QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 50 Håndbok

Transkript

1 Juni 2005 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 50 Håndbok Versjon 1 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit er et generisk system som bruker QIAamp-teknologi for manuell isolering og rensing av genomisk DNA fra humane fullblodprøver for in vitro-diagnostikkprosedyrer. For in vitro-diagnostisk bruk NO QIAGEN GmbH, D Hilden, Tlf.: R NO Sample & Assay Technologies

2 Varemerker: QIAGEN, QIAamp (QIAGEN Group); ABI PRISM, BigDye (Applera Corp.); BD Vacutainer (Becton, Dickinson and Company); Dynal AllSet+TM (Dynal Biotech ASA); Eppendorf (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH); LightCycler (Roche Group); Monovette (Sarstedt AG & Co.); Pyrosequencing (Biotage AB); RealArt (artus GmbH); Vacuette (Greiner BioOne). Registrerte navn, varmerker osv. som brukes i dette dokumentet skal ikke betraktes som ubeskyttet av lov, selv om de ikke spesifikt er merket som dette. PCR-prosessen dekkes av utenlandske motparter av de amerikanske patentnr. 4,683,202 og 4,683,195 som eies av F. Hoffmann-La Roche Ltd QIAGEN, alle rettigheter forbeholdt.

3 Innhold Pakkens innhold 4 Symboler 5 Oppbevaring 6 Kvalitetskontroll 6 Bruksområde 6 Begrenset bruk av produktet 7 Sikkerhetsinformasjon 7 Introduksjon 9 Prinsipp og prosedyre 9 Utstyr og reagenser som bruker må anskaffe 19 Viktige merknader 20 Viktige poeng før du starter en protokoll 20 Klargjøre reagenser og bufre 20 Eluering av genomisk DNA 21 Resultat og kvalitet på genomisk DNA 22 Sette opp QIAvac 24 Plus vakuumsystem 22 Protokoll: Isolering og rensing av genomisk DNA fra blodprøvene ved bruk av et vakuumsystem 24 Protokoll: Isolering og rensing av genomisk DNA fra blodprøvene ved bruk av en mikrosentrifuge 28 Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2005 3

4 Pakkens innhold QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Katalognr Antall klargjøringer 50 QIAamp Mini Spin QIAamp Mini Spin-kolonner med vaskerør (WT) (2 ml) 50 ET Elusjonsrør (1,5 ml) 50 VC VacConnectors 50 LT Lysisrør (1,5 ml) 50 WT Vaskerør (2 ml) 3 x 50 AL Lyseringsbuffer* 12 ml AW1 Vaskebuffer 1* (konsentrat) 19 ml AW2 Vaskebuffer 2 (konsentrat) 13 ml AE Elueringsbuffer 25 ml PS Proteaseløsning 2 ml QP QIAGEN -protease 1 vial CD H B 1 Håndbok 1 * Inneholder guanidinhydroklorid. Ikke kompatibel med desinfiseringsmidler som inneholder blekemiddel. Se side 7 for sikkerhetsinformasjon. Inneholder natriumazid som konserveringsmiddel. Resuspensjonsvolum 1.2 ml. 4 Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2005

5 2 C 8 C Ved Symboler i 50 Settet inneholder reagenser til 50 prøveklargjøringer Se informasjonen som gis i håndboken. Skal brukes innen? EtOH In vitro-diagnostisk medisinsk utstyr Katalognummer Partinummer Materialenummer Komponenter Volum Temperaturbegrensninger Ved ankomst Lovlig produsent Viktig merknad Skift hansker etter protokolltrinn med dette merket levering: lagre QIAamp Mini spinnkolonner ved 2 8 C Skriv ned aktuell dato etter at du har tilsatt flasken etanol Legge til Inneholder Lyofilisert Rekonsituer i Etanol Guanidinhydroklorid Subtilisin Fører til Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2005 5

6 Oppbevaring QIAamp Mini Spin-kolonner skal oppbevares ved 2 8 C ved mottak og kan brukes inntil utløpsdatoen som finnes på settets eske. Alle bufre kan lagres ved romtemperatur (15 25 C) inntil utløpsdatoen på settets eske. Lyofilisert QIAGEN protease (QP) kan lagres ved romtemperatur (15 25 C) inntil settets utløpsdato uten virkning på ytelsen. Rekonstituert QIAGEN-protease er stabil i inntil 1 år ved lagring ved 2 8 C, men kun inntil settets utløpsdato. Rekonstituert vaskebuffer 1 (AW1) og rekonstituert vaskebuffer 2 (AW2) er stabile i inntil 1 år ved lagring ved romtemperatur (15 25 C), men kun inntil settets utløpsdato. Den gule farge på lyseringsbufferen (AL) kan øke i intensitet over tid. Dette er normalt og påvirker ikke settets ytelse. Kvalitetskontroll I henhold til QIAGENs sertifiserte totale kvalitetsstyringssystem, testes hvert parti med QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit mot forhåndsbestemte spesifikasjoner for å sikre konsekvent produktkvalitet. Bruksområde QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit er et generisk system som bruker QIAampteknologi for manuell isolering og rensing av genomisk DNA fra humane fullblodprøver for in vitro-diagnostikkformål. Fersk eller frossen humant fullblod som behandles med EDTA eller citrat, men ikke med heparin, fra vanlig blodprøvetakingssystemer kan brukes som prøver. Produktet er beregnet brukt av profesjonelle brukere, slik som teknikere og fysikere som er opplært i molekylær-biologiske teknikker. Det er utformet til å brukes med enhver downstream-applikasjon som bruker enzymatisk amplifisering eller annen enzymatisk modifisering av DNA, fulgt av signaldetektering eller amplifisering. Alle diagnostiske resultater som er generert ved bruk av prøveklargjøringsprosedyren i sammenheng med downstream diagnostisk analyse skal tolkes med hensyn til andre kliniske funn eller laboratoriefunn. For å minimere uregelmessigheter i diagnostiske resultater skal det brukes passende kontroller for downstream-applikasjoner. 6 Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2005

7 Begrenset bruk av produktet Settet er ikke beregnet på bruk med vev eller avføringsprøver. Settet er heller ikke for isolering og rensing av bakterielle, fungale eller parasittiske nukleinsyrer, og heller ikke for isolering og rensing av RNA. Settets evne til å isolere og rense virus-dna har ikke blitt vurdert. Settets ytelse har heller ikke blitt evaluert for buffy coat, kulturceller eller isolerte celler, pinner, tørre blodflekker eller cellefri kroppsvæsker, slik som liquor, plasma og urin. Sikkerhetsinformasjon Bruk alltid egnet laboratoriefrakk, engangsfrakk og vernebriller ved arbeid med kjemikalier. For mer informasjon, se gjeldende HMS-datablad (MSDS). Disse er tilgjengelige på nettet i praktisk og kompakt PDF-format på Her kan du finne, vise og skrive ut MSDS for hvert QIAGEN-sett og settkomponent. FORSIKTIG: Ikke tilfør blekemidler eller sure løsninger direkte til prøvepreparatavfall. Lyseringsbuffer (AL) og vaskebuffer 1 (AW1) inneholder guanidinhydroklorid som kan danne sterkt reaktive forbindelser når kombinert med blekemiddel. Hvis væske som inneholder disse bufrene søles, må det rengjøres med egnet laboratorierengjøringsmiddel og vann. Hvis væsken som søles inneholder potensielt smittefarlige stoffer, renses det berørte området først med laboratorierengjøringsmiddel og vann, deretter med 1 % (v/v) natriumhypokloritt. Hvis bufferflaskene er ødelagte eller lekker, bruk hansker og beskyttelsesbriller når flaskene kastes for å unngå personlig skade eller skade på andre. QIAGEN har ikke testet væskeavfall som genereres av QIAamp DSP DNA Blood Mini-prosedyre for resterende infeksjonsmaterialer. Kontaminering av væskeavfallet med resterende infeksjonsmaterialer er svært usannsynlig, men kan ikke ekskluderes fullstendig. Derfor må væskeavfall betraktes som infeksjonsfarlig og kan håndteres og kastes etter lokale sikkerhetsforskrifter. Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2005 7

8 Følgende risiko og sikkerhetsuttrykk gjelder komponenter for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit. Lyseringsbuffer (AL) og vaskebuffer 1 (AW1) Inneholder guanidinhydroklorid: skadelig, irriterende. Risiko- og sikkerhetssetninger:* R22-36/38, S QIAGEN-protease (QP) Inneholder subtilisin: sensibilisator, irritant. Risiko- og sikkerhetssetninger:* R37/ , S /37/ timers nødsinformasjon Medisinsk nødsinformasjon på engelsk, fransk og tysk kan skaffes 24 timer i døgnet fra: Poison Information Center Mainz, Tyskland Tlf.: * R22: Skadelig ved svelging. R36/38: Irriterer øynene og huden. R37/38: Irriterende for åndedrettssystemet og huden. R41 Fare for alvorlig øyeskade. R42: Kan gi allergi ved innånding. S13: Må ikke oppbevares sammen med næringsmidler. S22: Unngå innånding av støv. S24: Unngå hudkontakt. S26: Får man stoffet i øynene; skyll straks grundig med store mengder vann og kontakt lege. S36: Bruk egnede verneklær. S36/37/39: Bruk egnet verneutstyr, hansker og øye/ansiktsvern. S46: Ved svelging, kontakt lege omgående og vis denne beholderen eller etiketten. 8 Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2005

9 Introduksjon QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit bruker veletablert teknologi til å gi en hurtig og enkel måte å isolere og rense genomisk DNA fra 200 μl fullblodprøver. Renset DNA yter pålitelig i downstream-applikasjoner som PCR. De enkle QIAamp DSP DNA Blood Mini-prosedyrene, som er designet for simultan prosessering av flere blodprøver, gir ren DNA som er klar til bruk. Prosedyrene egner seg for bruk med ferskt eller frossent fullblod og blod som har blitt behandlet med citrat eller EDTA. Forhåndsseparering av leukocytter er ikke nødvendig. Prosedyrene krever verken fenol/kloroformekstrahering eller alkoholpresipitering og krever minimal samhandling av brukeren, slik at det er mulig med sikker håndtering av potensielt smittefarlige prøver. Prosedyrene er utformet til å unngå krysskontaminering fra prøve til prøve. Renset DNA er klart til bruk i PCR eller andre applikasjoner, eller kan alternativt lagres ved 20 C til senere bruk. Prinsipp og prosedyre Hver QIAamp DSP DNA Blood Mini-prosedyre består av 4 trinn. Lysere cellene i blodprøven Binde det genomiske DNA i cellelysatet til membranen på en QIAamp Mini Spin-kolonne Vaske membranen Elutere genomisk DNA fra membranen Denne håndboken inneholder protokoller for 2 alternative QIAamp DSP DNA Blood Mini-prosedyrer: spinnprosedyren, som krever en sentrifuge, samt vakuumprosedyren, som krever en sentrifuge og et vakuumsystem (se flytskjema, side 18). Prøve Kryopresipitater som er dannet under opptining av frosne prøver vil tilstoppe QIAamp Mini Spin-kolonnemembranen. Hvis kryopresipitater er synlige, unngå aspirering av disse under aspirasjon av prøven. Virkningene for å fryse og tine blodprøvene på DNA-rensing ved bruk av QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit har blitt fastsatt (figur 1). Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2005 9

10 Virkning av frysing-tiningsykluser på DNA gis fra EDTA-behandlet blod Resultat Yield normalized normalisert til to fresh fersk sample prøve (%) Fresh Fersk Number of freeze/thaw cycles Antall frysing/opptiningssykluser Figur 1. EDTA-behandlet blod ble frosset og opptinet inntil 3 ganger, og deretter utsatt for DNA-rensing ved bruk av QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit. De kalkulerte DNA-resultatene er normalisert til resultatet fra fersk prøve (100 %). Hver søyle på grafen representerer resultatene fra 32 replikater (gjennomsnitt ± standard avvik). Mengden DNA renset i QIAamp DSP DNA Blood Mini-prosedyrene avhenger av innholdet av hvite blodceller i hver blodprøve. Ved bruk av spinn eller vakuumprosedyre renses DNA fra 200 µl blodprøver fra friske givere. Forskjellige ulike primærrør og antikoagulanter kan brukes til å ta blodprøver for QIAamp DSP DNA Blood Mini-prosedyrene (tabell 1). 10 Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2005

11 Tabell 1. Gjennomsnittlige relative resultater av DNA fra blodprøver innhentet ved bruk av forskjellige primærrør og antikoagulanter Primært rør BD Vacutainer 9NC BD Vacutainer K3E BD Vacutainer K2E S-Monovette EDTA S-Monovette CPDA1 Vacuette K3E Vacuette 9NC Produsent Katalognr. Nominelt volum BD ml 6,4 μg BD ml 6,6 μg BD ml 6,4 μg Sarstedt ml 6,5 μg Sarstedt ,5 ml 6,3 μg Greiner Bio-One Greiner Bio-One ml 6,5 μg ml 6,3 μg Gjennomsnittsresultater * For hvert primærrør bestemmes gjennomsnittsresultatet fra 11 triplikatprøver. Lineærområdet for DNA-resultat ved bruk av QIAamp DSP DNA Blood Minivakuumprosedyre har blitt bestemt for blod fra friske givere med hvite blodtellinger på 3,8 x ,34 x 10 7 celler/ml (figur 2). Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/

12 Lineært område for DNA-resultat ved bruk av QIAamp DSP DNA Blood Mini vakuumprosedyre ved 200 μl elusjonsvolum 14 Resultat Yield (µg/sample) (μg/prøve) Hvit blodcelletelling (x 10 6 celler/ml) Figur 2. Hvite blodcelletellinger for friske givere ble bestemt og var innenfor området 3,8 x ,34 x 10 7 celler/ml. DNA ble renset fra blodprøver ved bruk av QIAamp DSP DNA Blood Mini vakuumprosedyre ved 200 μl elusjonsvolum. Åttisju triplikatprøver ble prosessert. Lysering av blodceller Prøver lyseres under denatureringsbetingelser ved økte temperaturer. Lysering utføres i tilstedeværelse av QIAGEN Protease (QP) og lyseringsbuffer (AL). Binde genomisk DNA til QIAamp Mini Spin-kolonnemembranen For å optimalisere bindingen av genomisk DNA til QIAamp Mini Spin kolonnemembranen tilsettes først etanol til lysatene. Hvert lysat påføres deretter til en QIAamp Mini Spin-kolonne og genomisk DNA adsorberes på silicamembranen etter som lysatet trekkes gjennom ved vakuumtrykk eller sentrifugalkraft. Fjerne resterende kontaminanter Mens det genomiske DNA holder seg bundet til QIAamp Mini Spinkolonnemembranen, vaskes kontaminantene effektivt bort ved bruk av først vaskebuffer 1 (AW1), og deretter vaskebuffer 2 (AW2). Elutere rent genomisk DNA Genomiske DNA eluteres fra QIAamp Mini Spin-kolonnemembranen ved bruk av μl elusjonsbuffer (AE). Det eluerte DNA er klart til bruk i ulike downstream-analyser, inkludert en rekke ulike in vitro-diagnostiske downstream-analyser (tabell 2-8). Virkningene av elusjonsvolum og volumet av eluat som brukes i PCR på PCR-ytelse har blitt fastsatt (tabell 9). 12 Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2005

13 Tabell 2. HLA typebestemmelse ved bruk av Dynal AllSet + SSP Assays HLA-A "Low Resolution", HLA-B "Low Resolution", DR "Low Resolution" og DQ "Low Resolution" HLA locus A HLA locus B HLA locus DR HLA locus DQ Genotype Nummer Genotype Nummer Genotype A2/A3 2 B51, B51/ B13 eller B51/B27 Nummer Genotype Nummer 1 DR1/DR3 1 DQ2 1 A3/A1 1 B13/B35 1 DR3 eller DR3/DR13 1 DQ2/DQ3 2 A3/A25 1 B8/B27 1 DR3/DR7 1 DQ6 1 A2/A24 2 B7/B13 eller B7/B15 1 DR7/DR15 2 DQ2/DQ5 1 A1/A2 2 B7/B18 1 DR4/DR15 1 DQ2/DQ6 2 A30/A68 1 B7/B44 1 DR4/DR7 1 DQ3 1 A2/A32 1 Andre 0 DR4 1 DQ3/DQ6 2 Andre 0 DR15 1 Andre 0 DR1/DR7 1 Andre 0 Fullblod ble innhentet fra individuelle givere, og genomisk DNA ble renset fra 200 μl fullblod ved bruk av QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit. Ved bruk av Dynal AllSet + SSP Assays (Dynal Biotech), ble alleler identifisert ved indikert loci i det gitte antallet individer. Tabell 3. Factor V Leiden (FV) genotyping ved bruk av LightCycler Factor V Leiden Mutation Detection Kit Genotype Nummer Villtype 17 FV G16191 A heterozygot 13 FV G16191 A homozygot 0 Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/

14 Fullblod ble innhentet fra 30 individuelle givere, og genomisk DNA ble renset fra 200 μl fullblod ved bruk av QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit. Allelisk status ved FV G1691 A locus ble bestemt ved bruk av LightCycler Factor V Leiden Mutation Detection Kit (Roche Applied Science). Tabell 4. RealArt DPD LC PCR-analyse av dihydropyrimidin dehydrogenase (DPD) locus Genotype Nummer DPYD*1/*1 147 DPYD*1/*2A 0 DPYD*2A/*2A 0 Fullblod ble innhentet fra 147 individuelle givere, og genomisk DNA ble renset fra 200 μl fullblod ved bruk av QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit. Den alleliske statusen ved DPD locus ble bestemt ved bruk av RealArt DPD LC PCR Kit (artus). Ekson-14 skipping polymorfisme forårsakes av en punktmutasjon i posisjon 1G A i intron 14 av DPD-genet. Tabell 5. RealArt TPMT LC PCR-analyse av tiopurin S-metyltransferase (TPMT) locus Genotype TPMT*1/*1 139 Nummer TPMT*1/*3A eller TPMT*3B/*3C 8 TPMT*1/*3C 2 Andre 0 Fullblod ble innhentet fra 149 individuelle givere, og genomisk DNA ble renset fra 200 μl fullblod ved bruk av QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit. Den alleliske statusen ved TPMT locus ble bestemt ved bruk av RealArt TPMT LC PCR Kit (artus). Genetiske varianter ble analysert ved nukleosidposisjoner 238 (i ekson 5), 460 (I ekson 7) og 719 (i ekson 10). 14 Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2005

15 Tabell 6. Factor V Leiden (FV) genotyping ved bruk av endepunkt-pcr og Pyrosequencing -analyse med PSQ-96 SNP-Reagent-Kit på pyrosekvensierende PSQ 96MA Genotype Villtype 17 Nummer FV G16191 A heterozygot 13 FV G16191 A homozygot 0 Fullblod ble innhentet fra 30 individuelle givere, og genomisk DNA ble renset fra 200 μl fullblod ved bruk av QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit. Den alleliske status ved FV G1691 A-locus ble bestemt ved bruk av endepunkt-pcr- og pyrosekvensieringsanalyse med PSQ-96 SNP-Reagent-Kit på pyrosekvensierende PSQ 96MA (Biotage). Tabell 7. Protrombin (PT) genotyping ved bruk av endepunkt-pcr og pyrosekvensierende analyse med PSQ-96 SNP-Reagent-Kit på pyrosekvensierende PSQ 96MA Genotype Nummer Villtype 30 PT G20210A heterozygot 0 PT G20210A homozygot 0 Fullblod ble innhentet fra 30 individuelle givere, og genomisk DNA ble renset fra 200 μl fullblod ved bruk av QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit. Den alleliske status ved PT G20210A locus ble bestemt ved bruk av endepunkt-pcr- og pyrosekvensieringsanalyse med PSQ-96 SNP-Reagent-Kit på pyrosekvensierende PSQ 96MA (Biotage). Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/

16 Tabell 8. Analyse av ApoE polymorfisme T112C og C158T ved bruk av endepunkt-pcr, med sekvensiering av amplikon ved bruk av BigDye v1.1 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit og separering på ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer Genotype Nummer ApoE*3/*3 5 ApoE*3/*4 5 Andre 0 Fullblod ble innhentet fra 10 individuelle givere, og genomisk DNA ble renset fra 200 μl fullblod ved bruk av QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit. Analyse av APoE polymorfisme T112C og C158T ble utført ved bruk av endepunkt-pcr, med sekvensiering av amplikon ved bruk av BigDye v1.1 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit og separering på ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Tabell 9. Virkning av elusjonsvolum og eluatvolum som brukes i PCR på PCR-ytelse Eluatvolum per 50 μl PCR* Elusjonsvolum 2 μl 5 μl 10 μl 50 μl 100% 100% 100% 100 μl 100% 100% 97% 200 μl 100% 100% 100% * Verdier som viser PCR trefforhold og representerer gjennomsnittet for 48 prøver. I lagringstester med eluater generert ved bruk av QIAamp DNA Blood Mini Kit, et generelt laboratoriesett ved bruk av identisk teknologi, ble det vist at DNA som ble eluert fra QIAamp Mini Spin-kolonner i buffer AE var stabil i 8 år ved lagring ved enten 5 C eller 20 C (figur 3). Men langsiktige studier om stabiliteten til eluater som oppnås ved bruk av QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit pågår. 16 Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2005

17 Langsiktig stabilitet av DNA-isolatert og renset ved bruk av QIAamp Mini Spin-kolonner M 2 8 C 20 C M Figur 3. DNA ble renset ved bruk av QIAamp DNA Blood Mini Kit, eluert i 200 μl buffer AE og lagret ved enten 2 8 C eller 20 C i 8 år. DNA-prøver ble analysert på en etidiumbromidfarget agarosegel. M: markør. Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/

18 The QIAamp DSP DNA Blood Mini Spin QIAamp DSP DNA Blood Mini-prosedyrer and Vacuum Procedures Spinnprosedyre Procedure Vacuum Vakuumprosedyre Procedure Prøve Sample Prøve Sample Lysering Lyse Les protokollene (side 24 og 28) nøye før start Til LT, legg til 20 μl QP, 200 μl prøve og 200 μl AL Vortex 15 s Inkuber 10 min. (±1 min.) ved 56 C (±1 C) Tilfør 200 μl etanol Vortex 15 s Binding Vakuum Vacuum Overfør lysat til QIAamp Mini Spin-kolonne Spinnprosedyre: Sentrifuger 1 min. ved 6000 x g Vakuumprosedyre: Påfør vakuum Vask Wash (AW1) Vakuum Vacuum Spinnprosedyre: Plassser QIAamp Mini Spin-kolonne i ny WT, tilsett 500 μl AW1, og sentrifuger 1 min. ved 6000 x g Vakuumprosedyre: tilfør 750 μl AW1, og tilfør vakuum Vask Wash (AW2) (AW2) Vakuum Vacuum Spinnprosedyre: Plassser QIAamp Mini Spin-kolonne i ny WT, tilsett 500 μl AW2, og sentrifuger 1 min. ved x g Vakuumprosedyre: tilfør 750 μl AW2, og tilfør vakuum Tørr Dry Spin spinn Plasser QIAamp Mini Spin-kolonnen i WT Sentrifuger 3 min. ved x g Eluer Elute Plasser QIAamp Mini Spin-kolonnen i ET Tilfør μl AE, og inkuber 1 min. Sentrifuger 1 min. ved 6000 x g Rent Pure genomisk genomic DNA 18 Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2005

19 Utstyr og reagenser som bruker må anskaffe Bruk alltid egnet laboratoriefrakk, engangsfrakk og vernebriller ved arbeid med kjemikalier. For mer informasjon, se gjeldende HMS-datablad (MSDS) som fås fra leverandøren av produktet. For spinn- og vakuumprosedyrer Etanol ( %) Pipetter* og pipettspisser (for å unngå krysskontaminering anbefaler vi sterkt å benytte pipettspisser med aerosolbarrierer) Éngangshansker Varmeblokk* for lysering av prøver ved 56 C (vi anbefaler Eppendorf Thermomixer comfort med termoblokk for 1,5 ml mikrotestrør ) Mikrosentrifuge* Målesylinder (50 ml) Vortexer Kun for vakuumprosedyren QIAvac 24 Plus vakuumsystem (QIAvac 24 Plus, kat.nr , QIAvac tilkoblingssystem, kat.nr og vakuumpumpe, kat.nr ), eller tilsvarende generelt laboratorievakuumsystem * For å sikre at prøvene behandles tilstrekkelig i QIAamp DSP DNA Blood Mini-prosedyren, anbefaler vi på det sterkeste at instrumenter (f.eks. pipetter og varmeblokker) kalibreres ifølge produsentenes anbefalinger. Dette er ikke en fullstendig liste over leverandører og inkluderer ikke mange viktige forhandlere av biologiske varer. Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/

20 Viktige merknader Viktige poeng før du starter en protokoll Etter mottak av settet, kontroller settkomponentene for skade. Hvis boblepakningene eller bufferflaskene er skadet, ta kontakt med QIAGENs tekniske service eller din lokale leverandør. Ved søk av væske, se "Sikkerhetsinformasjon" (side 7). Ikke bruk skadede komponenter, siden bruk av disse kan føre til dårlig settytelse. Skift alltid pipettespissene ut mellom væskeoverføringer. For å unngå krysskontamnering anbefaler vi sterkt å benytte pipettspisser med aerosolbarrierer. Alle sentrifugeringstrinn utføres ved romtemperatur (15-25 C). Bruk alltid engangshansker, og kontroller regelmessig at de ikke er kontaminert med prøvemateriale. Kast hanskene hvis de blir kontaminert. For å unngå krysskontaminering, åpne kun ett rør om gangen. Ikke bruk settkomponentene fra andre sett med det settet du bruker i øyeblikket, med mindre partinumrene er identiske. Unngå mikrobiell kontaminasjon av settreagensene. For å minimere faren for infeksjon fra potensielt smittefarlig materiale, anbefaler vi å jobbe under laminar air-flow-forhold inntil prøvene er lysert. Dette settet skal kun brukes av personale som er opplært i in vitrodiagnostisk laboratoriepraksis. Klargjøre reagenser og bufre Klargjøre QIAGEN-protease Tilfør 1,2 ml proteaseløsning (PS) til flasken med lyofilisert QIAGEN protease (QP), og bland forsiktig. For å unngå skumming, bland ved å vende flasken flere ganger. Se til at QIAGEN-protease (QP) er helt oppløst. Ikke tilfør QIAGEN-protease (QP) direkte til lyseringsbufferen (AL). 20 Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2005

21 Klargjøre vaskebuffer 1 Bruk en målesylinder, tilfør 25 ml etanol ( %) til flasken som inneholder 19 ml vaskebuffer 1 (AW1)-konsentrat. Lagre den rekonstituerte vaskebufferen 1 (AW1) ved romtemperatur (15 25 C). Bland alltid den rekonstituerte vaskebufferen 1 (AW1) ved å vende flasken flere ganger før prosedyren startes. Klargjøre vaskebuffer 2 Bruk en målesylinder, tilfør 30 ml etanol ( %) til flasken som inneholder 13 ml vaskebuffer 2 (AW2)-konsentrat. Lagre den rekonstituerte vaskebufferen 2 (AW2) ved romtemperatur (15 25 C). Bland alltid den rekonstituerte vaskebufferen 2 (AW2) ved å vende flasken flere ganger før prosedyren startes. Klargjør elusjonsbuffer En flaske elusjonsbuffer (AE) leveres med settet. For å forhindre kontaminering av elusjonsbuffer (AE), anbefaler vi på det sterkeste å bruke pipettespisser med aerosolbarriere ved pipettering av elusjonsbuffer (AE) fra flasken og sette på lokket på flasken umiddelbart etterpå. Etter bruk av en flaske med elusjonsbuffer (AE) for første gang, lagre ved 2 8 C. Ekvilibrer elusjonsbufferen (AE) til romtemperatur (15 25 C) før etterfølgende bruk. Elusjonsbuffer (AE) inneholder preserveringsmiddelet natriumazid, som viser absorbering ved 260 nm. Derfor må det ved kvantifisering av DNA i eluatet ved absorberingsmåling ved 260 nm, ved bestemmelse av DNArenhet i eluat ved absorberingsmåling ved 260 nm og 280 nm, eller ved skanningsabsorbering i området mellom 220 nm og 350 nm, sikres at den blanke inneholder samme konsentrasjon av natriumazid som eluatet. For eksempel ved klargjøring av eluat for absorberingsmålinger ved å fortynne 50 μl eluat med 100 μl vann, klargjør deretter den blanke ved å fortynne 50 μl E elusjonsbuffer (AE) med 100 μl vann. Bruk ferskt, destillert vann til fortynningene. Eluering av genomisk DNA Volumet på DNA som er eluert fra en QIAamp Mini Spin-kolonne kan være inntil 20 μl mindre enn volumet til elusjonsbufferen (AE) som påføres kolonnen. Eluatvolumet som gjenopprettes avhenger av type prøve. Elusjonsbuffer (AE) skal ekvilibreres til romtemperatur (15 25 C) før den påføres kolonnen. Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/

22 Eluert DNA samles opp i elusjonsrør (ET). Ved lagring av DNA i opptil 4 uker, anbefaler vi lagring ved 2 8 C. For langsiktig oppbevaring, anbefaler vi lagring ved 20 C. Resultat og kvalitet på genomisk DNA Resultatet og kvaliteten på isolert genomisk DNA egner seg for alle typer downstream-deteksjonsprosedyrer i molekylær diagnostikk. Diagnostiske analyser skal utføres ifølge produsentenes instruksjoner. Sette opp QIAvac 24 Plus vakuumsystem Se til at du gjennomfører oppsett av QIAamp Mini Spin-kolonne, VacConnector (VC) og VacValve på riktig måte (se figur 4) Figur 4. Montering av komponenter i QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit for vakuumprosessering av prøver: 1: VacValve (leveres med vakuumsystemet) 2: VacConnector (VC) 3: QIAamp Mini Spin-kolonne Ved bruk av vakuumprosedyren med QIAvac 24 Plus vakuumsystem, anbefaler vi å merke lyseringsrørene (LT), elusjonsrørene (ET) og QIAamp Mini Spinkolonnene ifølge skjemaet i figur 5 for å kunne unngå sammenblanding av prøver. Denne figuren kan kopieres og merkes med navnene på prøvene. Vi anbefaler bruk av lignende skjema hvis det brukes andre vakuumsystemer eller ved bruk av spinnprosedyren. 22 Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2005

23 Dato: Operatør: Kjørings-ID: Figur 5. Merkingsskjema for lyseringsrørene (LT), elusjonsrørene (ET) og QIAamp Mini Spin-kolonnene for bruk på QIAvac 24 Plus vakuumsystem. Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/

24 Protokoll: Isolering og rensing av genomisk DNA fra blodprøvene ved bruk av et vakuumsystem For isolering og rensing av genomisk DNA fra 200 μl fullblodprøver som er behandlet med EDTA eller citrat ved bruk av et vakuumsystem, slik som f.eks. QIAvac 24 Plus vakuumsystem. Viktige poeng før du starter Prosedyren nedenfor gir instruksjoner for behandling av en enkelt blodprøve. Men inntil 24 prøver kan behandles samtidig på QIAvac 24 Plus vakuumsystem. Ting du skal gjøre før du starter Ekvilibrer blodprøvene til romtemperatur (15 25 C), og se til at de blandes godt. Hvis et presipitat har dannet seg i lyseringsbufferen (AL), løs opp ved inkubering ved 56 C. Se til at vaskebuffer 1 (AW1), vaskebuffer 2 (AW2) og QIAGEN-protease (QP) har blitt klargjort etter instruksjonene i "Viktige bemerkninger" på side 20 og 21. Ekvilibrer elusjonsbufferen (AE) til romtemperatur (15 25 C) for bruk i trinn 14. Still inn en varmeblokk til 56 C for bruk i trinn 4. For å unngå krysskontaminering, sett inn en VacConnector (VC) i hver lueradaptor på vakuumsystemet. Kvalitetskontrollprosedyrer ved QIAGEN bruker funksjonell settutgivelsestesting for hvert enkelte settparti. Derfor, ikke bland reagenser fra ulike settpartier, og ikke kombiner enkeltreagenser fra ulike reagenspartier. Se til at avfallsflasken til vakuumsystemet er tom og at alle koblinger er tilkoblet riktig. For detaljer om operasjon av vakuumsystemet, spesielt vedlikehold, se håndboken som medfølger. 24 Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2005

25 Prosedyre 1. Pipetter 20 μl QIAGEN protease (QP) inn i et lyseringsrør (LT). i Kontroller utløpsdatoen på den rekonstituerte proteasen før bruk. 2. Tilfør 200 μl blodprøve til lyseringsrøret (LT). 3. Legg til 200 μl lyseringsbuffer (AL) til lyseringsrøret (LT), lukk lokket, og bland med puls-vortex i 15 s. For å sikre effektiv lysering, er det avgjørende at prøven og lyseringsbufferen (AL) blandes grundig for å fremskaffe en homogen løsning. i Siden lyseringsbufferen (AL) har en høy viskositet, se til å tilføre riktig volum av lyseringsbufferen (AL) ved å pipettere forsiktig eller ved bruk av en egnet pipett, slik som en Eppendorf multistep-pipette eller tilsvarende. i Ikke tilfør QIAGEN-protease (QP) direkte til lyseringsbufferen (AL). 4. Inkuber ved 56 C (±1 C) i 10 min. (±1 min.). 5. Sentrifuger lyseringsrøret (LT) i 5 s. ved full hastighet for å fjerne dråpene fra innsiden av lokket. 6. Legg til 200 μl etanol ( %) til lyseringsrøret (LT), lukk lokket, og bland grundig med puls-vortex i 15 s. 7. Sentrifuger lyseringsrøret (LT) i 5 s. ved full hastighet for å fjerne dråpene fra innsiden av lokket. 8. Sett inn QIAamp Mini Spin-kolonnen i VacConnector (VC) på vakuumsystemet. Se til at hovedvakuumventilen (mellom vakuumsystemet og vakuummanifoldet) og skruehetteventilen (på vakuummanifoldet) er lukket. Slå på vakuumpumpen. Kast vaskerøret (WT) (2 ml) der QIAamp Mini Spin-kolonnen befinner seg I boblen. Vakuum påføres kun til tilkoblingssystemet (hvis det brukes) og ikke til vakuummanifoldet. 9. Påfør forsiktig hele lysatet fra trinn 7 til QIAamp Mini Spin-kolonnen uten at kanten blir våt. Unngå å komme i kontakt med QIAamp Mini Spin-kolonnemembranen med pipettespissen. i Ved prosessering av flere prøver, åpne kun et lyseringsrør (LT) om gangen. 10. Åpne hovedvakuumventilen. Etter at lysatet er trukket inn gjennom QIAamp Mini Spin-kolonnen, lukk hovedventilen på vakuumsystemet og åpne skruehetteventilen på vakuummanifoldet for å lufte ut Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/

26 manifoldet. Lukk skruehetteventilen etter at vakuum er frigjort fra manifoldet. Etter lukking av hovedvakuumventilen, påføres vakuum kun til tilkoblingssystemet (hvis det brukes) og ikke til vakuummanifoldet. i Bruk skruehetteventilen på vakuummanifoldet for hurtig frigjøring av vakuum. i Ved prosessering av flere QIAamp Mini Spin-kolonner samtidig, anbefaler vi å lukke VacValve på hver kolonne etter at lysatet har kommet gjennom for å redusere varigheten på dette vakuumtrinnet. i Hvis lysatet ikke har kommet helt igjennom membranen etter 10 min., plasser QIAamp Mini Spin-kolonnen i et rent vaskerør (WT), lukk lokket, og sentrifuger ved 6000 x g (8000 o/min.) i 3 min. eller inntil lysateet har kommet helt gjennom. Plasser QIAamp Mini Spin-kolonnen i et annet rent vaskerør (WT), og fortsett med trinn 10 av protokollen på side 30. i Hvis lysatet fortsatt ikke kommer gjennom membranen under sentrifugering, kast prøven og gjenta isoleringen og rensingen med nytt prøvemateriale fra trinn 1 på side Påfør 750 μl vaskebuffer 1 (AW1) til QIAamp Mini Spin-kolonnen uten å gjøre kanten våt. Unngå å komme i kontakt med QIAamp Mini Spin-kolonnemembranen med pipettespissen. La lokket på kolonnen være åpent, og åpne hovedvakuumventilen. Etter at vaskebuffer 1 (AW1) er trukket inn gjennom QIAamp Mini Spinkolonnen, lukk hovedvakuumventilen og åpne skruehetteventilen for å lufte ut manifoldet. Lukk skruehetteventilen etter at vakuum er frigjort fra manifoldet. 12. Påfør 750 μl vaskebuffer 2 (AW2) til QIAamp Mini Spin-kolonnen uten å gjøre kanten våt. Unngå å komme i kontakt med QIAamp Mini Spin-kolonnemembranen med pipettespissen. La lokket på kolonnen være åpent, og åpne hovedvakuumventilen. Etter at vaskebuffer 2 (AW2) er trukket inn gjennom QIAamp Mini Spinkolonnen, lukk hovedvakuumventilen og åpne skruehetteventilen for å lufte ut manifoldet. Lukk skruehetteventilen etter at vakuum er frigjort fra manifoldet. 13. Lukk lokket på QIAamp Mini Spin-kolonnen, fjern det fra vakuumsystemet, og kast VacConnector (VC). Plasser QIAamp Mini Spin-kolonnen i et rent vaskerør (WT), og sentrifuger ved full hastighet ( x g) i 3 min. for å tørke membranen helt. i Utelatelse av tørrsentrifugeringen kan føre til hemming av downstreamanalysen. 26 Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2005

27 14. Plasser QIAamp Mini Spin-kolonnen i et rent elusjonsrør (ET), og kast vaskerøret (WT) som inneholder filtratet. Åpne forsiktig lokket på QIAamp Mini Spin-kolonnen, og påfør 50 til 200 μl elusjonsbuffer (AE) på midten av membranen. Lukk lokket, og inkluber ved romtemperatur (15 25 C) i 1 min. Sentrifuger ved 6000 x g (8000 o/min.) i 1 min. for å eluere DNA. i Følg vedlikeholdsprosedyrene for vakuumsystemet etter utføring av denne protokollen (se håndboken som medfulgte vakuumsystemet for flere opplysninger). Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/

28 Protokoll: Isolering og rensing av genomisk DNA fra blodprøvene ved bruk av en mikrosentrifuge For isolering og rensing av genomisk DNA fra 200 μl fullblodprøver som er behandlet med EDTA eller citrat ved bruk av en mikrosentrifuge. Viktige poeng før du starter Prosedyren nedenfor gir instruksjoner for behandling av en enkelt blodprøve. Men flere prøver kan behandles samtidig, antallet avhenger av kapasiteten til mikrosentrifugen som brukes. Ting du skal gjøre før du starter Ekvilibrer blodprøvene til romtemperatur (15 25 C), og se til at de blandes godt. Hvis et presipitat har dannet seg i lyseringsbufferen (AL), løs opp ved inkubering ved 56 C. Se til at vaskebuffer 1 (AW1), vaskebuffer 2 (AW2) og QIAGEN-protease (QP) har blitt klargjort etter instruksjonene i "Viktige bemerkninger" på side 20 og 21. Kvalitetskontrollprosedyrer ved QIAGEN bruker funksjonell settutgivelsestesting for hvert enkelte settparti. Derfor, ikke bland reagenser fra ulike settpartier, og ikke kombiner enkeltreagenser fra ulike reagenspartier. Ekvilibrer elusjonsbufferen (AE) til romtemperatur (15 25 C) for bruk i trinn 15. Still inn en varmeblokk til 56 C for bruk i trinn 4. Prosedyre 1. Pipetter 20 μl QIAGEN-protease (QP) inn i et lyseringsrør (LT). i Kontroller utløpsdatoen på den rekonstituerte proteasen før bruk. 2. Tilfør 200 μl blodprøve til lyseringsrøret (LT). 3. Legg til 200 μl lyseringsbuffer (AL) til lyseringsrøret (LT), lukk lokket, og bland med puls-vortex i 15 s. For å sikre effektiv lysering, er det avgjørende at prøven og lyseringsbufferen (AL) blandes grundig for å fremskaffe en homogen løsning. 28 Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2005

29 i Siden lyseringsbufferen (AL) har en høy viskositet, se til å tilføre riktig volum av lyseringsbufferen (AL) ved å pipettere forsiktig eller ved bruk av en egnet pipett, slik som en Eppendorf multistep-pipette eller tilsvarende. i Ikke tilfør QIAGEN-protease (QP) direkte til lyseringsbufferen (AL). 4. Inkuber ved 56 C (±1 C) i 10 min. (±1 min.). 5. Sentrifuger lyseringsrøret (LT) i 5 s. ved full hastighet for å fjerne dråpene fra innsiden av lokket. 6. Legg til 200 μl etanol ( %) til lyseringsrøret (LT), lukk lokket, og bland grundig med puls-vortex i 15 s. 7. Sentrifuger lyseringsrøret (LT) i 5 s. ved full hastighet for å fjerne dråpene fra innsiden av lokket. 8. Påfør forsiktig hele lysatet fra trinn 7 til QIAamp Mini Spin-kolonnen uten at kanten blir våt. Unngå å komme i kontakt med QIAamp Mini Spin-kolonnemembranen med pipettespissen. i Ved prosessering av flere prøver, åpne kun et lyseringsrør (LT) om gangen. 9. Lukk lokket på QIAamp Mini Spin-kolonnen og sentrifuger ved omtrent 6000 x g (8000 o/min.) i 1 min. Plasser QIAamp Mini Spinkolonnen i et rent vaskerør (WT), og kast røret som inneholder filtratet. i Hvis lysatet ikke har kommet helt igjennom membranen etter sentrifugering ved 6000 x g (8000 o/min.), sentrifuger igjen ved full hastighet (inntil x g) i 1 min. i Hvis lysatet fortsatt ikke kommer gjennom membranen under sentrifugering, kast prøven og gjenta isoleringen og rensingen med nytt prøvemateriale fra trinn 1 på side 28. Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/

30 10. Åpne forsiktig QIAamp Mini Spin-kolonnen og tilfør 500 μl vaskebuffer 1 (AW1) uten å gjøre kanten våt. Unngå å komme i kontakt med QIAamp Mini Spin-kolonnemembranen med pipettespissen. 11. Lukk lokket på QIAamp Mini Spin-kolonnen og sentrifuger ved omtrent 6000 x g (8000 o/min.) i 1 min. Plasser QIAamp Mini Spinkolonnen i et rent vaskerør (WT), og kast røret som inneholder filtratet. 12. Åpne forsiktig QIAamp Mini Spin-kolonnen og tilfør 500 μl vaskebuffer 2 (AW2) uten å gjøre kanten våt. Unngå å komme i kontakt med QIAamp Mini Spin-kolonnemembranen med pipettespissen. 13. Lukk lokket på QIAamp Mini Spin-kolonnen og sentrifuger ved full hastighet ( x g) i 1 min. Plasser QIAamp Mini Spin-kolonnen i et rent vaskerør (WT), og kast røret som inneholder filtratet. 14. Sentrifuger ved full hastighet ( x g) i 3 min. for å tørke membranen helt. i Utelatelse av tørrsentrifugeringen kan føre til hemming av downstreamanalysen. 15. Plasser QIAamp Mini Spin-kolonnen i et rent elusjonsrør (ET), og kast vaskerøret (WT) som inneholder filtratet. Åpne forsiktig lokket på QIAamp Mini Spin-kolonnen, og påfør 50 til 200 μl elusjonsbuffer (AE) på midten av membranen. Lukk lokket, og inkluber ved romtemperatur (15 25 C) i 1 min. Sentrifuger ved 6000 x g (8000 o/min.) i 1 min. for å eluere DNA. 30 Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2005

31 Denne siden skal være tom Håndbok for QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/

32 Australia Bestillinger Faks Teknisk Østerrike Bestillinger 0800/ Faks 0800/ Teknisk 0800/ Belgia Bestillinger Faks Teknisk Canada Bestillinger Faks Teknisk 800-DNA-PREP ( ) Kina Bestillinger Faks Teknisk Danmark Bestillinger Faks Teknisk Finland Bestillinger Faks Teknisk Frankrike Bestillinger Faks Teknisk Tilbud Tyskland Bestillinger Faks Teknisk Hong Kong Bestillinger Faks Teknisk Irland Bestillinger Faks Teknisk Italia Bestillinger Faks Teknisk Japan Telefon Faks Teknisk Korea (Sør) Bestillinger Faks Teknisk Luxembourg Bestillinger Faks Teknisk Nederland Bestillinger Faks Teknisk Norge Bestillinger Faks Teknisk Singapore Bestillinger Faks Teknisk Sverige Bestillinger Faks Teknisk Sveits Bestillinger Faks Teknisk Storbritannia Bestillinger Faks Teknisk USA Bestillinger Faks Teknisk 800-DNA-PREP ( ) NO Sample & Assay Technologies