BRUKSANVISNING FOR FERDIGLAGDE AGARSKÅLER PA-257481.03 Rev.: Sep 2011 BD CHROMagar Orientation Medium BRUKSOMRÅDE BD CHROMagar Orientation Medium er et ikke-selektivt medium for isolering, direkteidentifisering, differensiering og kvantitering av urinveisspatogener. BD CHROMagar Orientation Medium gjør det mulig å differensiere og identifisere Escherichia coli og Enterococcus uten konfirmeringstesting. PROSEDYRENS PRINSIPPER OG FORKLARING Mikrobiologisk metode. Escherichia coli, enterokokker og Klebsiella-Enterobacter-Serratia og Proteus-Morganella- Providencia gruppene er de vanligste organismene som forårsaker urinveisinfeksjoner (= UVI). Seksti til 70 % av UVI forårsakes av E. coli i renkulture, eller sammen med enterokokker. Staphylococcus saprophyticus og Streptococcus agalactiae har blitt oppdaget, riktignok mindre ofte, i UVI hos kvinner. På grunn av ulik antimikrobiell resistens for stoffene det gjelder, er identifisering av arter ved bruk av flere biokjemiske tester nødvendig for effektiv antimikrobiell terapi. Dette er en av de mest tidkrevende oppgavene i laboratorier som behandler urinprøver. De vanligst isolerte artene eller organismegruppene produserer karakteristiske enzymer. Det er derfor mulig å identifisere disse organismene på artsnivå med et begrenset antall substratfermentering- eller forbrukstester. 1,2 Enkelte av organismene det gjelder, produserer enzymer, enten for metabolisering av laktose eller glukosider eller begge deler, mens andre ikke produserer noen av disse enzymene. For eksempel produserer E. coli enzymer for laktosemetabolisering, men er negativ for ß- glukosidase. Andre medlemmer av familien Enterobacteriaceae er positive for ß-glukosidase, men inneholder ikke de nødvendige enzymene for laktosefermentering, og andre kan inneholde begge enzymtypene, eller ingen av dem. Beta-glukosidaser finnes også i Gram-positive kokker, som Enterococcus spp. og Streptococcus agalactiae. Tryptofandeaminase (TDA) er et enzym som karakteristisk finnes i organismegruppen Proteus-Morganella-Providencia. Funksjonsevalueringer har vist at BD CHROMagar Orientation Medium er overlegen for vanlig brukte differensieringsmedier for isolering, differensiering og kvantitering av UVI-patogener, som CLED-agar eller en kombinasjon av blod- og MacConkey-agarer. 3-5 BD CHROMagar Orientation Medium gjør det mulig å identifisere E. coli og enterokokker direkte på isoleringsskålen. Videre er presumptiv identifisering av de fleste Staphylococcus saprophyticusog S. agalactiae-stammene, i tillegg til gruppene Klebsiella-Enterobacter-Serratia (= KES) og Proteus-Morganella-Providencia (= PMP) mulig ved hjelp av fargen på kolonien og mediet. Ettersom BD CHROMagar Orientation Medium er ikke-selektivt, vil andre UVI-patogener vokse, men det er nødvendig med biokjemiske tester for identifisering av disse. CHROMagar Orientation Medium ble utviklet av A. Rambach og selges av BD under en lisensavtale med CHROMagar, Paris, Frankrike. I BD CHROMagar Orientation Medium tilføres næringsstoffene av spesielt utvalgte peptoner. Kromogenblandingen består av syntetiske substrater (kromogener), som slipper ut ulike fargesammensetninger når de brytes ned av bestemte mikrobielle enzymer, og på denne måten sørger den for direkte differensiering av bestemte arter eller oppdagelse av bestemte organismegrupper med bare et minimum av konfirmerende tester. PA-257481.03-1 -
REAGENSER BD CHROMagar Orientation Medium Sammensetning* per liter renset vann Kromopepton 16,1 g Kromogenblanding 1,3 Agar 15,0 ph 6,9 +/- 0,2 *Justert og/eller tilsatt som påkrevd for å oppfylle funksjonskriteriene. FORHOLDSREGLER. Kun til profesjonelt bruk. agarskålene må ikke anvendes dersom de viser tegn til mikrobiell kontaminering, misfarging, uttørking, sprekkdannelse eller andre tegn til svekkelse. Se dokumentet GENERELLE BRUKSANVISNINGER for aseptiske håndteringsprosedyrer, biologiske farer og avhending av brukte produkter. OPPBEVARING OG HOLDBARHET Agarskålene oppbevares etter mottak i originalinnpakningen på et mørkt sted med temperatur fra 2 til 8 C, inntil de skal brukes. Unngå frost og overopphetning. Agarskålene kan inokuleres frem til utløpsdatoen (se etiketten på pakken) og inkuberes i de anbefalte inkubasjonstider. Agarskåler fra åpnede stabler på 10 skåler kan brukes i én uke når de oppbevares på et rent sted med temperatur på 2 til 8 C. BRUKERKVALITETSKONTROLL Inokulerer representative prøver med følgende stammer (se dokumentet GENERELLE BRUKSANVISNINGER for detaljer). Inkuber skålene aerobt i snudd stilling ved 35 til 37 C i 20 til 24 timer. Stammer Escherichia coli ATCC 25922 Enterobacter cloacae ATCC 13047 Proteus mirabilis ATCC 14153 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Streptococcus agalactiae ATCC 12386 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Staphylococcus saprophyticus ATCC 15305 (= NCTC 10516) Ikke-inokulert Vekstresultater God til fremragende vekst; middels til store kolonier, mørk rosa til rosa, transparente God til fremragende vekst; middels store, dyp blå kolonier med eller uten fiolette ringer God til fremragende vekst; middels store kolonier, bleke til beige, omgitt av en ravgul til brun ring. På steder med tett vekst kan mediet være fullstendig ravgult til brunt. Sverming er delvis til fullstendig hemmet. God til fremragende vekst; små kolonier, blågrønn til blå Ganske god til god vekst; knappenålsstørrelse til små kolonier, lys blågrønn til lys blå, med eller uten ringer God til fremragende vekst; middels til små kolonier med naturlig farge (hvit til kremfarget) Ganske god til god vekst; små kolonier, ugjennomskinnelig, lys rosa til rosa Fargeløs til svært lys ravgul, transparent PROSEDYRE Materialer som følger med BD CHROMagar Orientation Medium (90 mm Stacker-skåler). Mikrobiologisk kontrollert. Materialer som ikke følger med Supplerende vekstmedier, reagenser og laboratorieutstyr etter behov. PA-257481.03-2 -
Prøvetyper Dette mediet brukes utelukkende til kvantitering og differensiering av bakterier i urin. Midtstrømseller kateterurin, eller urin som er hentet ved suprapubisk blærepunksjon kan brukes (se også FUNKSJONSDATA OG PROSEDYRENS BEGRENSNINGER). Vær nøye med aseptiske teknikker ved innsamling av urinprøver. Urinen må strykes direkte på mediet (ikke senere enn 2 timer etter innsamlingen), ellers må den kjøles ned (ikke lenger enn 24 timer) for å unngå overvekst av smittefarlige stoffer eller forurensninger før inokulering av dette mediet. Testprosedyre Bruk av kalibrerte øser eller andre vanlige teknikker for utsåing av urinprøver er obligatorisk for å oppnå isolerte kolonier med deres typiske farger og fasonger. Samle inn en prøve av ufortynnet urin som er godt blandet med en kalibrert øse (0,01 eller 0,001 ml). Sørg for korrekt innhenting av prøven med øsen. Inokuler prøven ned på midten av skålen, i en enkelt stripe, der inokulatet spres ytterligere ut fra. 6,7 Inkuber de inokulerte skålene aerobt i snudd stilling ved 35 til 37 C i 20 til 24 timer. Unngå eksponering for lys under inkuberingen, da dette kan ødelegge kromogenene. Så snart fargen på koloniene er utviklet, er det akseptabelt å eksponere for lys. Resultater Etter inkubering skal skålene vise isolerte kolonier i de områdene der inokulatet ble riktig fortynnet. Tabell 1 og skjema 1 skal brukes for identifisering eller differensiering, og som en retningslinje for ytterligere konfirmerende tester. Det kan brukes en Gram-farging og mikroskopi for å bekrefte resultatene. Tabell 1 Retningslinjer for identifisering, basert på ulike kolonifarger Organisme Utseende på BD CHROMagar Orientation Medium E. coli a Middels til store, mørk rosa til rosa, transparente kolonier med eller uten ringer i det omliggende mediet KES b -gruppen Middels store, blå til mørk blå kolonier, med eller uten fiolette ringer PMP c -gruppen Bleke til beige kolonier som er omgitt av brune ringer d Enterococcus Små, blågrønne kolonier S. agalactiae Lys blågrønn til blå, knappenålsstørrelse til små kolonier, med eller uten ringer S. saprophyticus (de fleste Lys rosa til rosa, små, stammene) ugjennomskinnelige kolonier, med eller uten ringer Annet (inkludert gjærsopper) Naturlig (kremfarget) pigmentering For fotnotene a-h, se skjema 1 Konfirmerende tester (Nødvendig for ytterligere differensiering) BBL CRYSTAL E/NF for differensiering innen slekten Indol, H 2 S e, ODC f, BBL CRYSTAL E/NF for differensiering innen slekten PYR g 5 µg novobiocin-lapp h Egnede biokjemiske eller serologiske identifikasjonstester Bekreftende tester Utfør konfirmerings testene etter som det er påkrevd (tabell 1, skjema 1). Ikke tilsett påvisingsreagens direkte på koloniene på BD CHROMagar Orientation Medium. Testene bør i stedet utføres på filterpapir med vekst fra de respektive koloniene. For E. coli-kolonier som er mørk rosa til rosa, men som er knappenåls til små i størrelse, skal det ikke brukes Kovacs indol-reagens, da kolonifargen kan forstyrre den røde fargen for en PA-257481.03-3 -
positiv indol-test; i stedet skal det brukes dimetylaminocinnamaldehyd (DMACA) indol-reagens (grønn = positiv). Hvis andre konfirmeringstester eller biokjemiske identifikasjonssystemer brukes, må anvisningene som følger med disse testene eller systemene, følges. Utfør bare konfirmeringstester for Enterococcus hvis det er påkrevd å bestemme arten utover slektsnivået. Skjema 1: Retningslinjer for utføring av identifiseringstester på utvalgte organismer Utseende, koloni Liten, rosa, 5 µg novobiocinlapp S. sensitiv S. intermedius, ugjennomskinnelig simulans Fargeløse til beige kolonier, oransjebrunt medium PMP-gruppe resistent DMACA i indol-test PA-257481.03-4 - S. sapro phyticus, S. xylosus grønn (positiv) H 2 S-positiv e H 2 S-negativ e fargeløs til rosa (negativ) ODC-positiv f ODC-negativ f BBL CRYSTAL GP for differensiering innen slekten P. vulgaris Providencia spp., Morganella spp. P. mirabilis P. penneri a Se Prosedyrens begrensninger b KES = Klebsiella-Enterobacter-Serratia-gruppen c PMP = Proteus-Morganella-Providencia-gruppen d Den ravgule til brune fargen er forårsaket av positiv tryptofandeaminase (TDA), felles for alle organismer i PMP-gruppen. Ca. 50 % av P. vulgaris-stammene produserer blå kolonier på et ravgult til brunt medium. e Konvensjonell hydrogensulfidtest. f Konvensjonell ornitindekarboksylasetest. g Pyroglutamattest for pyrrolidonyl-arylamidase. h Spredningsinokuler en Mueller Hinton II Agar-skål med isolatet. Plasser en novobiocin (5 µg lapp) på den inokulerte skålen. Inkuber i 18 til 24 timer ved 35 til 37 C og bestem størrelsen på hemningssonen. (resistent: 16 mm, sensitiv: > 16 mm). i DMACA= Dimethylaminocinnamaldehyd-reagens for indol-produksjon. Tilsett reagens på filterpapiret og gni én koloni inn på området som inneholder reagens på filterpapiret. Vent i 10 20 sek. En grønn farge indikerer produksjon av indol (rød eller fargeløs = negativ). Beregning og tolking av resultater 6,7 Tell antallet kolonier (cfu) på skålen. Hvis det ble brukt en øse på 0,01 ml, er hver resultatkoloni representativ for 100 CFU/ml; hvis det ble brukt en øse på 0,001 ml, er hver koloni representativ for 1000 CFU/ml med urin. 7 Midtstrøms- og kateterurin: Gjeldende retningslinjer indikerer at for ett enkelt isolat, vil en tetthet på 10 5 cfu/ml indikere infeksjon, < 10 5 cfu/ml vil indikere forurensning fra urinrør eller vagina, og mellom 10 4 til 10 5 CFU/ml vil måtte reevalueres, basert på klinisk informasjon. 7 Forurensende bakterier vil vanligvis opptre i lavt antall, som varierer i kolonimorfologi. Urin som er innsamlet ved suprapubisk blærepunksjon: Siden blæren er steril hos ikke-infiserte individer, vil ethvert funn av cfu indikere en infeksjon. Urinveispatogener vil vanligvis vise høye tall med uniform kolonimorfologi og farge på dette mediet. FUNKSJONSDATA OG PROSEDYRENS BEGRENSNINGER BD CHROMagar Orientation Medium er et kromogent medium for isolering, direkte identifisering, differensiering og kvantitering av vanlige urinveispatogener. Mediet passer for isolering av mange mikroorganismer som vokser aerobt som Enterobacteriaceae, Pseudomonas og andre ikke-fermenterende Gram-negative staver, enterokokker, stafylokokker og mange andre fra urinprøver. Funksjonsevalueringer har vist at BD CHROMagar Orientation Medium
har fordeler i forhold til andre differensieringsmedia som brukes til isolering, differensiering og kvantitering av UVI-patogener, som CLED Agar eller en kombinasjon av blod- og MacConkeyagarer. 3-5 BD CHROMagar Orientation Medium muliggjør differensiering og identifisering av E. coli og enterokokker uten konfirmeringstesting, basert på kriteriene for identifisering som bestemt av CLSI-standarden M35-A, Abbreviated Identification of Bacteria and Yeast; Approved Guideline. 8 Presumptiv identifisering av S. saprophyticus, S. agalactiae, Klebsiella- Enterobacter-Serratia (KES) og Proteus-Morganella-Providencia (PMP)-gruppene er mulig ved bruk av kolonimorfologi, pigmentering og misfarging av mediet. Siden de fleste vanlige urinveisinfeksjoner forårsakes av E. coli og/eller enterokokker, vil bruk av dette mediet redusere arbeidsmengden og tiden for inokulering og avlesingsidentifikasjonssystemer betydelig, noe som er nødvendig når konvensjonelle media brukes. Funksjonsresultater 4,9,10 Den mikrobiologiske funksjonen for BD CHROMagar Orientation Medium og et kromogent medium fra en konkurrent ble sammenlignet med Columbia-agar med 5 % saueblod og MacConkey-agar uten krystallfiolett for kvantitering og presumptiv identifisering av bakterier som forårsaket urinveisinfeksjoner. 4 Av totalt 658 kliniske urinprøver ble det ikke funnet vekst i 118 prøver, vekst med celleantall på 10 5 CFU/ml i 402 prøver og vekst med celleantall på < 10 5 CFU/ml i 138 prøver. Av prøvene med celleantall på 10 5 CFU/ml, var 163 renkulturer og 239 blandede kulturer. Totalt 266 Escherichia coli-isolater ble funnet på begge de kromogene mediene, 260 var isolert på blodagar og 248 var isolert på MacConkey-agar. Én stamme (0,4 %) utviklet ikke den forventede rosa fargen på BD CHROMagar Orientation Medium, og 23 stammer (8,7 %) utviklet ikke den forventede rosa fargen på konkurrentens medium. Enterokokker (BD CHROMagar Orientation Medium, n = 266; konkurrentmedium, n = 265) produserte små, blågrønne kolonier på begge de kromogene mediene. Femti av de blandede kulturene inneholdt enterokokker som ble påvist kun på de kromogene mediene. Klebsiella- Enterobacter-Serratia (KES) og Proteus-Morganella-Providencia (PMP)-gruppene kunne identifiseres på begge de kromogene mediene. Av 66 isolater i KES-gruppen vokste 63 med den forventede fargen på BD CHROMagar Orientation Medium, og 58 av 64 isolater vokste med den forventede fargen på konkurrentmediet. Andre mikroorganismer krevde ytterligere identifiseringstester. I en annen funksjonsevaluering med totalt 421 kliniske urinprøver, hvorav 286 viste vekst av bakterier eller gjærsopper, ble BD CHROMagar Orientation Medium sammenlignet med BD Columbia Agar med 5 % saueblod. 9 På det kromogene mediet forekom det 483 isolater, og 447 stammer ble isolert på blodagarmediet. Stammene ble biokjemisk identifisert. Av E. colistammene ble 95 % korrekt identifisert ved den lys rosa til rosa kolonifargen, mens de gjenværende E. coli-stammene var ikke-pigmenterte. Alle isolatene av Enterococcus spp. viste den typiske blå til blågrønne kolonifargen. Isolater av Streptococcus agalactiae produserte små, lys blå til blågrønne kolonier, og var differensiert fra enterokokker med en negativ PYR-test. Alle isolatene av Staphylococcus saprophyticus og S. simulans produserte små, rosa, ugjennomsiktige kolonier og ble differensiert med en novobiocin-test og artsidentifisert med biokjemiske tester. I en intern blindstudie, som omfattet testing av over 900 bakteriestammer, utsådd i urin, var sensitivitet og spesifisitet for BD CHROMagar Orientation Medium-identifisering av E. coli basert bare på kolonifarge og morfologi, henholdsvis 97 % og 99 %, og for Enterococcus var sensitivitet og spesifisitet for identifisering henholdsvis 99 % og 97 %, (se tabellen). 10 Organisme Sensitivitet % (95 % konfidensintervall) E. coli 277/286 96,9 % (94,1 98,6 %) Enterococcus 319/324 98,5 % (96,4 99,5 %) Spesifisitet % (95 % konfidensintervall) 638/645 98,9 % (97,8 99,6 %) 603/622 97 % (95,3 98,2 %) PA-257481.03-5 -
Prosedyrens begrensninger Siden dette mediet er ikke-selektivt, vil andre UVI-patogener vokse. Kolonier som viser sin naturlige farge, og som ikke reagerer med de kromogene substratene på BD CHROMagar Orientation Medium, må differensieres ytterligere med egnede, biokjemiske eller serologiske tester. Se referansene. 1,2 E. coli-kolonier som er mørk rosa til rosa, men som har knappenåls- til liten størrelse, krever ytterligere konfirmeringstester, som spot-indol (DMACA indol-reagens). Gram-negative staver, bortsett fra de som hører til i KES-gruppen kan produsere store, blå kolonier på BD CHROMagar Orientation Medium, og krever derfor ytterligere biokjemiske tester for identifisering. 11 I svært sjeldne tilfeller kan Listeria monocytogenes eller andre Listeria-arter finnes i urin (f.eks. etter abort på grunn av disse agensene). Listeria vil produsere små, blå til blågrønne kolonier som er PYR-negative, og som ligner på Streptococcus agalactiae. Det kan derfor være nyttig å utføre en Gram-farging av alle stammer som produserer bittesmå til små, blå til blågrønne, PYRnegative kolonier, på dette mediet. Tilstedeværelsen av Gram-positive staver kan indisere Listeria-arter, men ytterligere biokjemiske tester er nødvendig for å bekrefte identifiseringen av disse. Svært sjeldent kan isolater av Aeromonas hydrophila produsere rosa kolonier. De kan differensieres fra E. coli med en oksidase-test (Aeromonas = positiv; E. coli = negativ). Av og til produserer koagulase-negative stafylokokker, bortsett fra S. saprophyticus, f.eks. S. simulans, S. xylosus og S. intermedius, små, rosa, ugjennomskinnelige kolonier. Det er derfor nødvendig å utføre ytterligere tester (se skjema 1) på disse isolatene. BD CHROMagar Orientation Medium vil ikke støtte veksten av organismer med kravstore næringsbehov, som Neisseria, Haemophilus eller Mycoplasma spp. Bruken av dette mediet for ikke-kliniske eller kliniske prøver, bortsett fra urin, er ikke dokumentert. Før førstegangs bruk av BD CHROMagar Orientation Medium, anbefaler vi øving i typiske koloniutseender med definerte stammer, f.eks. stammene som er nevnt under BRUKERKVALITETSKONTROLL. REFERANSER 1. Isenberg, H.D. (ed.). 1992. Clinical Microbiology Procedures Handbook, vol. 1. American Society for Microbiology. Washington, DC. 2. Forbes, B.A., D.F. Sahm, and A.S. Weissfeld. 1998. Bailey & Scott s diagnostic microbiology, 10th ed. Mosby, Inc., St. Louis. 3. Merlino, J., S. Siarakas, G. J. Robertson, G. R. Funnell, T. Gottlieb, and R. Bradbury. 1996. Evaluation of CHROMagar Orientation for differentiation and presumptive identification of gram-negative bacilli and Enterococcus species. J. Clin. Microbiol. 34: 1788-1793. 4. Hengstler, K.A., R. Hammann, and A.-M. Fahr. 1997. Evaluation of BBL CHROMagar Orientation medium for detection and presumptive identification of urinary tract pathogens. J. Clin. Microbiol. 35: 2773-2777. 5. Samra, Z., M. Heifetz, J. Talmor, E. Bain, and J. Bahar. 1998. Evaluation of use of a new chromogenic agar in detection of urinary tract pathogens. J. Clin. Microbiol. 36: 990-994. 6. Clarridge, J.E., M.T. Pezzlo, and K.L. Vosti. 1987. Cumitech 2A, Laboratory diagnosis of urinary tract infections. Coordinating ed., A.S. Weissfeld. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 7. Forbes, B.A., and P.A. Granato. Processing specimens for bacteria. 1995. In: Murray, P. R., E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 8. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved Guideline M35. Abbreviated identification of bacteria and yeast, CLSI, Wayne, PA.Search for latest version at www.clsi.org PA-257481.03-6 -
9. Data i arkiv. BD Diagnostic Systems Europe, Heidelberg, Germany. 10. Data i arkiv. BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA. 11. Abbott, S.L. 2003. Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Plesiomonas, and other Enterobacteriaceae. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. EMBALLASJE/BESTILLING BD CHROMagar Orientation Medium Kat. nr 257481 Ferdiglagde agarskåler, 20 stk. Kat. nr 254107 Ferdiglagde agarskåler, 120 stk. YTTERLIGERE INFORMASJON Kontakt din lokale BD-representant for ytterligere informasjon. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50 Fax: +49-62 21-30 52 16 Reception_Germany@europe.bd.com http://www.bd.com http://www.bd.com/europe/regulatory/ CHROMagar is a trademark of Dr. A. Rambach. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are property of Becton, Dickinson and Company. 2011 BD PA-257481.03-7 -