INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail

Transkript

1 INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail PRODUKTETS HENSIKT INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail er designet for kvantitativt å detektere amplifikasjon med lysmikroskopi av HER2-genet via tofarget kromogenisk in situ hybridisering (ISH) i formalinfikserte, parafininnstøpte vevsprøver av human bryst- og magekreft, inkludert den gastroøsofagale overgangen, etter farging på Ventana automatiske fargemaskiner. INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail er indisert som en hjelp i evaluering av pasienter med bryst- og magekreft der man vurderer behandling med HERCEPTIN (trastuzumab), og pasienter med brystkreft der man vurderer behandling med KADCYLA (trastuzumab emtansine (T-DM1)). Dette produktet skal tolkes av en kvalifisert patolog i sammenheng med en histologisk undersøkelse, relevant klinisk informasjon og egnede kontroller. Dette produktet er beregnet på in vitro diagnostisk bruk (IVD). PRINSIPP FOR PROSEDYREN INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail er optimalt formulert for bruk med Ventana ultraview SISH DNP Detection Kit, Ventana ultraview Red ISH DIG Detection Kit og tilbehørsreagenser på Ventana automatiske fargemaskiner. Under fargingsprosessen for Dual in situ-hybridiseringen (Dual ISH), hybridiseres DNP- og DIG-merkede prober sammen til deres respektive mål-dna-sekvenser i cellekjernen. Deteksjon av den DNPmerkede HER2-Probe skjer først i ultraview SISH DNP Detection Kit, som inneholder følgende dispensere: et Rabbit anti-dnp Monoclonal Antibody, Multimer-løsning som inneholder et Goat anti-rabbit Secondary Antibody konjugert til Horseradish Peroxidase (HRP),Silver ISH DNP Chromogen A (Silver A), Silver ISH DNP Chromogen B (Silver B) og Silver ISH DNP Chromogen C (Silver C). Etter inkubasjon med primært Rabbit anti- DNP Antibody og deretter sekundært Goat anti-rabbit HRP, oppstår Silver in situ hybridisering (SISH)-reaksjonen. Kort beskrevet drives denne reaksjonen av den sekvensielle tilsetningen av Silver A (sølvacetat), Silver B (hydrokinon) og Silver C (H2O2). Her reduseres sølvionene (Ag+) av hydrokinon til metalliske sølvatomer (Ag0). Denne reaksjonen drives av substratet for HRP, hydrogenperoksid (Silver C). Det sølvfargede bunnfallet avsettes i kjernen og en enkel kopi av HER2-genet visualiseres som et svart signal. Figur 1 illustrerer SISH-reaksjonen. Etter SISH-påvisning for HER2, påvises den DIG-merkede Chromosome 17-Probe med ultraview Red ISH DIG Detection Kit. Dette settet inkluderer følgende dispensere: Mouse anti-dig Monoclonal Antibody, Red ISH Multimer-løsning som inneholder Goat anti- Mouse IgG Antibody konjugert til Alkaline Phosphatase (AP), ph Enhancer, Naphtol og Fast Red. Etter utvikling av SISH-signalet inkuberes objektglasset med Mouse anti-dig Antibody, som binder seg til DIG Hapten på Chromosome 17-Probe. Anti-Hapten Primary Antibody påvises med Multimer-løsningen (goat anti-mouse IgG conjugated til AP-enzym). Objektglasset inkuberes med ph Enhancer-løsningen, som gir riktige saltkomponenter/- konsentrasjoner og bufret ph for optimal ytelse av AP-enzymet. Deretter påføres naftolfosfat, som fungerer som substratet for AP-enzymet (AP defosforylerer naftol). Fast Red, som deretter tilsettes objektglasset, kombineres med det defosforylerte naftolet og danner et rødt bunnfall som lett kan visualiseres med lysmikroskopi. Figur 2 illustrerer Red ISH-reaksjonen. Prøven motfarges med Hematoxylin II for tolkning med lysmikroskopi. SAMMENDRAG OG FORKLARING HER2/neu (HER2) tilhører en familie av fire transmembran-reseptor tyrosinkinaser som medierer vekst, differensiering og overlevelse av celler. 1,2 HER2-genet koder HER2- proteinet, 2,3 og overuttrykk av HER2-proteinet, amplifikasjon av HER2-genet, eller begge, forekommer i ca. 15 til 25 prosent av brystkrefttyper og er assosiert med aggressiv tumoropptreden. 4,5 INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail inneholder en HER2- probe (merket med haptendinitrofenyl eller DNP) og en Chromosome 17-probe (merket med haptendigoksigenin eller DIG) formulert med human blokkerende placenta-dna i en formamidbasert buffer. Probene er konstruert for å påvise amplifikasjon av HER2-genet i bryst- og gastrisk karsinom. HER2 DNA-Probe omfatter ca basepar langs den genomiske regionen som inneholder HER2-genet (også kalt ERBB2 og NEU), som finnes på humant Chromosome 17 (17q11.2-q21). Chromosome 17-Probe omfatter alfa-satellittsekvensene i den sentromeriske regionen, og fungerer som en referanse for aneusomi. Black Signal Kopinumre av begge prober telles i tumorkjernene og resultatene rapporteres som et forhold av HER2 / Chromosome 17 (HER2/Chr17) for å bestemme HER2- amplifikasjonsstatus (HER2/Chr17-forhold 2,0 er amplifisert mens < 2,0 er ikkeamplifisert). I mange kliniske studier har amplifikasjon og/eller overuttrykk av HER2 viset seg å være Rabbit anti-dnp Antibody assosiert med et dårlig klinisk utfall for kvinner med invasiv brystkreft, og korrelert med flere negative prognosevariabler, inkludert negativ status for Estrogen Receptor (ER), høy S-fasefraksjon, positiv nodestatus, mutert p53 og høy nukleær grad. 6,7 I flere studier viste pasienter med invasiv brystkreft (både nodepositiv og nodenegativ) med en amplifisert HER2 genstatus, redusert total overlevelse og høyere frekvens av tilbakefall. 1,8,9,10,11 Resultater fra kliniske studier som måler HER2-proteinoveruttrykk med immunhistokjemi DNP lignet på resultater oppnådd med HER2-genamplifikasjon. 9,11,12,13 Kunnskap om HER2- N H gen- og/eller -proteinstatus hos pasienter med invasiv brystkreft gjør leger i stand til å ta 17q11.2-q21 mer informerte beslutninger for å forbedre den totale styringen av pleie for disse pasientene. Trastuzumab (HERCEPTIN) er et humanisert monoklonalt antistoff mot det ekstracellulære domenet til HER2, og har vist seg å gagne pasienter med HER2-positiv brystkreft Demonstrert HER2-genamplifikasjon og/eller proteinoveruttrykk er sentralt ved valg av pasienter for trastuzumab-behandling. Kliniske studier har vist at brystkreftpasienter med høyt HER2-proteinoveruttrykk og/eller -genamplifikasjon har mest Figur 1. SISH-reaksjon for HER2-deteksjon. nytte av trastuzumab. 20 Påvisning av HER2-genamplifikasjon og/eller proteinoveruttrykk er nødvendig for pasienter med invasiv brystkreft der trastuzumab-behandling overveies og er klinisk indisert. En prosent av gastriske pasienter utviser HER2-genamplifikasjon og kan få nytte av HERCEPTIN-behandling. 21 INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktailanalysens anbefalte fargingsprotokoll, retningslinjer for feilsøking og scoringsalgoritme gjelder både bryst- og gastriske karsinomprøver. NO 2 HRP Silver A Silver B Silver C Goat anti-rabbit Antibody NO 2 HER2 DNA Probe (DNP-labeled) / NO Rev C

2 Goat anti-mouse Antibody Chromosome 17 Centromere Region Red Signal DIG AP ph Enhancer Naphthol Fast Red Mouse anti-dig Antibody Chr17 DNA Probe (DIG-labeled) 13. VENTANA ULTRA Cell Conditioning Solution (ULTRA CC2) (REF ) 14. VENTANA LCS (Predilute) (REF ) 15. VENTANA ULTRA LCS (Predilute) (REF ) 16. VENTANA BenchMark Series automatisert fargemaskin 17. Strekkodeetiketter 18. Superfrost Plus mikroskopobjektglass (VWR. REF eller tilsvarende) 19. Xylen (histologisk kvalitet) 20. Avionisert eller destillert vann 21. Permanent monteringsmedium (Permount Fisher Cat. No. SP eller tilsvarende)** 22. Dekkglass (tilstrekkelig til å dekke vevet, som VWR Cat. No eller tilsvarende) 23. Automatisk dekkmateriale (som Tissue Tek SCA automatisk dekkmateriale) 24. Fargeglass eller -bad 25. Tidsmåler 26. Lysmikroskop 27. VENTANA HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides (REF ) kan brukes til feilsøking etter behov. * Etter behov for spesifikke bruksområder. **Se Tabell 11 for kompatible monteringsmedier med denne analysen. Figur 2. Red ISH-reaksjon for Chromosome 17-deteksjon. Hvert trinn i den automatiske fargingsprotokollen inkluderer inkubasjon av objektglasset med den spesifikke reagensen som trengs for et nøyaktig tidsrom og en nøyaktig temperatur. På slutten av hvert inkubasjonstrinn skylles snittene av Ventana automatiske fargemaskin for å avbryte reaksjonen og fjerne ubundet materiale. For å minimere fordamping av vannholdige reagenser fra objektglasset, tilsettes en coverslip-løsning av fargemaskinen for hvert trinn. For mer detaljert informasjon om betjening av instrumentet, se den aktuelle brukerhåndboken for Ventana automatiske fargemaskin. REAGENS SOM FØLGER MED INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail inneholder tilstrekkelig reagens for 50 tester. Én 10 ml-dispenser med INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail inneholder ca. 12 μg/ml av HER2 Probe merke med dinitrofenyl (DNP) og 1 μg/ml med Chromosome 17- probe merket med digoxigenin (DIG) formulert med humant morkake-blokkerende DNA i en formaminbasert hybridiseringsbuffer. Begge probene brukes til å bestemme HER2- genstatus (dvs. forholdet HER2 / Chr17). I det aktuelle pakningsvedlegget for VENTANA-deteksjonssettet finner du detaljerte beskrivelser av: (1) Prosedyreprinsipper, (2) Nødvendige materialer og reagenser som ikke følger med, (3) Prøvetaking og preparering for analyse, (4) Prosedyrer for kvalitetskontroll, (5) Feilsøking, (6) Tolking av resultater og (7) Generelle begrensninger. NØDVENDIGE MATERIALER SOM IKKE FØLGER MED Fargingsreagenser, som VENTANA-deteksjonssett og tilleggskomponenter, følger ikke med. Ikke alle produkter som er oppgitt i pakningsvedlegget er tilgjengelige i alle markeder. Kontakt din lokale representant. 1. VENTANA ultraview SISH DNP Detection Kit (REF ) 2. VENTANA ultraview Red ISH DIG Detection Kit (REF ) 3. VENTANA HybReady Solution (REF ) 4. VENTANA ultraview Silver Wash II (REF eller tilsvarende) 5. VENTANA ISH Protease 2 (REF )* 6. VENTANA ISH Protease 3 (REF )* 7. VENTANA Hematoxylin II (REF )* 8. VENTANA Bluing Reagent (REF )* 9. VENTANA Reaction Buffer Concentrate (10X) (REF ) 10. VENTANA 10X SSC (REF ) 11. VENTANA EZ Prep Concentrate (10X) (REF ) 12. VENTANA Cell Conditioning Solution (CC2) (REF ) LAGRING Ved mottak og når den ikke er i bruk, må den oppbevares ved 2 8 C. Skal ikke fryses. For å sikre riktig tilførsel av reagenser og stabiliteten til proben, skal dispenserlokket settes på igjen etter hver bruk, og dispenseren skal umiddelbart settes i kjøleskapet i stående posisjon. Alle probedispensere har holdbarhetsdato. Når reagensen oppbevares på riktig måte, er den stabil frem til datoen som står på etiketten. Reagensen skal ikke brukes etter utløpsdatoen. PRØVEKLARGJØRING Rutinemessig behandlet, formalinfiksert, parafininnstøpt vev egner seg for bruk med denne proben ved bruk med BenchMark IHC/ISH-instrumenter. Hvert snitt skal skjæres til riktig tykkelse (ca. 4 µm) og legges på et Superfrost Plus (eller tilsvarende) objektglass. Det anbefalte vevsfiksativet er 10 % nøytralt bufret formalin (NBF). 22 Se Tabell 1 for en liste med anbefalte fiksativer og fiksativer som ikke er kompatible med denne proben. Hvis du har spørsmål om anbefalte fiksativer, kan du kontakte din lokale servicerepresentant. Tabell 1. Anbefalte og ikke-kompatible fiksativer. Anbefalte fiksativer Nøytralt bufret formalin (NBF) Sinkformalin Alkoholformalin PREFER-fiksativ Ikke-kompatible fiksativer Bouin s Alkoholformalin-eddiksyre (AFA) Prøver som fikseres > 6 timer med AFA eller Bouin s fiksativer gir svak eller manglende farging. 23 Bortsett fra med Ventana-analyser, har nylige studier funnet at de fleste ufullstendige HER2-genresultater med FISH er relatert til pre-analytiske faktorer, inkludert under- og overfiksering, 24 i tillegg til forsinket fiksering. 25 Streng implementering av fikseringsprosedyrene (f.eks. en dedikert prosessor for å sikre minst 6 timers fiksering) førte til 64 % reduksjon av ufullstendig tilfeller fra 10,8 % feil til 3,4 %. Prøver fiksert i < 6 timer i formalin kan resultere i tap av signal og nukleær overfordøyelse, som observert ved blek/svak hematoxylin-farging. Snitt som er tykkere enn 4 μm kan kreve en sterkere proteasebehandling enn de anbefalte betingelsene. På grunn av overflødig parafin i vevet kan dette innebære mer dannelse av nukleære bobler enn i tynnere snitt. Dannelse av nukleære bobler vises som små eller store bobler eller septum i cellekjernen. Når det oppstår nukleære bobler er det ofte et spektrum av virkninger på SISH- og Red ISH-signaler, kjennetegnet ved 1) cellekjerner med nukleære bobler der SISH- og Red ISH-signaler generelt fremdeles finnes i cellekjernen og 2) cellekjerner med nukleære bobler som skyver SISH- og Red ISHsignalene til periferien. I begge tilfeller, hvis SISH- og Red ISH-signalene tydelige, ellers ikke forvridde og fremdeles tellbare, kan tilfellet scores. Imidlertid kan alvorlig nukleær bobling forvrenge SISH- og Red ISH-signalene eller gjøre dem utydelige slik at nøyaktig / NO Rev C

3 telling blir umulig. Dette skjer oftere når SISH- og Red ISH-signalene skyves til den nukleære periferien. Når dette skjer kan man ofte finne cellekjerner andre steder i prøven som er tellbare, og tilfellet kan scores. Hvis den nukleære boblingen er betydelig, i den grad at man ikke kan finne tilstrekkelige cellekjerner der SISH- og Red ISH-signalene kan telles korrekt, skal tilfellet ikke scores. Disse prøvene kan måtte avparafiniseres i xylen- og alkoholbad før gjentatt farging på instrumentet. Brukeren kan også velge alternativet for utvidet avparafinisering i fargingsprosedyren (se Feilsøking). Nukleær bobling kan også forekomme ved underfiksering (1 3 timer med formalin), som er en mindre diskret nukleær bobling. Dette kan løses ved 3 timers fiksering med endret cellekondisjonering / proteasebehandling, men ved 1 time kan det sannsynligvis ikke løses INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-analysen er utviklet med flere alternativer for forhåndsbehandling som kan bidra til å optimere analysen i forskjellige laboratorier og for påfølgende feilsøking av bestemte vev/objektglass som viser under-optimal farging. Ventana anbefaler at hvert laboratorium utfører første kjøringer på representative kontrollprøver som er preparert under de samme betingelsene som de kliniske prøvene som skal testes. Dette vil bidra til å optimere de spesifikke fargingsbetingelsene for individuelle laboratorier som kan variere i prosedyrene for preparering av prøver. Variable resultater kan forekomme med forskjellige pre-analytiske faktorer enn anbefalt. Prøver som er preparert pre-analytisk med betingelser som ikke anbefales av Ventana vil kanskje ikke farge adekvat med analysen. FARGEPROSEDYRE VENTANA-prober er utviklet til bruk på en VENTANA automatisk fargemaskin i kombinasjon med VENTANA deteksjonssett og tilbehør. Parametrene for automatiserte prosedyrer kan vises, skrives ut og redigeres i henhold til prosedyren i brukerhåndboken for instrumentet. Andre bruksparametere for de automatiserte fargemaskinene er forhåndsinnstilt ved fabrikken. En anbefalt fargingsprotokoll for hver instrumentplattform er listet opp i Tabell 2. Se relevant pakningsvedlegg for VENTANA-deteksjonssett for mer informasjon om prosedyrer for farging med in situ-hybridisering (ISH). Tabell 2. Anbefalt fargingsprotokoll for INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail på VENTANA BenchMark Series automatiske fargemaskiner. Valgbart prosedyretrinn Anbefalt fargingsprotokoll for BenchMark og BenchMark XT Anbefalt fargingsprotokoll for BenchMark ULTRA Baketemperatur Ikke relevant Velg 63 ºC Baketid Ikke relevant 20 min Avparafinisering Valgt Velg 72 ºC Extended Depar* Ikke valgt Ikke valgt Valgbart prosedyretrinn Cell Conditioning ISH-Protease 3 Anbefalt fargingsprotokoll for BenchMark og BenchMark XT Valgt Cell Conditioning CC2 Mild CC2-8 min Standard CC2-12 min Utvidet CC2-8 min 16 min (vev) 8 min (Xenografts) Anbefalt fargingsprotokoll for BenchMark ULTRA Valgt Cell Conditioning CC2 86 ºC Mild CC2-8 min Standard CC2-12 min Utvidet CC2-8 min 16 min (vev) 8 min (Xenografts) Denaturering 20 min 20 min Kryssing 6 timer 6 timer Stringensvask 72 C (humant vev) 76 C (Xenografts) 72 C (humant vev) 76 C (Xenografts) SISH Multimer 16 min 32 min Silver Chromogen 4 min 4 min ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Red ISH Multimer 24 min 24 min 1. For in vitro-diagnostisk (IVD) bruk. Red Chromogen 8 min 8 min moderat giftig ved svelging. Det irriterer hud, øyne og slimhinner og absorberes 2. Kun til profesjonell bruk. 3. Advarsel, produktet inneholder formamid. Formamid er giftig ved inhalering og Kontrastfarge Etter kontrastfarging Hematoxylin II - 8 min Bluing Reagent - 4 min Hematoxylin II - 8 min Bluing Reagent - 4 min gjennom huden. Det kan skade ufødt liv. Ta forholdsregler ved håndtering av * Alternativet Extended Depar er beregnet på å redusere alvorlig nukleær bobling på reagenser. Bruk engangshansker og egnede verneklær ved håndtering av antatte grunn av for mye parafin. kreftfremkallende eller giftige materialer. 4. Pass på at avfallsbeholderen er tømt før en kjøring startes på instrumentet. Hvis ikke denne forholdsregelen er tatt, kan avfallsbeholderen flyte over og brukeren kan På grunn av variasjonen i vevsfiksering og bearbeiding, og i generelle risikere å skli og falle. laboratorieinstrumenter og miljømessige betingelser, kan det være nødvendig å øke eller 5. Materialer av humant eller animalsk opphav skal håndteres som potensielt biologisk farlige og avhendes med egnede forholdsregler. redusere probens hybridisering, cellekondisjoneringen eller proteaseforbehandling basert på individuelle prøver, deteksjonen som brukes og leserens preferanser. 6. Unngå at reagenser kommer i kontakt med øyne, hud og slimhinner. Hvis reagenser Starte en kjøring på BenchMark Series automatiske fargemaskiner. kommer i kontakt med sensitive områder, må du skylle med rikelige mengder vann. Unngå innånding av reagenser. 1. Sett på objektglassets strekkodeetikett, som tilsvarer probeprotokollen som skal utføres. Sentrer objektglassets etikett uten overheng. Unngå dobbel etikettering eller 7. Unngå mikrobiell kontaminasjon av reagensene, da dette kan gi feil resultater. ny festing av en etikett. Det skal brukes klart overlegg med VENTANA VANTAGE 8. Rådfør deg med lokale og/eller statlige myndigheter når det gjelder anbefalte etiketter for arbeidsflytløsninger. metoder for avfallshåndtering. 2. Last INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail, reagenser fra ultraview Red 9. For ytterligere sikkerhetsinformasjon, henvises du til produktets sikkerhetsdatablad ISH DIG og ultraview SISH DNP Detection Kits og nødvendige tilbehørsreagenser og til oversikten over symboler og risikotekst på på reagensbrettet(-ene). Sett reagensbrettet(-ene) på den automatiske fargemaskinen. Kontroller bulkvæske og avfall. 3. Bulkflaskene med reaksjonsbuffer må være fulle. 4. Avfallsbeholderen må tømmes før kjøringen startes. 5. Last objektglassene på den automatiske fargemaskinen. 6. Start fargekjøringen. 7. Når kjøringen er ferdig, fjerner du objektglassene fra den automatiserte fargemaskinen. 8. Fortsett med dehydreringsprosedyren. Dehydreringsprosedyre Merk: Fast Red-kromogenet er oppløselig i alkohol og aceton. Alkohol- eller acetonbad må ikke brukes til å dehydrere objektglass, da det rødesignal vil bli påvirket. 1. For å fjerne den flytende dekkmateriale-løsningen, vask objektglassene i 2 etterfølgende løsninger med mildt oppvaskmiddel (ikke bruk vaskemiddel som er beregnet på automatiske oppvaskmaskiner). 2. Skyll objektglass med godt destillert vann, ca. 1 minutt. Rist av overflødig vann. 3. Plasser objektglassene i en ovn (45 60 C) for å tørke eller lufttørk dem ved romtemperatur. I en ovn varierer tørketidene fra 10 minutter til én time. Pass på at objektglassene er helt tørre før du legger på dekkglass. 4. Overfør objektglassene til et xylen-bad i ca. 30 sekunder. 5. Legg dekkglasset på objektglasset. Merk deg at enkelte monteringsmedier ikke er kompatible med analysen (se avsnittene Begrensinger og Feilsøking) / NO Rev C

4 KVALITETSKONTROLLPROSEDYRER Positiv kontrollprøver HER2- og Chromosome 17-sekvenser finnes i hver celle i menneskekroppen. Derfor virker de som positive kontroller i alle vevsprøver og må være synlige (1 til 2 signaler per celle) i normale (ikke-neoplastiske) celler i og rundt det målrettede karsinomområdet. Imidlertid vil ikke alle celler vise enkel genkopi på grunn av biologisk heterogenitet og fra snitting av vevet. Spesifikk nukleær farging kan finnes i ulike celler, inkludert: stromale fibroblaster, endotelceller, lymfocytter og ikke-neoplastiske celler. Hvis de positive kontrollene ikke påviser positiv farging, kan det indikere et problem med en reagens eller instrumentet. Ettersom hver prøve har en intern positiv kontroll (dvs. passende SISH-farging i normale celler), fungerer denne som den sanne «positive kontrollen». En laboratoriespesifikk positiv prøvekontroll kan kjøres for hver utførte fargeprosedyre om man ønsker. Kontrollprøvene kan være prøver preparert på samme måte som pasientprøvene. Slike kontroller er nyttige for å overvåke alle trinn i prosedyren, fra prøvepreparering til farging. Xenograft-prøve HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides brukes til preliminær validering og feilsøking forbundet med INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail. De inneholder tre særegne xenograft-snitt som er formalinfiksert og innstøpt i én enkelt parafinblokk. Xenograftsnittene er valgt fordi de er godt karakterisert i forskningslitteratur for HER2-proteinnivåer og genkopinumre. Positiv reagenskontroll Positiv reagenskontroll skal kjøres under analyseverifisering og feilsøking, fordi tilgang til DNA kan variere med fikseringsmetode og forhåndsbehandling av prøven. INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail kan brukes som en positiv kontroll for denne analysen, ettersom hver normale celle i menneskekroppen inneholder en eller to kopier av HER2 og Chromosome 17. En negativ reagenskontroll kreves ikke, fordi interne positive kontroller er tilstrekkelige. Uforklarlige avvik Uforklarlige avvik i kontroller skal henvises til din lokale representant umiddelbart. Hvis resultater fra kvalitetskontrollene ikke oppfyller spesifikasjonene, vil pasientresultatene være ugyldige. Se avsnittet Feilsøking i dette pakningsvedlegget. Identifiser og korriger problemet, og gjenta deretter pasientprøvene. Analysebekreftelse Før første gangs bruk av en reagens i en diagnoseprosedyre, skal ytelsen til reagensen verifiseres ved å teste den i en serie prøver med kjente ISH-ytelsesegenskaper som VENTANA HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides (se prosedyrene for kvalitetskontroll som tidligere er beskrevet i denne delen av produktvedlegget). Disse kvalitetskontrollprosedyrene skal gjentas for hver nye serie reagenser, eller når det er en endring i analyseparametere. TOLKNING AV RESULTATER En kvalifisert leser med erfaring innen mikroskopisk tolkning av anatomiske patologiprøver, ISH-prosedyrer og gjenkjenning av enkle og amplifiserte HER2-kopier (som krever mikroskopisk undersøkelse med 20X, 40X og/eller 60X objektiver) må evaluere kontrollene før resultatene tolkes. Merk: Bruk av 100X objektiv anbefales ikke. All designverifisering og valideringstesting ble gjort med 20X, 40X og 60X objektiver. De neste avsnittene beskriver hvordan man tolker og scorer objektglass. Tabell 3 illustrerer hvordan man teller diskrete signaler. Definisjoner 1. HER2-genstatus HER2-genstatus er en funksjon av forholdet mellom gjennomsnittlig antall kopier av HER2-genet og antallet kopier av Chromosome 17 (Chr17), per celle, i et invasivt bryst- eller gastrisk karsinom. HER2-genstatus klassifiseres med følgende retningslinjer: a. HER2/Chr17-forhold 2,0 er amplifisert b. HER2/Chr17 ratio < 2,0 er ikke-amplifisert 2. Objektglass-tilstrekkelighet. Et individuelt objektglass farget med INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail må oppfylle to kriterier for å anses å være tilstrekkelig for å telles. Hvis objektglasset ikke oppfyller disse kriteriene, kan det ikke telles og resultatet er ikke tilfredsstillende. a. Intern positiv kontroll Normale HER2 (SISH) og Chr17 (Red ISH)-signaler (1 til 2 kopier per celle) fungerer som interne positive kontroller og må være synlige i prøven. Denne nukleære fargingen kan finnes i ulike ikke-neoplastiske celler, inkludert: stromale fibroblaster, endotelceller, lymfocytter og ikkeneoplastiske celler. Ikke alle celler på objektglasset vil farges for begge prober, men normale celler i og/eller rundt målet må farges korrekt. b. Karsinomceller. Med bruk av 20X, 40X og/eller 60X objektiver må karsinommålområdet vise et tellbart felt med SISH- og Red ISH-signaler. 3. Målområder for signaltelling Et akseptabelt målområde i det invasive karsinomet viser et tellbart felt med SISH- og Red ISH-signaler. Signaltelling skal ikke utføres i områder som inneholder svake SISH- og/eller Red ISH-signaler, komprimerte eller overlappende cellekjerner eller nekrose. Cellekjerner med kraftig SISH- eller Red ISH-bakgrunn som forstyrrer evnen til å telle spesifikke signaler, skal ikke telles. Hvis et målområde anses upassende for telling, er det ofte mulig å finne andre målområder på samme objektglass som er tilstrekkelige. Dette kan bestemmes ved tilstedeværelse av normale celler som viser passende SISH- eller Red ISH-farging i eller rundt målområdet. Ytterligere observasjoner for HER2 og Chromosome 17 Andre observasjoner kan noteres som kommentarer på patologens rapport. 1. Heterogenitet: I noen tilfeller kan vevet inneholde områder med karsinomer som er genetisk heterogene for HER2-kopiantallet (dvs., det kan være en blanding av ikkeamplifiserte og amplifiserte cellekjerner eller e blanding av cellekjerner med ulike kopier av HER2). Dette kan observeres blant karsinomceller i selve målområdet eller mellom to forskjellige målområder. 2. Aneusomi er enhver tilstand der en organisme har flere eler færre spesifikke kromosomer enn normalt, dvs. at antallet av et bestemt kromosom (i dette tilfellet, Chromosome 17) ikke er diploid. I polysomi kan det være tre eller flere kopier av kromosomet i stedet for de forventede to kopiene. I monosomi kan tumorcellene vise kun én kopi av Chromosome 17. Tydelig «amplifikasjon», klynger eller polysomi av Chromosome 17 (med eller uten HER2 SISH-klynger) har blitt rapportert. 26 I tilfeller med klynger av HER2 og Chromosome 17, må man unngå å anse dem med et forhold på ~1,0. Leseren skal i disse tilfellene henvise til IHC for analyser med overuttrykk av HER2-protein, idet de fleste har en tendens til å være Monoallelisk sletting: Sletting av HER2-genet fra Chromosome 17 i tumorcellene fører til et HER2/Chr17-forhold på < 1,0. Signalvisualisering og objektglass-tilstrekkelighet SISH- og Red ISH-signaler visualiseres som: 1. Enkel kopi. Et diskret svart (SISH) eller rødt signal (Red ISH) telles om en enkelt kopi av henholdsvis HER2 eller Chr17. For SISH (svart) representerer diskrete enkle signaler som visualiseres i de interne, fysiologiske, samme objektglass, positiv kontroll (ikke-neoplastiske) cellekjernene størrelsen på en enkelt kopi av invasive karsinomceller. For Red ISH-signaler telles hvert diskrete signal som én kopi. Det bør anmerkes at Red ISH-signalet fra Chromosome 17-DIG-proben kan virke større enn SISH-signalene, av og til med en langstrakt form, og kan variere i størrelse innenfor et målområde og på tvers av prøver. SISH-signaler kan virke vesentlig mindre enn Red ISH-signaler. Imidlertid kreves ingen minimal signalstørrelse, og alle diskrete signaler skal telles. SISH-flekking eller rød tåke kan forekomme og må ikke feilaktig oppfattes som et signal. Røde signaler som er svært fargesvake sammenlignet med signalet i interne positive kontrollkjerner og resten av fargingsmønsteret, skal ikke telles da de kan være uspesifikke. Se avsnittet Feilsøking for anbefalinger for når SISH-flekking observeres. 2. Flere kopier. Diskrete enkle SISH-signaler som visualiseres i interne positive kontrollceller, representerer størrelsen på en enkelt kopi av HER2 i invasive karsinomceller. Størrelsen på enkle SISH-signaler brukes som en referanse for å bestemme det relative antallet kopier i kreftcellekjernene. For Red ISH-signaler telles hvert diskrete signal som én kopi. 3. Klynger. En klynge defineres som flere overlappene SISH-signaler i cellekjernen som ikke kan skilles fra hverandre. Klynger av HER2 kan kun estimeres av leseren. For eksempel kan en stor klynge med flere SISH-signaler estimeres til 12 kopier, mens mindre klynger kan estimeres til 6 kopier. Estimering gjøres ved å bruke enkle SISH-kopier som finnes i de interne, positive kontrollcellene som en referanse. Tilstedeværelse av HER2-klynger noteres på scoringsarket. 4. Overlappende cellekjerner, cellekjerner med en enkelt farge og prøver med uspesifikk farging skal ikke telles. Enhver cellekjerne med overlappene Red ISH- og SISH-signaler som ikke kan skilles fra hverandre, skal visualiseres med kraftigere forstørrelse for å skill de to signalene, eller skal ikke telles. Cellekjerner som virker å inneholde bobler i en slik grad at signaltolkning er vanskelig, skal ikke telles / NO Rev C

5 Telling av SISH- og Red ISH-signaler for å bestemme HER2-genstatus Før telling av HER2- og Chromosome 17-signaler for å bestemme HER2-genstatus, er det viktig å bestemme om det invasive målområdet (lesjonsvevet) er tilstrekkelig farget og oppfyller kriteriene som beskrives for objektglass-tilstrekkelighet (se avsnittet Definisjoner ovenfor, 2. Objektglass-tilstrekkelighet). Ventana har utviklet en scoringsalgoritme for analysen som maksimerer presisjon og effektivitet i telling. Tjue cellekjerner, hver med røde (Red ISH) og svarte (SISH) signaler, skal telles. De endelige resultatene for HER2-status rapporteres på grunnlag av forholdet man får ved å dele summen av HER2-signaler for alle 20 cellekjerner med summen av Chromosome 17-signaler for alle 20 cellekjerner. Amplifikasjonsstatus defineres som amplifisert hvis HER2/Chr17-forholdet er 2,0 and som ikke-amplifisert hvis forholdet er HER2/Chr17 ratio < 2,0. Hvis HER2/Chr17-forholdet faller mellom 1,8 og 2,2 (inklusive), skal ytterligere 20 cellekjerner telles. Det skal beregnes et nytt forhold basert på alle 40 cellekjerner, og amplifikasjonsstatus skal rapporteres som allerede beskrevet. Kriterier for celleutvalg Tell bare cellekjerner med diametere som er representative for den gjennomsnittlige populasjonen av invasive karsinomcellekjerner i målområdet. Ikke tell signalene i cellekjerner som er: 1. Mye større i diameter enn gjennomsnittlig størrelse på karsinomcellekjerner 2. Mye mindre i diameter enn gjennomsnittlig størrelse på karsinomcellekjerner I målområder som er genetisk heterogene for antall HER2-kopier skal du kun telle cellekjerner som er representative for populasjonen av invasive karsinomcellekjerner med det høyeste gjennomsnittlige antallet signaler. Noter at et er heterogenitet på scoringsarket. Tabell 3. Signalvisualisering for INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail. Ikke tell hvis cellekjernene overlapper. Ikke tell hvis det ikke finnes noe signal. Estimer den store klyngen. Her kan klyngen estimeres som 12 svarte signaler. Ved å legge til de andre 4 enkle signalene får man et totalt antall på 16. Tell røde signaler som 2 kopier av Chromosome 17. Noter på scoringsarket at det finnes klynger for HER2. Et rødt signal nærme et sart signal skal telles som ett rødt og ett svart signal. Det kan kreves telling med 60x objektiv for å skille dem. Tell dem derfor som 4 svarte og 2 røde signaler. Hvis overlappende signaler ikke kan skilles ad, skal denne cellekjernen ikke telles. Klynge med svarte signaler skjuler røde signaler. Det kan brukes kraftigere (60X) forstørrelse i forsøk på å bekrefte tilstedeværelse eller fravær av røde signaler. Ellers må de ikke telles. Telle alltid cellekjerner med tydelige røde signaler. Tilstedeværelse av SISHklynger noteres på scoringsarket. Cellekjerner med tydelige og høyere antall røde signaler skal scores i cellekjerner med SISHklynger. Hvis det finnes SISH-støv i bakgrunnen i cellekjernen, skal den kun telles hvis spesifikke SISH-signaler tydelig kan skilles ut fra bakgrunnen. Rød tåke kan forekomme og må ikke feilaktig oppfattes som et signal. Det røde signalet kan variere i intensitet, men er alltid diskret. Bildet viser 2 diskrete røde (Chr17) signaler og 2 svarte (HER2) signaler. HER2-genstatus: Scoringsalgoritme for HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Tjue cellekjerner, hver med røde (Chr17) og svarte (HER2) signaler, skal telles. De endelige resultatene for HER2-status rapporteres på grunnlag av forholdet man får ved å dele summen av HER2-signaler for alle 20 cellekjerner med summen av Chromosome 17 - signaler for alle 20 cellekjerner. Amplifikasjonsstatus defineres som amplifisert hvis HER2/Chr17-forholdet er 2,0 and som ikke-amplifisert hvis forholdet er HER2/Chr17 ratio < 2,0. Hvis HER2/Chr17-forholdet faller mellom 1,8 og 2,2, skal ytterligere 20 cellekjerner telles. Det skal beregnes et nytt forhold basert på alle 40 cellekjerner, og amplifikasjonsstatus skal rapporteres som allerede beskrevet. Ikke tell hvis det kun finnes ett signal for én farge. Ikke tell hvis signalene er utenfor cellekjernen. Telles som 1 svart (HER2) og 1 rødt (Chr17) signal. Telles som 2 svarte (HER2) og 2 røde (Chr17) signaler. Telles som 1 svart (HER2) og 2 røde (Chr17) signaler. Det svarte signalet er en «dublett» Tell to tilstøtende signaler av samme farge kun dersom avstanden mellom signalene er større eller lik diameteren til et enkelt signal. Mindre SISH-klynger kan kun estimeres ved å bruke størrelsen til et enkelt signal som referanse. Bruk stromaceller til å estimere signalstørrelse (mindre celler til venstre). For eksempel skal denne klyngen estimeres som 6 SISH-signaler. Ved å legge til de andre 2 enkle signalene får man et totalt antall på 8. Tell som 2 røde signaler. Noter på scoringsarket at det finnes klynger for HER / NO Rev C

6 Start Totalt overensstemmelsesnivå HER2/Chr17- farget objektglass Objektglasset tilstrekkelig? Ja Identifiser og velg målområde Tell HER2- og Chromosome 17-signaler i 20 cellekjerner Beregn HER2/Chr17-forholdet ved å dele det totale antallet HER2-signaler fra målområde 1 med det totale antallet Chr17-signaler fra målområde 1 Er 1,8 HER2/Chr17 2,2? Nei Rapporter resultater Ikke-amplifisert HER2/Chr17 < 2,0 Amplifisert HER2/Chr17 2,0 Kontroller Sølv og røde signaler i en normal cellekjerne er en indikasjon på positiv reaktivitet. Normale cellekjerner skal inneholde gjennomsnittlig 1 2 diskrete SISH- Red ISH-signaler, noe som indikerer at HER2 DNA og sentromeriske Chromosome 17-Probes har krysset til henholdsvis genet og dets kromosom. Manglende påvisning av enkel genkopi i normale celler indikerer et utilstrekkelig objektglass og resultatene skal anses som ugyldige. Bruk av Xenograft-objektglass vil hjelpe til med feilsøking av mulige problemer med instrument og/eller reagens. Pasientprøve Pasientens morfologiske funn og relaterte kliniske data må tolkes av en kvalifisert patolog. BEGRENSNINGER Generelle begrensninger 1. ISH er en flertrinnsmetode som krever spesialisert opplæring i valg av egnede reagenser, preparering av prøver, prosessering og preparering av ISH-objektglasset samt tolkning av resultatene. 2. Vevsfarging er avhengig av håndteringen og bearbeidingen av vevet før farging. Uriktig fiksering, dypfrysing, opptining, vask, tørking, oppvarming, snitting eller kontaminasjon med annet vev eller væsker kan produsere artefakter. Inkonsekvente resultater kan oppstå som følge av variasjoner i fikserings- og innstøpingsmetodene, eller på grunn av naturlige uregelmessigheter i vevet. 3. Kraftig eller ufullstendig kontrastfarging kan hindre riktig tolkning av resultater. 4. Klinisk tolkning av farging må vurderes i lys av sykehistorikk, morfologi og andre histopatologiske kriterier. Det er ansvaret til en kvalifisert patolog å ha grundig kunnskap om reagensene og metodene som brukes til å frembringe det fargede preparatet. Farging må utføres i et sertifisert, akkreditert laboratorium under oppsyn av en patolog som har ansvar for å gjennomgå de fargede objektglassene og sikre at kontrollene er adekvate. 5. Ventana leverer reagenser ved optimal fortynning til bruk når de medfølgende instruksjonene følges. Ytterligere fortynning kan føre til tap av egnet farging, og brukeren må validere slike endringer. Avvik fra anbefalte testprosedyrer kan ugyldiggjøre forventede resultater. Brukere som avviker fra anbefalte testprosedyrer, må godta ansvaret for tolkningen av pasientresultatene. 6. På grunn av variasjonene i prøveprosessering, kan det enten være nødvendig å øke eller redusere ISH-proteasens behandlingstid eller bruke en annen ISH-protease på individuelle prøver. Slike endringer må valideres av brukeren. Brukere som avviker Nei Ja Utilstrekkelig Tell ytterligere 20 cellekjerner Beregn HER2/Chr17-forholdet ved å dele det totale antallet HER2-signaler fra målområdene 1 og 2 med det totale antallet Chr17-signaler fra målområdene 1 og 2 fra anbefalte testprosedyrer, har selv ansvar for tolkning av pasientresultater under disse omstendighetene. 7. Reagenser kan vise uventede reaksjoner i tidligere utestet vev. Muligheten for uventede reaksjoner selv i testede vevsgrupper kan ikke elimineres helt på grunn av biologisk variasjon i vev. Ta kontakt med din lokale supportrepresentant med dokumenterte uventede reaksjoner. Spesifikke begrensninger 1. INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail er utviklet or å farge vevssnitt som er fiksert i 10 % NBF og kuttet til ~4 μm tykkelse. 27 Analysen farger også prøver fiksert i alkoholformalin, sinkformalin og PREFER-fiksativ. Fiksering i Bouin s eller AFA anbefales ikke. 2. For å hindre at Red ISH-signalet oppløses, skal fargede objektglass ikke senkes i alkohol- eller acetonbad for dehydrering. Lufttørking eller tørking i ovn anbefales. 3. SISH-signalet er kjent for å avta etter eksponering for visse monteringsmedier. Se Tabell 11 i avsnittet Feilsøking for en liste med inkompatible monteringsmedier. YTELSESEGENSKAPER 1. INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail ble evaluert med bruk av HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides som tidligere var karakterisert for antall HER2-genkopier av Abbott/Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit for fluorescerende in situ hybridisering (FISH) og ble funnet å ha lignende HER2/Chr17-forhold. I tillegg ble ca. 90 humane prøver (en blanding av amplifiserte og ikke-amplifiserte tilfeller) farget med INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail og telt av to kvalifiserte lesere. Samme kohort ble farget med PathVysion FISH og lest av en kvalifisert leser. For INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-analysen var nivået av suksess ved første farging > 93 %. Resultatene som beskriver nivået av negativ, positiv og total overensstemmelse i ca. 60 kliniske prøver i denne kohorten som ble telt både i FISH og INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail som vist i Tabell 4 og Tabell 5. Tabell 4. Overensstemmelse mellom INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail og FISH i en kohort av humane brystkarsinomprøver over 2 lesere. HER2 Dual ISH leser Leser A Leser B HER2 Dual ISH amplifikasjonsstatus FISH amplifikasjonsstatus Ampl. Ikke-ampl. Ampl Ikke-ampl Ampl Ikke-ampl Tabell 5. Oppsummering av nivået av negativ, positiv og total overensstemmelse for INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail og FISH med humane brystkarsinomprøver. HER2 Dual ISH leser Negativt overensstemmelsesnivå Rådata / antall tilfeller Leser A 40/42 Leser B 41/42 Prosent (95 % Score CI) 95,2 (84,2 98,7) 97,6 (87,7 99,6) Positivt overensstemmelsesnivå Rådata / antall tilfeller 21/22 17/19 Prosent (95 % Score CI) 95,5 ( ,2) 89,5 (68,6 97,1) Rådata / antall tilfeller 61/64 58/61 Prosent (95 % Score CI) 95,3 (87,1 98,4) 95,1 (86,5 98,3) 2. Analytisk spesifisitet (kryssingseffektivitet) av INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail ble bestemt ved å farge normale humane metafaseutstrykninger med HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail på et BenchMark XT-instrument. Av 100 analyserte metafaseutstrykninger viste 100 % spesifikk samlokalisering av både HER2- og Chromosome 17 Probes. 3. Reproduserbarheten til INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail ble testet over fem ulike tilfeller med humant brystkarsinom (som representerte området av HER2-genstatus) og HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides over fem tilfeldige dager på seks instrumenter (2 BenchMark, 2 BenchMark XT, 2 BenchMark ULTRA) / NO Rev C

7 Gjennomsnittlig antall HER2- og Chromosome 17-kopier ble oppnådd fra hvert instrument (over 3 plattformer) for hver av de fem kjøringene. Over 98 % av alle objektglass som ble farget og evaluert i denne studien (360 totalt) passerte objektglass-tilstrekkelighet og resulterte i reproduserbare antall HER2- og Chromosome 17-kopier med %CVs < 10 % over alle dager, instrumenter og plattformer testet. 4. Reproduserbarhet lot for lot for INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktailanalysen ble bestemt ved å teste hver av 3 loter av INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail med 3 loter av ultraview SISH DNP og ultraview Red ISH DIG Detection Kits på dupliserte objektglass for 3 tilfeller av humant brystkarsinom og HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides. Alle objektglass (100 %) passerte objektglass-tilstrekkelighet og ble telt av en kvalifisert leser for rå HER2- og Chromosome 17-kopier i 20 cellekjerner/prøver. Data gikk gjennom en avvikskomponentanalyse basert på en vilkårlig effektmodell, og resultatene viste at alle forventningskriteriene ble oppfylt i denne studien. %CVs over probelot, deteksjonssettlot og innenfor kjøringen var alle < 11 %, noe som indikerer at analysen har fremragende presisjon. 5. Analysens sammenlignbarhet på brystprøver ble bestemt med en studie som sammenlignet en INFORM HER2 DNA Probe-analyse der antallet HER2- og Chromosome 17-kopier ble bestemt på individuelle objektglass med bruk av enkel SISH-påvisning med en INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-analyse der antallet HER2- og Chromosome 17-kopier ble bestemt på et enkelt objektglass med SISH- og Red ISH-påvisning. En kohort med 213 brystkarsinomtilfeller som inneholdt ~50/50 blanding av ikke-amplifisert og amplifisert genstatus ble testet med begge analyser på BenchMark XT automatiserte fargemaskiner ( Tabell 6). Totalt nivå av overensstemmelse i kliniske prøver i INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail med INFORM HER2 DNA Probe-analyse vises i Tabell Reproduserbarheten til INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail ble testet over fire ulike tilfeller med humant gastrisk karsinom (som representerte det dynamise området av HER2-genstatus) over fem tilfeldige dager på seks instrumenter (2 BenchMark, 2 BenchMark XT, 2 BenchMark ULTRA). Gjennomsnittlig antall HER2- og Chromosome 17-kopier ble oppnådd fra hvert instrument (over 3 plattformer) for hver av de fem kjøringene. Over 98 % av alle objektglass som ble farget og evaluert i denne studien (240 totalt) passerte objektglass-tilstrekkelighet og resulterte i reproduserbare antall HER2- og Chromosome 17-kopier med %CVs < 10 % over alle dager, instrumenter og plattformer testet. 7. Analysens sammenlignbarhet på gastriske prøver ble bestemt ved å sammenligne fargingsresultatene fra INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-analysen kjørt på en BenchMark XT med Dako HER2 FISH pharmdx Kit ( Tabell 8). Totalt nivå av overensstemmelse i kliniske prøver i INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail med Dako HER2 FISH pharmdx Kit vises i Tabell Klinisk nytte i utvalget av pasienter for KADCYLA har blitt påvist i MARIANNEstudien. MARIANNE er en randomisert, trearmet, fase III flersenterstudie som er designet for å evaluere effektiviteten og sikkerheten av trastuzumab emtansine (T-DM1) kombinert med pertuzumab, og T-DM1 kombinert med placebo, i forhold til behandling med trastuzumab pluss taxane, for behandling av pasienter med HER2- positiv (som bestemt med IHC 3+ med PATHWAY HER2 (4B5)-analysen og/eller ISH amplifisert med INFORM HER2 Dual ISH-analysen), progressiv eller tilbakevendende lokalt avansert brystkreft (LABC) eller metastatisk brystkreft (MBC) som ikke tidligere er gitt kjemoterapi for deres metastatiske sykdom. Totalt 1629 pasienter ble vurdert for deltakelse i MARIANNE-studien, der 1563 ble testet med PATHWAY HER2 (4B5) og/eller INFORM HER2 Dual ISH-analyser. Totalt meldte Phase III-forsøket på 1093 HER2-positive og 2 HER2-negative pasienter i henhold til MARIANNE-kriteriene for forsøkspåmelding, der 983 hadde en prøve som testet HER2-positiv med INFORM HER2 Dual ISH-analysen. Det primære effektivitetsendepunktet for MARIANNE-studien var progresjonsfri overlevelse (PFS), basert på vurdering ved en uavhengig gjennomgangsfasilitet (IRF), hos pasienter med HER2-positiv progressiv eller gjentakende LABC eller tidligere ubehandlet MBC. Middels PFS var 13,7 måneder for trastuzumab + taxane, 14,1 måneder for T-DM1 + placebo og 15,2 måneder for T-DM1 + pertuzumab. Studien viste ikke-underlegen PFS for begge T-DM1-inneholdende behandlinger sammenlignet med trastuzumab + taxane (stratifiserte HR-er var under den forhåndsspesifiserte grensen for ikke-underlegenhet på HR=1,1765). Imidlertid viste ingen av behandlingene med T-DM1 statistisk signifikant overlegenhet for PFS over trastuzumab + taxane. For T-DM1 + placebo: HR=0,91 (95 % CI: 0,73, 1,13); For T- DM1 + pertuzumab: HR=0,87 (95 % CI: 0,69, 1,08). I tillegg ført ikke tilsetning av pertuzumab til T-DM1 til en statistisk signifikant økning av PFS (HR=0,91, 95 % CI: 0,73, 1,13). Tabell 6. Overenskomst mellom INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail med bruk av Dual SISH og Red ISH Detection og INFORM HER2 DNA Probe med bruk av enkel SISH-deteksjon på en kohort av prøver av invasive brystkarsinomer. HER2 Dual ISH amplifikasjonsstatus FISH amplifikasjonsstatus Amplifisert Ikke-amplifisert Totalt Amplifisert Ikke-amplifisert Totalt Tabell 7. Oppsummering av total overenskomst mellom INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail med bruk av Dual SISH og Red ISH Detection sammenlignet med INFORM HER2 DNA Probe med bruk av enkel SISH-deteksjon på prøver av invasive brystkarsinomer. 95 % konfidensintervall presenteres også. Rådata / antall tilfeller Totalt overensstemmelsesnivå Prosent (95 % Score CI) 193/213 90,6 (85,9 93,8) Tabell 8. Overensstemmelse mellom INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktailanalyse og Dako FISH pharmdx-test i prøver av gastrisk karsinom. HER2 Dual ISH amplifikasjonsstatus Dako FISH amplifikasjonsstatus Amplifisert Ikke-amplifisert Totalt Amplifisert Ikke-amplifisert Totalt Tabell 9. Oppsummering av overensstemmelse mellom INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-analyse og Dako FISH for HER2-genstatus på prøver av gastrisk karsinom. 95 % konfidensintervall presenteres også. Rådata / antall tilfeller Totalt overensstemmelsesnivå Prosent (95 % Score CI) 138/146 94,5 (89,6 97,2.) Tabell 10. Varighet av PFS i henhold til IRF-analyse. Trastuzumab + Taxane (N=365) T-DM1 + Placebo (N=367) T-DM1 + Pertuzumab (N=363) Pasienter med hendelse (%) 231 (63,3 %) 236 (64,3 %) 217 (59,8 %) Pasienter uten hendelse (%) 134 (36,7 %) 131 (35,7 %) 146 (40,2 %) Varighet av PFS (måneder) Median (95 % CI) Stratifisert analyse* 13,7 (12,4, 14,9) 14,1 (10,9, 16,8) T-DM1 + Pertuzumab og T-DM1 + Placebo vs Trastuzumab + Taxane 15,2 (12,5, 18,8) p-verdi (log-rank) Ikke relevant 0,3125 0,1407 Relativ risiko (95 % CI) Ikke relevant 0,91 (0,73, 1,13) 0,87 (0,69, 1,08) / NO Rev C

8 Ikke-stratifisert analyse Trastuzumab + Taxane (N=365) T-DM1 + Placebo (N=367) T-DM1 + Pertuzumab (N=363) p-verdi (log-rank) Ikke relevant 0,5142 0,0972 Relativ risiko (95 % CI) Stratifisert analyse* Ikke relevant 0,94 (0,76, 1,16) T-DM1 + Pertuzumab vs T-DM1 + Placebo 0,85 (0,69, 1,06) p-verdi (log-rank) Ikke relevant Ikke relevant 0,3075 Relativ risiko (95 % CI) Ikke relevant Ikke relevant Ikke-stratifisert analyse 0,91 (0,73, 1,13) p-verdi (log-rank) Ikke relevant Ikke relevant 0,2949 0,91 Relativ risiko (95 % CI) Ikke relevant Ikke relevant (0,73, 1,12) *Stratifisering etter global region (USA, Vest-Europa, Canada og Australia og Stillehavsområdet, Øst-Europa, Asia, Andre), tidligere adjuvant/neo-adjuvant behandling (nei; ja-trastuzumab og/eller lapatinib; ja-nei trastuzumab og/eller lapatinib) og visceral sykdom (tilstedeværende / fraværende). FEILSØKING 1. Det er viktig å evaluere tilstedeværelse av passende signal i intern positiv kontrollkjerne. Normale HER2- og Chromosome 17-signaler (1 til 2 kopier per celle) fungerer som interne positive kontroller og deres tilstedeværelse bekrefter analysens sensitivitet og spesifisitet på individuelle objektglass. Denne nukleære fargingen kan finnes i ulike ikke-neoplastiske celler, inkludert: stromale fibroblaster, endotelceller, lymfocytter og ikke-neoplastiske celler. 2. Svak eller ingen farging av prøver på en kjøring kan indikere et problem med reagensene eller instrumentet. Sjekk at passende pre-analytiske vilkår er fulgt (se Prøveklargjøring). Sjekk for å sikre at alle dispensere virker korrekt. HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides kan brukes til feilsøking hvis det er mistanke om problemer med reagenser eller instrument. 3. Hvis SISH-signalet er adekvat, mens Red ISH-signalet er svakt eller mangler, må man påse at objektglassene ikke har blitt dehydrert i alkohol eller aceton og ikke har hatt langvarig eksponering for xylenbad. Hvis Red ISH-signalet er adekvat, men SISH-signalet er svakt eller mangler (eller virker å avta eller bli brunt/oransje), kan det skje en oksidering av signalet. Påse at korrekte monteringsmedier er brukt (se Tabell 11). 4. Pasientprøver som er innsamlet, fiksert eller oppbevart på feil måte, vil kanskje ikke vise riktig farging (se Prøveklargjøring). 5. Hvis signalet for en eller begge prober virker svakt eler mangler og tumorcellekjernen virker intakt og/eller blåfarget, anbefales det å øke kondisjoneringstiden før behandling. Spesifikt kan man bruke ISH Protease 3 i over 16 minutter (dvs. 24 minutter) eller ISH Protease 2 i 4 minutter eller mer. Økte tider for cellekondisjonering (16 minutter per syklus i 3 sykluser) er også effektiv. Ventana har fastslått av manipulering av forbehandlingstrinnene er mest effektiv for å løse svak farging. 6. Hvis signalet fra de anbefalte tilstandene er svakt eller mangler i tumorcellene og tumorcellene virker overfordøyd (dvs. blek eller manglende motfarging), kan dette skyldes underfiksering (se Prøveklargjøring). Det anbefales å redusere ISH Protease 3-tiden til 8 eller 12 minutter. I tillegg er en økning av inkubasjonstidene for SISH HRP Multimer, Silver C, AP Multimer og Fast Red Chromogen også effektivt for å løse svak farging. 7. Hvis objektglassene viser uspesifikk SISH-bakgrunnsfarging («støv») i cellekjernen, som kan innvirke på tellingen av det spesifikke SISH-signalet, kan man redusere Protease 3-tiden fra 16 minutter til 4, 8 eller 12 minutter. 8. Hvis uspesifikk Red ISH-farging i cellekjernen forstyrrer tellingen, farger du objektglasset på nytt med høyere temperaturer for stringentvasken (dvs. 76 C). 9. For korrigerende tiltak, se avsnittet Prosedyrene trinn for trinn i håndboken til den automatiserte fargemaskinen eller ta kontakt med din lokalesupport-representant. 10. Snitt tykkere enn 4 μm kan kreve sterkere proteasevilkår for å avdekke mål-dna. Tynnere snitt kan kreve forsiktigere proteasevilkår. I tillegg kan tykke snitt vise mer nukleær bobling enn tynnere snitt, på grunn av for mye parafin i vevet (se Prøveklargjøring). Disse prøvene kan måtte avparafiniseres i xylen- og alkoholbad før farging på instrumentet. Brukeren kan også velge alternativet «Utvidet avparafinisering» i fargingsprosedyren for å dempe nukleær bobling på grunn av for mye parafin. 11. Hvis et tilfelle viser farging som ikke kan tolkes, med brun, svart eller mørkerød bakgrunn i vevet, må objektglasset kjøres på nytt. Hvis fargingen fremdeles er uakseptabel, må du påse at objektglassene er SuperFrost Plus. Hvis det er for mye avsetning av Silver og Red på objektglasset som gjør det vanskelig å telle det nukleære signalet på grunn av flekking rundt vevet, må objektglasset også kjøres på nytt. Vanligvis vil ikke mer enn 5 6 % av tilfellene måtte gjentas på grunn av disse tørke-/flekkeartefaktene. Tabell 11. Monteringsmedienes kompatibilitet med SISH-baserte analyser. Monteringsmedier Produsent Type (xylen, alkohol, vannholdig) Eukitt EMS Xylen N Entellan New Merck Xylen N Entellan Merck Xylen N HSR Sysmex Xylen N Malinol Muto Chemical Xylen N Cytoseal XYL Richard Allan Scientific Xylen J Softmount WAKO LEMASOL A J Paramount Protaqs Quartett: Dako Xylen J DPX BDH: Raymond Lamb Xylen J Cytoseal 60 Richard Allan Scientific Xylen J Permount Fisher Xylen J Histomount Raymond Lamb Xylen J Ultramount Dako Xylen J Thermo EZ Mount Thermo Scientific Xylen J SureMount Triangle Biomedical Sciences Xylen Flo-Texx Lerner Labs Xylen J Mountex Histolab Xylen J Shandon Consul mount Thermo Scientific Xylen J MM24 SurgiPath Xylen J Pertex Cell Path Xylen J MicroMount SurgiPath Xylen J Diamount Diapath Xylen J Alcolmount Diapath Alkohol J BioMount 2 BBInternational Xylen J Acrytol SurgiPath Xylen J Gel Mount Biomeda Vannholdig J Mount-Quick Daido Sangyo Co. Vannholdig J Kompatibilitet med SISH J / NO Rev C

9 REFERANSER 1. Gschwind A, Fischer OM, Ullrich A. The discovery of receptor tyrosine kinases: target for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 2004;4(5); Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic leukemic viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet. 1997;76(1-2): Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science. 1985;230(4730): Slamon DJ, Godolphin W, Jones LA, et al. Studies of the HER-2/neu protooncogene in human breast and ovarian cancer. Science. 1989;244(4905): Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, et al. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 1987;235(4785): Narita M, Nakao K, Ogino N, et al. Independent prognostic factors in breast cancer patients. Am J Surg. 1998;175(1): OPPHAVSRETT 7. O Reilly SM, Barnes DM, Camplejohn RS, et al. The relationship between c-erbb-2 expression, S-phase fraction, and prognosis in breast cancer. Br J Cancer. 1991;63(3): Pegram MD, Finn RS, Arzoo K, et al. The effect of HER-2/neu overexpression on chemotherapeutic drug sensitivity in human breast and ovarian cancer cells. Oncogene. 1997;15(5): Press MF, Pike MC, Chazin VR, et al. Her-2/neu expression in node-negative breast KONTAKTINFORMASJON cancer: Direct tissue quantitation by computerized image analysis and association of overexpression with increased risk of recurrent disease. Cancer Res. Roche Diagnostics GmbH 1993;53(20): Sandhofer Strasse Press MF, Bernstein L, Thomas PA, et al. HER-2/neu gene amplification characterized by fluorescence in situ hybridization: Poor prognosis in node-negative breast carcinomas. J Clin Oncol. 1997;15(8): D Mannheim Germany 11. Gusterson BA, Gelber RD, Goldhirsch A, et al. Prognostic importance of c-erbb-2 expression in breast cancer. J Clin Oncol. 1992;10: Bianchi S, Paglierani M, Zampi G, et al. Prognostic significance of c-erbb-2 expression in node negative breast cancer. Br J Cancer. 1993;67(3): Kallioniemi OP, Holli K, Visakorpi T, et al. Association of c-erb-2 protein expression with high rate of cell proliferation, increased risk of visceral metastasis and poor long-term survival in breast cancer. Int J Cancer. 1991;49(5): Vogel CL, Cobleigh MA, Tripathy D, et al. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer. J Clin Oncol. 2002;20(3): Baselga J, Carbonell X, Castañeda-Soto NJ, et al. Phase II study of efficacy, safety, and pharmacokinetics of trastuzumab monotherapy administered on a 3-weekly schedule. J Clin Oncol. 2005;23(10): Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, et al. Concurrent administration of anti-her2 monoclonal antibody and first-line chemotherapy for HER2-overexpressing metastatic breast cancer: A phase III, multinational, randomized, controlled trial. N Engl J Med. 2001;344: Marty M, Cognetti F, Maraninchi D, et al. Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment: the M77001 study group. J Clin Oncol. 2005;23(19): Piccart-Gebhart MJ, Procter M, Leyland-Jones B, et al. Trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positive breast cancer. N Engl J Med. 2005;353(16): Romond EH, Perez EA, Bryant J, et al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N Engl J Med. 2005;353(16): Bilous M, Dowsett M, Hanna W, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol. 2003;16(2): Hofmann M, Stoss O, Shi D, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology. 2008;52(7): Wolff AC, Hammond ME, Schwartz, JN, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 2007;131(1): Baloglu G, Haholu A, Kucukodaci Z, et al. The effects of tissue fixation alternatives on DNA content: a study on normal colon tissue. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2008;16(5): Middleton LP, Price KM, Puig P, et al. Implementation of American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists HER2 Guideline Recommendations in a tertiary care facility increases HER2 immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization concordance and decreases the number of inconclusive cases. Arch Pathol Lab Med. 2009;133(5): Khoury T, Sait S, Hwang H, et al. Delay to formalin fixation effect on breast biomarkers. Mod Pathol. 2009;22(11): Reinholz MM, Bruzek AK, Visscher DW, et al. Breast cancer and aneusomy 17: implications for carcinogenesis and therapeutic response. Lancet Oncol. 2009;10(3): Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and Practice of Histotechnology, 2nd Edition. The C.V. Mosby Company, St. Louis, INFORM, ultraview, BENCHMARK, VENTANA og VENTANA-logoen er varemerker som tilhører Roche. Alle andre varemerker tilhører sine respektive eiere Ventana Medical Systems, Inc / NO Rev C

10 Vedlegg A: Scoringsark for tolkning av resultater 20 cellekjerner skal telles. Hvis HER2/Chr17-forholdet faller mellom 1,8 og 2,2: 20 ytterligere cellekjerner skal telles. Målområde 1 Målområde 2 Hvis forholdet 1,8 HER2/Chr17 2,2 Heterogenitet finnes? (Merk av hvis ja) Heterogenitet finnes? (Merk av hvis ja) Celle HER2-antall Celle Chr17-antall Celle HER2-antall Celle Chr17-antall Klynger finnes? (Merk av hvis ja) Klynger finnes? (Merk av hvis ja) Klynger finnes? (Merk av hvis ja) Klynger finnes? (Merk av hvis ja) Totalt antall HER2- signaler i målområde 1 Totalt antall Chr17- signaler i målområde 1 Totalt antall HER2-signaler i målområde 2 Totalt antall Chr17-signaler i målområde 2 a b d e Målområde 1 HER2/Chr17-forhold Målområder 1 og 2 HER2/Chr17-forhold c = a/b f = (a+d)/(b+e) Ikke-amplifisert: HER2/Chr17 < 2,0 Ikke-amplifisert: HER2/Chr17 < 2,0 Amplifisert: HER2/Chr17 2,0 Amplifisert: HER2/Chr17 2, / NO Rev C