Bioforsk Rapport Bioforsk Report Vol. 5 Nr

Transkript

1 Bioforsk Rapport Bioforsk Report Vol. 5 Nr Utvikling av en multipleks mitokondrie-dna-test spesifikk for elg, rein, rødrev, mårhund og grevling Analyse av 344 ekskrementer negative for brunbjørn-dna fra innsamlingen til overvåkning av brunbjørn i Västerbotten i 2009 Hans Geir Eiken, Mari Bergsvåg, Per M. Knappskog, Siv Grete Aarnes, Paul E. Aspholm, Snorre B. Hagen og Ingvild Wartiainen Bioforsk Jord og miljø, Svanhovd

2 Hovedkontor/Head office Frederik A. Dahls vei 20 N-1432 Ås Tel.: (+47) Bioforsk Svanhovd Bioforsk Jord og miljø Svanhovd N-9925 Svanvik Tel.: (+47) Tittel/Title: Utvikling av en multipleks mitokondrie-dna-test spesifikk for elg, rein, rødrev, mårhund og grevling. Analyse av 344 ekskrementer negative for brunbjørn-dna i fra innsamlingen til overvåkning av brunbjørn i Västerbotten i Forfatter(e)/Author(s): Hans Geir Eiken, Mari Bergsvåg, Per M. Knappskog, Siv Grete Aarnes, Paul E. Aspholm, Snorre B. Hagen og Ingvild Wartiainen Dato/Date: Tilgjengelighet/Availability: Prosjekt nr./project No.: Saksnr./Archive No.: Åpen Arkivnr Rapport nr./report No.: ISBN-nr./ISBN-no: Antall sider/number of pages: 126/ Antall vedlegg/number of appendices: Oppdragsgiver/Employer: Länsstyrelsen i Västerbotten Kontaktperson/Contact person: Hans Geir Eiken Stikkord/Keywords: Mitokondrie DNA, ekskrementer rødrev, elg, rein, grevling, mårhund, brunbjørn Mitochondrial DNA, feces, Red fox, Moose, Reindeer, Badger, Raccoon dog, Brown bear Fagområde/Field of work: Molekylær økologi Molecular ecology Sammendrag: Mitokondrielt DNA (mtdna) forekommer i høyt kopitall i celler, og viser sekvenser med høy spesifisitet for ulike arter. Vi har utviklet en multiplex PCR-analyse for mtdna for rødrev (Vulpes vulpes), elg (Alces alces), rein (Rangifer tarandus), grevling (Meles meles) og mårhund (Nyctereutes procyonoides). Multipleks mtdna-assayet ble anvendt til analyse av 344 bjørne-negative ekskrementer fra innsamlingen til overvåkning av brunbjørn i Västerbotten i Sverige i Vi har tidligere rapportert påvisning av brunbjørn-dna i 997 (74 %) av 1341 ekskrementprøver fra denne innsamlingen i felten i Multipleks mtdna-testen viste at rødrev (7,4 %) og elg (4,4 %) var de hyppigst forekommende forvekslingsartene i denne feltinnsamlingen. I tillegg ble det påvist grevling, rein og mårhund i et mindre antall prøver. Blandinger av to eller tre arter ble påvist i 60 prøver (4,5 %), og årsaken til dette kan være påvisning av byttedyr-dna i ekskrementene fra kjøttetere. I så fall er andelen rødrevekskrementer blant forvekslingene høyere (~10 %) enn det som ble påvist fra prøver med utvetydig artsidentitet alene (7,4 %). Samlet viser denne studien at arten kunne bestemmes for 1233 (997 brunbjørn og 236 annen art, totalt 92 %) av 1341 ekskrementer samlet inn i Västerbotten i Summary: Mitochondrial DNA exists in high copy number in cells and shows sequences of high specificity for different species. We have developed a multiplex PCR analysis for mtdna for red fox (Vulpes vulpes), moose (Alces alces), reindeer (Rangifer tarandus), badger(meles meles) and raccoon dog (Nyctereutes procyonoides). The multiplex mtdna assay for the five species was applied to the

3

4 Innholdsfortegnelse 1. Sammendrag Innledning Material og Metode Resultater Diskusjon Referanser Appendiks

5 1. Sammendrag Mitokondrielt DNA (mtdna) forekommer i høyt kopitall i celler, og viser sekvenser med høy spesifisitet for ulike arter. Vi har utviklet en multiplex PCR-analyse for mtdna for rødrev (Vulpes vulpes), elg (Alces alces), rein (Rangifer tarandus), grevling (Meles meles) og mårhund (Nyctereutes procyonoides). Multipleks mtdnaassayet ble anvendt til analyse av 344 bjørne-negative ekskrementer fra innsamlingen til overvåkning av brunbjørn i Västerbotten i Sverige i Vi har tidligere rapportert påvisning av brunbjørn-dna i 997 (74 %) av 1341 ekskrementprøver fra denne innsamlingen i felten i Multipleks mtdna-testen viste at rødrev (7,4 %) og elg (4,4 %) var de hyppigst forekommende forvekslingsartene i denne feltinnsamlingen. I tillegg ble det påvist grevling, rein og mårhund i et mindre antall prøver. Blandinger av to eller tre arter ble påvist i 60 prøver (4,5 %), og årsaken til dette kan være påvisning av byttedyr-dna i ekskrementene fra kjøttetere. I så fall er andelen rødrevekskrementer blant forvekslingene høyere (~10 %) enn det som ble påvist fra prøver med utvetydig artsidentitet alene (7,4 %). Samlet viser denne studien at arten kunne bestemmes for 1233 (997 brunbjørn og 236 annen art, totalt 92 %) av 1341 ekskrementer samlet inn i Västerbotten i

6 2. Innledning Bestandsovervåkning av brunbjørn (Ursus arctos) i Sverige og Norge er basert på innsamling av ekskrementprøver i felt med påfølgende DNA-analyse av prøvene. DNA-analysen for individbestemmelse er basert på multiple STR (Short Tandem Repeats) med høy informasjonsverdi (Eiken et al. 2009). I innsamlingene i Västerbotten i Sverige og hele Norge i 2009 var henholdsvis 74 % og 58 % av ekskrementprøvene positive for brunbjørnindivider (Wartiainen et al. 2010). De mange negative prøvene har likevel aktualisert spørsmålet om i hvilken grad innsamling av ekskrementer fra andre arter innvirker på resultatet. I tillegg er det vanskelig å evaluere DNA-metodenes sensitivitet på grunn av denne usikkerheten. I 2006 utførte vi en mitokondrie-dna (mtdna) test for rødrev (Vulpes vulpes) på 435 bjørne-negative ekskrementprøver fra Norge, og 17 % av disse var positive for rødrev (Bjervamoen&Eiken 2007). MtDNA foreligger i et stort antall kopier per celle, og representerer således også en mye mer sensitiv test enn DNA-analyse basert på det kjerne-dna som er utgangspunktet for STR-analysen og identitetsbestemmelsen. Cytokrom b genet i mtdna viser liten variasjon imellom individer av samme art, men samtidig noe variasjon mellom arter, og har derfor vært brukt til å lage artsspesifikke DNA-tester. Tobe & Linacre presenterte i 2008 et muliplex assay for 18 ulike pattedyr basert på Cytokrom b -genet. Vi har i denne studien brukt denne kunnskapen for å lage et nytt mtdna multiplex-assay spesifikt for artene rødrev (Vulpes vulpes), elg (Alces alces), rein (Rangifer tarandus), grevling (Meles meles) og mårhund (Nyctereutes procyonoides). Prosjektet for å utvikle artsspesifikke DNA-tester for rødrev, elg, rein, grevling og mårhund ble gjort på oppdrag fra Länsstyrelsen i Västerbotten i Sverige og Direktoratet for naturforvaltning i Norge. I denne rapporten beskrives utviklingsarbeidet, samt anvendelsen av mtdna-tester for disse fem artene på 344 brunbjørn-negative ekskrementer fra innsamlingen i Västerbotten i Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr

7 3. Materiale og metode 3.1 DNA-analyse for brunbjørn DNA ble renset fra 1341 ekskrementprøver, og tilstedeværelsen av bjørne-dna ble testet med to spesifikke DNA-analyser (STR-markører). Det ble analysert for kjønn og genotyper for 8 STR-markører (MU05, MU09, MU10, MU23, MU50, MU51, MU59, og G10L). Analysen ble utført i henhold til beskrivelse i akkreditert prosedyre. En detaljert metodebeskrivelse fås ved henvendelse til laboratoriet (metode MH101). Resultatet for bjørne-positive ekskrementprøver (n=997) og negative prøver (n=344) er beskrevet i Bioforsk Analyserapport av til Länssstyrelsen i Västerbotten. 3.2 Multipleks mtdna-assay Universelle primere og spesifikke primere for PCR-amplifisering av cytokrom b genet i mtdna ble laget og satt sammen etter en modifisert fremgangsmåte etter Tobe&Linacre (2008). For artene mårhund, elg og rein ble helt nye, spesifikke PCRprimere konstruert i Oligo (Medprobe) og testet mot Genbank (BLAST, NCBI) for spesifisitet. Multipleks PCR ble utført etter en modifisert protokoll etter Tobe&Linacre (2008). FAM-merkede PCR-produkter av spesifikk størrelse ble analysert på en ABI 3130xl Genetic Analyzer (kapillær elektroforese) (se Fig. 1). Rødrev Rein Mårhund Elg Grevling Fig. 1. Multiplex PCR-amplifisering av cytokrom b genet i mtdna for fem ulike arter. Panelet viser resultatet av kapillær elektroforese med spesifikke topper (blå og grønne fylte topper) for hver art (ca 1pg templat DNA), røde topper uten fyll viser størrelsesmarkør. 4

8 4. Resultater Utvikling av et multipleks mtdna-assay for artene rødrev, elg, grevling, rein og mårhund ble utført etter en modifisert fremgangsmåte etter Tobe&Linacre (2008). Det var mulig å utføre assayet i en PCR-reaksjon med en enkelt fluorecence-farge (se Materiale og Metode). Multiplex-assayet ble testet ned til >1 pg templat DNA i en blanding fra alle fem artene (se Fig. 1). I tillegg ble multipleks-assayet testet med DNA fra ekskrementprøver. Alle primersett var spesifikke for ønsket art, og ga negative resultat i analyse der DNA fra andre arter ble tilsatt som templat (resultat ikke vist). Alle kontroller uten DNA eller kontroller som inneholdt bjørne-dna var negative i alle forsøk med multiplex-assayet. Det ble i 2009 samlet inn 1341 ekskrementprøver i Västerbotten i Sverige, og av disse var 997 positive for bjørne-dna (74 %). Alle de 344 negative prøvene fra innsamlingen ble testet for artene rødrev, elg, grevling, rein og mårhund i med multipleks mtdna-assayet (se Tabell 1 og Appendiks 1). Alle kontroller uten DNA eller bjørne-dna var blanke i undersøkelsen. Tabell 1: Resultat fra multipleks mtdna-analyse av 344 brunbjørn-negative ekskrementer fra innsamlingen i Västerbotten i 2009 Art Antall % av negative (n=344) % av alle prøver (n=1341) Rødrev 97 28,2 7,2 Elg 59 17,2 4,4 Grevling 17 4,9 1,2 Rein 3 0,9 0,2 Mårhund Blanding av arter 60 17,4 4,5 Uidentifisert art ,4 8,1 Total ,0 25,6 Rødrev og elg var de arter som hyppigst kunne påvises i innsamlingen fra 2009, med henholdsvis 7,2 % og 4,4 %. Grevling og rein kunne også påvises i materialet, mens mårhund ikke kunne påvises i prøver uten tilblanding av andre arter (se Tabell 2). Totalt kunne 176 Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr

9 (51 %) av de 344 uidentifiserte ekskrementene bestemmes til en spesifikk art ved hjelp av multipleks mtdna assayet. En kombinasjon av to ulike arter ble påvist i 55 prøver, mens 5 prøver var en blanding av tre ulike arter (Tabell 2, Appendiks 1). For alle de 60 blandingsprøvene ble eksperimentet gjentatt en gang til, men med det samme resultatet for alle prøvene. Rødrev var representert i 54 av de 60 blanda prøvene, og rødrev-elg kombinasjonen var den hyppigste. Utenom rødrev-kombinasjonene var der 3 prøver av grevling og mårhund hver i kombinasjon med elg. Tabell 2. Multipleks mtdna assay: Resultater fra analyse av blanding av ulike arter i 60 av 344 ekskrementprøver Blanding mtdna Antall(n=60) Rødrev-Elg 37 Rødrev-Mårhund 8 Grevling-Elg 3 Mårhund-Elg 3 Rødrev-Rein 2 Rødrev-Grevling 2 Rødrev + 2 andre arter 5 Total 60 I tillegg til ekskrementprøvene ble en enkelt hårprøve (SVH025) som var negativ for brunbjørn DNA testet med multipleks mtdna-assayet. Resultatet viste en positiv reaksjon for elg (se Appendix1). 6

10 5. Diskusjon Multiplex-assayet for de fem artene gav et entydig resultat med kjente DNA-kontroller, og assayet sin sensitivitet var betydelig lavere enn 1 picogram DNA. Assayet var negativt for bjørne-dna, og enkeltvis var alle mtdna-artstestene negative for DNA fra de andre artene. I den gruppen ekskrementer fra innsamlingen i Västerbotten som var negative for STRer spesifikke for bjørn, kunne testen påvise en annen art for over halvparten av prøvene (176 av 344). Rødrev (7,2 %) og elg (4,4 %) var de hyppigst forekommende forvekslingsartene i innsamlingen. Innsamlingen vi har studert her ser likevel ut til å ha en vesentlig lavere andel ekskrementer fra rødrev enn vi fant i en tilsvarende innsamling i Norge i 2006, som hadde hele 17 % ekskrementer positive for rødrev (Bjervamoen&Eiken 2007). Grevling, rein og mårhund var representert blant forvekslingsartene, men i mindre antall. En mindre andel av de bjørne-negative prøvene (n=60) viste et blandingsresultat, der en kombinasjon av to, og i noen få tilfeller 3 arter kunne påvises med testen. Ut fra testen alene kan dette resultatet ikke forklares. Det kan være flere ulike årsaker til at flere enn en art forekommer i en slik test, og vi har gjort følgende vurderinger: i) Påvisning av byttedyr i ekskrementer: I en nylig publisert studie er det sannsynliggjort at mtdna fra vertebrat-byttedyr kan påvises i ekskrementer fra dvergsjimpanse (Pan paniscus) og gorilla (Gorilla gorilla) (Hofreiter et al. 2010). Tidligere kontrollforsøk med mating av tamme sjøløver (Eumetopias jubatus) viser lignende resultater (Deagle et al. 2005). Ut fra dette tror vi at påviste byttedyr i ekskrementene er den mest sannsynlige årsaken til våre funn av mer enn en art i en mindre andel av prøvene. I så fall er det sannsynliggjort at rødrev-elg og rødrev-rein prøvene er fra rødrev. Det samme gjelder for mårhund og grevling i kombinasjon med elg. Med dette som premiss vil det likevel ikke være mulig å avgjøre opphavet til ekskrementet for kombinasjoner mellom artene rødrev og mårhund, samt grevling og rødrev, da alle tre artene er kjøttetere. Ut fra dette vil de 60 blanda prøvene fordele seg som følger: rødrev 39, grevling 3, mårhund 3 og ukjent 15. Potensielt er da andelen av de tre artene noe høyere enn det Tabell 1 viser, og korrigerer vi for dette blir resultatene som følger: Rødrev -136 ekskrementer (10,1 %), grevling - 20 ekskrementer (1,5 %) og mårhund - 3 ekskrementer (0,2 %). ii) iii) Oversmitting i laboratoriet: mtdna foreligger i >1000 ganger så mange kopier som kjerne-dna, og således er risikoen for oversmitting fra andre prøver forhøyet i forhold til vanlig STR-analyse. Kontroller uten DNA kjøres for hver 11. prøve for å ha kontroll med oversmitting. I disse eksperimentene har alle kontroller vært negative. I tillegg har det vært tatt med positive kontroller for hver av de fem artene samt bjørn i hvert eksperiment, uten at tilblanding har vært observert. Eksperimentene utføres adskilt fra annen aktivitet, og de samme rutinene for PCR som for akkrediterte analyser legges til grunn. Vi bruker heller ikke DNA fra de fem nye artene rutinemessig i vårt laboratorium som er spesialisert på brunbjørn. Basert på dette tror vi sannsynligheten for oversmitting er liten, men muligheten kan selvsagt aldri utelukkes helt. Oversmitting ved innsamling: Ved håndtering av blod og vev av andre arter før innsamling av ekskrementer og ved overføring til plastpose kan oversmitting fra annen art være mulig. Teoretisk kan dette forekomme ved slakting av elg /rein og håndtering av kjøtt med påfølgende innsamling av ekskrementer. Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr

11 Oversmitting er en særlig risiko i en slik sammenheng siden vev og blod inneholder mye større mengder DNA enn ekskrementer. Vi tror likevel at sannsynligheten for slik oversmitting er liten med gode innsamlingsrutiner. Samlet viser dette arbeidet at 1233 ekskrementer av de 1341 ekskrementene fra innsamlingen fra Västerbotten 2009 var mulig å artsbestemme (997 brunbjørn og 236 annen art), dvs. DNA-ekstraksjonen og DNA-analysen har fungert for 92% av prøvene. De 108 prøvene som gjenstår som uidentifisert art (8 %) kan være fra andre arter enn de fem vi har undersøkt for her. Prøvene kan også ha så dårlig DNA at mtdna assayet ikke har fungert. Det er også en mulighet for at uidentifiserte prøver kan være fra brunbjørn ut fra at mtdna-assayet er en mer sensitiv test enn STR-testene. En mtdna-test for brunbjørn bør derfor også utvikles og brukes i slike studier. Vi mener rapporten viser at artsspesifikke mtdna-tester vil være til nytte for både forvaltning og forskning i fremtiden. 8

12 6. Referanser Bjervamoen S. G. og Eiken H.G Populasjonsovervåkning av brunbjørn DNA-test for rødrev (Vulpes vulpes) utført på brunbjørn-negative eksrementprøver fra Bioforsk rapport 74:1-12. Deagle B.E., Tollit D.J., Jarman S.N., Hindell M.A., Trites A.W., Gales N.J Molecular scatology as a tool to study diet: analysis of prey DNA in scats from captive Steller sea lions. Mol Ecol 14: Eiken H. G., Andreassen, R. J., Kopatz, A., Bjervamoen, S. G., Wartiainen, I., Tobiassen, C., Knappskog, P. M., Aspholm, P. E., Smith, M. E., Aspi, J Population data for 12 STR loci in Northern European brown bear (Ursus arctos) and application of DNA profiles for forensic casework. Forensic Science International: Genetic Supplement Series 2: Hofreiter M., Kreuz E., Eriksson J., Schubert G., Hohmann G Vertebrate DNA in fecal samples from Bonobos and Gorillas: Evidence for meat consumption or artefact? PLoS ONE 5(2): e9419. doi: /journal.pone Tobe S. S. and Linacre A.M A multiplex assay to identify 18 European mammal species from mixtures using the mitochondrial cytochrome b gene. Electrophoresis 29: Wartiainen, I., Tobiassen, C., Brøseth, H., Bergsvåg M, Aarnes S. G., Eiken, H. G Populasjonsovervåkning av brunbjørn : DNA analyse av prøver samlet i Norge i Bioforsk rapport 58: Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr

13

14 7. Appendiks 1 Appendix 1. Artsspesifikk mtdna-analyse av 345 brunbjørn-negative prøver fra innsamlingen i Västerbotten i Svanhovd ID Strekkode Resultat Innsamlingsdato Nord Øst Kommune (-09) SVF br0015 N Sorsele SVF br0019 Rein Malå SVF019 SEB Rev Vindeln SVF020 SEB Elg Vindeln SVF022 SEB Rev/Elg Vindeln SVF024 SEB Rev/Elg Vindeln SVF026 SEB N Vindeln SVF027 SEB Rev/Elg Vindeln SVF028 SEB Rev/Elg Vindeln SVF033 SEB Rev/Elg/Mårhund Vindeln SVF034 SEB Rev Vindeln SVF036 SEB N Vindeln SVF052 SEB Rev Vindeln SVF053 SEB Grevling Vindeln SVF055 SEB Rev Vindeln SVF058 SEB Rev Vindeln SVF060 SEB N Vindeln SVF064 SEB Elg Vindeln SVF065 SEB N Vindeln SVF069 SEB Rev Skellefteå SVF073 SEB Rev Vännäs SVF075 SEB N Vilhelmina SVF076 SEB Rev Vännäs 10

15 SVF080 SEB Elg Åsele SVF084 SEB Rev Nordmaling SVF085 SEB Rev/Elg Skellefteå SVF089 SEB Rev Skellefteå SVF094 SEB Rev Skellefteå SVF099 SEB Rev Nordmaling SVF1001 SEB N Åsele SVF101 SEB Grevling Nordmaling SVF1014 SEB Elg Åsele SVF1029 SEB Elg Åsele SVF1032 SEB Grevling Åsele SVF105 SEB Elg Nordmaling SVF1061 SEB Elg Åsele SVF1063 SEB Rev Åsele SVF1066 SEB N Åsele SVF1074 SEB Rev Åsele SVF1076 SEB N Åsele SVF1087 SEB N Åsele SVF1095 SEB N Dorotea SVF111 SEB Grevling Nordmaling SVF112 SEB Rev Nordmaling SVF1129 SEB N Dorotea SVF113 SEB Grevling Nordmaling SVF1137 SEB Rein Dorotea SVF1141 SEB N Dorotea SVF1146 SEB Elg Dorotea SVF1149 SEB Rev Dorotea SVF1151 SEB N Dorotea SVF1153 SEB Elg Dorotea SVF1166 SEB Rev Dorotea Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr

16 SVF1168 SEB N Dorotea SVF1172 SEB N Dorotea SVF1179 SEB N Dorotea SVF1197 SEB Rev Dorotea SVF1198 SEB Rev Dorotea SVF1206 SEB Rev/Elg Dorotea SVF1208 SEB N Dorotea SVF1210 SEB Elg Dorotea SVF1213 SEB N Dorotea SVF1215 SEB Rev Dorotea SVF122 SEB Grevling Nordmaling SVF1227 SEB Elg Dorotea SVF1234 SEB N Dorotea SVF1242 SEB Rev Dorotea SVF1246 SEB N Dorotea SVF1247 SEB Elg Dorotea SVF1248 SEB Rev Dorotea SVF1254 SEB Elg Dorotea SVF126 SEB N Skellefteå SVF1264 SEB N Dorotea SVF1267 SEB Rev Dorotea SVF127 SEB Elg Skellefteå SVF1278 SEB N Dorotea SVF128 SEB Rev/Elg Skellefteå SVF1280 SEB N Dorotea SVF1282 SEB Elg Dorotea SVF1284 SEB Grevling Dorotea SVF1286 SEB N Dorotea SVF1287 SEB N Dorotea SVF129 SEB Rev/Elg Skellefteå 12

17 SVF1294 SEB Elg Dorotea SVF130 SEB Rev Skellefteå SVF131 SEB Rev Skellefteå SVF1310 SEB Elg Dorotea SVF1312 SEB N Dorotea SVF1318 SEB Rev Dorotea SVF1324 SEB Rev Dorotea SVF1326 SEB Elg/Mårhund Dorotea SVF1329 SEB Elg Dorotea SVF1332 SEB N Dorotea SVF1333 SEB N Dorotea SVF1346 SEB Rev Dorotea SVF135 SEB Grevling Skellefteå SVF139 SEB Rev Skellefteå SVF141 SEB Rev/Elg? Skellefteå SVF142 SEB Elg Skellefteå SVF145 SEB N Skellefteå SVF146 SEB Rev/Elg Skellefteå SVF148 SEB N Skellefteå SVF149 SEB Rev Skellefteå SVF150 SEB Elg Skellefteå SVF151 SEB N Skellefteå SVF152 SEB Rev/Elg Skellefteå SVF153 SEB Rev/Elg Skellefteå SVF155 SEB Rev Skellefteå SVF157 SEB N Skellefteå SVF158 SEB Rev Skellefteå SVF159 SEB Rev Skellefteå SVF160 SEB Elg Skellefteå SVF161 SEB N Skellefteå Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr

18 SVF163 SEB Rev/Elg Skellefteå SVF164 SEB Rev/Elg Skellefteå SVF165 SEB Grevling Skellefteå SVF166 SEB Rev Skellefteå SVF168 SEB N Skellefteå SVF169 SEB Elg Skellefteå SVF170 SEB Rev Skellefteå SVF171 SEB Rev/Elg Skellefteå SVF173 SEB Rev/Elg Skellefteå SVF174 SEB Elg Skellefteå SVF175 SEB Rev Skellefteå SVF176 SEB Rev Skellefteå SVF179 SEB Elg Skellefteå SVF180 SEB Rev Skellefteå SVF181 SEB Rev Skellefteå SVF182 SEB N Skellefteå SVF183 SEB N Skellefteå SVF184 SEB Rev Skellefteå SVF185 SEB Rev Skellefteå SVF189 SEB Rein Malå SVF190 SEB N Norsjö SVF191 SEB N Norsjö SVF194 SEB Elg Norsjö SVF197 SEB Rev Norsjö SVF200 SEB Rev Norsjö SVF202 SEB Rev/Mårhund Norsjö SVF207 SEB N Norsjö SVF210 SEB Rev Malå SVF213 SEB Rev/Elg Norsjö SVF216 SEB Elg Norsjö 14

19 SVF217 SEB N Norsjö SVF218 SEB Rev/Elg Norsjö SVF219 SEB Elg Norsjö SVF220 SEB Rev/Elg Norsjö SVF221 SEB Rev Norsjö SVF223 SEB N Vilhelmina SVF224 SEB N Vilhelmina SVF226 SEB Rev Vilhelmina SVF227 SEB Elg Vilhelmina SVF231 SEB N Vilhelmina SVF232 SEB N Vilhelmina SVF238 SEB Rev/Rein Sorsele SVF241 SEB Elg Sorsele SVF249 SEB Elg Storuman SVF254 SEB Elg Storuman SVF258 SEB Elg Storuman SVF261 SEB Elg Storuman SVF270 SEB N Storuman SVF276 SEB Elg Storuman SVF282 SEB Elg Lycksele SVF285 SEB N Lycksele SVF289 SEB N Lycksele SVF291 SEB Rev Lycksele SVF292 SEB Rev Lycksele SVF298 SEB Rev/Elg Bjurholm SVF303 SEB Rev/Elg Lycksele SVF305 SEB Rev Lycksele SVF306 SEB Rev Lycksele SVF311 SEB N Åsele SVF314 SEB Rev/Elg Åsele Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr

20 SVF330 SEB Rev Lycksele SVF331 SEB Elg Lycksele SVF337 SEB Rev/Elg Lycksele SVF341 SEB N Lycksele SVF343 SEB Elg Umeå SVF345 SEB Rev/Grevling Lycksele SVF348 SEB Rev Lycksele SVF349 SEB Rev Lycksele SVF350 SEB Rev Lycksele SVF353 SEB Elg Robertsfors SVF354 SEB Rev Umeå SVF357 SEB N Lycksele SVF359 SEB Rev/Elg Lycksele SVF361 SEB Rev Lycksele SVF363 SEB Rev Lycksele SVF368 SEB Rev Umeå SVF369 SEB Rev/Mårhund Umeå SVF370 SEB Rev/Mårhund Umeå SVF372 SEB Elg Bjurholm SVF373 SEB N Lycksele SVF374 SEB Rev/Mårhund Lycksele SVF378 SEB Rev Lycksele SVF383 SEB Rev/Elg Lycksele SVF386 SEB Elg Lycksele SVF388 SEB Rev/Elg Robertsfors SVF391 SEB Grevling Umeå SVF392 SEB Rev Robertsfors SVF393 SEB Rev/Elg Umeå SVF395 SEB Rev/Elg Vännäs SVF396 SEB Rev Vännäs 16

21 SVF397 SEB Rev/Elg Robertsfors SVF398 SEB Rev Umeå SVF399 SEB Rev Umeå SVF400 SEB Elg Umeå SVF401 SEB Rev Robertsfors SVF402 SEB Rev/Elg Umeå SVF408 SEB Rev Lycksele SVF412 SEB Rev Lycksele SVF413 SEB Elg Lycksele SVF416 SEB Rev Lycksele SVF418 SEB Rev Lycksele SVF420 SEB Elg Lycksele SVF425 SEB Elg Lycksele SVF428 SEB Rev Robertsfors SVF432 SEB Rev Bjurholm SVF433 SEB Rev/Elg Åsele SVF435 SEB Rev Vännäs SVF436 SEB Rev Umeå SVF437 SEB Grevling Umeå SVF438 SEB Rev/Elg Umeå SVF439 SEB Rev Umeå SVF444 SEB N Lycksele SVF446 SEB Rev/Mårhund Lycksele SVF456 SEB Elg Vännäs SVF457 SEB Grevling Vännäs SVF458 SEB Rev Vännäs SVF459 SEB Rev/Elg/Mårhund Vännäs SVF460 SEB Elg/Mårhund Robertsfors SVF461 SEB Grevling Vännäs SVF462 SEB N Vännäs Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr

22 SVF463 SEB Elg Robertsfors SVF465 SEB Grevling Vännäs SVF466 SEB Rev Vännäs SVF474 SEB Rev Bjurholm SVF485 SEB Elg Bjurholm SVF495 SEB Grevling Bjurholm SVF497 SEB N Bjurholm SVF507 SEB N Bjurholm SVF525 SEB Rev/Elg Åsele SVF526 SEB Rev Åsele SVF550 SEB Elg Åsele SVF590 SEB Elg Sorsele SVF591 SEB N Sorsele SVF595 SEB N Sorsele SVF603 SEB Rev Sorsele SVF604 SEB N? Sorsele SVF607 SEB Rev/Elg/Grevling Sorsele SVF614 SEB N Sorsele SVF619 SEB Rev Sorsele SVF641 SEB Rev Sorsele SVF643 SEB N Sorsele SVF646 SEB Grevling Sorsele SVF648 SEB N Sorsele SVF655 SEB Rev Sorsele SVF657 SEB Rev Sorsele SVF660 SEB Rev/Elg Sorsele SVF667 SEB Rev Sorsele SVF669 SEB N Sorsele SVF672 SEB N Sorsele SVF679 SEB N Sorsele 18

23 SVF684 SEB N Sorsele SVF687 SEB Elg/Grevling Sorsele SVF691 SEB Rev Sorsele SVF695 SEB Elg Sorsele SVF696 SEB N Sorsele SVF698 SEB Rev Sorsele SVF701 SEB Rev Sorsele SVF702 SEB N Sorsele SVF705 SEB N Sorsele SVF710 SEB Elg/Mårhund Vilhelmina SVF712 SEB Rev/Mårhund Vilhelmina SVF716 SEB N Vilhelmina SVF719 SEB N Vilhelmina SVF720 SEB Rev Vilhelmina SVF724 SEB Rev Vilhelmina SVF733 SEB N Vilhelmina SVF735 SEB N Vilhelmina SVF736 SEB Elg Vilhelmina SVF739 SEB N Vilhelmina SVF740 SEB Elg Vilhelmina SVF747 SEB Elg Vilhelmina SVF752 SEB Elg Vilhelmina SVF756 SEB Rev Vilhelmina SVF759 SEB Rev Vilhelmina SVF764 SEB Rev/Elg Vilhelmina SVF768 SEB Rev Vilhelmina SVF769 SEB Rev/Elg Vilhelmina SVF771 SEB N Vilhelmina SVF772 SEB Elg Vilhelmina SVF777 SEB Rev Vilhelmina Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr

24 SVF781 SEB N Vilhelmina SVF783 SEB N Vilhelmina SVF790 SEB Rev/Grevling/Mårhund Vilhelmina SVF793 SEB N Vilhelmina SVF799 SEB Rev/Elg Vilhelmina SVF803 SEB Elg/Grevling Vilhelmina SVF810 SEB N Vilhelmina SVF811 SEB N Vilhelmina SVF815 SEB N Vilhelmina SVF822 SEB Rev/Mårhund Vilhelmina SVF823 SEB Rev Vilhelmina SVF831 SEB N Storuman SVF834 SEB N Vilhelmina SVF837 SEB Rev/Elg/Mårhund Vilhelmina SVF843 SEB N Vilhelmina SVF845 SEB Rev/Mårhund Vilhelmina SVF848 SEB N Vilhelmina SVF850 SEB N Storuman SVF851 SEB Elg/Grevling Storuman SVF852 SEB N Storuman SVF853 SEB N Storuman SVF858 SEB N Storuman SVF860 SEB N Storuman SVF869 SEB N Vilhelmina SVF881 SEB Elg Vilhelmina SVF885 SEB Elg Vilhelmina SVF895 SEB N Storuman SVF900 SEB N Vilhelmina SVF904 SEB Rev/Rein Vilhelmina SVF906 SEB N Vilhelmina 20

25 SVF907 SEB N Vilhelmina SVF909 SEB Rev Vilhelmina SVF917 SEB N Storuman SVF923 SEB N Storuman SVF934 SEB Rev Åsele SVF936 SEB Rev Åsele SVF938 SEB N Åsele SVF948 SEB N Åsele SVF955 SEB Elg Storuman SVF960 SEB Elg Storuman SVF967 SEB N Storuman SVF969 SEB Grevling Åsele SVF973 SEB N Storuman SVF974 SEB N Storuman SVF977 SEB N Storuman SVF978 SEB Rev/Grevling Storuman SVF982 SEB Rev Storuman SVF983 SEB N Storuman SVF989 SEB N Storuman SVF994 SEB N Storuman SVF995 SEB N Storuman SVH025 SEB Elg Storuman Eiken et al. Bioforsk Rapport vol. 5 nr