Membran-proteiner (Del 3.4) Poriner adskiller seg dramatisk fra andre integral proteiner. Finnes bl.a. i ytre membranen hos E.coli (se Figure 1-7). Poriner er med å beskytte bakterien mot toksiske forbindelser (antibiotika, proteaser), men tillater ved å danne kanaler i membranen, transport inn av næringstoffer og utskillelse av avfallstoffer. Viktig del av membran-oppbyggingen hos eukaryote celler er at polypeptid-kjeden hos noen integral proteiner ikke går inn i bilaget men er forankret til hydrokarbonkjeder inne i membranen (Figure 3-36). Dette gjelder bl.a. cytosoliske signalproteiner (Ras-protein) som er forankret gjennom farnesyl- og palmitat-grupper (Figure 3-36 b). Flere exoplasmatiske hydrolytiske proteiner er forankret i membranen i komplekse glykosylerte fosofolipider - f.eks. alkalisk fosfatase og Thy-protein som er forankret i glycosyl-phosphatidyl-inositol ; to fettsyre acyl-grupper, N- acetylglucosamin, mannose og inositol (Figure 3-36a). En annen og viktig gruppe perifere membranproteiner er fosfolipaser (bl.a. Fosfolipase A 2 ; Figure 3-37) som hydrolyserer ulike grupper i hodet på fosfolipider ved nedbrytning av gamle cellemembraner. Arbeides med av bl.a. Berit Johansen.
Membran-proteiner (Del 3.4) Figure 3-36 Figure 3-37
Forelesning Kap. 3 - knyttet til demonstrasjoner VELKOMMEN TIL PLANTEBIOSENTERET
Isolering og rensing av proteiner (Del 3.5) - detergenter På grunn av at proteinene varierer i størrelse må ulike metoder kombineres ved isolering og opprensing. Selv om proteiner varierer i aminosyresammensetning så er det i første rekke størrelsen (lengde og masse) dvs. fysiske karakterer som gir grunnlag for separasjon. Det samme gjelder nukleinsyrene. Proteinene fjernes fra cellemembranene ved bruk av detergenter eller løsninger med høye saltkonsentrasjoner. Detergentene f.eks. Triton X-100 og octylglucoside (ikke-ionisk) og SDS (ionisk) er amfifatiske molekyler som bryter opp fosfolipid-bilaget (Figure 3-38). Detergenter brukes mye som fettløselige midler og vaskemidler. Figure 3-38
Isolering og rensing av proteiner (Del 3.5) - detergenter Ved høyere konsentrasjoner danner detergenter miceller (sfæriske aggregater) med hydrofile deler pekende utover. Den kritiske micellekonsentrasjonen (CMC) er spesifikk for hver detergent (se Figure 3-39). Perifere proteiner fjernes fra membranoverflaten med løsninger med høy ionestyrke som bryter ned ionebindingene. Figure 3-39
Proteinrensing - sentrifugering Sentrifugering er første trinn ved isolering og opprensing av proteiner og er basert på ulikheter i masse dvs. vekt eller tetthet (forholdet vekt/volum). Sentrifuger kan gi opptil 600.000xg og mer enn 60.000 rpm - dvs. nok til å sedimentere masser større enn 10.000 dalton (Da). Immunoglobuliner er fra 153.000 Da (Ig G) til 1.000.0000 Da (Ig M) mens lysozym er 15.000 Da. Sentrifugering har to mål : 1. Preparativ - separere en type fra en annen og 2. Analytisk - måle fysiske egenskaper (molekylvekt, tetthet, form). Sedimentasjonskonstanten er viktig. Differensiell sentrifugering - skiller løselige proteiner fra uløselig cellemateriale (se Figure 3-40 a); pellet og supernatant Rate-Zonal sentrifugering - skiller partikler som er ulike i masse men like i form og tetthet (se Figure 3-40 b). Bruker en tetthetsgradient f.eks. sukrose. Likvekts-tetthetsgradient-sentrifugering brukes for separasjon av DNA og organeller.
Proteinrensing - sentrifugering Figure 3-40
Proteinrensing - elektroforese Elektroforese er en teknikk for separasjon/oppløsning av proteiner basert på ulikheter i ladning:masse. Benyttes til separasjon av aminosyrer og nukleotider. SDS-PAGE (SDS-polyacrylamid-elektroforese) - geler av polyacrylamid kan varieres mht porestørrelse. Små proteiner beveges raskere enn store i en slik gel i et elektrisk felt (Figure 3-41 ). Denne type elektroforese vil bli demonstrert i den praktiske oppgaven i laboratoriet. Gelene og proteinbåndene farges med Coomassie Blue (Bio-Rad Protein Assay) eller lignende fargereagenser som er spesifikke for proteiner. SDS(sodium dodecylsulfate) denaturerer proteinene til underenheter slik at alle polypetidkjedene tvinges til en utvidet konformasjon dvs. ulikheter i form elimineres og kun forskjeller i lengden dvs. massen er avgjørende for bevegelsen.
Proteinrensing - elektroforese Figure 3-41
SDS-PAGE - elektroforese (demo på lab.) SDS-PAGE (SDS-polyacrylamid-elektroforese) - geler av polyacrylamid er laget ferdig på forhånd (prosedyre gjennomgåes av Ann Cicilie Larsen og Ragnhild Lyngved). Oppgaver på lab blir : Oppbygging av elektroforese-apparatet gjennomgåes Påsetting av ukjente prøver og standard-løsninger Kjøring av elektroforese - følge bevegelsen av standarden Foreta farging av gel og forklare hvordan Coomassie-blue-fargingen virker. Bestemmelse av protein-størrelse basert på at ukjente bånd sammenlignes med standard. Demonstrere bruk av gel-doumentasjons-utstyr som automatisk analyserer gelene. Forklare mulighetene som gel-doumentasjons-utstyr representerer innen molekylærbiologi og genteknologi
Proteinrensing - 2D-elektroforese Todimensjonal-elektroforese brukes for å skille proteiner tilnærmet like i molekylvekter f.eks. et 41 kda fra et 42 kda protein. I praksis benyttes først isoelektrisk fokusering ( IEF - basert på elektrisk ladning) - fulgt av SDS-elektroforese (masse). Etter felling av celle-ekstraktet med 8M urea brukes amfolytter som danner en ph-gradient (se Figure 3-42a ). Ladete proteiner beveges til sitt isoelektriske punkt (pi). Etter IEF separeres i andre dimensjon ved bruk av SDS-elektroforese på basis av molekylvekt. Figur 3.42 b viser resultatet ; hver flekk representerer ett enkelt polypeptid som er farget eller radioaktivt merket.
Proteinrensing - 2D-elektroforese Figure 3-42 a Figure 3-42b
Proteinrensing - Væskekromatografi Væskekromatografi brukes for å skille blandinger av proteiner og nukleinsyrer. Prinsippet er at molekyler i løsning vil med ulike evne bindes til/løses fra en fast overflate.dette vil påvirke gjennomstrømnings- hastigheten til molekylene dvs. gi separasjon ned gjennom en søyle. Ulike typer : Gelfiltrerings-kromatografi Ionebytter-kromatografi Affinitets-kromatografi Gelfiltrerings-kromatografi med bæresubstans av polyacrylamid, dextran eller agarose : skiller proteiner som er ulike i masse. Små molekyler må innom hulene i bæresubstansen og forsinkes i gjennomstrømmingen (se Figure 3-43 a).
Proteinrensing - Væskekromatografi Figure 3-43a
Proteinrensing - Væskekromatografi Ionebytter-kromatografi med bæresubstans (kuler) dekket med amino(+ladning) eller karboksyl(-ladning)-grupper ved nøytral ph : skiller proteiner som er ulike i ladning (se Figure 3-43 b). Sure proteiner med negativ ladning vil stoppe opp og forsinkes i sin bevegelse på en søyle med positive ladninger - og omvendt. De sure proteinene elueres selektivt ved å benytte en gradient med økende saltkonsentrasjon (f.eks NaCl eller KCl). Ettersom konsentrasjonen øker vil saltionene erstatte den posisjon i gelkulene som proteinene midlertidig har inntatt. De svakt ladete proteiner elueres først og høyt ladete sist.