BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM)

Transkript

1 PA BRUKSANVISNING FOR FERDIGLAGDE AGARSKÅLER PA Rev.: April 2013 BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) BRUKSOMRÅDE BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) brukes i resistenstesten med antimikrobiell lappdiffusjon for kliniske isolater av Haemophilus-arter, som beskrevet i den godkjente standarden M2 utgitt av Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 1 PRINSIPPER FOR OG FORKLARING AV PROSEDYREN Mikrobiologisk metode. Mueller Hinton-agar supplert med 1 % hemoglobin og 1 % IsoVitaleX Enrichment (Mueller Hinton-sjokoladeagar) var mediet tidligere foreslått for Haemophilus influenzae. 2 Omfattende studier utført av Jorgensen et al. har først til utviklingen av Haemophilus-testmediumagar (HTM). 3,4 Dette mediet er Mueller Hinton-agar tilsatt X-faktor (hemin eller hematin), V-faktor (nikotinamid-adenin-dinukleotid, NAD) og gjærekstrakt. En stor fordel med HTM-agar sammenlignet med Mueller Hinton-sjokoladeagar er optisk klarhet, som muliggjør måling av sonediametre fra bunnen av skålen standard testprosedyre for ikke-næringskrevende organismer på Mueller Hinton-agar. HTM-agar inneholder i tillegg lave nivåer av tymidin, og er derfor egnet til testing av trimetoprim/sulfametoksasol. Tolkningskriteriene for antimikrobiell resistenstesting er gitt i CLSI-dokumentet M100 (M2), som er inkludert i CLSI-dokumentet M2. 1 Se dette dokumentet for nærmere informasjon. BD Haemophilus-testmediumagar består av Mueller Hinton-agar tilsatt X-faktor (hemin eller hematin), V-faktor (nikotinamid-adenin-dinukleotid, NAD) og gjærekstrakt. REAGENSER BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) Sammensetning* per liter renset vann Storfeekstrakt 2,0 g Syrehydrolysat fra kasein 17,5 Stivelse 1,5 Agar 17,0 Gjærekstrakt 5,0 Hematin 0,015 Nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) 0,015 ph 7,3 0,1 *Justert og/eller supplert etter behov for å oppfylle visse ytelseskriterier. FORHOLDSREGLER. Kun til profesjonelt bruk. Skålene må ikke anvendes dersom de viser tegn på mikrobiell kontaminering, misfarging, uttørking, sprekkdannelse eller har andre tegn til forringelse. Overdreven skrumping av dette mediet, som følge av uttørking, kan føre til gale resistensresultater. Se dokumentet GENERELL BRUKSANVISNING for informasjon om aseptiske håndteringsprosedyrer, biologiske farer og avhending av brukte produkter. OPPBEVARING OG HOLDBARHET Agarskålene oppbevares etter mottak i originalinnpakningen på et mørkt sted med temperatur fra 2 til 8 C, inntil de skal brukes. Unngå frost og overoppheting. Agarskålene kan inokuleres frem til utløpsdatoen (se etiketten på pakken) og inkuberes i de anbefalte inkubasjonsperiodene. Agarskåler fra åpnede stabler på 10 skåler kan brukes i én uke når de oppbevares på et rent sted med temperatur på 2 til 8 C.

2 KVALITETSKONTROLL FOR BRUKERE CLSI-standarden 1 eller eventuelt nasjonale standarder skal følges når brukere utfører kvalitetskontroll. Følg prosedyrene beskrevet nedenfor under Testprosedyre ved hjelp av referansestammene nevnt under Materialer som ikke følger med. Skåler med BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) og de antimikrobielle skivene som brukes, skal testes minst to ganger i uken med henblikk på riktig funksjon. Utseende av ikke-inokulert medium: lys ravgul. PROSEDYRE Materialer som følger med: BD Haemophilus Test Medium Agar (90 mm Stacker-skåler). Mikrobiologisk kontrollert. Materialer som ikke følger med 1. Inokulatvekstmedium på rør, som BD Trypticase Soy Broth (vekstmedium fremstilt av soyabønne-kasein) eller Mueller Hinton II-vekstmedium (kation-justert), i 5 ml rørvolumer for tillaging av et standardinokulat, og sterilt vekstmedium eller saltvann til fortynning av inokulat. 2. Bariumsulfat-sammenligningsstandard (0,5 ml av 0,048 M BaCl 2 [1,175 % w/v BaCl 2 2H 2 O] til 99,5 ml av 0,18 M [0,36 N] H 2 SO 4 [1 % v/v]). 3. Et fotometrisk apparat for justering av turbiditeten i inokulatsuspensjonen, slik at den er i samsvar med 0,5 McFarland-standarden. 4. Som alternativ til materialene nevnt ovenfor (1 3) kan BD Prompt Inoculation System (volumetrisk inokulat-tillagingsutstyr) brukes. 5,6 5. Kontrollkulturer Haemophilus influenzae ATCC 49247, ATCC og ATCC Papirskiver som er impregnert med angitte mengder antimikrobielle midler, som BD Sensi- Disc-skiver for resistenstesting. 7. Dispenser, som Sensi-Disc 6-hulls dispenser. 8. Linjal eller annet utstyr for å måle sonestørrelse i millimeter. 9. En inkubator som skaper en atmosfære inneholdende 5 % CO 2, eller annet utstyr som skaper en CO 2 -beriket aerob atmosfære. 10. En reagens for utføring av en hurtig ß-laktamasetest, som BD Cefinase-skiver. 11. Supplerende vekstmedier, reagenser og laboratorieutstyr etter behov. Prøvetyper Dette produktet brukes til resistenstesting av renkulturer av Haemophilus som har blitt isolert fra kliniske prøver (se også PROSEDYRENS YTELSESEGENSKAPER OG BEGRENSNINGER). Testprosedyre 1. Klargjør en Gram-farging før resistenstesten startes for å bekrefte kulturrenhet og tentativ identifisering av Haemophilus. 2. Bruk flere godt isolerte kolonier tatt direkte fra en sjokoladeagarskål som har ligget over natten (fortrinnsvis 20 til 24 timer), som kilden til inokulatet. 3. En hurtig ß-laktamasetest skal brukes for rask påvisning av stammer som er resistente overfor penicillin, ampicillin eller amoksicillin. 4. Klargjør en suspensjon av testorganismen i Mueller Hinton-vekstmedium, Mueller Hinton II-vekstmedium eller 0,9 % saltvann. Denne suspensjonen skal justeres til turbiditeten i 0,5 McFarland-standarden ved hjelp av et fotometrisk apparat. Denne suspensjonen vil inneholde omtrent 1 4 x 10 8 CFU/mL. Vær nøye ved tillagingen av denne suspensjonen siden høye inokulatkonsentrasjoner kan føre til falskt resistente resultater med enkelte ß- laktam-antibiotika, spesielt ved testing av H. influenzae-stammer som produserer betalaktamase Alternative metoder for tillaging av inokulat omfatter bruk av utstyr som muliggjør direkte standardisering av inokulater uten justering av turbiditeten, som BD Prompt Inoculation System. Slikt utstyr enhetene er funnet å være akseptabelt for rutinemessig testing, inkludert testing av H. influenzae. 5,6 PA

3 6. Innen 15 minutter etter justering av inokulatets turbiditet dyppes en steril prøvepensel ned det korrekt fortynnede inokulatet og dreies flere ganger kraftig rundt mot rørets øvre innerside for å presse ut overflødig væske. 7. Inokuler hele agaroverflaten i en skål med BD Haemophilus Test Medium Agar tre ganger, og drei skålen 60 mellom strøkene for å oppnå jevn inokulasjon. 8. La lokket stå åpent i 3 til 5 minutter og skålen stå i romtemperatur i opptil 15 minutter, slik at eventuell overflatefuktighet absorberes, før du legger på de impregnerte skivene. 9. Plasser de antimikrobielle skivene ved hjelp av en dispenser. Følg aseptiske forholdsregler. De fleste antimikrobielle midler produserer store hemningssoner når testet mot Haemophilus sammenlignet med andre organismer. Det bør derfor ikke legges mer enn fire antimikrobielle skiver på en enkelt 100 mm skål, inkludert opptil seks av følgende skåler: tredjegenerasjons cefalosporiner (f.eks. cefotaksim, ceftazidim, ceftriakson, ceftizoksim), aztreonam, imipenem eller ciprofloksacin. Etter at skivene er plassert på agaren, skal de trykkes ned med en steril nål eller pinsett for å sørge for fullstendig kontakt med overflaten på mediet. 10. Innen 15 minutter etter at skivene er plassert, skal skålene vendes og inkuberes i 16 til 18 timer ved 35 C i en aerob atmosfære beriket med 5 % karbondioksid. 11. Stryk ut på en skål med BD Haemophilus Test Medium Agar med H. influenzae ATCC 10211, og inkuber sammen med resistenstestskålene for å fastslå om mediet støtter tilstrekkelig vekst. Resultater 1. Undersøk skålene etter 16 til 18 timers inkubering. En konfluerende plen med vekst skal være synlig. Hvis det bare er vekst av isolerte kolonier, var inokulatet for tynt og testen må gjentas. 2. Mål diameteren på sonene med fullstendig hemning (som kan sees med det blotte øye), inkludert skivediameteren til nærmeste, hele millimeter ved hjelp av skyvelær, linjal eller en mal laget for dette formålet. Måleverktøyet holdes bakpå skålen, som holdes over en svart, ikke-reflekterende bakgrunn med belysning ovenfra. 3. Endepunktet skal være det området som ikke viser tydelig, synlig vekst som kan sees med det blotte øye. Se bort fra svak vekst av små kolonier, som så vidt er synlige nær kanten av den tydelige hemningssonen. Med trimetoprim og sulfonamidene kan spor av antagonister i mediet tillate svak vekst. Se derfor bort fra svak vekst (20 % eller mindre av plenen med vekst) og mål den mer tydelige margen for å fastslå sonediameteren. Beregning og tolking av resultater Se CLSI-dokumentet M100 (M2) for informasjon om tolkning av resultater oppnådd med kliniske isolater av Haemophilus. 1 Resulter kan rapporteres som resistente, intermediære eller sensitive avhengig av sonediametrene oppnådd. Organismer som tester positivt for produksjon av beta-laktamase, skal regnes som resistente mot ampicillin uansett oppnådde sonediametre. Vær oppmerksom på at ampicillinresistente stammer av H. influenzae er beskrevet med mangel på ß-laktamase-aktivitet. 7 Så hvis sonediameteren indikerer resistens mot ampicillin, skal isolatet rapporteres som resistent mot dette legemiddelet selv om ß-laktamasetesten er negativ. Kontrollkulturer skal inkluderes hver gang en resistenstest utføres, eller ukentlig hvis tilfredsstillende funksjon kan dokumenteres i henhold til CLSI-standarden M2, som omfatter tabeller (M100) med de korrekte sonediametrene. 1 Merk! Det utgis med jevne mellomrom informasjonstillegg til CLSI-dokumentet M2 eller reviderte versjoner, som inneholder reviderte tabeller for antimikrobielle skiver og tolkningsstandarder. De nyeste tabellene bør konsulteres for gjeldende anbefalinger. Den komplette standarden og tilleggsinformasjon kan bestilles fra Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA , USA. Telefon: PA

4 FUNKSJONSDATA OG PROSEDYREBEGRENSNINGER A. Reproduserbarhetsstudie 8 Tre produksjonspartier av BD Haemophilus Test Medium Agar ble evaluert ved hjelp av resistenstestprosedyren med antimikrobielle skiver (M2-A4) som på den tiden var anbefalt av NCCLS. 9 Totalt 12 antimikrobielle midler (amoksicillin/klavulanat, ampicillin, ampicillin/sulbaktam, cefaclor, cefonicid, ceftriakson, cefuroksim, kloramfenikol, ciprofloksacin, rifampin, tetracyklin, trimetoprim/sulfametoksasol) og 14 stammer av H. influenzae ble brukt i studien. Av de 14 stammene var sju stammer fra American Type Culture Collection (ATCC) og de sju andre var vekstkulturer som omfattet seks kliniske isolater og én industriell kvalitetskontrollkultur. Sonediametrene oppnådd med hvert av de tre mediepartiene ble sammenlignet med tolkningskriteriene (tabell 2A) i M2-A4. 9 I kun seks tilfeller ble soner oppnådd med ett parti som ville produsere en annen tolkningskategori sammenlignet med de to andre partiene. Av de seks avvikene var fire med tetracyklin, ett med cefaclor og ett med cefuroksim. Når det gjaldt tetracyklin, ville resultatet ha produsert en tolkningskategori av enten sensitiv eller intermediær (mindre feil). Med cefaclor og cefuroksim ville forskjellen som oppstod på 1 mm, føre til enten kategorien intermediær eller resistent, også en mindre feil. I denne studien var de fem stammer av H. influenzae som produserte beta-laktamase. Med hver av disse stammene produserte hvert HTM-parti sonediametre med ampicillin som ville blitt tolket som resistente. To av de fem stammene produserte også kloramfenikol-acetyltransferase (CAT). Kloramfenikol-sonene oppnådd med disse to stammene, ville vært konsekvente med kloramfenikol-resistens. 10,11 B. Sammenligning med Mueller Hinton-sjokoladeagar 8 NCCLS-skriveprosedyren ble utført med 213 kliniske isolater av H. influenzae på HTM-agar og Mueller Hinton-sjokoladeagar. 9,12 De antimikrobielle midlene som ble testet, var ampicillin, ampicillin/sulbaktam, amoksicillin/klavulanat og kloramfenikol. Disse var de eneste antimikrobielle midlene som det var definert tolkningskriterier for basert på sonediameter på Mueller Hinton-sjokoladeagar. 13,14 Følgende resultater ble oppnådd. BD Haemophilus Test Medium Agar S I R Mueller Hintonsjokoladeagar S I R Samsvar: 99,6 % S = Sensitiv I = Intermediær R = Resistent Det var to større feil og én mindre feil med ampicillin. I begge større feil produserte BD Haemophilus Test Medium Agar et resistent resultat, mens Mueller Hinton-sjokoladeagar produserte et sensitivt resultat. Begge disse isolatene var beta-laktamase-positive. Resistensresultatet var derfor korrekt. Den ene mindre feilen var med et isolat som produserte et intermediært resultat på HTM-agar og et sensitivt resultat på Mueller Hinton-sjokoladeagar. C. Begrensninger ved prosedyren For enkelte kombinasjoner av organismer og antimikrobielt middel kan det hende at hemningssonen ikke har skarpt avgrensede kanter, noe som kan føre til feiltolking. Feil konsentrasjon av inokulater kan føre til ukorrekte resultater. Hemningssonene kan bli for små hvis inokulatet er for tykt, og de kan bli for store og vanskelige å måle hvis inokulatet er for tynt. Feil oppbevaring av antimikrobielle skiver kan føre til svekket konsentrasjon og feil resistensresultat. Selv om en organisme er sensitiv overfor et spesifikt antimikrobielt middel in vitro, betyr ikke det nødvendigvis at midlet vil være effektivt in vivo. Les relevante tekster for hjelp til tolkning av resultatene. 2,15 PA

5 REFERANSER 1. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at 2. Thornsberry, C., T.L. Gavan, E.H. Gerlach Cumitech 6, New developments in antimicrobial agent susceptibility testing. Coordinating ed., J.C. Sherris. American Society for Microbiology, Washington, D.C 3. Jorgensen, J.H., J.S. Redding, L.A. Maher, and A.W. Howell Improved medium for antimicrobial susceptibility testing of Haemophilus influenzae. J. Clin. Microbiol. 25: Jorgensen, J.H., A.W. Howell, and L.A. Maher Antimicrobial susceptibility testing of less commonly isolated Haemophilus species using Haemophilus test medium. J. Clin. Microbiol. 28: Baker, C.N., C. Thornsberry, and R.W. Hawkinson Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J. Clin. Microbiol. 17: Marsik, F., G. Evans, J. Fowler, and L. Thompson Comparison of the BBL Prompt system, Abbott A-Just, and visual method for the preparation of Haemophilus influenzae inoculum for the Bauer-Kirby procedure, abstr. C-67, p Abstr. 89th Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol Doern, G.V., J.H. Jorgensen, C. Thornsberry, D.A. Preston, T.A. Tubert, J.S. Redding, and L.A. Maher A national collaborative study of the prevalence of antimicrobial resistance among clinical isolates of Haemophilus influenzae. Antimicrob. Agents Chemother. 32: Data i arkiv. BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA. 9. National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved standard: M2-A4. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 4th ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 10. Azemun, P., T. Stull, M. Roberts, and A.L. Smith Rapid detection of chloramphenicol resistance in Haemophilus influenzae. Antimicrob. Agents Chemother. 20: Doern, G.V., G.S. Daum, and T.A. Tubert In vitro chloramphenicol susceptibility testing of Haemophilus influenzae: disk diffusion procedures and assays for chloramphenicol acetyltransferase. J. Clin. Microbiol. 25: National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved standard: M2-A3. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 3rd ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 13. National Committee for Clinical Laboratory Standards Second Informational Supplement: M100-S2. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 14. Doern, G.V. and R.N. Jones Antimicrobial susceptibility testing of Haemophilus influenzae, Branhamella catarrhalis, and Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob. Agents Chemother. 32: Woods, G.L., and J.A. Washington Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods, p In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. USA. FORPAKNING/TILGJENGELIGHET BD Haemophilus Test Medium Kat.nr Ferdiglagde agarskåler, 20 stk. FLERE OPPLYSNINGER Ta kontakt med din lokale BD-representant for mer informasjon. PA

6 Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D Heidelberg/Germany Phone: Fax: Reception_Germany@europe.bd.com Prompt is a trademark of 3M ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are property of Becton, Dickinson and Company BD PA