kan se ut etter farging: