Fasekontrast og interferens-mikroskopi

Transkript

1 Fasekontrast og interferens-mikroskopi Fasekontrast og Normanski-interferens mikroskopi kan gi bilder av levende ufargete celler Begge teknikker er basert på fenomener som brytning og diffraksjon av lysbølger og gir bilder som har lys/mørke kontrastforskjeller Fasekontrast er velegnet for struktur og bevegelse av større organeller (kjerne, mitokondrier) i levende celler (Fig. 5-13a) Normanski-bilder fremtrer med skyggevirkning (Fig. 5-13b) Fasekontrast og Normanski-interferens mikroskopi er egnet for time-lapse - mikroskopi - bilder tas jevnlig over en tidsperiode og gir muligheter for bestemmelse av cellebevegelser

2 Lysmikroskopet og SEM - praktisk demo På PBS vil følgende typer mikroskoper og teori om disse bli demonstrert og gjennomgått av Tor Beisvåg : Fasekontrast-mikroskopi av levende epitelceller DIC (Differensiell-interferens-kontrast-mikroskopi) av levende epitelceller Fluorescens-mikroskopi av preparater av protoplaster farget med FDA for demonstrasjoner av levende celler med intakt plasmamembran Videooverføring fra lysmikroskop til dataskjerm av snitt av rothetteceller med amyloplaster med stivelse utsatt for variable g-krefter (bl.a. fra forsøk på romfergen) Scanning-elektronmikroskopi (SEM) med preparater av jordbærsnutebille,granbarkbille og peppermynteblad med kjertelceller for produksjon av eteriske oljer.

3 TEM og SEM-teknikker (elektronmikroskopi) Elektronmikroskopet [transmisjon-(tem) og scanning- (SEM)] bruker ikke optiske men elektromagnetiske linser - oppløsningsevne --> 0.1 nm TEM: Elektroner fra en katode (100 kv) sendes gjennom vakum i en søyle mot en anode. Kondensor-, objektiv- og projektiv-linser danner bildet av det biologiske preparatet (Fig. 5-15). Preparatet er fiksert, snittet ultratynt (500Ångstrøm), samlet på en grid (Fig. 5-16) og farget med metaller (bly, uran, gull og osmium) som gir elektrontetthet (svart/hvitt-kontraster)

4 Ultramikrotom-snitting og 3Drekonstruksjon/animeringsprogram - praktisk demo På PBS vil bruk av en ultramikrotom for TEM-tynnsnitting og et dataprogram for 3D-rekonstruksjon av celler fra romforsøk bli demonstrert og gjennomgått av Tor-Henning Iversen: Snittingen foregår ved bruk av glasskniver. Snittene samles opp på en vannoverflate i et trau på kniven. En grid brukes til å overføre snittene til farging med tuungmetaller før undersøkelse i TEM. Et interaktivt billed-analyseprogram er brukt til bearbeiding av resultater fra et romfergeforsøk (IML-1 i 1992). Dataene er samlet i en hovedfagsoppgave laget av Gary Chinga og publisert i tidskriftet Microscopy. Programmet og noen resultater vil bli demonstrert.

5 TEM og SEM-teknikker (elektronmikroskopi) Bruk av antistoffer og gull-merking gir muligheter for lokalisering av spesifikke proteiner (Fig. 5-17) i TEM Figure 5-17 Gullmerking (svaret prikker) av katalase i peroxisomer ved bruk av antistoff-teknikk.

6 TEM og SEM-teknikker (elektronmikroskopi) Pådamping av metaller med skyggelegging gir replika av f.eks. membraner (Fig. 5-18). Cryo-elektronmikroskopi gir muligheter for å se ufikserte celler - frysing i flytende nitrogen SEM ; benyttes for overflatestudier dvs. ikke snitting av biologisk materiale. Oppsamling i en detektor av primære og sekundære elektroner gir 3-D opplevelse av preparatet. Skal vises på PBS av Tor-Beisvåg.

7 Del 5.2 Celle-rensing-teknikker Flow-cytometri Bestemmer egenskaper ved og kan skille ulike celler i blanding ved måling av lys som sendes ut (fluorescence) ved gjennomstrømming i en laser-stråle. Fluorescence-aktivert celle-sortering (FACS) kan selektere én celle fra tusenvis av andre (Fig. 5-21). Baseres f.eks. på antistoff-binding på celleoverflaten. FACS kan også brukes til bestemmelse av DNA/RNA-innholdet og deres form ved bruk av DNA-bundet fargestoff Figure Celle-sorterer En blanding av celler lages hvor f.eks. en membrankomponent er merket med fluorescerende mabs eller et annet fargereagens. Blandes med en buffer (sheath fluid). Cellene sendes enkeltvis gjennom en laser-stråle som måler fluorescensen --> cellestørrelse og form bestemmes.en celle plasseres i enkeltdråper (gjennom nozzle) og tvinges videre som ladete dråper proporsjonal med fluorescensen. Et elektrisk felt skiller deretter dråper med og uten ladning.

8 Celleknusing og sentrifugering I en egnet salt- og buffer-løsning kan celler knuses (ultralyd=sonikering eller ved trykk-homogenisering) Det er vesentlig at man kontrollerer den osmotiske balanse ved celleknusingen (hypo-, hyper- og isotoniske løsninger - se Fig. 5-22) Figure 5-22 Ionekonsentrasjon og vanntransport (osmose) I et isotont medium (a) påvirkes ikke cellevolumet dvs.ingen netto-transport av vann over mebranen. Cellen i et hypotont ytre medium medfører svelling dvs. netto vannbevegelse inn. I et hypertont medium er nettotransporten av vann ut av cellen.

9 Isolering av protoplaster Knut Robert Fossum vil demonstrere isolering av veggfrie rapshypokotyl-protoplaster : I en egnet buffer-løsning vil mørkdyrkete raps-hypokotyl-biter kuttes opp og plasmolyseres. Cellene er lagt i veggnedbrytende enzymer over natten. Blir demonstrert. Den osmotiske balanse ved isoleringen er viktig bl.a. ved rensingen av protoplastene som skjer på en sentrifuge. Det blir også foretatt en levedyktighetstest (FDA) med bruk av fluorescensmikroskopi. Teorien bak romfergeforsøket på IML-1, sterilteknikk, dyrking av protoplaster etc. blir gjennomgått

10 Celleknusing og sentrifugering De knuste celler i løsning kalles et homogenat. Ved bruk av ulike sentrifugeringsbetingelser (hastighet og tetthet = differensiell-hastighets- og tetthets-sentrifugering) oppnås en cellefraksjonering (Fig. 5-23, Fig. 5-24). De ulike celleorganeller separeres ved slike metoder. Figure 5-23 Figure 5-24

11 Celleknusing og sentrifugering Ved bruk av immunologiske teknikker (monoklonale antistoffer = MAbs) kan spesifikke protein- membrankomplekser isoleres (eks. clathrindekkete vesikler ; Fig. 5-26)