BD Mueller Hinton Chocolate Agar

Transkript

1 BRUKSANVISNING - FERDIGLAGDE AGARSKÅLER PA Rev.: Sep 2011 BRUKSOMRÅDE brukes til isolering og kultivering av kravstore bakterier fra kliniske prøver, med kravstore næringsbehov. Det kan også brukes til resistenstesting av Neisseria gonorrhoeae. PROSEDYRENS PRINSIPPER OG FORKLARING Mikrobiologisk metode. På grunn av at kliniske mikrobiologilaboratorier tidlig på 1960-tallet brukte et bredt utvalg av prosedyrer for resistenstesting av bakterier overfor antibiotika og kjemoterapeutiske midler, utviklet Bauer, Kirby og andre en standardisert prosedyre, der Mueller Hinton Agar, et medium som opprinnelig var utviklet for isolering av gonokokker, ble valgt som testmedium. 1-4 En senere, internasjonal samarbeidsundersøkelse bekreftet verdien av Mueller Hinton Agar for dette formålet, på grunn av den relativt gode reproduserbarheten ved mediet, oppskriftens enkelheten og mengden av eksperimentelle data som hadde blitt samlet inn ved bruk av dette mediet. 5 I følge CLSI er det anbefalte mediet for agardiffusjonsresistenstesting av Streptococcus pneumoniae Mueller Hinton Agar med 5 % saueblod. Det anbefalte mediet for Haemophilus influenzae er Haemophilus Test Medium (HTM) Agar. Brytningspunktene er vedlagt CLSIdokumentet M100 (M2), som følger med CLSI-dokumentet M2, Prestasjonsstandarder for antimikrobiell resistenstesting med agarskåler, 7. utgave; Godkjent standard. 6 Det anbefalte mediet for Neisseria gonorrhoeae er GC Agar med et definert vekstsupplement. I henhold til andre data kan Mueller Hinton Agar med hemin og Iso-VitaleX brukes for rutineresistenstesting av N. gonorrhoeae overfor penicillin og spectinomycin. 7 Mueller Hinton Agar har, når den er supplementert med oppvarmet blod eller hemoglobin og vekstfaktorer (f.eks. BD IsoVitaleX), vært anbefalt som et ikke-selektivt medium for isolering av Neisseria og Haemophilus. 8 I tilføres næringsstoffer ved hjelp av storfeekstrakt og kaseinpeptoner. Stivelse absorberer giftige stoffer som fettsyrer, trukket ut fra bomullspinner. Hemoglobin sørger for X-faktoren. BD IsoVitaleX tilfører vitaminer og vekstfaktorer, inkludert V-faktoren (= NAD), som er nødvendig for vekst av Haemophilus influenzae. REAGENSER Sammensetning* per liter renset vann Storfeekstrakt 2,0 g Syrehydrolysat fra kasein 17,5 Stivelse 1,5 Hemoglobin 10,0 IsoVitaleX 10,0 ml Agar 17,0 g ph 7,3 +/- 0,2 *Justert og/eller tilsatt som påkrevd for å oppfylle funksjonskriteriene. PA

2 BD IsoVitalex-tilsetning inneholder følgende vekstfaktorer (sammensetning* per liter renset vann): Vitamin B 12 0,01 g L-glutamin 10,0 Adenin 1,0 Guanin hydroklorid 0,03 p-aminobenzosyre 0,013 Nicotinamid adenin dinucleotid (NAD) 0,25 Tiamin pyrofosfat 0,1 Jernnitrat 0,02 Tiamin hydroklorid 0,003 Cystein hydroklorid 25,9 L-cystin 1,1 Glukose 100,0 *Justert og/eller tilsatt som påkrevd for å oppfylle funksjonskriteriene. FORHOLDSREGLER. Kun til profesjonelt bruk. agarskålene må ikke anvendes dersom de viser tegn til mikrobiell kontaminering, misfarging, uttørking, sprekkdannelse eller andre tegn til svekkelse. Overdreven skrumping av dette mediet, som følge av uttørking, kan føre til gale resistensresultater. Se dokumentet GENERELLE BRUKSANVISNINGER for aseptiske håndteringsprosedyrer, biologiske farer og avhending av brukte produkter. OPPBEVARING OG HOLDBARHET Agarskålene oppbevares etter mottak i originalinnpakningen på et mørkt sted med temperatur fra 2 til 8 C, inntil de skal brukes. Unngå frost og overopphetning. Agarskålene kan inokuleres frem til utløpsdatoen (se etiketten på pakken) og inkuberes i de anbefalte inkubasjonstider. Agarskåler fra åpnede stabler på 10 skåler kan brukes i én uke når de oppbevares på et rent sted med temperatur på 2 til 8 C. BRUKERKVALITETSKONTROLL Inokulatrepresentative prøver med følgende stammer (se dokumentet GENERELLE BRUKSANVISNINGER for detaljer). Inkuber agarskålene ved 35 ± 2 C i en aerob atmosfære med karbondioksid. Les av platene etter 18 til 24 og etter 42 til 48 timers inkubering. Stammer Haemophilus influenzae ATCC Neisseria gonorrhoeae ATCC Neisseria meningitidis ATCC Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 Ikke-inokulert Vekstresultater Ganske god til fremragende vekst Sjokoladebrun, gjennomskinnelig, kan være lett uensartet Se Testprosedyre for inokulering og inkubering av resistenstester. Teststamme Resistenslapper Sonestørrelse* (mm) Neisseria gonorrhoeae ATCC Penicillin P Spectinomycin SPT * Sonestørrelser basert på resultater fra minst 3 ulike partier av PROSEDYRE Materialer som følger med (90 mm Stacker-skåler). Mikrobiologisk kontrollert. Materialer som ikke følger med Supplerende vekstmedier, reagenser og laboratorieutstyr etter behov. PA

3 Prøvetyper kan i prinsippet brukes for alle prøvetyper fra infeksjoner som mistenkes å inneholde organiser med kravstore næringsbehov, spesielt, men ikke bare, for prøver fra primært sterile steder i kroppen (f.eks. cerebrospinalsvæske, abscesser) og som et subkulturmedium fra blodkulturer. Hovedbruksområdet for denne er for ikke-selektiv isolering av Neisseria, Haemophilus, og andre bakterier som ikke kan vokse på blodagarmedia som brukes rutinemessig, som Columbia Agar med 5 % saueblod. (Se også FUNKSJONSDATA OG PROSEDYRENS BEGRENSNINGER). Bruken av dette mediet for rutinemessig resistenstesting av Neissseria gonorrhoeae med penicillin G og spectinomycin krever at det brukes renkulturer. Ikke inokuler med prøven for direkte resistenstesting! Prøvesamling og transport Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis, Haemophilus, og andre organismer med kravstore næringsbehov er sensitive overfor negative forhold i omgivelsesmiljøet. Det må derfor brukes egnede transportmedia for alle prøver. Prøvene må sendes til laboratoriet så raskt som mulig, og må ikke være eldre enn 24 timer, selv om det brukes transportmedia. Den optimale transporttemperaturen er 20 til 25 C. Må ikke nedkjøles! 9,10 Testprosedyre Ved isolering av organismer med kravstore næringsbehov må prøven sås ut så snart som mulig etter mottak i laboratoriet. Primærskålen brukes først og fremst til å isolere renkulturer fra prøver som inneholder blandet flora. Hvis materialet kultiveres direkte fra en bomullspinne, kan den som alternativ rulles over et lite område ved kanten av overflaten, og deretter spres fra dette inokulerte området. Hvis prøven er samlet fra et sted på kroppen med normalflora, bør den også inokuleres på passende selektive media, avhengig av patogenet som skal isoleres. For Neisseria gonorrhoeae skal det brukes en BD Martin-Lewis Agar, modifisert eller BD GC-Lect Agar, og for Haemophilus, skal det brukes BD Chocolate Agar with IsoVitaleX and Bacitracin. Inkuber skålene ved 35 ± 2 C i en aerob atmosfære, med karbondioksid. Les av skålene etter 18 til 24 og etter 42 til 48 timers inkubering. For rutinemessig resistenstesting av N. gonorrhoeae tilsettes isolatet, som må være en renkultur, i BD Trypticase Soy Broth for å passe med turbiditeten i McFarland 0,5-standarden. Innen 15 min. etter justering av inokulatets turbiditet, dyppes en steril bomullspinne ned i det korrekt fortynnede inokulatet, og dreies flere ganger kraftig rundt mot rørets øvre innerside for å presse ut overflødig væske. Inokuler hele agaroverflaten på platen tre ganger, roter skålen 60 mellom strøkene for å oppnå jevn inokulering. Plasser lappene med en antimikrobiell lappedispenser ved bruk av aseptiske forholdsregler. Plasser lappene slik at midtpunktene er minst 24 mm fra hverandre. Det anbefales at penicillinlapper plasseres slik at de ikke ligger mindre enn 10 mm fra kanten på Petri-skålen. Etter at lappene er plassert på agaren, skal de trykkes ned med en steril nål eller tang for å sørge for fullstendig kontakt med overflaten på mediet. Dette trinnet er ikke nødvendig dersom lappene plasseres med BD Sensi-Disc 6- eller 8-hulls dispenser. Innen 15 minutter etter at lappene er plassert, skal skålene snus og inkuberes i en aerob atmosfære som med 5 % karbondioksid ved 35 til 37 C i 20 til 24 timer. Resultater Typisk koloni-morfologi på er som følger: Haemophilus influenzae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae Liten, fuktig og perleaktig med en karakteristisk mousy lukt Liten, gråhvit til fargeløs, mukoid Middels til stor, blågrå, mukoid Små, flate eller større,mukoide, grønnaktige kolonier, middelsomliggende kolonier kan være grønnaktige PA

4 Resistenstester: Sonene må leses fra oversiden av skålen. Penicillinresistens skal bekreftes med en beta-laktamasetest, f.eks. BD Cefinase-testen. FUNKSJONSDATA OG PROSEDYRENS BEGRENSNINGER er et anriket, ikke-selektivt medium, der både bakterier med og uten kravstore næringsbehov, inkludert normal flora, vil vokse. Det anbefales derfor også å inokulere prøvene på egnede, selektive media. Uttrykket bakterie med kravstore næringsbehov viser til bakterier som ikke vokser eller ikke vokser godt på vanlig brukte, primære isoleringsmedia som inneholder saueblod, f.eks. Haemophilus, patogenisk Neisseria, og flere andre organismer. For detaljerte beskrivelser av prøvetypene som må inokuleres på dette mediet, og typen organismer dette mediet brukes for isolering av, se referansene. 10,11 Dette mediet er ikke testet for støtte av vekst av streptokokker med næringsvariasjoner. Antall og typer bakteriearter som forekommer som smittefarlige agens er svært store. Før dette mediet tas i rutinemessig bruk for sjeldent isolerte, eller nylig beskrevne mikroorganismer, må egnetheten derfor først testes av brukeren ved å kultivere renkulturer av organismen det gjelder. Sonestørrelser for resistenstester som er funnet på dette mediet, er ikke helt i samsvar med det som er nevnt i CLSI standarden M2, 6 som er nedtegnet fra GC Chocolate Agar med definert veksttilsetning. REFERANSER 1. Bauer, A.W., W.M.M. Kirby, J.C. Sherris, and M. Turck Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45: Ryan, K.J., F.D. Schoenknecht, and W.M.M. Kirby Disc sensitivity testing. Hospital Practice 5: Mueller, J.H., and J. Hinton A protein-free medium for primary isolation of the gonococcus and meningococcus. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 48: Barry, A.L., F. Garcia, and L.D. Thrupp An improved single-disk method for testing the antibiotic susceptibility of rapidly-growing pathogens. Am. J. Clin. Pathol. 53: Ericsson, H.M., and J.C. Sherris Antibiotic sensitivity testing. Report of an international collaborative study. Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sec. B, Suppl Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at 7. Berger, U Neisseriaceae. In: Mikrobiologische Diagnostik (F. Burkhardt, ed.). Thieme Verlag, Stuttgart, Germany. 8. Nash, P., and M.M. Krenz. Culture media. In: Manual of clinical microbiology, (Balows, A., et al., eds.). 5 th edition. American Society for Microbiology, Washington, D.C., USA. 9. Miller, J.M., and H.T. Holmes Specimen collection, transport, and storage. In: Murray, P. R., E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 10. Forbes, B.A., and P.A. Granato Processing specimens for bacteria. In: P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 11. P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.) Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. EMBALLASJE/BESTILLING Kat. nr Ferdiglagde agarskåler, 20 stk. Kat. nr Ferdiglagde agarskåler, 120 stk. YTTERLIGERE INFORMASJON Kontakt din lokale BD-representant for ytterligere informasjon. PA

5 Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D Heidelberg/Germany Phone: Fax: Reception_Germany@europe.bd.com ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are the property of Becton, Dickinson and Company BD PA