358 N. S. Johansen & E. Nordhus / Grønn kunnskap 8 (2) Resistens mot insektmidler Nina Svae Johansen / nina.johansen@planteforsk.no Einar Nordhus / einar.nordhus@planteforsk.no Planteforsk Plantevernet Introduksjon Problemene med insektmiddelresistens har økt dramatisk de siste 20 årene, og resistens er i dag en viktig begrensing for planteproduksjon i mange land verden over. I 1999 hadde 533 insekt- og middarter utviklet resistens mot en eller flere grupper av insektmidler. Omtrent 60% av disse artene er skadedyr på kulturplanter, resten er av betydning for veterinær- og humanhelse (Mota-Sanchez et al., 2002). Rundt 80 % av de resistente artene er biller, fluer, mygg, bladlus, mellus, sugere, teger og sommerfugler. Resten er trips, kakkerlakker, lus, lopper, midd og flått (Denholm & Jespersen, 1999). Klorerte hydrokarboner, fosformidler, pyretroider og karbamater har blitt mye brukt i mange år. Resistens er mest vanlig mot disse midlene, men det blir stadig flere tilfeller av resistens også mot nye midler med andre virkningsmekanismer. Resistensen mot insektpatogene bakterier (Bacillus popilliae og B. thuringiensis) er også påvist, hos bl.a. japanbille og kålmøll (Mota-Sanchez et al., 2002). I mange tilfeller omfatter resistensen alle tilgjengelige midler, noe som fører til vanskeligheter med å produserer planter og store økonomiske tap. Plantevernmiddelresistens har vært kjent siden 60-tallet her i Norge, da det ble funnet resistens mot det klorerte hydrokarbonet aldrin hos kålflue i Nord-Norge. Siden da er resistens påvist hos flere skadedyr i veksthus og på friland, og resistensproblemene ser ut til å øke. Flere alvorlige skadedyr er blitt resistente eller har fått økt toleranse mot et eller flere kjemiske midler de siste årene (tabell 1). I tillegg mistenkes resistens hos arter både på friland (jordbærsnutebille, potetsikade, gulrotsuger og eplesuger) og i veksthus (amerikansk blomstertrips og veksthusspinnmidd).
N. S. Johansen & E. Nordhus / Grønn kunnskap 8 (2) 359 Tabell 1. Plantevernmiddelresistens påvist hos skadedyr i jord- og hagebrukskulturer på friland og i veksthus i Norge. betyr at opplysninger ikke er funnet (Ottesen et al., 1998; Johansen, 2000; Johansen and Nordhus, 2001; Nordhus et al., 2003, Sverre Kobro, pers. komm.) Skadedyr Kultur Lokalitet Resistent mot Påvisnings-år Ferskenbladlus Krysantemum Veksthus Fosformidler 1974 Ferskenbladlus Krysantemum, Gerbera, Viola, kinakål Veksthus Pirimikarb, fosformidler, pyretroider 1998, 2000 Ferskenbladlus Kinakål Akershus, Buskerud, Rogaland Fosformidler, pyretroider og karbamater, nedsatt følsomhet mot imidakloprid 1999-2002 Ferskenbladlus Potet Rogaland Pyretroider 2003 Agurkbladlus - Veksthus Karbamater, fosformidler - Bomullsmellus, Julestjerne Veksthus Fosformidler, pyretroider, 1998 biotype B og Q nedsatt føl- somhet for buprofezin og imidakloprid Veksthusmellus Julestjerne Veksthus Pyretroider 1997 Pæresuger Frukthager Rogaland Fosformidler - (påvist), Møre-og Romsdal (mistanke) Kålflue Kål Nord-Norge Aldrin 1964 Veksthusspinnmidd Prydplanter, agurk, tomat, jordbær Veksthus Fosformidler, dikofol, aldikarb Veksthusspinnmidd Frukthager Vidt utbredt? Fosformidler (basert på erfaring) Frukttremidd Frukthager Vidt utbredt? Fosformidler (basert på erfaring) 1974 - -
360 N. S. Johansen & E. Nordhus / Grønn kunnskap 8 (2) Hva er resistens? Insektmiddelresistens er en genetisk endring hos skadeinsektet som følge av naturlig seleksjon ved eksponering til insektmidler, og kan føre til mislykket bekjempelse. Ifølge IRAC (Insecticide Resistance Action Commitee) kan en insektpopulasjon kalles resistent når 1) insektmidlet er anbefalt brukt mot skadeinsektet, og har gitt god virkning tidligere, 2) manglende effekt ikke er en forårsaket av ukorrekt lagring, dosering og bruk, eller av uvanlige forhold 3) den anbefalte dosen ikke reduserer insektpopulasjonen under den økonomiske skadeterskelen og 4) den manglende effekten av insektmidlet er forårsaket av en arvelig endring i følsomheten for midlet hos insektpopulasjonen (Mota-Sanchez et al., 2002). Mistanke om resistens skal alltid bekreftes med pålitelige påvisningsmetoder. Resistensmekanismer Insektmidler har mange ulike virkningsmåter, og som svar på dette har insekter og midd utviklet en rekke forskjellige resistensmekanismer. De 2 viktigste mekanismene er 1) økt evne til å avgifte insektmidlet ved økt produksjon eller endret aktivitet av enzymer som bryter ned insektmidlet til en ikke giftig forbindelse før det når bestemmelsesstedet i insektet, eller 2) en strukturell endring av reseptoren for insektmidlet slik at insektet blir ufølsomt (Denholm & Jespersen, 1999). Det er kjent 3 ulike typer avgiftningsmekanismer: 1. Økt produksjon av cytokrom P450 monooxygenase øker den oksidative metabolismen av insektmidlet, og kan gi resistens til de fleste hovedgrupper av insektmidler (bl.a. fosformidler, pyretroider og karbamater) 2. Økt aktivitet av glutathion-s-transferase (GTS) katalyserer prosessen der glutathion hos insektet angriper ulike reaktive substrater hos insektmidlet. GTS fjerner en arylgruppe eller en alkylgruppe fra insektmidlet og overfører den til glutathion, og spiller en viktig rolle ved resistens mot fosformidler. 3. Økt esteraseaktivitet gir økt hydrolyse eller sekvestrasjon av insektmidlet, og kan gi resistens mot fosformidler, pyretroider og karbamater. To av de mest kjente mekanismene for reseptorendringer er ufølsomt AchE og kdr: 1. Fosformidler og karbamater virker ved at de hemmer acetylcholinesterase (AChE) og dermed forstyrrer overføringen av nerveimpulser ved synapsen. Produksjon av en type acetylcholinesterase som blir mindre hemmet av insektmidlene er kjent hos mange insekt- og middarter. Skadedyrene kan ha ulike mutante former av enzymet med forskjellige profiler for kryss-resistens. 2. Pyretroider virker hovedsakelig ved at de binder seg til og blokkerer den ladede natriumkanalen i nervemembranene slik at ionetransporten gjen-
N. S. Johansen & E. Nordhus / Grønn kunnskap 8 (2) 361 nom membranen forstyrres. Endringer i proteiner i natriumkanalen fører til at pyretroidet ikke kan binde seg til reseptoren. Denne mekanismen kalles knock down resistance (kdr). Andre resistensmekanismer kan være redusert opptak av insektmidlet gjennom insektenes hud eller endret adferd ved at insektene lærer å unngå insektmidlet (Denholm & Jespersen, 1999). Begge disse mekanismene kan gi resistens mot en lang rekke insektmidler fra ulike kjemiske grupper. En enkel resistensmekanisme kan gi resistens mot flere insektmidler samtidig. Dette kalles kryss-resistens, og gir oftest resistens mot midler fra samme kjemiske gruppe eller mot midler fra ulike kjemiske grupper med noenlunde lik virkningsmåte. Flere resistensmekanismer kan akkumuleres i det samme individet, eller innen den samme populasjonen. Dette kalles multippel resistens, og kan gi resistens mot midler fra ulike kjemiske grupper med forskjellige virkemåter. Multippel resistens oppstår som regel ved at insektet har vært eksponert gjentatte ganger til flere grupper av insektmidler over lang tid. For å kunne gi råd om bekjempelse og legge opp en strategi for å håndtere resistenssituasjonen, er det viktig å undersøke mønstre av kryssresistens og forekomst av multippel resistens. Vi har påvist 3 resistensmekanismer hos 15 populasjoner av ferskenbladlus (Myzus persicae L.) som ble samlet inn fra veksthus og friland ulike steder i Norge i perioden1999-2002. Populasjonene hadde økt produksjon av karboksylesterase (påvist med immunologisk test med E4 antiserum), kdr- resistens (påvist med PCR og sekvensanalyse) og/eller produksjon av ufølsomt acetylcholinesterase (påvist med mikroplate-basert enzym kinetisk test). Alle populasjonene var mer eller mindre resistente mot fosformidler. Flere populasjoner var i tillegg resistente mot karbamater og pyretroider, mens noen bare var resistente mot fosformidler (Nordhus et al., 2003). Resistensutvikling og dynamikk Resistente alleler (R-alleler, R = resistant) som koder for en bestemt resistensmekanisme kan være tilstede i en insektpopulasjon i utgangspunktet, eller de kan oppstå ved mutasjon. Insektmidler øver et sterkt seleksjonspress ved at R-allelene plutselig blir helt avgjørende for populasjonens fortsatte eksistens, og de normale allelene (S-allelene, S = susceptible) er blitt letale i de giftige omgivelsene. Det kan skje en drastisk endring i den relative frekvensen av R-alleler og S-alleler over kort tid ved at de normale individene drepes eller hemmes, og den relative reproduksjonsraten for de minst følsomme individene øker (Stenersen, 1988). Ved ensidig bruk av et insektmiddel øker andelen resistente individer for hver generasjoner inntil populasjonen er dominert av resistente individer (fig. 1).
362 N. S. Johansen & E. Nordhus / Grønn kunnskap 8 (2) Resistent insekt Mottakelig insekt 5 % resistente individer Sprøyting, 80 % virkning Overlevende individer formerer seg 25 % resistente individer Sprøyting, 60 % virkning Overlevende individer formerer seg 60 % resistente individer Sprøyting, 30 % virkning Overlevende individer formerer seg 90 % resistente individer Figur 1. Slik bygges resistens opp i en skadedyrpopulasjon under konstant seleksjonspress fra et og samme skadedyrmiddel (Johansen, 2002) Hvor raskt resistens utvikles og spres er avhengig av flere faktorer, bl.a. opprinnelig andel R-alleler, genetisk variasjon og genflyt innen en populasjon, genflyt mellom populasjoner gjennom migrasjon og spredning med plantemateriale, type livssyklus, reproduksjonsrate og reproduksjonsmønster, hva slags resistensmekanisme som er involvert, egenskaper hos insektmidler, bruken av insektmidler (dose, antall behandlinger, veksling og blanding av midler og behandlingsteknikk) og betydning av andre mortalitetsfaktorer.
N. S. Johansen & E. Nordhus / Grønn kunnskap 8 (2) 363 Resistens utvikler seg oftest raskere i veksthus enn på friland her i Norge. I veksthus skjer det en rask og kontinuerlig oppformering av skadedyret, og skadedyrpopulasjonene er isolerte. Mange veksthusskadedyr har en reproduksjonsstrategi som favoriserer resistensutvikling. Plantevernmiddelbruken kan være høy, særlig i prydplantekulturer, noe som gir et sterkt seleksjonspress. På friland utvikles færre generasjoner skadedyr per år, og det sprøytes mindre. Åkrene på norske gårder er små, og ligger ofte spredt med mye vill vegetasjon rundt. De fleste skadedyrene er ikke isolert på kulturplantene, men lever også på ville planter som ikke behandles med insektmidler. Migrasjon av ikke resistente individer fra den ville vegetasjonen og inn i åkeren eller frukthagen vil motvirke eller forsinke resistensutviklingen. Resistens som er utviklet i en populasjon kan gå tilbake eller holde seg mer eller mindre stabil når seleksjonspresset opphører. Hva som skjer er avhengig av flere faktorer, bl.a. hva slags resistensmekanisme som er involvert, om denne har betydning for den generelle levedyktigheten hos populasjonen, reproduksjonsmønster, andel R-alleler og genetisk variasjon i populasjonen. Det er vist at ferskenbladlus som har utviklet produksjon av karboksylesterase, kdr- resistens og/eller produksjon av ufølsomt acetylcholinesterase har nedsatt levedyktighet i forhold til mottakelige individer under fravær av seleksjonspress fra insektmidler (Foster et al., 1997; Foster et al., 1999; Foster et al., 2002). I slike tilfeller kan en populasjon av skadedyr få økt følsomhet for det midlet de er blitt resistente mot dersom sprøyting opphører over en periode fordi den relative reproduksjonsraten for de mest følsomme individene i populasjonen øker. I andre tilfeller kan resistensen holde seg mer stabil. Vi har vist dette i en laboratorietest med bomullsmellus (Bemisia tabaci Gennadius) (tabell 2). Fire populasjoner ble samlet inn fra julestjerneveksthus forskjellige steder i Norge og testet for følsomhet mot de insektmidlene vi hadde på markedet i 1998 ved hjelp av en standardisert bladdyppe-test. Alle populasjonene var resistente mot klorpyrifos, lambdacyhalotrin og fenpropatrin, og hadde nedsatt følsomhet for buprofezin og imidakloprid. En av populasjonene ble testet på nytt etter oppformering i 24 måneder uten at de ble eksponert for insektmidler. Populasjonen var blitt følsom igjen for imidakloprid, men var fremdeles resistent mot fenpropatrin selv om følsomheten hadde økt litt. Det var ingen endring i følsomheten mot buprofezin (Johansen & Nordhus, 2001).
364 N. S. Johansen & E. Nordhus / Grønn kunnskap 8 (2) Tabell 2. Følsomhet mot imidakloprid, fenpropatrin og buprofezin hos en populasjon av bomullsmellus (Bemisia tabaci) 6 og 30 måneder etter innsamling fra veksthus. Populasjonen var ikke eksponert for insektmidlene etter innsamling Måneder uten sprøyting Imidakloprid a (% mortalitet) Fenpropatrin b (LC 50 ) Buprofezin c (% mortalitet) 6 31 1001 65 30 100 361 66 Økning i følsomhet 3,2 x 2,8 x 0 x a Diagnostisk dose, systemisk bladtest med voksne mellus b Dose-respons, bladdyppetest med voksne mellus c Diagnostisk dose, bladdyppetest med unge mellusnymfer Påvisning av insektmiddelresistens For å kunne påvise en mulig resistensutvikling i en populasjon, må det undersøkes om det har oppstått endringer i følsomheten ovenfor det aktuelle insektmidlet. Det er utviklet standardiserte påvisningsmetoder for en lang rekke insektarter. I biologiske tester eksponeres et utvalg av insektpopulasjonen til en diagnostisk dose eller en fortynningsserie av insektmidlet. Insektene kan for eksempel eksponeres direkte ved at det avsettes en dråpe med et bestemt volum av insektmidlet på selve insektet eller ved at insektene dyppes i insektmidlet. De kan også eksponeres til rester av insektmidlet på et blad eller overflate, eller gjennom maten. Med disse metodene sammenligner man som regel LD 50 eller LD 90 (den dosen som gir henholdsvis 50 og 90 % mortalitet) hos testpopulasjonen med en kjent følsom populasjon. LD 50 eller LD 90 blir funnet ved å tilpasse en probit- eller logitmodell til den observerte dose-responsen hos testpopulasjonen. Sammenligning av dødeligheten ved en diagnostisk dose, (som regel LD 99 eller høyere) har den statistiske begrensningen at probit- eller logitverdiene i den ekstreme enden av dose-respons-skalaen er mindre presise enn rundt LD 50, derfor kreves det et større antall observasjoner for å få pålitelige resultater. De biologiske testene er godt egnet når det er en stor andel resistente individer i en populasjon, dvs. når resistensen har utviklet seg langt, men er for ufølsom når det gjelder å påvise begynnende resistensutvikling. Etter hvert som man har fått god kunnskap om resistensmekanismene, er det blitt utviklet biokjemiske og molekylære tester (in vitro-tester) som gir informasjon om gener eller genprodukter hos enkeltindivider i populasjonen. In vitro-testene gir informasjon om den genetiske sammensetningen i en populasjon og kan brukes til å identifisere mønstre av kryss-resistens. Disse testene kan påvise lavere nivå av resistens enn de biologiske testene, og er som regel billigere, raskere og mindre arbeidskrevende enn de biologiske testene.
N. S. Johansen & E. Nordhus / Grønn kunnskap 8 (2) 365 Resultatene fra biologiske og in vitro-tester behøver ikke nødvendigvis gjenspeile hvordan et insektmiddel virker ute i åkeren. Derfor bør de bekreftes med feltforsøk for å fastslå resultatenes praktiske betydning. Hvorfor er insektmiddelresistens viktig? Etter hvert som resistens mot et kjemisk middel bygges opp i en insektpopulasjon, blir midlet mindre effektivt og kan til slutt miste virkningen. Resistensen kan også omfatte andre beslektede insektmidler pga. kryssresistens, slik at en hel gruppe insektmidler ikke virker lengre. Når nye typer insektmidler tas i bruk for å bekjempe insektet vil dette føre til seleksjon av andre resistensmekanismer. Resultatet kan bli multi-resistente insektpopulasjoner med ulike mønstre av kryssresistens. Resistens fører til oftere sprøyting, bruk av høyere doser og blanding av flere midler for å få god nok effekt. Produksjonskostnadene blir høyere, og avlingstapet øker. Antall virksomme preparater blir redusert når midlene mister virkningen. Dette er dramatisk i Norge, siden utvalget av kjemiske midler mot mange skadedyr allerede er svært lite, ofte bare 1 eller 2. Bruken av de midlene som er igjen vil dermed økes, og de vil bli brukt mer ensidig. Dette gjør faren for resistensutvikling enda større, og vi kommer inn i det vi kan kalle resistens-tredemøllen. Den økte insektmiddelbruken vil også føre til større fare for rester av kjemiske midler i mat og miljø, og for helseskade som følge av økt eksponering hos dem som arbeider med planteproduksjon. Tradisjonelt har resistensproblemer blitt møtt med å introdusere et nytt kjemisk middel på markedet når det oppsto resistens. Dette har stort sett vist seg å være en midlertidig løsning, siden insektene snart utviklet resistens mot det nye midlet. Det er lenge mellom hver gang det introduseres nye kjemiske midler på markedet her i Norge, noe som viser at vi ikke kan basere oss på at plantevernmiddelindustrien skal redde situasjonen ved å trylle fram nye kjemiske midler når det har oppstått resistens mot de midlene vi har. Resistensforebyggende tiltak Kjemiske insektmidler er fremdeles en nødvendig del av plantevernet fordi det mangler alternative metoder mot mange skadedyr, og fordi det må finnes virksomme midler å sette inn hvis det oppstår en akutt situasjon på tross av alle forholdsregler. Det er derfor viktig å beholde virkningen av de midlene vi har på markedet. Dette kan gjøres ved å følge en strategi som tar sikte på å unngå eller forsinke resistensutvikling, og å øke følsomheten igjen hos populasjoner som har opparbeidet økt toleranse for et middel. Strategien er basert på:
366 N. S. Johansen & E. Nordhus / Grønn kunnskap 8 (2) 1. Redusert avhengighet av kjemiske midler ved å ta i bruk alternative bekjempelsesmetoder 2. Bruk av eksisterende og nye insektmidler slik at seleksjonspresset blir minst mulig. 3. Kartlegging for å dokumentere forekomst av resistens. 4. Overvåking for å oppdage begynnende resistens. 5. Utarbeidelse av modeller for å prøve å forutsi resistensutvikling Det er først og fremst viktig å redusere seleksjonspresset fra kjemiske insektmidler. Dette gjøres ved å forebygge insektangrep så godt det lar seg gjøre, og i størst mulig grad bruke alle tilgjengelige ikke-kjemiske bekjempelsesmetoder når angrep oppstår. Biologisk bekjempelse er meget godt egnet som resistensforebyggende metode. Bruk av kjemiske midler skal bare være siste utvei, men når de må tas i bruk er det viktig at behandlingen skjer på riktig måte og til rett tid slik at effekten blir god. Er det nødvendig med flere behandlinger må det veksles mellom midler som har forskjellige virkemåter. Valg av kjemiske midler må skje ut fra det man vet om resistenssituasjonen til enhver tid, slik at seleksjon for samme resistensmekanisme unngås. I enkelte tilfeller kan det være riktig å begrense bruksområdet eller antall behandlinger med et middel for å hindre resistensoppbygging mot viktige midler. Hvis et middel ikke har gitt forventet virkning, og dette ikke kan forklares med svikt i behandlingsteknikken eller andre spesielle forhold, skal det samme midlet ikke brukes på nytt. Ved mistanke om resistens skal all bruk av det aktuelle midlet og andre beslektede midler stoppe, og resistensen skal undersøkes for å avklare situasjonen. Overvåking og kartlegging av resistenssituasjonen er avgjørende for å kunne gi råd om bekjempelse og legge opp en resistensforebyggende strategi. Myndigheter, forskning, veiledningstjeneste og dyrkere må samarbeide om en strategi framover for å motvirke videre resistensoppbygging. Det bør etableres et program for resistensovervåking og kartlegging, slik at vi får løpende oversikt over resistenssituasjonen og kan handle ut fra det. Det må satses mer på forskning på biologisk bekjempelse, alternative bekjempelsesmetoder og integrert plantevern for å redusere avhengigheten av kjemiske midler. Samtidig må tilgangen på plantevernmidler fra ulike kjemiske grupper økes slik at det blir mulig å veksle mellom ulike midler i de tilfellene det er nødvendig å sprøyte. Dyrkerne må i størst mulig grad forebygge skadedyrangrep, benytte biologisk og integrert bekjempelse der dette er mulig, og bruke de kjemiske midlene som er på markedet på en slik måte at risikoen for resistensutvikling ikke blir unødvendig stor.
N. S. Johansen & E. Nordhus / Grønn kunnskap 8 (2) 367 Litteratur Denholm, I. & J.B. Jespersen. 1999. Overview of insecticide resistance. In: Denholm, I. and Ioannidis, P.M. (eds.) Proceedings of a symposium on combating insecticide resistance in Thessaloniki (Greece) 27 th May 1999:26-35. Foster, S.P., R. Harrington, A.L. Devonshire, I. Denholm, S.J. Clark & M.A. Mugglestone. 1997. Evidence for a possible fitness trade-off between insecticide resistance and the low temperature movement that is essential for survival of UK populations of Myzus persicae (Hemiptera: Aphididae). Bulletin of entomological research 87:573-579. Foster, S.P., R. Harrington, A.M. Dewar, I. Denholm & A.L. Devonshire. 2002. Temporal and spatial dynamics of insecticide resistance in Myzus persicae (Hemiptera : Aphididae). Pest Management Science 58:895-907. Foster,S.P., C.M. Woodcock, M.S. Williamson, A.L. Devonshire, I. Denholm & R. Thompson. 1999. Reduced alarm response by peach-potato aphids, Myzus persicae (Hemiptera : Aphididae), with knock-down resistance to insecticides (kdr) may impose a fitness cost through increased vulnerability to natural enemies. Bulletin of Entomological Research 89:133-138. Johansen, N.S. 2000. Plantevernmiddelresistens hos insekter og midd et økende problem i veksthusdyrkingen i Norge. Gartneryrket 10:26-27. Johansen, N.S. & E.G. Nordhus. 2001. Insecticide resistance in Bemisia tabaci in Norway. Proceedings 1 st European whitefly symposium, Ragusa, Sicily (Italy) 26 th February 2 nd March 2001. Sammendrag. Johansen, N.S. 2002. Overview of insecticide resistance. Proceedings Vietnamese-Norwegian Workshop, Ås (Norway) 25 th -26 th September 2001. Grønn Forskning 13/2002:81-87. Mota-Sanchez, D., P.S.Bills, & M.E. Whalon. 2002. Arthropod resistance to pesticides: Status and overview. In: Wheeler, W.B. (ed.) Pesticides in agriculture and the environment pp. 241-272. Marcel Dekker Inc., NY. Nordhus, E., Alsvik, M., Klemsdal, S.S. & N.S. Johansen. 2003. Insecticide resistance in Norwegian populations of peach potato aphid, Myzus persicae (Sulzer) (Hemiptera: Aphididae). Manuskript. Ottesen, P.S., Horsberg, T.E & N.S. Johansen. 1998. Arthropod resistance to pesticides in Norway. http://www.rothamsted.bbsrc.ac.uk/enmaria/database/norway/svenma.html. Stenersen, J. 1988. Kjemiske plantevernmidler, pp. 218. Yrkeslitteratur AS, Hestholms Boktrykkeri AS, Hagan, Norge