(12) SØKNAD (19) NO (21) 161140 (13) A1 NORGE (1) Int Cl. C12N 1/11 (06.01) C12N 1/09 (06.01) C12Q 1/68 (06.01) Patentstyret (21) Søknadsnr 161140 (86) Int.inng.dag og søknadsnr 06.03.03 PCT/KR06/00746 (22) Inng.dag 16.07.08 (8) Videreføringsdag 16.07.08 (24) Løpedag 06.03.03 () Prioritet 0.03.0, KR, -0-0018419 (41) Alm.tilgj 06.09.06 (62) Avdelt fra 074394, med inndato 07.08.29 (73) Innehaver Seegene Inc., 8FL, 9FL, Taewon Bldg., 6-, Bangi-dong, KR-138-00 SONGPA-GU, SEOUL, Sør-Korea (72) Oppfinner Jong-Yoon Chun, 1-3702 Jamsil The Sharp Star Park 7-14 Sincheon-dong, KR-138-794 SONGPA-GU, SEOUL, Sør-Korea (74) Fullmektig Acapo AS, Postboks 1880 Nordnes, 817 BERGEN, Norge (4) Benevnelse Oligonukleotid med dobbel spesifisitet (7) Sammendrag Det beskrives forskjellige fremgangsmåter for templatavhengig ekstensjonsreaksjon ved anvendelse av et dobbeispesifisitetsoligonukleotid, og et dobbeispesifisitetsoligonukleotid sammensatt av tre forskjellige Tm porsjoner. Egenskapene med dobbelspesifisitetsoligonukleotidet vises, som høy hybridiseringsspesifisitet og mismatch toleranse.
BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN OMRÅDE FOR OPPFINNELSEN Den foreliggende oppfinnelse oligonukleotid med dobbel spesifisitet, og en fremgangsmåte for syntese av et nukleinsyremolekyl ved anvendelse av et dobbeltspesifisitets oligonukleotid med en templat-avhengig ekstensjonsreaksjon. Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av universelle baser for fremstilling av et dobbeltspesifisitets oligonukleotid med forbedret annealingspesifisitet. BESKRIVELSE AV TEKNIKKENS STAND 1 Nukleinsyremangfoldiggjøring er en sentral framgangsmåte for et bredt spekter av framgangsmåter innen molekylær biologi, og således har forskjellige mangfoldiggjøringsmetoder blitt foreslått. For eksempel, Miller, H. I. et al. (WO 89/06700) mangfoldiggjorde en nukleinsyresekvens basert på hybridisering av en promoter/primersekvens til en enkelttrådet mål-dna ( ssdna ) etterfulgt av transkripsjon av mange RNA-kopier av sekvensen. Andre kjente nukleinsyremangfoldiggjøringsprosedyrer inkluderer transkripsjonsbaserte mangfoldiggjøringssystemer (Kwoh, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:1173(1989); og Gingeras T.R. et al., WO 88/31). 2 Den vanligste framgangsmåte for nukleinsyremangfoldiggjøring kjent som polymerase kjedereaksjon (heretter benevnt som PCR ), er basert på repeterende sykluser av denaturering av dobbelttrådet DNA, etterfulgt av oligonukleotid primer annealing til DNA-templatet, og primer ekstensjon av en DNA-polymerase (Mullis et al. U.S. Pat. Nos. 4,683,19, 4,683,2, and 4,800,19; Saiki et al., (198) Science 2, 1-134). Oligonukleotid primerne anvendt i PCR designes for å anneale til motsatte tråder av DNA-templaten. Primerne forlenges med DNA-polymerase, hvorfra produktet av en primer kan fungere som templattråd for den andre primer i påfølgende reaksjoner. PCR-mangfoldiggjøringsprosessen resulterer i en eksponentiell økning av bestemte DNA-fragmenter hvis lengde er definert av -ender av oligonukleotid primerne. 3 Suksessen med nukleinsyremangfoldiggjøringer, spesielt PCR-mangfoldiggjøring, er basert på spesifisiteten hvorved en primer annealer til dets mål (og ikke til ikke-mål) sekvenser; og det er derfor viktig å optimere denne molekylære interaksjon. Hvordan en primer kan anneale kun til dets perfekte komplement eller også til sekvenser
2 som er én eller flere mismatcher avhenger kritisk av annealingstemperaturen. Generelt, høyere annealingstemperatur vil føre til mer spesifikk annealing av primeren til dets perfekte matchete templat, som deretter øker sannsynligheten for mangfoldiggjøring av kun målsekvensen. På den andre side, mer mismatch mellom templat og primer kan tolereres ved lavere annealingstemperaturer. Ved vurdering av et slikt fenomen kan justering av annealingstemperaturen endre spesifisiteten av paring av templat og primer. For eksempel, om der ikke er noe produkt, kan temperaturen være for høy for annealing. Dersom der er flere produkter som er av forskjellig størrelse hvor kun én primer foreligger, vil dette indikere at den enkle primer annealer til mer enn én region av templatet. I dette tilfellet bør annealingstemperaturen økes. 1 I tillegg til annealingstemperatur bør flere primer søkeparametere, så som primer lengde, GC-innhold og lengde av PCR-produkt vurderes for primer annealingsspesifisitet. En primer som tilfredsstiller alle slike parametre vil resultere i betydelig forbedring av primer annealingspesifisiteten under mål-dna-mangfoldiggjøring, mens man løser problemene på bakgrunn og ikke-spesifikke produkter som oppstår av primere som anvendes i eksperimentene. Det er vanlig at godt konstruerte primere kan bevirke til å unngå ikke-spesifikk annealing og bakgrunn, og likeledes skille mellom cdnaer eller genomiske templater i RNA-PCR. 2 3 Mange løsninger har blitt utviklet for å forbedre primer annealingsspesifisitet og gjennomføringen av mangfoldiggjøringen av det ønskete produkt. Eksempler er "touchdown" PCR (Don et al., (1991) Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res., 19, 4008), hot start PCR (DAquila et al., (1991) Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating. Nucleic Acids Res., 19, 3749), nested PCR (Mullis and Faloona, (1987) Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 1, 33-), og booster PCR (Ruano et al., (1989) Biphasic amplification of very dilute DNA samples via booster PCR. Nucleic Acids Res. 17, 40). Andre alternative løsninger har også blitt rapportert der forskjellige enhancer forbindelser kan forbedre spesifisiteten av PCR. Enhancer-forbindelsene inkluderer kjemikalier som øker den effektive annealingstemperatur i reaksjonen, DNAbindingsproteiner, og kommersielt tilgjengelige reagenser. Imidlertid, der er intet magisk tilsettingsstoff som vil sikre suksess med hver PCR, og det er svært tidkrevende å teste forskjellige tilsettingsstoffer under forskjellige betingelser så som annealingstemperatur. Selv om disse løsninger har bidratt til forbedring av primer
3 annealingsspesifisiteten i noen tilfeller, har de ikke undersøkt fundamentalt en løsning for de problemer som oppstår fra primere som anvendes i PCRmangfoldiggjøring, så som ikke-spesifikke produkter og høye bakgrunner. PCR-baserte teknikker har blitt bredt anvendt ikke kun for mangfoldiggjøring av en mål DNA-sekvens, men også for spesifikke applikasjoner eller framgangsmåter innen feltet biologisk og medisinsk forskning, så som revers transkriptase PCR (RT- PCR), differensiell display PCR (DD-PCR), kloning av kjente eller ukjente gener med PCR, hurtig mangfoldiggjøring av cdna-ender (RACE), vilkårlig priming PCR (AP- PCR), multipleks PCR, SNP genom typing, og PCR-baserte genomiske analyser (McPherson and Moller, (00) PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, NY). 1 Som beskrevet over, alle disse framgangsmåter og teknikker som involverer nukleinsyre mangfoldiggjøring, særskilt PCR mangfoldiggjøring, er ikke fullstendig fri fra begrensninger og problemer som er resultatet av ikke-spesifisitet av primerne som anvendes i hver framgangsmåte, så som falske positive, svak reproduserbarhet, høye bakgrunner, selv om forbedrete løsninger for hver metode kontinuerlig har blitt introdusert. Derfor, der er framdeles et behov for nye primere og framgangsmåter for å forbedre annealingsspesifisitet, som kan gi opphav til sanne mangfoldiggjøringsresultater. 2 3 Samtidig er DNA-hybridisering er fundamental prosess i molekylærbiologi, og er påvirket av ionestyrke, sammensetning av baser, lengde av fragmenter hvortil nukleinsyrene har blitt redusert, grad av mismatching, og nærvær av denaturerende midler. DNA hybridiseringsbaserte teknologier vil være svært nyttige redskaper i spesifikk nukleinsyresekvensbestemmelser og er klart nyttige i klinisk diagnose, genetisk forskning og rettsvitenskapelig laboratorieanalyse. For eksempel, Wallace og medarbeidere viste at sekvensforskjeller så marginale som en enkelt baseforandring er tilstrekkelig til å muliggjøre diskriminering av korte (for eksempel 14- mer) oligomerer og viste hvordan dette kan anvendes i molekylær analyse av punktmutasjon i β-globin genet (Wallace, B.R., et al., (1981) The use of synthetic oligonucleotides as hybridization probes. Hybridization of oligonucleotides of mixed sequence to rabbit β-globin DNA. Nucleic Acids Res. 9, 879-894; and Conner, B.J., et al. (1983) Detection of sickle cell β-globin allele by hybridization with synthetic oligonucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 278-282).
4 1 2 Til tross for effekten av oligonukleotid hybridisering for å korrekt identifisere en komplementær tråd, står forskerne fortsatt ovenfor begrensninger. Hybrider inneholdende oligonukleotider er mindre stabile enn hybrider av lange nukleinsyrer. Dette er reflektert i lavere smeltetemperatur. Denne ustabilitet av hybridene er en av de mest viktige faktorer som må vurderes når man konstruerer oligonukleotid hybridisering. Stabilitetsforskjellen mellom et perfekt komplement og et komplement som er mismatchet med kun én base kan være ganske liten, korresponderende til så lite som 0, 0 C i forskjell i deres T m s (dupleks smeltetemperatur). Jo kortere den aktuelle oligomer er (som muliggjør identifisering av en komplementær tråd i en mer kompleks blanding), jo sterkere er effekten av en enkel base mismatch på total dupleksstabilitet. Imidlertid, ulempen med å anvende slike korte oligonukleotider er at de hybridiserer svakt, selv til en perfekt komplementær sekvens, og således må anvendes under betingelser av redusert stringens, som alvorlig resulterer i redusert hybridiseringsspesifisitet. Der har blitt gjort mange forsøk for å forbedre spesifisiteten av oligonukleotid hybridisering. En framgangsmåte for kjemisk å modifisere baser av DNA for høysensitivitetshybridisering (Azhikina et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:11460-11462) og en framgangsmåte hvor vasking etter hybridisering utføres ved lave temperaturer i en lang periode for å forsterke evnen til å diskriminere mismatch (Drmanac et al., (1990) DNA and Cell Biology, 9:27-34) har blitt foreslått. Nylig, en ytterligere framgangsmåte har blitt introdusert for å øke oppløsningseffekten av enkelt nukleotid polymorfisme (SNPer) i DNA-hybridisering ved hjelp av artifisielle mismatcher (Guo et al., (1997) Nature Biotechnology, 1:331-). I tillegg beskriver mange US-patenter, inkluderende US patenter nr. 6,077,668, 6,329,144, 6,140,04, 6,,80, 6,9,824, 6,342,3 og 6,268,128 probe for hybridisering, og dets applikasjoner. Selv om disse forbedrete løsninger til hver framgangsmåte kontinuerlig har blitt introdusert, så er alle disse framgangsmåter og teknikker som involverer oligonukleotidhybridisering ikke fullstendig fri for begrensninger og problemer som oppstår av ikke-spesifisitet av oligonukleotidhybridiseringen. 3 Der er framdeles en mulighet for at artifisielle faktorer, så som feil med applisering og immobilisering av oligonukleotid på substrat og etablering av optimale hybridiseringsbetingelser, vil påvirke negativt hybridiseringsdata; effekten av feil resulterer i mer skader på resultatene generert fra høygjennomstrømnings screeningsmetoder. Slike artifisielle faktorer som er en del av applisering og hybridisering, er viktige praktiske ulemper i oligonukleotidbaserte DNA microarrays.
1 Videre, utvikling av DNA-sekvensbestemmelsesteknikker som forbedrer hastighet, sensitivitet og gjennomstrømming er ytterst viktige for studie av biologiske systemer. Konvensjonelle DNA-sekvenseringsteknikker opprinnelig utviklet for mer enn to tiår siden (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci., 74:463-467) står overfor begrensninger både med hensyn til gjennomstrømming og kostnader for framtidige applikasjoner. Derfor har flere nye teknikker blitt foreslått. Tre framgangsmåter som virker lovende er sekvensering med hybridisering (Brain and Smith, (1988) J. Theor. Biol., 13:3-7); Drmanac et al., (1989) Genomics, 4:114-128); and Southern, E.M. (1989) Patent WO/977), parallell signatursekvensering basert på ligering og spalting (Brenner et al., (00) Proc. Natl. Acad. Sci., 97:166-1670), og pyrosekvensering (Ronaghi et al., (1996) Anal. Biochem., 242:84-89; and (1998) Science 281:363-36). For alle disse ovennevnte teknikker er suksessen for sekvensreaksjonene absolutt avhengige av hybridiseringsspesifisiteten av sekvenserende primer til målnukleinsyre. Ved vurdering av hybridiseringsspesifisitet til den sekvenserende primer er gjeldende metoder underlagt begrensning med hensyn til lengde av templatnukleinsyrer som forsynes til sekvenseringsreaksjonene. Generelt, sekvenseringsreaksjoner utføres ved anvendelse av templat nukleinsyrer som fortrinnsvis er mindre enn noen få hundre basepar i lengde slik at den spesifikke hybridisering av sekvenseringsprimeren oppnås i en viss utstrekning. 2 For avanserte studier bør imidlertid ikke DNA sekvenseringsreaksjoner med forbedret hastighet, sensitivitet og gjennomstrømming hindres av størrelsen av templat nukleinsyren. I lys av dette muliggjøres direkte sekvensering av en målnukleinsyre fra en populasjon av templatnukleinsyrer, noe som tilveiebringer at de sekvenserende primere hybridiseres med målnukleinsyrene med høy spesifisitet. Gjennom denne søknad oppgis forskjellige patenter og publikasjoner som referanser og siteringer i parentes. Beskrivelse av disse patenter og publikasjoner inkorporeres heri i sine helheter med referanse i denne søknad for mer fullstendig å beskrive denne oppfinnelse og teknikkens stilling den hører til. SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN 3 For å eliminere problemene og ulempene med slike konvensjonelle oligonukleotider, anvendt som primere eller prober, og forskjellige framgangsmåter som involverer nukleinsyrehybridisering, har oppfinneren av foreliggende oppfinnelse utviklet et
6 dobbeltspesifisitetsoligonukleotid som muliggjør at en templatavhengig reaksjon kan foregå med langt høyere spesifisitet, og dette har funnet utmerkete applikasjoner i et bredt spekter av prosesser som involverer oligonukleotidhybridisering eller annealing. Således, det er et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe framgangsmåter for å syntetisere et nukleinsyremolekyl som benytter et oligonukleotid med dobbelt spesifisitet med en templatavhengig ekstensjonsreaksjon. Det er ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en framgangs- måte for selektiv mangfoldiggjøring av en målnukleinsyresekvens fra et DNA eller en blanding av nukleinsyrer. 1 Det er et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en framgangsmåte for mangfoldiggjøring av to eller flere målnukleotidsekvenser samtidig ved anvendelse av to eller flere par av primere i den samme reaksjon. Det er et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en framgangsmåte for å sekvensere et nukleinsyremolekyl fra et DNA eller blanding av nukleinsyrer. 2 Det er et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en framgangsmåte for å detektere et nukleinsyremolekyl med genetisk diversitet av en templatavhengig ekstensjonsreaksjon. Det er et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en framgangsmåte for å detektere en målnukleotidsekvens i en nukleinsyreprøve ved å anvende en dobbel spesifisitet oligonukleotidimmobilisert microarray. Det er et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et oligo- nukleotid med dobbel spesifisitet for syntetisering av et nukleinsyremolekyl med en templatavhengig ekstensjonsreaksjon. 3 Det er et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en framgangsmåte for å muliggjøre at en annealingsspesifisitet av et oligonukleotid kan bestemmes dobbelt gjennom en struktur i oligonukleotidet.
7 Det er et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en framgangsmåte for å forbedre en annealingsspesifisitet av et oligonukleotid. Andre formål og fordeler med foreliggende oppfinnelse vil bli åpenbare ut fra den detaljerte beskrivelse som følger, sammen med de medfølgende krav og figurer. KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE Fig. 1A og 1B representerer skjematisk prinsippet med dobbel spesifisitet (DS) oligonukleotid ifølge oppfinnelsen i en templatavhengig ekstensjonsreaksjon. Fig. 1A viser høy hybridiseringsspesifisitet av DS-oligonukleotidet under høye stringensbetingelser. Fig. 1B viser mismatch toleranse av DS-oligonukleotidet. 1 Fig. 2 viser skjematisk representasjon for selektiv mangfoldiggjøring av en målnukleinsyre av dobbelttrådet DNA ved anvendelse av DS oligonukleotid primere ifølge oppfinnelsen. Fig. 3 viser skjematisk representasjon for selektiv mangfoldiggjøring av en målnukleinsyre av mrna ved anvendelse av DS oligonukleotid primere ifølge oppfinnelsen. 2 Fig. 4 viser skjematisk representasjon for templatavhengige ekstensjonsreaksjoner i selektiv bestemmelse av en målnukleinsyre ved anvendelse av oligonukleotider med dobbel spesifisitet på oligonukleotid microarray. Fig. er et agarose gel fotografi som viser resultatene av PCR mangfoldiggjøring for cytokinfamilien av gener, IL-1 og IL-19, ved anvendelse av et sett av konvensjonelle primere (IL-1b- -0 og IL-1b-3-0, spor 1; IL-19- -0 og IL-19-3 -0, spor 3) og dobbel spesifisitets oligonukleotider (IL-1b- og IL-1b-3, spor 2; IL-19- og IL-19-3, spor 4). M er en 0-bp størrelsesmarkør generert av Forever 0-bp Ladder Personalizer (Seegene, Inc. Seoul, Korea). 3 Fig. 6A er en agarose gel fotografi som viser resultatene av 3 -RACE (hurtig mangfoldiggjøring av cdna ender) av DEG genet, som viser PCR spesifisitet av oligonukleotidet med dobbel spesifisitet. Spor 1 representerer en primer med perfekt matchsekvens, sporene 2-4 representerer primere med 3, 2 og 1 base mismatch ved dets 3 -lav T m spesifisitetsdel, respektivt, og spor -7 representerer primere med, 3
8 og 2 base mismatch ved dets -høy T m spesifisitetsporsjon, respektivt. M er en 0- bp størrelsesmarkør generert av Forever 0-bp Ladder Personalizer. Fig. 6B er et agarose gel fotografi som viser resultatene av 3 -RACE av DEG genet, som viser mismatch toleranse av dobbel spesifisitetsoligonukleotidet i PCR. Spor 1 representerer en primer med perfekt matchsekvens, sport 2-4 representerer primere med 3, 2 og 1 base mismatch og dets 3 -lav T m spesifisitetsporsjon, respektivt, og sport -7 representerer primere med, 3 og 2 base mismatch ved dets -høy T m spesifisitetsporsjon, respektivt. M er en 0-bp størrelsesmarkør generert av Forever 0-bp Ladder Personalizer. 1 Fig. 7A representer sekvensene av primerne for 3 -RACE av mus placentaspesifikk homeobox familiegener Psx1 og Psx2. Psx1- -40 og Psx1- -40 er konvensjonelle primere og Psx1- -41 og Psx2- -41 er primere konstruert i samsvar med foreliggende oppfinnelse. Fig. 7B er et agarose gel fotografi som viser resultatene av 3 -RACE av Psx1 og Psx2. Sport 1, 3 -RACE av Psx1 ved anvendelse av dobbel spesifisitetsoligonukleotid primer Psx1- -41; sport 2, 3 -RACE av Psx2 ved anvendelse av dobbel spesifisitetsoligonukleotid primer, Psx2- -41, spor 3, 3 -RACE av Psx1 ved anvendelse av konvensjonell primer Psx1- -40; og sport 4, 3 -RACE av Psx2 ved anvendelse av konvensjonell primer Psx2- -40. M er en 0-bp størrelsesmarkør generert av Forever 0-bp Ladder Personalizer. 2 Fig. 8 viser resultatene av direkte syklerende sekvensering for Psx1 og Psx2 gener fra mus placenta cdna pool ved anvendelse av dobbel spesifisitetsoligonukleotid primere Psx1- -41 (for Psx1) og Psx2- -41 (for Psx2) som en sekvenserende primer. 3 Fig. 9 viser resultatene av multipleks PCR ved anvendelse av 9 sett av cytokinfamilie genspesifikke doble spesifisitetsprimere. Spor 1, multipleks PCR for 9 cytokingener; spor 2, monopleks PCR for IL-3 (0 bp), sport 3, monopleks PCR for IL-1 ( bp); spor 4, monopleks PCR for IL-18 (0 bp); spor, monopleks PCR for IL-2 ( bp); spor 6, monopleks PCR for IL-2 (400 bp); spor 7, monopleks PCR for IL-6 (40 bp), spor 8, monopleks PCR for IL-19 (00 bp); spor 9, monopleks PCR for IL- 1β (0 bp); og spor, monopleks PCR for IL- (600 bp). M er en 0-bp størrelsesmarkør generert med Forever 0-bp Ladder Personalizer.
9 Fig. viser resultatene av PCR mangfoldiggjøringer av fusjonsglykoprotein (F) genet av human metapneumovirus (hmpv) ved anvendelse av dobbelspesifisitetsoligonukleotid primere. Spor 1, mål PCR ved anvendelse av hmpv -8 og hmpv 3-698 primersett; spor 2, mål PCR ved anvendelse av hmpv -8 og hmpv 3-07 primersett; spor 3, mål PCR ved anvendelse av human β-aktin primere; spor 4, mål PCR uten templat; og spor, mål PCR uten templat. 1 DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN Den foreliggende oppfinnelse vedrører generelt (a) et bredt spekter av framgangsmåter som anvender dobbel spesifisitetsoligonukleotid og (b) en dobbel spesifisitetsoligonukleotid dertil. Dobbel spesifisitetsoligonukleotid ifølge oppfinnelsen (heretter benevnt som DS oligo ) muliggjør at primere eller prober kan anneales til dets målsekvens med forbedret spesifisitet, slik at spesifisiteten av nukleinsyremangfoldiggjøring (spesielt PCR) og hybridiseringsreaksjoner kan forbedres signifikant. Oligonukleotid med dobbel spesifisitet (DS Oligo) I et aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en dobbelspesifisitet oligo- nukleotid som forbedrer annealingspesifisitet, kjennetegnet ved at det er representert med følgende generelle formel: 2 3 -X p -Y q -Z r -3 hvor, X p representerer en -høy T m spesifisitetsporsjon som har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på en initial måltemplat nukleinsyre for å hybridisere dermed, Y q representerer en separasjonsporsjon omfattende minst tre kontigøse universelle baser, Z r representerer en 3 -lav T m spesifisitetsporsjon som har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på nevnte initial templat nukleinsyre for å hybridisere dermed, p, q og r representerer antallet nukleotider, p representerer et heltall på minst 1, q representerer et heltall på minst 3 og r representerer et heltall på minst 3; og X, Y og Z er deoksyribonukleotid eller ribonukleotid; T m av -høy T m spesifisitetsporsjon er minst C høyere enn for 3 -lav T m spesifisitetsporsjon, hvor separasjonsporsjonen har den laveste T m av de tre porsjoner; hvor -høy T m spesifisitetsporsjon er lengre enn 3 -lav T m spesifisitetsporsjon; hvor
separasjonsporsjonen danner en ikke-baseparing under betingelser hvor -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon er annealet til initial måltemplat nukleinsyre, noe som muliggjør at -høy T m spesifisitetsporsjon separerer fra 3 -lav T m spesifisitetsporsjon i termer av annealingspesifisitet til initial måltemplat nukleinsyre, hvor annealingspesifisitet av oligonukleotidet til initial måltemplat nukleinsyre bestemmes dobbelt av -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon slik at den totale annealingspesifisitet av oligonukleotidet økes. Foretrukne utførelser av dette aspekt er angitt i underkravene 2-. Den foreliggende oppfinnelse vedrører også en fremgangsmåte for syntese av et nukleinsyremolekyl ved anvendelse av et dobbeltspesifisitets oligonukleotid med en templat-avhengig ekstensjonsreaksjon, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter trinnene: 1 2 (a) anneale nevnte dobbelspesifisitets oligonukleotid til et templat nukleinsyremolekyl, hvor nevnte dobbeltspesifisitets oligonukleotid er representert med følgende generelle formel: -X p -Y q -Z r -3 hvor, X p representerer en -høy T m spesifisitetsporsjon som har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på en templatnukleinsyre for å hybridisere dermed, Y q representerer en separasjonsporsjon omfattende minst tre kontigøse universelle baser, Z r representerer en 3 -lav T m spesifisitetsporsjon som har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på nevnte templat nukleinsyre for å hybridisere dermed, p, q og r representerer antallet nukleotider, og p representerer et heltall på minst 1, q representerer et heltall på minst 3 og r representerer et heltall på minst 3; og X, Y og Z er deoksyribonukleotid eller ribonukleotid; T m av -høy T m spesifisitetsporsjon er minst C høyere enn for 3 -lav T m spesifisitetsporsjon, hvor separasjonsporsjonen har den laveste T m av de tre porsjoner; hvor -høy T m spesifisitetsporsjon er lengre enn 3 -lav T m spesifisitetsporsjon; hvor separasjonsporsjonen danner en ikke-baseparing som ikke fungerer som et hybridiseringssete og som ikke reagerer med templatet for 3 baseparing, under betingelser hvor -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon er annealet til templat nukleinsyre, noe som muliggjør at -høy T m spesifisitetsporsjon separerer fra 3 -lav T m spesifisitetsporsjon i termer av annealingspesifisitet til templat nukleinsyre, hvor annealingspesifisitet av
11 oligonukleotidet bestemmes dobbelt av -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon slik at den totale annealingspesifisitet av oligonukleotidet økes; og (b) forlenge dobbeltspesifisitets oligonukleotidet til å syntetisere nukleinsyremolekylet som er komplementær til templat nukleinsyren. Foretrukne utførelser av fremgangsmåten er angitt i underkravene 12-. 1 2 Den foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelse av universelle baser for fremstilling av et dobbeltspesifisitets oligonukleotid med forbedret annealingspesifisitet for å muliggjøre at en annealingspesifisitet av dobbeltspesifisitets oligonukleotidet kan bestemmes dobbelt gjennom en struktur av dobbeltspesifisitets oligonukleotidet, hvor fremstillingen omfatter trinnene; (a) selektere en målnukleinsyresekvens; (b) designe en sekvens av en oligonukleotid som har (i) en hybridiserende sekvens som i hovedsak er komplementær til målnukleinsyren og (ii) en separasjonsporsjon omfattende minst tre kontigøse universelle baser, slik at separasjonsporsjonen intervenerer i hybridiseringssekvensen og danner tre porsjoner i oligonukleotidet; og (c) bestemme posisjonen av separasjonsporsjonen i oligonukleotidet for å muliggjøre at en porsjon ved -retningen av separasjonsporsjonen har en høyere Tm enn en porsjon i 3 -retningen av separasjonsporsjonen og å muliggjøre at separasjonsporsjonen har den laveste T m i de tre porsjoner, og tilveiebringer dermed en et oligonukleotid som har tre distinkte porsjoner med forskjellige T m -verdier fra hverandre hvor (i) en -høy T m spesifisitetsporsjon av oligonukleotidet har en hybridiserende nukleotidsekvens som i det vesentlige er komplementær til målnukleinsyren, (ii) en 3 -lav T m spesifisitetsporsjon av oligonukleotidet har en hybridiserende nukleotidsekvens som i det vesentlige er komplementær til målnukleinsyren; og (iii) separasjonsporsjonen av oligonukleotidet mellom -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon omfattende minst tre kontigøse universelle baser; - høy T m spesifisitetsporsjonen har en lengde av minst 1 nukleotider, separasjonsporsjonen har en lengde av minst 3 nukleotider; og 3 -lav T m 3 spesifisitetsporsjonen har en lengde av minst 3 nukleotider; T m av -høy T m spesifisitetsporsjon er minst C høyere enn for 3 -lav T m spesifisitetsporsjon, separasjonsporsjonen har den laveste T m i de tre porsjoner; -høy T m spesifisitetsporsjonen er lengre enn 3 -lav T m spesifisitetsporsjonen, hvormed annealing- spesifisiteten av oligonukleotidet til målnukleinsyren bestemmes dobbelt med både -høy T m spesifisitetsporsjonen og 3 -lav T m spesifisitetsporsjonen.
12 Termen dobbelspesifisitet med referanse til DS oligonukleotidet (heretter benevnt som DS oligo ) ifølge oppfinnelsen, anvendes heri for å beskrive dets dominerende trekk idet dets annealingsspesifisitet til en målsekvens dobbelt bestemmes av to separate porsjoner, det vil si -høy T m spesifisitetsporsjonen og 3 -lav T m spesifisitetsporsjonen. Generelt, annealingsspesifisiteten av primere eller prober styres av deres totale konsekutive sekvens. I motsetning, annealingsspesifisiteten av DS oligo bestemmes dobbelt med dets to porsjoner ( -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon) separert av separeringsporsjonen, hvor disse tre porsjoner er lokalisert i én oligonukleotidsekvens. Slik dobbelspesifisitet muliggjør at DS oligo kan fungere som en primer og probe som oppviser mye større spesifisitet, noe som gjør foreliggende oppfinnelse ny og oppfinnerisk over teknikkens stand. 1 2 Oppfinneren av foreliggende oppfinnelse har allerede utviklet ACP (annealing kontroll primer) for å forbedre annealingsspesifisitet som beskrevet i WO 03/003, hvis beskrivelse inkorporeres heri med henvisning. DS oligo ifølge foreliggende oppfinnelse er distinkt forskjellig fra ACPen med hensyn til følgende: (i) DS oligo har to spesifisitetsfunksjoner som kan hybridiseres med en målsekvens mens ACPen har én spesifisitetsporsjon; (ii) tre porsjoner i DS oligo er distinkt diskriminert i lys av T m mens porsjoner i ACPen ikke er det; (iii) DS-primere forlenges for å syntetisere et nukleinsyremolekyl som er komplementært til templatet kun idet annealing foregår ved både -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon, mens ACPen forlenges selv idet annealingen foregår ved 3 -endeporsjon; og (iv) annealing eller hybridiseringsspesifisiteten av DS oligo bestemmes dobbelt av de to separate porsjoner, det vil si -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon, mens ACPen styres kun av 3 -endeporsjon. Således, det skal anerkjennes at annealing eller hybridiseringsspesifisitet av DS oligo til dets målsekvens er langt høyere enn for ACPen, noe som gjør at DS oligo er ny og oppfinnerisk over ACPen.
13 Det påfallende trekk av DS oligo er at den har tre forskjellige porsjoner med distinkte egenskaper innen ett oligonukleotidmolekyl; -høy T m spesifisitetsporsjon, 3 -lav T m spesifisitetsporsjon og separeringsporsjon. DS oligo er nyttig innen et bredt spekter av framgangsmåter og analyser som involverer en templatavhengig ekstensjonsreaksjon. Termen en templatavhengig ekstensjonsreaksjon angir en reaksjon for å forlenge et oligonukleotidmolekyl hybridisert til en målsekvens ved å inkorporere suksessive nukleotider inn i dets ende-enhet hvor den forlengete sekvens bestemmes med en komplementær templatssekvens. 1 En skjematisk representasjon for prinsippene som styrer hybridiseringen (annealing) spesifisitet av DS oligoen er illustrert i fig. 1A. Med henvisning til fig. 1A, DS oligo vil bli beskrevet i mer detalj. Hvor kun -høy T m spesifisitetsporsjon av DS oligo anneales til et templat kan den ikke fungere som et primingsete for en templatavhengig ekstensjon, noe som resulterer i ingen forekomst av ekstensjon. 2 Idet -høy T m spesifisitetsporsjon av DS oligo anneales til en ikke-målsekvens, vil 3 - lav T m spesifisitetsporsjon som har en kortere sekvens sannsynligvis ikke anneale til ikke-målsekvensen. Grunnene for dette er at -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon er separert av separasjonsporsjonen i termer av annealingshendelser. Med andre ord, 3 -lav T m spesifisitetsporsjon er involvert i annealingshendelser i en relativ uavhengig måte fra -høy spesifisitetsporsjon og annealingen av 3 -lav T m spesifisitetsporsjon er mindre påvirket av annealingen av -høy T m spesifisitetsporsjon. I denne forbindelse, sannsynligheten for annealing av 3 -lav T m spesifisitetsporsjon til en ikke-målsekvens blir langt lavere. Idet kun 3 -lav T m spesifisitetsporsjon har en sekvens som er komplementær til et ikke-målsete, foregår heller ikke annealing under visse høye stringente betingelser, for eksempel stringentbetingelsere for annealing av -høy T m spesifisitetsporsjon. I
14 samsvar med en foretrukket utførelse er det fordelaktig å utføre templatavhengig ekstensjonsreaksjoner ved anvendelse av DS oligo under stringente betingelser med annealingstemperatur langt høyere enn T m av 3 -lav T m spesifisitetsporsjon. Idet både -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon har en sekvens som i hovedsak er komplementær til et templat, kan DS oligo anneales til templatet og således kan suksessfull ekstensjon forekomme. 1 Uten å ønske å være bundet av teori antas det at separasjonsporsjonen gjør 3 -lav T m spesifisitetsporsjon mer sensitiv til annealingsbetingelser (for eksempel temperatur og sekvenskomplimentaritet). I denne forbindelse, hyppigheten av ikkespesifikk hybridisering mellom 3 -lav T m spesifisitetsporsjon og ikke-målsekvensene blir langt lavere under visse annealing (eller stringenter) betingelser. Der hvor 3 -lav T m spesifisitetsporsjon og likeledes -høy T m spesifisitetsporsjon anneales til dets målsekvens, vil 3 -enden av 3 -lav T m spesifisitetsporsjon mer sannsynlig generere et sete som kan forlenges av DNA polymeraser. 2 Termen oligonukleotid som anvendt heri benevner en lineær oligomer av naturlige eller modifiserte monomerer eller bindinger, inkluderende deoksyribonukleotider, ribonukleotider og lignende, i stand til spesifikt å hybridisere med en målnukleotidsekvens, enten denne forekommer naturlig eller produseres syntetisk. Oligonukleotidet er fortrinnsvis enkelttrådet for maksimal effektivitet med hensyn til hybridisering. Fortrinnsvis, oligonukleotidet er en oligodeoksyribonukleotid. Oligonukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse kan utgjøres av naturlige forekommende dnmp (det vil si damp, dgm, dcmp og dtmp), nukeotidanaloger, eller nukleotidderivater. Oligonukleotidet kan også inkludere ribonukleotider. For eksempel, oligonukleotidet ifølge oppfinnelsen kan inkludere nukleotider med backbone-modifiseringer så som peptidnukleinsyre (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 36:66-68(1993)), fosforotioat DNA, fosforoditioat DNA, fosforamidat DNA, amidkoblet DNA, MMI-koblet DNA, 2'-O-metyl RNA, alfa-dna og metylfosfonat DNA, nukleotider med sukkermodifikasjoner så som 2'-O-metyl RNA, 2'-fluor RNA, 2'-amino RNA, 2'-O-alkyl DNA, 2'-O-allyl DNA, 2'-Oalkynyl DNA, heksose DNA, pyranosyl RNA, og anhydroheksitol DNA, og nukleotider
1 som har basemodifikasjoner så som C--substituerte pyrimidiner (substituenter inkluderer fluor-, brom-, klor-, jod-, metyl-, etyl-, vinyl-, formyl-, etynyl-, propynyl-, alkynyl-, tiazolyl-, imidazolyl-, pyridyl-), 7-deazapuriner med C-7 substituenter (substituenter inkluderer fluor-, brom, klor-, jod-, metyl-, etyl-, vinyl-, formyl-, alkynyl-, alkenyl-, tiazolyl-, imidazolyl-, pyridyl-), inosin og diaminopurin. 1 2 Termen primer som anvendt heri refererer til et oligonukleotid, som er i stand til å virke som et initieringspunkt for syntese idet det plasseres under betingelser hvor syntese av primerekstensjonsprodukt som er komplementær til en nukleinsyretråd (templat) er introdusert, det vil si i nærvær av nukleotider og et polymeriseringsmiddel, så som DNA polymerase, og ved en egnet temperatur og ph. Primeren er fortrinnsvis enkelttrådet for maksimal effektivitet med hensyn til mangfoldiggjøring. Fortrinnsvis, primeren er en oligodeoksyribonukleotid. Primeren ifølge oppfinnelsen kan omfatte naturlig forekommende dnmp (det vil si damp, dgm, dcmp og dtmp), modifisert nukleotid, eller ikke-naturlig nukleotid. Primeren kan også inkludere ribonukleotider. Primere må være tilstrekkelige lange til å prime syntese av ekstensjonsprodukter i nærvær av polymeriseringsmidlene. Den eksakte lengde av primere vil avhenge av mange faktorer, inkluderende temperatur, applikasjon og kilde for primer. Termen annealing eller priming som anvendt heri refererer til nær plassering av (apposisjon) som muliggjør at polymerasene polymeriserer nukleotider til et nukleinsyremolekyl som er komplementær til templatnukleinsyren eller en porsjon derav. Termen hybridisering som anvendt heri refererer til dannelse av en dobbelttrådet nukleinsyre fra komplementære enkelttrådete nukleinsyrer. Der er ingen tiltenkt forskjell mellom termene annealing og hybridisering, og disse termer vil anvendes om hverandre. Termen probe refererer til et enkelttrådet nukleinsyremolekyl som omfatter en porsjon eller porsjoner som i hovedsak er komplementære til en målnukleotidsekvens. Termen porsjon som anvendt heri i forbindelse med DS oligo ifølge oppfinnelsen refererer til en nukleotidsekvens separert av separasjonsporsjonen. Termen -høy
16 T m spesifisitetsporsjon eller 3 -lav T m spesifisitetsporsjon refererer til en nukleotidsekvens ved -enden eller 3 -enden av DS oligoen ifølge oppfinnelsen, respektivt, som er separert av separasjonsporsjonen. Termen -høy T m spesifisitetsporsjon i forbindelse med DS oligoen er tiltenkt å referere til en porsjon med den høyeste T m av disse tre porsjoner og som har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på templat nukleinsyren. Termen 3 -lav T m spesifisitetsporsjon i forbindelse med DS oligoen angir en porsjon med en lavere T m enn -høy T m spesifisitetsporsjon men høyere T m enn separasjonsporsjonen og som har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på templat nukleinsyren. 1 Termen T m som anvendt heri referer til smeltetemperaturen hvor halvparten av molekylene i en nukleinsyre dupleks er enkelttrådet. Termene høy T m og lav T m i forbindelse med porsjoner i DS oligoen er tiltenkt å beskrive en relativ T m -verdi, og ikke en absolutt T m -verdi. Det vil si, det er kun nødvendig at T m av - høy T m spesifisitetsporsjon er høy i forhold til den for 3 -lav T m spesifisitetsporsjon. 2 -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon er designert til å ha en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til et sete på en templat nukleinsyre for å hybridisere dermed. Termen i hovedsak komplementær refererer til DS oligoen anvendt heri for å angi at oligonukleotidmolekylet er tilstrekkelig komplementær til å hybridisere selektivt til en templat nukleinsyresekvens under de designerte annealingsbetingelser eller stringente betingelser, slik at det annealete oligonukleotid kan forlenges av en polymerase for å danne en komplementær kopi av templatet. Derfor, denne term har en forskjellig betydning fra perfekt komplementaritet eller beslektede termer derav. Det skal anerkjennes at -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon av DS oligo kan ha én eller flere mismatcher til et templat i en slik grad at DS oligo kan fungere som primer eller probe. Mest foretrukket, -høy T m spesifisitetsporsjon og/eller 3 -lav T m spesifisitetsporsjon av DS oligoen har en nukleotidsekvens som er perfekt komplementær til et sete på et templat, det vil si ingen mismatcher.
17 For suksessfull utførelse av DS oligoen, er det essensielt at T m av -høy T m spesifisitetsporsjon er høyere enn for den for 3 -lav T m spesifisitetsporsjon. Det er foretrukket T m av -høy T m spesifisitetsporsjon er i området fra 40 0 C til 80 0 C, mer foretrukket 40 0 C til 7 0 C, eller mer foretrukket 0 0 C til 68 0 C, og mer foretrukket 0 0 C til 6 0 C. Det er foretrukket at T m av 3 -lav T m spesifisitetsporsjon er i området fra 0 C til 40 0 C, mer foretrukket 1 0 C til 40 0 C, og mer foretrukket 0 C til 3 0 C. Fortrinnsvis, T m av -høy T m spesifisitetsporsjon er høyere ved minst 0 C, mer fortrinnsvis ved minst 0 C, mer fortrinnsvis ved minst 1 0 C, og mest foretrukket ved minst 0 C enn det for 3 -lav T m spesifisitetsporsjon. Fortrinnsvis, T m av -høy T m spesifisitetsporsjon er høyere -70 0 C, fortrinnsvis -70 0 C, mer foretrukket -60 0 C, enda mer foretrukket -0 0 C, enda mer foretrukket -40 0 C og mest foretrukket -40 0 C enn den for 3 -lav T m spesifisitetsporsjon. 1 2 I samsvar med en foretrukket utførelse er -høy T m spesifisitetsporsjon lengre enn 3 -lav T m spesifisitetsporsjon. Lengden av -høy T m spesifisitetsporsjon er fortrinnsvis 1 til 40 nukleotidenheter, mer fortrinnsvis 1 til nukleotidenheter, og mest foretrukket til 40 nukleotidenheter. Lengden av 3 -lav T m spesifisitetsporsjon er fortrinnsvis 3 til 1 nukleotidenheter, mer foretrukket til 1 nukleotidenheter, og mest foretrukket 6 til 12 nukleotidenheter. Separasjonsporsjonen som omfatter minst to universelle baser er delvis ansvarlig for fordelene og egenskapene med DS oligo. Termen universell base som anvendt heri refererer til én som er i stand til å danne basepar med hver av de naturlige DNA/RNA-baser med liten diskriminering der i mellom. Det er bredt kjent at nukleotider ved noen flertydige posisjoner av degenererte primere har blitt erstattet av universale baser så som deoksyinosin (Ohtsuka, E. et al., (198) J. Biol. Chem. 260, 260-2608; and Sakanari, J.A. et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 4863-4867), 1-(2 -deoksy-beta-d-ribofuranosyl)-3-nitropyrrol (Nichols, R. et al., (1994) Nature 369, 492-493) and -nitroindole (Loakes, D. et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4039-4043) for å løse designproblemene assosiert med degenererte primere, på grunn av at slike universalbaser er i stand til ikke-
18 spesifikk baseparing med alle fire konvensjonelle baser. Imidlertid, det har ikke blitt rapportert at disse universalbaser muliggjør å danne en porsjon i et oligonukleotidmolekyl for å generere en boblestruktur under annealing (hybridisering) eller mangfoldiggjøring, og deretter separere to motsatte tilgrensende sekvenser, som resulterer i en forbedring av annealingsspesifisiteten av primere eller prober til en målsekvens med dobbel spesifisitet gjennom to separate spesifisitets- (annealing) porsjoner. 1 2 3 I samsvar med en foretrukket utførelse er universalbasen i separasjonsporsjonen valgt blant gruppen omfattende deoksyinosin, inosin, 7-deaza-2 -deoksyinosin, 2- aza-2 -deoksyinosin, 2'-OMe inosin, 2'-F inosin, deoksy 3-nitropyrrol, 3-nitropyrrol, 2'- OMe 3-nitropyrrol, 2'-F 3-nitropyrrol, 1-(2 -deoksy-beta-d-ribofuranosyl)-3-nitropyrrol, deoksy -nitroindol, -nitroindol, 2'-OMe -nitroindol, 2'-F -nitroindol, deoksy 4- nitrobenzimidazol, 4-nitrobenzimidazol, deoksy 4-aminobenzimidazol, 4-aminobenzimidazol, deoksy nebularin, 2'-F nebularin, 2'-F 4-nitrobenzimidazol, PNA-- introindol, PNA-nebularin, PNA-inosin, PNA-4-nitrobenzimidazol, PNA-3-nitropyrrol, morfolino--nitroindol, morfolinonebularin, morfolinoinosin, morfolino-4-nitrobenzimidazol, morfolino-3-nitropyrrol, fosforamidat--nitroindol, fosforamidatnebularin, fosforamidatinosin, fosforamidat-4- nitrobenzimidazol, fosforamidat-3- nitropyrrol, 2'-0-metoksyetylinosin, 2'0-metoksyetylnebularin, 2'-0-metoksyetyl - nitroindol, 2'-0-metoksyetyl 4-nitrobenzimidazol, 2'-0-metoksyetyl 3-nitropyrrol, og kombinasjoner derav. Mer fortrinnsvis, den universale base eller ikke-diskriminerende baseanalog er deoksyinosin, 1-(2 -deoksy-beta-d-ribofuranosyl)-3- nitropyrrol eller -nitroindol, og mest foretrukket er deoksyinosin. Slike universalbaser kan være inneholdt i separasjonsporsjonen i en kontigøs måte eller på en avbrutt måte med andre nukleotider så som dmnper. Det er foretrukket at separasjonsporsjonen omfatter kontigøse nukleotider som har universalbaser, fortrinnsvis deoksyinosin. Det er kritisk at separasjonsporsjonen i DS oligoen har den laveste T m i de porsjoner, for at separasjonsporsjonen skal danne en ikke-baseparende boblestruktur under betingelser hvor -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon er annealet til templat nukleinsyren, noe som muliggjør at -høy T m spesifisitetsporsjon kan separere fra 3 -lav T m spesifisitetsporsjon med hensyn til annealingsspesifisitet
19 til templatnukleinsyren, hvorved annealingsspesifisiteten av oligonukleotidet bestemmes dobbelt av -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon slik at den totale annealingsspesifisitet av oligonukleotidet er betydelig forbedret. Fortrinnsvis, T m av separasjonsporsjonen er i området fra 3 0 C til 1 0 C, mer foretrukket 4 0 C til 1 0 C, og mest foretrukket 0 C til 0 C. I samsvar med en foretrukket utførelse, separasjonsporsjonen mellom -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon inneholder minst 3 universale baser, mer fortrinnsvis minst 4 universale baser, og mest foretrukket minst universale baser. I samsvar med en foretrukket utførelse inneholder spesifisitets- porsjonen 2- universelle baser, mer fortrinnsvis 3- universelle baser, enda mer foretrukket 4-8 universelle baser, og mest foretrukket -7 universelle baser. 1 2 Idet det er nødvendig med en primer eller probe med en lengre sekvens er fordelene med DS oligo mest foretrukket. For eksempel, i samsvar men en konvensjonell teknikk, en primer som har en nukleotidsekvens lengre enn 3 bp som en hybridiseringssekvens er svært disponert for å generere ikke-spesifikke mangfoldiggjøringer. I motsetning, DS oligo kan generere spesifikke mangfoldiggjøringer selv med lengre sekvenser, siden den bærer to hybridiseringssekvenser (det vil si -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon) separert fra hverandre med hensyn til molekylær interaksjon med templater (det vil si annealing). For eksempel, DS oligoen kan inneholde 3-4 bp av en hybridiserende sekvens som er komplementær til en målsekvens. I denne sammenhengen skal det anerkjennes at foreliggende oppfinnelse muliggjør at primere kan konstrueres med mye lengre sekvenser som vurderes å være ikke-praktiske i konvensjonelle primer designstrategier. I samsvar med en foretrukket utførelse, -høy T m spesifisitetsporsjon er 1 til 2 nukleotider i lengde, separasjonsporsjonen er 3 til 1 nukleotider i lengde, og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon er 3 til 1 nukleotider i lengde. 3 Mer foretrukket, -høy T m spesifisitetsporsjon er 1 til 2 nukleotider i lengde; spesifisitetsporsjonen er 3 til nukleotider i lengde; og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon er til 1 nukleotider i lengde. Mest foretrukket, -høy T m spesifisitetsporsjon er 1 til 2 nukleotider i lengde; separasjonsporsjonen er til 7 nukleotider i lengde; og 3 - lav T m spesifisitetsporsjon er 6 til nukleotider i lengde. I samsvar med en representerende og illustrerende DS oligo beskrevet i eksempler, er -høy T m
spesifisitetsporsjon ca. nukleotider i lengde; separasjonsporsjonen er ca. nukleotider i lengde; og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon er ca. 8 til nukleotider i lengde. I den mest foretrukne utførelse er DS oligo representert med følgende generelle formel: -X p -(di) q -Z r -3 (definisjoner og karakteristika av X p og Z r er de samme som beskrevet tidligere, di representerer deoksyinosin, (di) q representerer en separasjonsporsjon omfattende kontigøse nukleotider som har universelle baser og q er et heltall mellom -7). Interessant, foreliggende DS oligo har mismatch toleranse under stringente betingelser tilstrekkelig til å tolerere mismatching til dets målsekvens. 1 En skjematisk representasjon for prinsippene som styrer mismatch toleranse av DS oligo er illustrert i fig. 1B. Én eller flere, fortrinnsvis én til tre basemismatcher i -høy T m spesifisitetsporsjon kan tolereres under betingelser der både -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon er annealet til templatet. Én eller flere, fortrinnsvis én til to base mismatcher i 3 -lav T m spesifisitetsporsjon kan tolereres under betingelser der både -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon er annealet til templatet. Videre, én eller flere, fortrinnsvis én til fem base mismatcher i både -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon kan tolereres under betingelsene der både -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon er annealet til templatet. 2 3 For å påtvinge mismatch toleranse på DS oligo, er annealingsbetingelsene, spesielt annealingstemperaturen viktig. Annealing utføres under betingelser der annealing kun ved 3 -lav T m spesifisitetsporsjon ikke forekommer, men der annealing med alle porsjoner foregår idet -høy T m spesifisitetsporsjon og/eller 3 -lav T m spesifisitetsporsjon har én eller flere, ennå begrenset, mismatchede baser til dets målsete. DS oligoer som har mismatch toleranse er nødvendig for å mangfoldiggjøre eller detektere en nukleotidsekvens med genetisk diversitet. DS oligoen med mismatch toleranse kan anneales til målsekvenser som viser genetisk diversitet og resultere i suksessrik amplifisering og deteksjon av nukleotidsekvenser av interesse. Med andre ord, DS oligo som opprinnelig ble utviklet for dramatisk å forsterke spesifisitet av annealing og hybridisering kan også anvendes i prosesser som krever mismatch toleranse hvor annealing eller stringente betingelser hensiktsmessig illustreres.
21 1 I et annet aspekt beskrives en framgangsmåte for å muliggjøre en annealingsspesifisitet av et oligonukleotid til å dobbelt bestemmes gjennom en struktur av oligonukleotidet, hvor framgangsmåten omfatter trinnene: (a) selektere en målnukleinsyresekvens; (b) designe en sekvens av et oligonukleotid som har (i) en hybridiseringssekvens i hovedsak komplementær til målnukleinsyren og (ii) en separasjonsporsjon omfattende minst to universelle baser, slik at separasjonsporsjonen intervenerer i hybridiseringssekvensen og danner tre porsjoner av oligonukleotidet; og (c) bestemme posisjonen av separeringsporsjonen i oligonukleotidet for å muliggjøre at en porsjon ved -retningen av separasjonsporsjonen har en høyere T m enn en porsjon ved 3 -retningen av separasjonsporsjonen, og for å muliggjøre at separasjonsporsjonen har laveste T m av de tre porsjoner, for derved å tilveiebringe et oligonukleotid som har tre distinkte porsjoner med forskjellige T m - verdier fra hverandre, hvor (i) en -høy T m spesifisitetsporsjon av oligonukleotidet har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til målnukleinsyren, (ii) en 3 -lav T m spesifisitetsporsjon av oligonukleotidet har en hybridiserende nukleotidsekvens i hovedsak komplementær til målnukleinsyren; og (iii) separasjonsporsjonen av oligonukleotidet mellom -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon omfatter minst to universelle baser; og T m av -høy T m spesifisitetsporsjon er høyere enn for 3 -lav T m spesifisitetsporsjon, og separasjonsporsjonen som har den laveste T m av de tre porsjoner, hvor annealingsspesifisitet av oligo- nukleotidet til målnukleinsyren bestemmes dobbelt med både -høy T m spesifisitetsporsjon og 3 -lav T m spesifisitetsporsjon. 2 Den foreliggende framgangsmåte tilveiebringer en ny løsning for dramatisk å øke annealingsspesifisitet av et oligonukleotid som skal hybridisere med dets målsekvens. Foreliggende framgangsmåte uttrykkes også som en framgangsmåte for å forbedre en annealingsspesifisitet av et oligonukleotid. Videre, beskrives en framgangsmåte som anvender en separasjonsporsjon omfattende minst to universelle baser for å forbedre annealingsspesifisitet av et oligonukleotid hybridisert til en målsekvens. 3 Den foreliggende framgangsmåte utføres for å framstille DS oligo beskrevet ovenfor. Det er således av interesse å unngå unødvendig overflødighet, og de felles beskrivelser av disse repeteres ikke, men inkorporeres i denne beskrivelse i framgangsmåten som om de ble repetert.