NOVA Lite dsdna Crithidia luciliae For In Vitro-diagnostikk ProdutKode: 708200, 708205 508200.10, 508205.20, 508205.80 CLIA-klassifisering: Høy kompleksitet Anvendelsesområde NOVA Lite dsdna Crithidia luciliae er en indirekte immunfluorescerende analyse for screening og semikvantitativ bestemmelse av anti-dobbelttråd DNA i humant serum. Forekomsten av antidobbelttråd DNA kan brukes sammen med kliniske resultater og andre laboratorietester som støtte i diagnosen av systemisk lupus erythematosus (SLE). Sammendrag og forklaring av testen NOVA Lite dsdna Crithidia luciliae-testen er en indirekte immunfluorescens antistofftest som bruker hemoflagellaten, crithidia luciliae, som substrat. Denne encellede organismen har et gigantisk mitokondrium som inneholder sterkt kondensert masse av sirkulært dsdna. 1 Denne massen av dsdna, kjent som kinetoplast, fremstår som uten histon og andre nukleære antigener. 1,2 Den fungerer som et sensitivt og spesifikt substrat for påvisning av autoantistoffer mot dsdna. Autoantistoffer mot dsdna forekommer nesten utelukkende hos pasienter med systemisk lupus erythematosus (SLE) og, som sådan, betraktes de som markørantistoffer. Autoantistoffer mot dsdna har blitt inkludert i Reviderte kriterier for klassifisering av systemisk lupus erythematosus av 1982 av en underkomité for foreningen for artritt og revmatisme. 3 Mens den ofte brukte antinukleære-antistoff (ANA) testen er en sensitiv screeningstest for SLE og andre bindevevssykdommer, er den slett ikke spesifikk for SLE. På grunn av dette skal alle positive ANA-prøver testes for spesifikke antistoffer mot dsdna. Forekomsten av antistoffer mot dsdna er en sterk indikasjon på SLE, men fraværet av disse antistoffene utelukker ikke SLE i alle tilfellene. En rekke metoder har blitt brukt i årenes løp for å påvise antistoffer mot dsdna. Disse metodene inkluderer kkomplementifiksering, 4 passiv agglutinasjon 5 og RIA. 6-8 Hovedfordelen til en crithidia luciliae-basert dsdna-test er dens spesifisitet på grunn av karakteristikken til den tett sammenrullede massen av sirkulær dsdna i kinetoplasten. 9-11 Denne karakteristikken er fundamental for en markørantistofftest. Prosedyreprinsipper I den indirekte immunfluorescerende teknikken, inkuberes prøver med et antigensubstrat og antistoffer som ikke reagerer, vaskes bort. Substratet inkuberes med spesifikk fluorescein-merket løsning og reagenter som ikke bindes, vaskes bort. Ved å se gjennom et fluorescensmikroskop vil positive prøver for autoantistoff utvise en eplegrønn fluorescens tilsvarende de områdene av cellen eller kjerner hvor autoantistoffer har bundet seg. Reagenser 1. Crithidia luciliae Slides (dsdna) substrat, 6 eller 12 brønner/slide med tørkemiddel - 1 -
Kitet Bare 2. Antihumant IgG-løsning (geit), uten Evans blå, fluorscein-merket i buffer som inneholder og 0,09% natriumazid 3. dsdna Positive, en ampulle med buffer som inneholder 0,09% natriumazid og humant serum-antistoffer mot dsdna, forhåndsfortynnet 4. IFA System Negative kontroll, en ampulle med buffer som inneholder 0,09% natriumazid og humant serum-antistoffer mot dsdna, forhåndsfortynnet 5. PBS II-konsentrat (40x) 6. Montering medium, 0,09% natriumazid 7. Dekkglass Advarsler 1. Alt materiale fra menneskekilder brukt i preparatet til kontroller for dette produktet har blitt testet og funnet negativ for antistoff mot HIV, HBsAg og HCV av metoder klarert av det amerikanske helsetilsynet (FDA). Imidlertid kan ingen testmetode gi fullstendig sikkerhet om at HIV, HBV, HCV eller andre smittsomme agens er fraværende. Derfor skal dsdna positive og IFA System Negative Kontroll behandles på samme måte som potensielt smittsomt materiale. 12 2. Natriumazid brukes som konserveringsmiddel. Natriumazid er en gift og kan være giftig ved svelging eller ved opptak gjennom huden eller via øynene. Natriumazid kan reagere med blyeller kobberrør og danne potensielt eksplosive metallazider. Bruk rikelig med vann i vaskene, hvis de brukes for avfallshåndtering av reagenser, for å forhindre oppsamling av azider. 3. Bruk egnet personlig verneutstyr når du arbeider med reagensene som er levert. 4. Dersom du søler reagenser skal disse straks vaskes bort. Du skal være oppmerksom på alle kommunale, statlige og lokale miljøbestemmelser ved avfallsbehandling. Forholdsregler 1. Dette produktet (Kitet) brukes for in vitro-diagnostikk. 2. Utbytting av komponenter med andre enn de som leveres med dette systemet kan føre til inkonsistente resultater. 3. Ufullstendig eller ineffektiv vasking av IFA brønners kan forårsake en høy bakgrunn. 4. Tilpassing av denne analysen for bruk sammen med, helt eller delvis, automatiske prøveprosessorer eller andre væskebehandlingsapparater, kan gi avvikende testresultater i forhold til de som utføres ved hjelp av manuell prosedyre. Det er hvert enkelt laboratoriums ansvar å stadfeste at deres automatiske prosedyre gir testresultater innenfor akseptable grenser. 5. En rekke faktorer påvirker analyseprestasjonene. Herunder inkluderes starttemperaturen til reagensene, styrken av mikroskopet pæren brukte, pipetteteknikkens nøyaktighet og reproduserbarhet, hvor grundig det er vasket og fjernet væske og inkubasjonstidenes varighet under analysen. Det er nødvendig med konsistens konsistens for å oppnå nøyaktige og reproduserbare resultater. 6. Streng fastholdelse til denne protokollen er anbefalt. Oppbevaringsbetingelser 1. Lagre alle reagensene i kitet og slides ved 2-8 C. Ikke frys. Reagensene er stabile helt til de går ut på dato hvis de oppbevares og behandles på foreskriftsmessig vis. 2. Fortynnet PBS II er stabil i 4 uker ved 2-8 C. - 2 -
Innhenting av prøver Denne prosedyren skal utføres med en serumprøve. Tilsetting av azid eller andre konserveringsmidler til testprøvene kan påvirke resultatene. Mikrobielt kontaminerte, varmebehandlede prøver eller prøver som inneholder synlige partikler skal ikke brukes. Sterkt hemolysert eller lipemisk serum eller prøver skal unngås. Etter innhenting skal serumet skilles fra blodklumpen. CLSI (NCCLS) dokument H18-A3 anbefaler følgende oppbevaringsbetingelser for prøver: 1) Ikke oppbevar prøver i romtemperatur lenger enn i 8 timer. 2) Hvis analysen ikke fullføres innen 8 timer, kjøl prøven ned til 2-8 C. 3) Hvis analysen ikke fullføres innen 48 timer, eller ved forsendelse av prøven, frys den ned til -20 C eller lavere. Nedfryste prøver må blandes godt etter tining og før testing. Prosedyre Leverte materialer (Kitet) 708200 10 6 brønners dsdna Crithidia luciliae substrat slide 1 4mL FITC Anti-human IgG-konjugat 1 0.5mL dsdna Positive 1. 0.5mL IFA System Negative kontroll 1 25mL PBS II-konsentrat (40x) 1 7mL Monteringsmedium 1 10 Dekkglass 708205 20 12 brønners dsdna Crithidia luciliae substrat slide 1 15mL FITC Anti-human IgG-konjugat 1 0.5mL dsdna Positive 1. 0.5mL IFA System Negative kontroll 2 25mL PBS II-konsentrat (40x) 1 7mL Monteringsmedium 1 20 Dekkglass Leverte materialer (slide) 508200.10 10 x 6 brønners dsdna Crithidia luciliae substrat slide 508205.20 20 x 12 brønners dsdna Crithidia luciliae substrat slide 508205.80 80 x 12 brønners dsdna Crithidia luciliae substrat slide Påkrevd tilleggsutstyr (ikke levert) Mikropipetter for å forsyne 15-1000µL volum Destillert eller deionisert vann Plastflasker eller Pasteurpipetter Fuktighetskammer 1L beholder (for å løse opp PBS II) Skål coplin Fluorescensmikroskop med 495nm eksitasjonsfilter og 515nm barrierefilter - 3 -
Metode Før du starter 1. Bring alle reagenser og prøver opp til romtemperatur (20-26 o C) og bland godt. 2. Tynn PBS II-konsentratet ut: VIKTIG: Tynn PBS II-konsentratet ut (1:40) ved å blande innholdet av PBS II-konsentratflasken med 975mL destillert eller deionisert vann. Bland grundig. PBS II-bufferen brukes for å fortynne pasientprøver og som en vaskebuffer. Fortynnet buffer kan lagres opp til fire uker ved 2-8 C. 3. Tynn ut pasientprøver: a. Innledende screening: Tynn ut pasientprøver (1:10) med fortynnet PBS II-buffer (dvs. bland 100µL serum med 900µL PBS II-buffer). b. Titrering: Lag serielle totrinns løsninger fra den innledende screeningsløsningen for alle positive prøvene med fortynnet PBS II-buffer (dvs. 1:20, 1:40,... 1:640). Analyseprosedyre 1. Forbered substratslidene: La substratslidene varmes opp til romtemperatur før du fjerner dem fra posen. Merk det med blyant og plasser det i et passende fuktighetskammer. Tilsett 1 dråpe (20-25µL) av ufortynnet positiv og negativ kontroll til henholdsvis brønn 1 og 2. Tilsett 1 dråpe (20-25µL) av ufortynnet pasientprøve til resterende brønner. 2. Inkubasjon av slide: Inkuber sliden i 30 (±5 minutter) i et fuktighetskammer (et fuktig kjøkkenpapir plassert vannrett på bunnen av en lukket plastikk-eller glassbeholder) vil opprettholde de riktige fuktighetsbetingelsene. Ikke la substratet tørke ut under analyseprosedyren. 3. Vask sliden: Etter inkubasjon, bruk en plastikkflaske eller pipette for å vaske serum forsiktig av med fortynnet PBS II-buffer. Innrett sliden og sprøyt PBS II-bufferen slik at vaskeavfall av prøver minimeres mellom brønnene. Unngå å rette strålen direkte på brønnene for å forhindre at substratet skades. Hvis ønsket, plasser slidene i en Coplin skål med fortynnet PBS II-buffer i opp til 5 minutter. 4. Tilsetting av fluorescensløsning: Rist av overskytende PBS II-buffer. Plasser sliden tilbake i fuktigheteskammeret og dekk umiddelbart hver brønn med en dråpe fluorescensløsning. Inkuber slidene i ytterligere 30 (±5) minutter. 5. Vask sliden: Gjenta trinn 3. 6. Dekkglass: Dekkglassprosedyrer kan variere fra laboratorium til laboratorium. Imidlertid anbefales følgende prosedyre: a. Plasser et dekkglass på et kjøkkenpapir. b. Påfør monteringsmedium i en kontinuerlig linje til nedre kant av dekkglasset. c. Rist av overskytende PBS II-buffer og ta på nedre kant av sliden og før det til kanten av dekkglasset. Senk forsiktig sliden på dekkglasset på en slik måte at monteringsmediet flyter til øvre kant av diapositivet uten at det dannes luftbobler eller trykk. Kvalitetskontroll dsdna Positive og IFA System Negative kontroll skal kjøres på hvert slide for å sikre at alle reagenser og prosedyrer fungerer riktig. Egnede tilleggskontrollsera kan forberedes ved å aliquotere innsamlede humane serumprøver som oppbevares ved < -70 o C. Alle kriteriene oppgitt nedenfor må oppfylles for å betrakte testresultatene som gyldige. Hvis noen av disse kravene ikke oppfylles, skal testresultatene betraktes som ugyldige og analysen må gjentas. 1. Ufortynnede dsdna-positiv kontroll må være > 2+. 2. IFA System Negative kontroll må være negativ. - 4 -
Tolkning av resultater Negativ reaksjon. En prøve betraktes som negativ hvis spesifikk kinetoplastfargelegging er mindre enn den negative kontrollen. Fargelegging av andre strukturer slik som basallegemet, flagellum eller kjernen uten medfølgende fargelegging av kinetoplasten skal betraktes som negativ for dsdnareaktivitet. Positiv reaksjon. En prøve betraktes som positiv hvis spesifikk kinetoplastfargelegging eller kinetoplast- og kjernefargelegging observeres som større enn negativ kontroll. Alle positive prøver skal titeres ved hjelp av serielle doble fortynninger til endepunkt. Bestem fluorescensgrad eller intensitet ved hjelp av disse kriteriene: 4+ Skarp eplegrønn fluorescens 3+ Klar eplegrønn fluorescens 2+ Helt tydelig positiv fluorescens 1+ Svakest spesifikk fluorescens som gjør det mulig å skille nukleær og/eller cytoplasmisk fargelegging fra bakgrunnsfluorescens Prosedyrebegrensninger 1. Brukeren skal være oppmerksom på effektene til antistoffoverskudd og muligheten for å få ikke-dsdna fargelagte mønstre under avlesning av slidene. 2. En rekke eksterne faktorer påvirker testsensitiviteten inkludert type fluorescensmikroskop brukt, lampestyrken og alder, brukt forstørrelse, filtersystemet og observatøren. 3. Hvis et båndpassfilter brukes istedenfor en 515 barrierefilter, er det mulig å observere økt kunstig fargelegging. 4. Bare blyant skal brukes for å merke slidene. Bruk av annet skrivemateriale kan forårsake kunstig fargelegging. 5. Alle coplin skålene som brukes for vask av slidene skal være fri for fargestoffavfall. Bruk av coplin skåler som inneholder fargestoffavfall kan forårsake kunstig fargelegging. 6. Resultatene til denne analysen bør brukes sammen med kliniske resultater og andre serologiske tester. 7. Prestasjonsegenskapene til analysen har ikke blitt etablert for annet prøvemateriale enn serum. Slides som selges separate er klassifisert som analysespesifikke reagenser. Det er bare som en komponent i NOVA Lite dsdna Crithidia luciliae kitet at analytiske data er etablert. - 5 -
Forventede verdier NOVA Lite dsdna Crithidia luciliae-substratet ble brukt til å teste en rekke bindevevssykdomspasienter i tillegg til 200 tilfeldig utvalgte blodgivere. Resultatene vises under: Pasientgruppe Antall Antall Positiv* NOVA Lite dsdna Crithidia lucilae SLE 105 42 Legemiddelsindusert lupus 24 0 Revmatisk artritt 40 0 Sklerodermi 24 0 Dermatomyositt 14 0 Sjögrens syndrom 14 0 Normalt 200 0-6 -
Referanser 1. Aarden LA, de Groot ER, Feltkamp TE: Immunology of DNA. III. Crithidia luciliae, a simple substrate for the detection of anti-dsdna with immunofluorescence techniques. Ann. NY Acad. Sci. 254: 505-515, 1975. 2. Crowe W, Kusher I: An immunofluorescent method using Crithidia luciliae to detect antibodies to double-stranded DNA. Arthritis and Rheumatism 20: 811-814, 1977. 3. Tan EM, et al.: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: 1271-1277, 1982. 4. Arana R, Seligmann M: Antibodies to native and denatured deoxyribonucleic acid in systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 46: 1867-1882, 1967. 5. Inami YH, Nakamura RM, Tan EM: Microhemagglutination test for the detection of native and single-stranded DNA antibodies and circulating DNA antigen. J. Immunol. Methods 3: 287-300, 1973. 6. Aarden LA, Lakmaker F, de Groot ER, et al.: Detection of antibodies to DNA by radioimmunoassay and immunofluorescence. Scand. J. Rheu. Suppl. 11: 12-19, 1975. 7. Fish F, Ziff M: A sensitive solid phase microradioimmunoassay for anti double-stranded DNA antibodies. Arthritis and Rheumatism 24: 534-543, 1981. 8. Pincus T, Schur P, Rose JA, et al.: Measurement of serum DNA-binding activity in systemic lupus erythematosus. The New England J. of Medicine 281: 701-705, 1969. 9. Somerfield SD, Roberts MW, Booth RJ: Double-stranded DNA antibodies: comparison of four methods of detection. J. Clin. Path. 34: 1032-1035, 1981. 10. Sontheimer RD, Gilliam JD: An immunofluorescence assay for double-stranded DNA antibodies using the Crithidia luciliae kinetoplast as a double-stranded DNA substrate. J. Lab Clin. Med. 91: 550-558, 1978. 11. Stingl G, Meingassner JG, Swelty P, Knapp W: An immunofluorescence procedure for the demonstration of antibodies to native, double-stranded DNA and of circulating DNA-anti DNA complexes. Clin. Immunol. Immunopath. 6: 131-140, 1976. 12. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5 th Edition. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2009-7 -
Fabrikkert av: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : 877-829-4745 Technical Service (Outside the U.S.) : 1 858-805-7950 support@inovadx.com Autorisert representant i EU: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 628200NOR Desember 2012 Rev. 2 NOVA Lite og INOVA Diagnostics, Inc., er registrerte varemerker. Copyright 2012 Alle rettigheter reservert - 8 -