HercepTest for Dako Autostainer

Transkript

1 HercepTest for Dako Autostainer Kode K utgave For immunocytokjemisk farging. Settet er ment for 50 tester (100 objektglass). ( ) P04087NO_01_K / s. 1/52

2 Innhold Side Tiltenkt bruk 4 Sammendrag og forklaring - Bryst 5 Bakgrunn 5 Egenskaper 5 Prosedyreprinsipp - Bryst 5 Reagenser - Bryst 6 Materialer som følger med 6 Materialer som er nødvendige, men som ikke medfølger 7 Lagring - Bryst 8 Klargjøre prøve - Bryst 8 Parafininnstøpte vevssnitt 8 Behandling av vev før farging 8 Forholdsregler - Bryst 9 BRUKSANVISNING - Bryst 10 A. Reagenspreparering 10 A.1 Epitope Retrieval Solution 10 A.2 Wash Buffer 10 A.3 Substrate-Chromogen Solution (DAB) 10 A.4 Kontrastfarge 10 A.5 Monteringsmedium 11 B. Fargeprosedyre som utføres på Autostainer 11 B.1 Prosedyremerknader 11 B.2 Fargingsprotokoll 11 Kvalitetskontroll - Bryst 13 Tolkning av farging - Bryst 15 Begrensninger - Bryst 18 Generelle begrensninger 18 Produktspesifikke begrensninger 18 Metodeegenskaper - Bryst 19 Bakgrunn 19 Sammenligningsundersøkelser 19 Sammenligning med klinisk prøvevurdering (CTA) 19 Nøyaktighet 20 Reproduserbarhet 20 Immunoreaktivitet 21 Feilsøking - Bryst 22 Sammendrag og forklaring - Gastrisk 25 Bakgrunn 25 Egenskaper 25 Prosedyreprinsipp - Gastrisk 25 Reagenser - Gastrisk 26 Materialer som følger med 26 Materialer som er nødvendige, men som ikke medfølger 27 Lagring - Gastrisk 28 Klargjøre prøve - Gastrisk 28 Parafininnstøpte vevssnitt 28 Behandling av vev før farging 28 Forholdsregler - Gastrisk 29 BRUKSANVISNING - Gastrisk 31 A. Reagenspreparering 31 A.1 Epitope Retrieval Solution 31 A.2 Wash Buffer 31 A.3 Substrate-Chromogen Solution (DAB) 31 A.4 Kontrastfarge 31 A.5 Monteringsmedium 31 ( ) P04087NO_01_K / s. 2/52

3 B. Fargeprosedyre som utføres på Autostainer 31 B.1 Prosedyremerknader 31 B.2 Fargingsprotokoll 32 Kvalitetskontroll - Gastrisk 34 Tolkning av farging - Gastrisk 36 Begrensninger - Gastrisk 39 Generelle begrensninger 39 Produktspesifikke begrensninger 39 Metodeegenskaper - Gastrisk 40 Bakgrunn 40 Reproduserbarhet 42 Immunoreaktivitet 43 Feilsøking - Gastrisk 47 Referanser 50 Forklaring av symboler 52 ( ) P04087NO_01_K / s. 3/52

4 Tiltenkt bruk Til in vitro-diagnostisk bruk. HercepTest er en halvkvantitativ immunocytokjemisk analyse for å påvise overuttrykk av HER2-protein i brystkreftvev som rutinemessig behandles for histologisk evaluering og formalinfiksert, parafininnstøpt kreftvev fra pasienter med adenokarsinom i magen, inkludert gastro-øsofageal overgang. HercepTest indikeres som et hjelpemiddel i bedømmingen av pasienter som Herceptin -behandling (trastuzumab) vurderes for (se Herceptin pakningsvedlegg). MERKNAD kun for brystkreft: Alle pasientene i Herceptin -kliniske studier ble utvalgt ved bruk av en forskningsmessig immunocytokjemisk klinisk prøvevurdering (CTA). av pasientene i disse studiene ble valgt ved bruk av HercepTest. HercepTest ble sammenlignet med CTA på et uavhengig eksempelsett og bestemt til å gi tilstrekkelig samsvarende resultater. Den faktiske korrelasjonen for HercepTest til Herceptin -klinisk resultat har ikke blitt bestemt. MERKNAD kun for magekreft: Alle pasientene i fase III BO18255 (ToGA)-studien som er sponset av Hoffmann-La Roche ble valgt ved bruk av Dako HercepTest (IHC) og Dako HER2 FISH pharmdx Kit (FISH). Studien demonstrerte den kliniske bruken av begge tester for vurderingen av HER2-statusen i pasienter med uopererbar lokalt avansert, tilbakevendende og/eller metastatisk adenokarsinom i magen eller gastroøsofageal overgang. For det aktuelle settet, Kode K5207, har reagensvolumene blitt justert spesielt for bruk med Autostainer. Adenokarsinom i magen, inkludert gastroøsofageal overgang, refereres også til som magekreft i dette dokumentet. For bruksområdet brystkreft, vennligst se side For bruksområdet magekreft, vennligst se side Viktig: Vennligst merk forskjeller for brystkreftvev og magekreftvev, spesielt i tolkningen av fargingsseksjoner. ( ) P04087NO_01_K / s. 4/52

5 Brystkreft Sammendrag og forklaring - Bryst Bakgrunn Det humane HER2-genet (også kjent som ERBB2 eller NEU) koder et protein som ofte kalles HER2-protein eller p185 HER2. HER2-proteinet er en membranreseptor-tyrosinkinase med homologi til den epidermiske vekstfaktorreseptoren (EGFR eller HER1) (1-8). HER2-proteinet er en normal komponent som uttrykkes av en rekke forskjellige epiteliale celletyper (8). I en fraksjon av pasienter med brystkreft er HER2-proteinet overuttrykt som en del av prosessen ved malign transformasjon og tumorprogresjon (9). Overuttrykk av HER2-proteinet på overflaten av brystkreftceller foreslo at det kan være et mål for en antistoffterapi. Herceptin (trastuzumab) er et humanisert monoklonalt antistoff (10) som binder med høy affinitet til HER2-proteinet og har blitt vist å inhibere proliferasjon av humane tumorceller som overuttrykker HER2-proteinet in vitro og in vivo (11-13). Egenskaper HercepTest ble utviklet for å gi et alternativ til undersøkelses-cta som brukes i Herceptin kliniske undersøkelser. Ytelsen til HercepTest for påvisning av HER2-proteinoveruttrykk ble evaluert i en uavhengig studie som sammenlignet resultatene til HercepTest med CTA på 548 brysttumorprøver, der ingen ble hentet fra pasienter i de kliniske studiene med Herceptin. Resultatene indikerte et 79 % samsvar mellom resultatene fra de to analysene på disse vevsprøvene. Samsvarsdataene indikerer også at en 3+-avlesing med HercepTest høyst sannsynlig ville tilsvare en posistiv avlesning på CTA som ville ha oppfylt inngangskriteriene for studien (2+ eller 3+). Et funn på 2+ på HercepTest korrelerte ikke så bra med CTA-resultatene. Omtrent 42 % (53/126) av HercepTest 2+-resultatene var negative ved CTA (0 1+), noe som ikke ville ha tillatt opptak i Herceptin -kliniske undersøkelser. HercepTest tolkes som negativ for HER2-proteinoveruttrykk (0- og 1+-fargeintensitet), svakt positiv (2+-fargeintensitet) og sterkt positiv (3+-fargeintensitet). HercepTest er ikke ment for å gi prognoseinformasjon til pasienten og legen, og har ikke blitt validert til det formålet. Prosedyreprinsipp - Bryst HercepTest inneholder reagenser som kreves for å fullføre en totrinns immunocytokjemisk fargeprosedyre for rutinemessig behandlede, parafininnstøpte prøver. Etter inkubasjon med primært antistoff fra kanin til humant HER2-protein, bruker dette settet en bruksklar Visualization Reagent basert på dekstran-teknologi. Denne reagensen består av både sekundære anti-kanin immunoglobulinmolekyler fra geit og pepperrotperoksidasemolekyler som er linket til en vanlig dekstran-polymerryggrad, og utelukker dermed behovet for sekvensiell applikasjon av linkantistoff og peroksidasekonjugert antistoff. Kryssreaksjon av Visualization Reagent med humane immunoglobuliner og serum fra kalvefostre har blitt fjernet ved solidfaseabsorpsjon. Den enzymatiske konverteringen av det deretter tilførte kromogenet resulterer i dannelsen av et synlig reaksjonsprodukt på antigenstedet. Prøven kan deretter kontrastfarges, og et dekkglass kan legges på. Resultatene tolkes ved bruk av et lysmikroskop. Kontrollobjektglass som inneholder tre formalinfikserte, parafininnstøpte humane brystkreftcellelinjer med fargeintensitetsscoringer på 0, 1+ og 3+ medfølger for å validere fargekjøringer. Fargingsintensiteten på disse cellelinjene har blitt korrelert til antall reseptorer pr. celle. HercepTest, Kode K5207, brukes til automatisert farging ved bruk av Autostainer. ( ) P04087NO_01_K / s. 5/52

6 Brystkreft Reagenser - Bryst Materialer som følger med Materialene som er opplistet nedenfor er tilstrekkelig for 50 tester (50 objektglass inkubert med primært antistoff for HER2-protein og 50 objektglass inkubert med tilhørende Negative Control Reagent). Antallet tester er basert på bruk av 200 µl per vevsnitt (22 mm x 22 mm) fra flaskenr. 1, 2, 3 og 4, samt av Substrate-Chromogen Solution (DAB). Settet gir materialer som er tilstrekkelig til maksimalt 15 enkelte fargekjøringer. Flaskenr. Mengde Beskrivelse 1 2 x 11 ml 2 1 x 12 ml 3 2 x 11 ml 4 1 x 12 ml 5 15 x 11 ml 6 3 x 3 ml 7 3 x 500 ml 8 2 x 1 L Peroxidase-Blocking Reagent: 3 % hydrogenperoksid som inneholder 15 mmol/l natriumazid (NaN 3 ). Rabbit Anti-Human HER2 Protein: Bruksklart affinitetsisolert antistoff. Leveres i 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, inneholder stabiliserende protein. Immunogen: Syntetisk C-terminalfragment (intracytoplasmisk del) av HER2-proteinet forbundet med keyhole-limpet hemocyanin. Spesifisitet: HER2-protein. Rensemetode: Antistoffet affinitetsisoleres ved bruk av et immobilisert HER2-proteinpeptid. Visualization Reagent: Dekstranpolymer konjugert med pepperrotperoksidase og affinitetsisolerte anti-kanin immunoglobuliner fra geit. Leveres i Tris/HCl-buffer som inneholder stabiliserende protein og et antimikrobielt middel. Negative Control Reagent: Immunoglobulinfraksjon av normalt serum fra kanin ved en tilsvarende proteinkonsentrasjon som antistoffet for HER2-protein. Leveres i 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, inneholder stabiliserende protein. DAB Buffered Substrate: Substratbufferløsning, ph 7,5, som inneholder <0,1 % hydrogenperoksid, stabilisatorer, akseleratorer og et antimikrobielt middel. DAB Chromogen: 5 % 3,3 -diaminobenzidintetrahydroklorid kromogenløsning. Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x): 0,1 mol/l citratbuffer med et rengjøringsmiddel. Wash Buffer (10x): Tris/HCl-buffer med vaskemiddel og et antimikrobielt middel. ( ) P04087NO_01_K / s. 6/52

7 Brystkreft 3 x 5 objektglass Control Slides: Hvert kontrollobjektglass inneholder snitt av tre formalinfikserte, parafininnstøpte brystkarsinomcellelinjer som representerer ulike nivåer av HER2-proteinuttrykk: MDA-231 (0), MDA-175 (1+) og SK-BR-3 (3+). Kontrollobjektglassene har blitt forhåndsbehandlet for bedre binding av snittene til glassene. All ekstra varmebehandling av kontrollobjektglassene som utføres for å forbedre bindingen av snittene til glassene, kan forringe fargeresultatene. MERK: Alle reagenser, inkludert Epitope Retrieval Solution og Wash Buffer, er spesialformulerte for bruk med denne testen. For at testen skal yte som spesifisert, skal det ikke foretas erstatninger, unntatt av Wash Buffer, der Dako Kode S3006 kan brukes. Materialer som er nødvendige, men som ikke medfølger Ammoniumhydroksid, 15 mol/l fortynnet til 37 mmol/l Kontrastfarge: Hematoksylin, slik som vannbaserte Mayer's Hematoxylin, Dako Kode S3301 (se BRUKSANVISNING, A.4) Dekkglass Destillert eller avionisert vann (Washing Water) Tørkeovn som kan opprettholde 60 C eller mindre Etanol, absolutt og 95 % Lysmikroskop (4 40x objektivforstørrelse) Monteringsmedium, slik som Dako Faramount, Kode S3025, eller Glycergel, Kode C0563 Positive og negative vev til å bruke som prosesskontroller (se kvalitetskontrollavsnittet) Objektglass, SuperFrost Plus, poly-l-lysin-belagte objektglass eller Dako Silanized Slides, Kode S3003, (se Klargjøre prøve) Fargekyvetter eller -bad Stoppeklokke (som klarer 2-40 minutters intervaller) Vannbad med lokk (har evne til å opprettholde Epitope Retrieval Solution ved C) Xylen, toluen eller xylensubstitutter K5207 har blitt skreddersydd for bruk med Autostainer Immunostaining System, Kode S3400. Se brukerveiledningen til Autostainer for nødvendige komponenter til Autostainer. ( ) P04087NO_01_K / s. 7/52

8 Brystkreft Lagring - Bryst Lagres ved 2 8 C. Ikke bruk settet etter utløpsdatoen som er stemplet utenpå pakningen. Hvis reagensene oppbevares under andre forhold enn de som er spesifisert i dette pakningsvedlegget, må de valideres av brukeren (14a, 14b). Merk at kontrollobjektglassene må oppbevares ved 2 8 C. Det er ingen tydelige tegn som indikerer at dette produktet er ustabilt. Positive og negative kontroller bør derfor kjøres samtidig med pasientprøver. Hvis det observeres uventet farging som ikke kan forklares med variasjoner i laboratorieprosedyrer, og det er mistanke om at det er et problem med HercepTest, ta kontakt med Dakos tekniske avdeling umiddelbart. Klargjøre prøve - Bryst Prøver fra biopsi må håndteres slik at vevet bevares til immunocytokjemisk farging. Standardmetoder for vevsbehandling skal brukes på alle prøver (15). Parafininnstøpte vevssnitt Vevssnitt som er preservert i bufret formalin eller Bouins fiksativ for rutineprosessering og parafininnstøpning, egner seg for bruk. For eksempel skal prøver fra biopsi blokkes i en tykkelse på 3 eller 4 mm og fikseres i timer i nøytral bufret formalin. Vevene dehydreres i en serie av alkoholer og xylen, fulgt av infiltrering av smeltet parafin som ikke holder mer enn 60 C. Riktig fikserte og innstøpte vev som uttrykk er HER2-proteinet vil holde seg ubegrenset før snitt og objektglassmontering ved lagring på kjølig sted (15 25 C) (15, 16). I USA krever Clinical Laboratory Improvement Act av 1988, i 42 CFR (b) at Laboratoriet må oppbevare fargede objektglass i minst ti år fra undersøkelsesdatoen og beholde prøvebiter i minst to år etter undersøkelsesdatoen (16). Vevsprøver skal skjæres i snitt på 4 5 µm, monteres på objektglass og lufttørkes ved romtemperatur i minst 12 timer (eller inntil de er tørre) eller ved 37 C over natten eller ved 60 C i én time. FORSIKTIG: Overdreven oppvarming i mer enn én time ved 60 C kan forårsake en betydelig reduksjon i eller tap av spesifikk membrantilknyttet HER2 immunoreaktivitet (17). For å bevare antigenisitet, skal vevsnitt som er montert på objektglass (SuperFrost Plus, Poly-L-lysine eller silaniserte glass), farges innen 4 6 uker etter oppsnitting ved oppbevaring ved romtemperatur (20 25 C) (18). Objektglassene s om kreves for HER2-proteinevaluering og verifisering av tilstedeværelsen av en tumor, skal prepareres samtidig. Det anbefales minst 5 objektglass, 1 objektglass for tilstedeværelse av tumor, 2 objektglass for HER2-proteinevaluering (1 for inkubasjon med flaske nr. 2 og 1 for inkubasjon med flaske nr. 4), samt 2 objektglass for eserve. Bruk av HercepTest TM på avkalkede vev har ikke blitt validert, og anbefales ikke. Se Dakos Utdannelsesveiledning: Immunohistokjemiske fargemetoder (19) og referansene 15 og 16 for ytterligere detaljer om klargjøring av prøver. Behandling av vev før farging En spesifikk epitophentingsmetode i 10 mmol/l citratbuffer må brukes for optimal analyseytelse. Epitope Retrieval Solution medfølger i HercepTest kit. Denne metoden innbefatter oppvarming av vevssnitt som er montert på objektglass som neddykkes i 10 mmol/l citratbuffer (20) i et kalibrert vannbad som har evne til å opprettholde Epitope Retrieval Solution ved ønsket temperatur (95 99 C). Laboratorier som befinner seg på høyere plan skal bestemme den beste metoden for å opprettholde den ønskede vannbadtemperaturen. Epitophentingen må utføres i vannbad. Andre oppvarmingsmetoder har blitt testet og gir ikke reproduserbare resultater. Start fargeprosedyren umiddelbart etter epitohentingen. Avvik fra beskrevet prosedyre kan påvirke resultatene. ( ) P04087NO_01_K / s. 8/52

9 Brystkreft Forholdsregler - Bryst 1. Til in vitro-diagnostisk bruk. 2. For profesjonelle brukere. 3. Flaske 1, Peroxidase-Blocking Reagent, inneholder 3 % hydrogenperoksid. Sikkerhetsdatablad er tilgjengelig for profesjonelle brukere på forespørsel. 4. Flaske 6, DAB Chromogen, inneholder 5-<10% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride) og er merket: Fare H350 Kan forårsake kreft. H341 Mistenkes for å kunne forårsake genetiske skader. P201 Innhent særskilt instruks før bruk. P280 Bruk vernehansker. Bruk vernebriller eller ansiktsvern. Bruk verneklær. P308 + P313 Ved eksponering eller mistanke om eksponering: Søk legehjelp. P405 Oppbevares innelåst. P501 Disponer innholdet og emballasje i henhold til lokale, regionale, nasjonale og internasjonale forskrifter. Generelt sett har personer under 18 år ikke tillatelse til å arbeide med dette produktet. Brukerne må instrueres nøye i riktig arbeidsprosedyre, de farlige egenskapene til produktet og de nødvendige sikkerhetsinstruksjonene. Vennligst se databladet for materialsikkerhet (SDS) for ytterligere informasjon. 5. Flaske 8, Wash Buffer, inneholder 5-<10% 2-amino-2-(hydroksymetyl)propan-1,3- diolhydroklorid og 0.1-<0.2% 5-brom-5-nitro-1, 3-dioksan. Kan forårsake en allergisk reaksjon. Wash Buffer (10x) er merket: Advarsel H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Gir alvorlig øyeirritasjon. Bruk vernebriller eller ansiktsvern. Vask hendene grundig etter håndtering. VED KONTAKT MED ØYNENE: Skyll forsiktig med vann i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser dersom dette enkelt lar seg gjøre. Fortsett skyllingen. 6. Dette produktet inneholder natriumazid (NaN 3 ), en svært giftig kjemikalie i ren form. Selv om produktkonsentrasjonene ikke klassifiseres som farlige, kan natriumazid reagere med bly- og kopperrør og danne metallazider som bygger seg opp og som er svært eksplosive. Ved avfallsbehandling skyll rikelig med vann for å forhindre ansamling av metallazid i rørene (21, 22). 7. Flaske 2, 3 og 4 inneholder materialer med dyreopprinnelse. Riktig håndteringsprosedyrer bør brukes i likhet med alle andre produkter derivert fra biologiske kilder. 8. Kontrollobjektglass og prøver, før og etter fiksering, og alle materialer som er utsatt for slike, skal håndteres som om de har evne til å overføre infeksjon og avhendes med riktige forholdsregler (23). Pipetter aldri reagenser med munnen, og unngå at reagenser og prøver kommer i kontakt med hud og slimhinner. Hvis reagens kommer i kontakt med følsomme områder, må det skylles med rikelige mengder vann. 9. Minimer mikrobiell kontaminering av reagenser for å unngå uspesifikk farging. ( ) P04087NO_01_K / s. 9/52

10 Brystkreft 10. Andre inkubasjonstider og temperaturer, eller andre metoder enn dem som er spesifisert, vil kunne gi feilaktige resultater. Overdreven tørking i mer enn én time ved 60 C kan forårsake en betydelig reduksjon i eller tap av spesifikk membrantilknyttet HER2 immunoreaktivitet (17). 11. Reagenser har blitt optimalt fortynnet. Ytterligere fortynning kan forårsake tap av antigenfarging. 12. Alle reagenser, inkludert Epitope Retrieval Solution og Wash Buffer, er spesialformulerte for bruk med denne testen. For at testen skal yte som spesifisert, skal det ikke foretas erstatninger, unntatt av Wash Buffer, der Kode S3006 kan brukes. 13. Visualization Reagent og DAB chromogen kan påvirkes ufordelaktiv ved eksponering for unødige lysnivåer. Ikke oppbevar systemkomponentene eller utfør farging i sterkt lys, slik som direkte sollys. 14. Bruk egnet personlig verneutstyr for å unngå kontakt med øyne og hud. Se databladet for materialsikkerhet (SDS) for ytterligere informasjon. 15. Parafinrester kan føre til falske negative resultater. 16. Bruk av andre reagensvolumer enn de som er anbefalt, kan føre til tap av synlig HER2 immunoreaktivitet. Vevsnitt som er større enn 22 mm x 22 mm vil kreve 2-3x 200 µl av reagens brukt i 2-3 automatiske bruksområder. BRUKSANVISNING - Bryst A. Reagenspreparering Det er praktisk å klargjøre følgende reagenser før farging: A.1 Epitope Retrieval Solution Fortynn en tilstrekkelig mengde av flaske 7 (Epitope Retrieval Solution x 10) 1:10 ved bruk av destillert eller avionisert vann for fargeprosedyren som er planlagt. Ubrukt fortynnet løsning kan oppbevares ved 2 8 C i én måned. Kast fortynnet lø sning hvis den får et tåkete utseende. A.2 Wash Buffer Fortynn en tilstrekkelig mengde flaske 8 (Wash Buffer x 10) 1:10 ved bruk av destillert eller avionisert vann for vasketrinnene. Ubrukt fortynnet buffer kan oppbevares ved 2 8 C i én måned. Kast bufferen hvis den får et tåkete utseende. Autostainer er programmert til å skylle vevsnittene etter Peroxidase-Blocking Reagent og Substrate-Chromogen Solution. Merk at det for disse skylletrinnene kan brukes enten destillert (eller avionisert) vann eller Wash Buffer. Alle de andre skylletrinnene krever bruk av Wash Buffer. A.3 Substrate-Chromogen Solution (DAB) Klargjør Substrate-Chromogen Solution ved å tilføre 11 dråper (25 30 µl per dråpe) DAB Chromogen fra flaske 6 til en flaske 5 som inneholder DAB Buffered Substrate (11 ml), og bland. Klargjort Substrate-Chromogen Solution (DAB) er stabil i omtrent 5 dager hvis den oppbevares ved 2 8 C. Denne løsningen skal blandes godt før bruk. Bunnfall som utvikler seg i løsningen påvirker ikke fargekvaliteten. MERK: Fargen på DAB Chromogen i flaske 6 kan variere fra klar til lys lavendelbrun. Dette vil ikke påvirke ytelsen til dette produktet. Vennligst fortynn etter veiledningen i dette pakningsvedlegget. Tilsetning av overflødig DAB Chromogen til DAB Buffered Substrate vil føre til forringelse av det positive signalet. A.4 Kontrastfarge Det fargede sluttproduktet av DAB-fargereaksjonen er uløselig i alkohol og vann. Bruk en hematoksylinkontrastfarge og juster hematoksylinfargingsintensiteten til et lignende nivå som vist i Dakos "Tolkningshåndbok for HercepTest Brystkreft". Hematoksylin, enten alkohol- eller vannbasert, slik som f.eks. Dako Mayer's Hematoxylin, Kode S3301, kan brukes. Følg ( ) P04087NO_01_K / s. 10/52

11 Brystkreft hematoksylin-kontrastfarging med en grundig skylling i destillert eller avionisert vann, og neddykk deretter objektglassene i et bad med 37 mmol/l ammoniakkvann (se avsnitt B.2, trinn 3). Ammoniakkvann (37 mmol/l) klargjøres ved å blande 2,5 ml av 15 mol/l (konsentrert) ammoniumhydroksid med 1 liter destillert eller avionisert vann. Ubrukt 37 mmol/l ammoniakkvann kan lagres ved romtemperatur (20 25 C) i en tett l ukket flaske i inntil 12 måneder. A.5 Monteringsmedium Ikke-vandig, permanent monteringsmedium anbefales. Men vannholdig montering kan også aksepteres. Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, bruksklar, Kode S3025, eller Glycergel Mounting Medium, Kode C0563, anbefales for vannholdig montering. Kondenser Glycergel ved å varme opp til omtrent 40 (±5) C f ør bruk. B. Fargeprosedyre som utføres på Autostainer B.1 Prosedyremerknader Brukeren skal lese disse instruksjonene nøye og gjøre seg kjent med alle komponentene og instrumentene før bruk (se Forholdsregler). Alle reagenser skal stabiliseres ved romtemperatur (20 25 C) før immunofarging. Likedan skal alle inkubasjoner utføres ved romtemperatur. Ikke la vevssnitt tørke mens objektglassene lastes på Autostainer eller i løpet av fargeprosedyren. Tørkede vevssnitt kan vise økt uspesifikk farging. Hvis fargeprosedyren avbrytes, kan objektglassene oppbevares i bufferbad etter inkubasjon av det primære antistoffet i inntil 1 time ved romtemperatur (20 25 C) uten at fargeytelsen påvirkes. Avparafinisering og rehydrering: Før fargingen, må vevsnittene avparafiniseres for å fjerne innstøpningsmedium og rehydreres. Unngå ufullstendig fjerning av parafin. Resterende innstøpningsmedium vil føre til økt ikke-spesifikk farging. Dette trinnet skal utføres ved romtemperatur (20 25 C ). 1. Plasser objektglassene i et xylenbad og inkuber i 5 (±1) minutter. Skift bad og gjenta én gang. 2. Bank forsiktig av overflødig væske, og plasser objektglassene i absolutt etanol i 3 (±1) minutter. Skift bad og gjenta én gang. 3. Bank forsiktig av overflødig væske, og plasser objektglassene i 95 % etanol i 3 (±1) minutter. Skift bad og gjenta én gang. 4. Bank forsiktig av overflødig væske, og plasser objektglassene i destillert eller avionisert vann i minst 30 sekunder. Begynn fargeprosedyren slik som skissert i avsnitt B.2, trinn 1, epitophenting. Xylen- og alkoholløsningene skal skiftes etter 40 objektglass. Toluen eller xylensubstitutter, slik som Histoclear, kan brukes i stedet for xylen. MERK: Reagenser og instruksjoner som medfølger i dette settet er designet for optimal ytelse. Ytterligere fortynning av reagenser eller endring av inkubasjonstemperaturer kan gi feilaktige eller ikke-samsvarende resultater. Forskjeller i vevsbehandling og tekniske prosedyrer i brukerens laboratorium kan gjøre analyseresultatene ugyldige til bruk for utvelging av pasienter til Herceptin -behandling. B.2 Fargingsprotokoll Utføres ved romtemperatur, C. Trinn 1: Epitophenting Fyll fargingsglassene, f.eks. Coplin-glass, med fortynnet Epitope Retrieval Solution (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.1). Plasser fargingsglassene som inneholder Epitope Retrieval Solution i vannbad. Varm opp vannbadet og Epitope Retrieval Solution til C. Ved oppvarming får Epitope Retrieval Solution et tåkete utseende. Dekk til glassene med lokk for å stabilisere temperaturen og unngå fordampning. ( ) P04087NO_01_K / s. 11/52

12 Brystkreft Neddykk de romtempererte avparafiniserte snittene i den forhåndsoppvarmede Epitop Retrieval Solution i fargingsglassene. BRING TEMPERATUREN PÅ VANNBADET OG EPITOPE RETRIEVAL SOLUTION TILBAKE TIL C. Inkuber i 40 (±1) minutter ved C. Fjern hele glasset med objektglassene fra vannbadet. La objektglassene kjøle seg ned i Epitope Retrieval Solution i 20 (±1) minutter ved romtemperatur. Dekanter Epitope Retrieval Solution og skyll snittene i Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.2). For optimal ytelse, neddykk snittene i Wash Buffer i 5 20 minutter etter epitophenting og før farging. MERK: Epitope Retrieval Solution er utformet kun til engangsbruk. Skal ikke brukes på nytt. Trinn 2: Autostainer-prosedyre 1. Bruk Autostainer-produsert kart på HercepTest autoprogram for ønskede programtider og reagensvolum (se punkt 4 nedenfor for spesifikke volum). 2. Plasser Autostainer-reagensflaskene i Autostainer-reagensstativ etter dataprodusert reagenskart. 3. Plasser objektglassene i Autostainer ifølge dataprodusert objektglasskart. 4. Still inn programmet og begynn HercepTest -programmet. Her følger en oversikt over programkjøringen: Skylling 200 µl Peroxidase-Blocking Reagent 5 minutter Skylling 200 µl Primary Anti-HER2 Protein (eller Negative Control Reagent) 30 minutter Skylling 200 µl Visualization Reagent 30 minutter Skylling Skylling Bytte 200 µl Substrate-Chromogen Solution (DAB) 10 minutter Skyll objektglassene i avionisert vann etter substratkromogentrinnet. MERK: Autostainer Hardware versjon 01 skyller objektglassene i buffer. Derfor må objektglassene skylles med avionisert vann etter at de er fjernet fra Autostainer. Trinn 3: Kontrastfarging (instruksjonene er for hematoksylin) Fjern objektglassene fra Autostainer og utfør kontrastfarging i hematoksylin slik som beskrevet nedenfor. Neddykk objektglassene i et bad med hematoksylin. Inkuber i 2 5 minutter, avhengig av styrken på brukt hematoksylin. Skyll forsiktig i destillert eller avionisert vannbad. Pass på at all resterende hematoksylin har blitt fjernet. Valgfritt: Dypp objektglassene 10 ganger i et bad på 37 mmol/l ammoniakkvann (se avsnitt A.4). Skyll objektglassene forsiktig i et bad med destillert eller avionisert vann i 2 5 minutter. ( ) P04087NO_01_K / s. 12/52

13 Brystkreft MERK: Avhengig av inkubasjonstiden og styrken av det benyttede hematoxylinet, vil kontrastfarging gi en blek til mørk blå farging av cellenuklein. Overdreven eller ufullstendig motfarging kan gjøre det vanskelig å tolke resultatene riktig. Trinn 4: Montering Ikke-vandig, permanent monteringsmedium anbefales. Ellers kan vannholdig montering også aksepteres. Prøvene kan monteres og dekkes med vannbasert monteringsmedium, slik som Dako Faramount, Kode S3025 eller Glycergel, Kode C0563. MERK: Objektglassene kan leses når det passer. Men det kan oppstå noe blekning hvis objektglassene har dekkglass med vannholdig monteringsmedium og utsettes for sterkt lys over en periode på én uke. For å minimere blekning, skal objektglassene oppbevares på et mørkt sted i romtemperatur (20 25 C). Kvalitetskontroll - Bryst Forskjeller i vevsfiksering, -prosessering og innstøpning i brukerlaboratoriet, kan frembringe signifikant variasjon i resultatene og gjør det påkrevd med regelmessige interne kontroller i tillegg til kontrollobjekt-glassene fra Dako. I USA, se retningslinjer for kvalitetskontroll fra College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry, se også CLSI (tidligere NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24), samt referanse 25 for ytterligere informasjon. Tabell 1. Formål med daglig kvalitetskontroll Vev: Fiksert og prosessert som pasientprøve Positiv kontroll: Vev eller celler som inneholder målantigen som skal påvises (kan finnes i pasientvev). Den ideelle kontrollen er svakt positivt vev som er mest sensitivt for antistoff eller antigendegradering. Spesifikt antistoff og sekundært antistoff Kontrollerer alle trinnene i analysen. Validerer reagens og prosedyrer som brukes for HER2-proteinfarging. Uspesifikt antistoff eller buffer pluss samme sekundært antistoff som bruk med spesifikt antistoff Påvisning av uspesifikk bakgrunnsfarging. Negativ kontroll: Vev eller celler forventes å være negative (kan finnes i pasientens vev eller positivt kontrollvev). Påvisning av utilsiktet kryssreaktivitet av antistoff til celler/cellekomponenter. Påvisning av uspesifikk bakgrunnsfarging. Pasientvev. Påvisning av spesifikk farging. Påvisning av uspesifikk bakgrunnsfarging. Kontrollobjektglass levert av Dako. Kun kontrollfargeprosedyre. * Serum fra samme art som det spesifikke antistoffet, men ikke rettet mot samme målantigen. For å oppdage uspesifikk antistoffbinding, f.eks. binding av Fc-del av antistoff ved vevet. Kontrollobjektglass (medfølger): Hvert av de medfølgende kontrollobjektglassene inneholder tre pelleterte, formalinfikserte, parafininnstøpte humane brystkreftcellelinjer med fargeintensitetsscoringer på 0, 1+ og 3+. Ett objektglass skal farges i hver fargekjøring. Evalueringen av kontrollobjektglassenes cellelinjer som leveres av Dako indikerer validiteten til fargekjøringen. Positiv vevskontroll: Kontroller bør være fra nylig obduksjon/biopsi/kirurgiske prøver som er fiksert, behandlet og innstøpt så snart som mulig på identisk måte som pasientprøven(e). Positive vevskontroller er avgjørende for korrekt klargjorte vev og riktige fargeteknikker. En positiv vevskontroll for hvert sett testbetingelser skal inkluderes i hver fargekjøring. De positive vevskontrollene skal gi svak positiv farging, slik at de kan påvise forsiktige endringer i sensitiviteten til det primære antistoffet. Kontrollobjektglassene som medfølger dette settet, eller prøver som er prosessert på annen måte enn pasientprøven(e), validerer kun reagensytelsen og verifiserer ikke klargjøringen av vev. Bruk tidligere påvist HER2-protein 2+ ( ) P04087NO_01_K / s. 13/52

14 overuttrykkelig invasivt (infiltrerende) humant brystkarsinomvev til den ideelle positive vevskontrollen. Brystkreft MERK: Vevskontroller som er kjent positive, bør bare brukes ved overvåking av korrekt yteevne for prosesserte vev og testreagenser og IKKE som hjelp til å stille spesifikk diagnose i pasientprøver. Hvis den positive vevskontrollen ikke gir tilstrekkelig positiv farging, bør resultater med pasientprøvene betraktes som ugyldige. Negativ vevskontroll: Bruk en negativ vevskontroll (kjent for å være HER2-proteinnegativ) som skal fikseres, behandles og innstøpes på en måte som er identisk med pasientens prøve(r) med hver fargingsomgang for å verifisere spesifisiteten til det primære antistoffet og gi en indikasjon på spesifikk bakgrunnsfarging. Kolon, lever eller tyroid egner seg til negativt kontrollvev. Variasjonen av ulike celletyper som kan finnes i de fleste vevssnitt, gir rom for negative kontroll (dette må verifiseres av brukeren). Normale brystkanaler kan tjene som interne negative kontroller. Hvis det forekommer spesifikk farging i cellene for negativ vevskontroll eller i det interne negative kontrollvevet, bør resultatene for pasientprøvene betraktes som ugyldige og testen må kjøres på nytt. Uspesifikk Negative Control Reagent: Bruk den medfølgende Negative Control Reagent i stedet for primærantistoffet med et snitt av hver pasientprøve til å evaluere uspesifikk farging og gi bedre tolkning av spesifikk farging ved antigenstedet. Inkubasjonsperioden for Negative Control Reagent bør være lik inkubasjonsperioden for primærantistoffet. Analyseverifisering: Før innledende bruk av et antistoff eller fargesystem i en diagnostisk prosedyre, skal brukeren verifisere antistoffets spesifisitet ved å teste den på en serie interne vev med kjente immunocytokjemiske ytelsesegenskaper som representerer kjente positive og negative vev. Se kvalitetskontrollprosedyrene som tidligere ble skissert i dette avsnittet av produktvedlegget og anbefalte kvalitetskontroller i CAP-sertifiseringsprogrammet for immunohistokjemi, og/eller CLSI (tidligere NCCLS) kvalitetssikring for immunocytokjemi, godkjent retningslinje (24). Disse kvalitetskontrollprosedyrene bør gjentas for hver produksjonsserie av et nytt antistoff, eller hver gang det gjøres en endring i analyseparametrene. Brystkarsinom med kjent HER2-proteinfargingsintensitet fra 0 3+ og negative vev, f.eks. kolon, lever eller tyroid, egner seg for analyseverifisering. ( ) P04087NO_01_K / s. 14/52

15 Brystkreft Tolkning av farging - Bryst For påvisning av HER2-proteinoveruttrykk skal kun membranfargingsintensiteten og mønsteret evalueres ved bruk av skalaen som finnes i tabell 2. Evaluering av objektglass skal utføres av en patolog ved bruk av et lysmikroskop. For å evaluere den immunocytokjemiske fargingen og scoringen, egner det seg med et objektiv på 10x forstørrelse. Bruk av en 20 40x objektivforstørrelse er nyttig for å bekrefte scoringen. Cytoplasmisk farging skal betraktes som uspesifikk og skal ikke inkluderes i vurderingen av membranfargingsintensiteten (8). For å hjelpe til med differensieringen av 0, 1+, 2+ og 3+ farging, se Dakos Tolkningshåndbok for HercepTest Brystkreft for representative bilder av fargingsintensiteten. Kun prøver fra pasienter med invasiv brystkarsinom skal vurderes. I tilfeller med karsinom in situ og invasiv karsinom i samme prøve, skal kun den invasive komponenten scores. Tabell 2. Intensitetskriterier for cellemembranfarging. Fargingsmønster farging observeres eller membranfarging observeres i mindre enn 10 % av tumorcellene. En blek/knapt synlig membranfarging påvises i mer enn 10 % av tumorcellene. Cellene farges kun i en del av membranen. En blek/knapt synlig membranfarging påvises i mer enn 10 % av tumorcellene. En sterk, fullstendig membranfarging påvises i mer enn 10 % av tumorcellene. Scoring (Rapport til den behandlende legen) HER2-protein Overuttrykk vurdering (Rapport til den behandlende legen) Negativ Negativ Svakt positiv Sterkt positiv HercepTest tolkes som negativ for HER2-proteinoveruttrykk (0- og 1+-fargeintensitet), svakt positiv (2+-fargeintensitet) og sterkt positiv (3+-fargeintensitet). HercepTest er ikke ment for å gi prognoseinformasjon til pasienten og legen, og har ikke blitt validert til det formålet. For hver fargekjøring, skal objektglassene undersøkes i den rekkefølgen som presenteres i tabell 3 for å bestemme validiteten på fargekjøringen og aktivere halvkvantitativ vurdering av fargeintensitet på prøvevevet. ( ) P04087NO_01_K / s. 15/52

16 Brystkreft Tabell 3. Rekkefølge på objektglassevalueringen. Avlesingsrekkefølge for objektglass Rasjonal 1. Kontrollobjektglasset inneholder de tre cellelinjene Tilstedeværelse av 3+ brun cellemembranfarging (rimming) i 3+ kontrollcellelinjen SK-BR-3, delvis brun rimming i 1+ kontrollcellelinjen MDA-175 samt ingen farging i 0 kontrollcellelinjen MDA-231, indikerer en gyldig analyse Punktvis og avbrutt membranfarging finnes i et lite til et moderat antall av cellene i den svakt positive 1+ kontrollcellelinjen MDA Også punktaktig immunofarging av Golgi-regionen av cytoplasma kan observeres i denne cellelinjen. Tilstedeværelse av brun farging i 0 kontrollcellelinjen MDA-231 (negativ for HER2-proteinfarging) indikerer at det var en uspesifikk farging i løpet av analysen. Analyseresultatene kan være ugyldige på grunn av overfarging. 2. Positivt kontrollvev Tilstedeværelse av brun membranfarging skal observeres. Farging av cytoplasma og negative vev skal ikke være mer enn Negativt kontrollvev MANGLENDE spesifikk farging i den negative vevskontrollen bekrefter manglende kryssreaktivitet for settet til celler/cellekomponenter. Hvis det forekommer spesifikk membranfarging i de negative vevskontrollene, bør resultater med pasientprøvene betraktes som ugyldige. 4. Pasientvev ble farget ved bruk av negativ kontrollreagens Fravær av spesifikk membranfarging verifiserer den spesifikke merkingen av målantigenet gjennom det primære antistoffet. Annen brunaktig eller brun farging som oppstår i cytoplasmaet til prøven som behandles med Negative Control Reagent, slik som i bindevev, leukocytter, erytrocytter eller nekrotisk vev, skal betraktes som uspesifikk bakgrunnsfarging og skal rapporteres under kommentardelen av dataregnearket 5. Pasientvev ble farget ved bruk av primært antistoff Der HER2-proteinoveruttrykk påvises i prøven, vil dette vises som brun rimming som befinner seg på cellemembranen på tumorceller som er behandlet med det primære antistoffet. 1. Kontrollobjektglass (medfølger): Kontrollen som er farget med HercepTest skal undersøkes først for å få bekreftet at alle reagenser fungerer riktig. Tilstedeværelsen av brunt (3,3 diaminobenzidin, DAB) reaksjonsprodukt ved cellemembranen er et tegn på positiv reaktivitet. Tilstedeværelse av perifer brun cellemembranfarging (rimming) i 3+ kontrollcellelinjen SK-BR-3, delvis brun rimming i 1+ kontrollcellelinjen MDA-175 samt ingen farging i 0 kontrollcellelinjen MDA-231, indikerer en gyldig analyse. Hvis noen av kontrollcellelinjene yter utenfor disse kriteriene, bør alle resultatene for pasientprøvene betraktes som ugyldige. 2. Positiv vevskontroll: Deretter skal objektglasset med den positive vevskontrollen undersøkes. Dette objektglasset verifiserer at fikseringsmetoden og epitop-hentingsprosessen er effektive. Bruk intakte celler ved tolking av fargingsresultater, da nekrotiske eller degenererte celler ofte farges uspesifikt (26). Farging skal observeres i tumorvev som brun cellemembranfarging. Brun farging av cytoplasma og negative vev innenfor prøven skal ikke være mer enn tilsvarende 1+ fargeintensitetsscoring. 3. Negativ vevskontroll: Den negative vevskontrollen bør undersøkes etter den positive vevskontrollen for å bekrefte den spesifikke merkingen av målantigenet av primærantistoffet. Manglende spesifikk farging i den negative vevskontrollen bekrefter manglende kryssreaktivitet for settet til celler/celle-komponenter. Hvis det forekommer spesifikk farging i de negative vevskontrollene, bør resultater med pasientprøvene betraktes som ugyldige. Alternativt kan negative deler av det positive kontrollvevet tjene som negativt kontrollvev, men dette må verifiseres av brukeren. Merk at en svak reaksjon (0-1+ fargingsintensitet) kan observeres i de fleste normale epiteliale vev. Mulige negative kontrollvev inkluderer: kolon, lever og tyroid. ( ) P04087NO_01_K / s. 16/52

17 Brystkreft Uspesifikk farging, hvis dette forekommer, har diffust utseende. Sporadisk farging i bindevev vil også kunne observeres i vevssnitt som er fiksert for lenge i formalin Pasientvev: Undersøk pasientprøvene som er farget med HercepTest til slutt. Positiv fargingsintensitet bør vurderes i lys av eventuell ikke-spesifikk bakgrunnsfarging i den negative reagenskontrollen. På samme måte som for alle andre immunocytokjemiske tester, betyr et negativt resultat at antigenet ikke ble påvist, ikke at antigenet ikke var tilstede i cellene/det analyserte vevet. Se Sammendrag og forklaring, Begrensninger og Karakteristikker for ytelsesegenskaper for spesifikk informasjon angående HercepTest immunoreaktivitet. Ekstra anbefalinger for tolkning av HercepTest -farging De fleste metastatiske brystkarsinomer som testes for HER2-proteinoveruttrykk gis en scoring på 0 eller 3+. Mens de fleste av disse tilfellene er tydelige, er en mindre andel av de gjenstående 1+- og 2+-prøvene vanskeligere å tolke. Bruk følgende retningslinjer for tolkning av HercepTest -farging ved ditt laboratorium. Evaluer kontrollcellelinjene for å validere analyseytelsen. Evaluer objektglassene for positive og negative kontroller. En hematoksylin og eosin (H&E) farging av vevsprøven anbefales for den første evalueringen. (Tumoren er kanskje ikke tydelig når du ser på prøven som er farget med HercepTest. Et H&E-farget objektglass kreves fra patologen for å verifisere tilstedeværelsen av tumoren.) HercepTest TM skal utføres på et paret snitt (seriesnitt) fra samme parafinblokk av prøven. Evaluer snittene som er farget for HER2-proteinoveruttrykk ved lite strøm først. De fleste av de positive tilfellene vil være tydelige ved liten forstørrelse. Godt bevarte og svært fargede områder av prøven skal brukes til å foreta en bestemmelse av prosenten positive tumorceller. Generelt skal scoringen av tilfeller være tydelig ved liten forstørrelse. Hvis bestemmelsen mellom grensetilfeller 1+/2+ er vanskelig ved liten forstørrelse, er scoringen vanligvis 1+. For å verifisere membranfarging, brukes 20 40x objektivforstørrelse. Hvis de fleste tumorceller demonstrerer fullstendig membranfarging, er fargingen enten 2+ eller 3+. Gå til 20 40x objektivforstørrelse for å bekrefte resultatet. I størstedelen av 3+-tilfellene farges minst 80 % av tumorcellene, og membranfargingen er intens. Hvis prøven er i nærheten av avkutt på 10 % tumorcellepositiv, anbefales det at et minimum på 100 tumorceller telles opp for å bestemme prosentandelen av fargede celler. Hvis det er fullstendig membranfarging ved en svak til moderat intensitet i mer enn 10 % av tumorcellene, er scoringen på prøven 2+. Dette følges vanligvis av ufullstendig membranfarging av de fleste av de gjenstående tumorcellene. Hvis mindre enn 10 % av tumorcellene har fullstendig perifer membranfarging, selv om andre tumorceller kan demonstrere en ufullstendig membranfarging, er scoringen 1+. Hvis mindre enn 10 % av tumorcellene har fullstendig eller ufullstendig perifer membranfarging, er scoringen 0. ( ) P04087NO_01_K / s. 17/52

18 Brystkreft Begrensninger - Bryst Generelle begrensninger 1. Immunocytokjemi er en diagnostisk prosess i flere trinn som krever spesialisert opplæring i valg av egnede reagenser og vev, fiksering, prosessering, preparering av det immunocytokjemiske glasset samt tolking av fargeresultatene. 2. Vevsfargingen er avhengig av håndteringen og prosesseringen av vevet før det farges. Uriktig fiksering, dypfrysing, opptining, vask, tørking, oppvarming, snitting eller kontaminasjon med annet vev eller væsker kan frembringe artefakter, antistoffopphopning eller falske, negative resultater. Inkonsistente resultater vil kunne være en konsekvens av variasjoner i fikserings- og innstøpingsmetoder, eller uregelmessigheter i vevet. 3. Overdreven eller ufullstendig motfarging kan gjøre det vanskelig å tolke resultatene riktig. 4. Klinisk tolking av positiv farging eller fraværet av slikt må evalueres i lys av klinisk presentasjon, morfologi og andre histopatologiske kriterier. Klinisk tolking av farging eller fraværet av dette, må suppleres med morfologiske undersøkelser og riktige kontroller i tillegg til andre diagnostiske tester. En kvalifisert patolog skal ha ansvar for å ha grundig kjennskap til antistoffene, reagensene og metodene som brukes til å tolke det fargede preparatet. Farging må utføres i et sertifisert, akkreditert laboratorium under oppsyn av en patolog som har ansvar for å gjennomgå de fargede objektglassene og sikre at de negative og positive kontrollene er adekvate. 5. Vev fra personer som er infisert med Hepatitt B-virus og som har hepatitt B overflate-antigen (HBsAg), vil kunne utvise uspesifikk farging med peroksidase fra pepperrot (27). 6. Reagensene vil kunne vise uventede reaksjoner i vevstyper som tidligere ikke har vært testet. Muligheten for uventede reaksjoner, selv i vevstyper som testes, kan ikke helt utelukkes på grunn av biologisk variabilitet i antigenuttrykket i neoplasmer eller andre patologiske vev (28). Kontakt Dakos tekniske avdeling med dokumentert, uventet reaksjon. 7. Falske positive resultater kan sees på grunn av ikke-immunologisk proteinbinding eller substratreaksjonsprodukter. De kan også være forårsaket av pseudoperoksydase-aktivitet (erytrocytter) og endogen peroksydase-aktivitet (cytokrom C) (28). 8. Fargeprosedyren skal utføres ved en omgivelsestemperatur på C. Produktspesifikke begrensninger 1. Antigenet som er til stede i 1+ kontrollcellelinjen MDA-175 er underlagt degradering over tid. Vurder kontrollglassresultatene i forbindelse med utløpsdatoen på kontrollobjektglasset. Negativ farging av MDA-175-celler kan kun indikere at kontrollglasset er degradert. Kontrollobjektglassene må oppbevares ved 2 8 C. 2. Falske negative resultater kan forårsakes av degradering av antigen i vev over tid. Prøver skal farges innen 4 6 uker etter montering av vev på objektglass ved lagring i romtemperatur (20 25 C) (29). 3. For optimale og reproduserbare resultater, krever HER2-proteinet varmeindusert epitophenting når vev fikseres rutinemessig (nøytralbufret formalin eller Bouins fiksativ) og parafininnstøpes. Denne forhåndsbehandlingen må fullføres ved begynnelsen av hele fargeprosessen. Se Klargjøre prøver, Behandling av vev før farging for instruksjoner. 4. Varmeindusert epitophenting av HER2-proteinet skal kun gjøres ved bruk av et kalibrert vannbad. Andre oppvarmingsmetoder har blitt testet og gir ikke reproduserbare resultater. 5. Ikke skift ut settets reagenser med reagenser som har andre partinumre eller med reagenser fra andre produsenter. Det eneste unntaket er Wash Buffer, som kan erstattes med Dako Wash Buffer, kode S Falske resultater kan oppnås ved evaluering av cytoplasmafarging. Vurder kun intensiteten på cellemembranfarging ved tolkning av resultater. ( ) P04087NO_01_K / s. 18/52

19 Brystkreft 7. Fargede kontrollglass skal kun brukes til validering av fargekjøringen og ikke som en rettledning for å score fargereaksjonen i vevssnitt. 8. Sterkt fokusert farging (3+), f.eks. hot spots, kan ses av og til. Dette kan være resultatet av ujevn fiksering og/eller prosessering av vev. Immunofarging av en annen vevsblokk fra samme prøve anbefales. 9. Bruk av HercepTest på prøver som er fiksert i andre fiksativer enn nøytralbufret formalin eller Bouins fiksativ, har ikke blitt validert. 10. Normalt epitel i brystvev skal farges mellom 0 og 1+. Hvis fargingen er over 1+ for det normale epitelet, skal testen gjentas. Merk at normalt tonsill- og øsofagepitel kan farge inntil 2+-intensitet. Metodeegenskaper - Bryst Bakgrunn Den kliniske undersøkelsesanalysen (CTA) som ble brukt til å identifisere egnede pasienter for Herceptin -kliniske studier, var for undersøkelsesbruk og er ikke lenger tilgjengelig. HercepTest ble utviklet for å gi et sammenlignbart alternativ til CTA. Sikkerheten og effektiviteten til Herceptin ble evaluert i en randomisert, kontrollert klinisk studie og en stor studie med åpen merking (se pakningsvedlegget til Herceptin ). Alle pasienter som ble utvalgt til Herceptin -kliniske studier, viste overuttrykk av HER2- proteinet ved immunocytokjemisk testing som ble utført med CTA ved et sentralt laboratorium. Pasienter egnet seg for Herceptin -behandling hvis tumoren hadde 2+- eller 3+-nivåer av HER2- proteinoveruttrykk (basert på en 0 3+-skala, der 3+ representerte det høyeste nivået). Undergruppeanalyse av resultatene fra disse studiene foreslår at pasienter som hadde vev som var sterkt positive (3+) for HER2-proteinoveruttrykk kan ha større nytte av Herceptin enn pasienter som hadde vev som var svakt positive (2+). Graden av HER2-proteinoveruttrykk er potensielt en viktig prediktor for effektiviteten til Herceptin -behandlingen. Siden ingen av pasientene i Herceptin -studiene ble utvalgt ved bruk av HercepTest, er korrelasjonen mellom positivitetsgraden og sannsynligheten for klinisk fordel av Herceptin -behandlingen ukjent. Sammenligningsundersøkelser Det ble gjennomført to undersøkelser for å karakterisere HercepTest. 1) Sammenligning med klinisk prøvevurdering (CTA). 2) Nøyaktighet ved sammenligning med fem ekstra vurderinger. Sammenligning med klinisk prøvevurdering (CTA) HercepTest ble sammenlignet med CTA som ble brukt til å identifisere egnede pasienter for Herceptin -behandling ved bruk av 274 HER2-proteinpositive (2+ eller 3+) og et likt antall HER2-protein negative brystkreftvevsprøver. Tabell 4 viser resultatene i et 2 x 2 diagram der 0 g 1+ ble betraktet som negative og 2+ og 3+ var positive. Tabell 4. Et 2 x 2 samsvar av HercepTest og klinisk prøvevurdering (CTA) (antall prøver). Klinisk studieanalyse Positiv Negativ Total HercepTest Positiv Negativ Total Samsvar: 79 % (76 82 %) 95 % sikkerhetsintervall. Det helhetlige binære samsvaret til HercepTest med CTA var 79 % (431/548), med et 2-sidet 95 % sikkerhetsintervall på %. Tjueen prosent (21 %) av resultatene manglet samsvar mellom disse to metodene. ( ) P04087NO_01_K / s. 19/52

20 HercepTest -resultatene rapporteres på en 0 3+-skala som tolkes som negativt for HER2-proteinoveruttrykk (0- og 1+-fargeintensitet), svakt positivt (2+-fargeintensitet) og sterkt positivt (3+-fargeintensitet). Tabell 5. Et 3 x 3 samsvar for HercepTest og klinisk prøvevurdering (CTA). Klinisk studieanalyse Brystkreft Total HercepTest Total Denne 3 x 3- presentasjonen av samsvarsundersøkelsen indikerer at en 3+-avlesing på HercepTest høyst sannsynlig ville tilsvare et positivt resultat på CTA som ville ha oppfylt inngangskriteriene for Herceptin -undersøkelsen (2+ eller 3+). Et funn på 2+ på HercepTest korrelerte ikke så bra med CTA-resultatene. Omtrent 42 % (53/126) av HercepTest 2+-resultatene var negative ved CTA (0 1+), noe som ikke ville ha tillatt opptak i Herceptin -kliniske undersøkelser. Nøyaktighet HercepTest ble også testet på 2 mikroskopobjektglass som inneholdt parafininnstøpte vevssnitt fra 168 brysttumorer. Disse tumorene hadde tidligere blitt karakterisert ved fem ulike metoder for å påvise HER2-genamplifikasjon og overuttrykk av HER2-protein, inkludert intern Southern blot, fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) for amplifikasjonen av DNA, Northern blot RNA-analyse, Western blot samt immunocytokjemi (ICC) på frosne vev (29). Resultatene presenteres i Tabell 6. Tabell 6. Sammenligning av HercepTest med kombinerte resultater (OE) fra genamplifikaskjon og HER2-proteinoveruttrykkstester. Referanse OE-klassifisering + - Total HercepTest Total Positiv overensstemmelse: 43/69 = 62 % Negativ overensstemmelse: 99/99 = 100% Resultatene indikerte et overensstemmelsesnivå på 85 % (142/168) (95 % sikkerhetsintervall på %) mellom positiv (2+ og 3+) og negativ (0 og 1+) fargingsintensitet ved HercepTest. av prøvene som var negative med de 5 ulike metodene var positive ved HercepTest, mens de kombinerte resultatene for de 5 forskjellige metodene viste et høyere antall positive tilfeller. Reproduserbarhet Intern reproduserbarhet: Intern reproduserbarhet ble testet i et laboratorium med 5 prøver av ulik ICC-intensitetsfargingsscoringer. Hver prøve ble kjørt i tre eksemplarer i et maskert, randomisert format. Denne protokollen ble brukt med automatisert farging. Alle prøver ga 100 % reproduserbare resultater. Ekstern reproduserbarhet: Ekstern reproduserbarhet ble testet ved tre laboratorier over 4 dager med 5 prøver av ulike ICC-intensitetsfargingsscoringer som var randomisert og maskert ved bruk av automatisert metodologi. Utmerket reproduserbarhet ble sett for positive versus negative resultater (0 og 1+ versus 2+ og 3+) med unntak av to prøver i ett laboratorium som varierte mellom 1+ og 2+. Det var 100 % reproduserbarhet for 2+- og 3+-prøvene. Reproduserbarhet mellom laboratorier: Reproduserbarhet mellom laboratorier ble testet ved tre laboratorier som er geografisk separert med 40 identiske, randomiserte og maskerte prøver av ulike ICC-fargingsintensitetsscoringer. Nykuttede snitt ble sendt til hvert testlaboratorium ( ) P04087NO_01_K / s. 20/52

21 Brystkreft for automatisert farging og evaluering av en patolog. Prosentoverensstemmelsen mellom laboratorier spredte seg fra 83 % til 90 % for en dikotomøs positiv/negativ påvisning der 0 og 1+ var negative og 2+ og 3+ var positive for HER2-proteinoveruttrykk. Sammenlignet med resultatene som ble oppnådd ved referanselaboratoriet som hadde utført CTA, var 12,5 % (15/120) komparative resultater avvikende mellom negative (0 eller 1+) og positive (2+ eller 3+) bestemmelser. Et tillegg på 10 % (12/120) var avvikende mellom 2+- og 3+-scoringer. Immunoreaktivitet Tabell 7 oppsummerer HercepTest immunoreaktivitet med anbefalt panel av normale vev. Alle vev var formalinfiksert og parafininnstøpt og farget med HercepTest ifølge instruksjonene i pakningsvedlegget. Tabell 7. Sammendrag av normal vevsreaktivitet for HercepTest. Vevstype (Ant. testet) Positiv vevselementfarging og fargemønster Binyre (3) Benmarg (3) Hjerne/cerebellum (3) Hjerne/cerebrum (3) Bryst (3) Cervix uteri (3) Kolon (3) Spiserør (3) Hjerte (3) Nyre (3) Lever (3) Lunge (3) Mesoteliale celler (3) Eggstokk (3) Bukspyttkjertel (3) Skjoldbruskkjertel (3) Perifer nerve (3) Hypofyse (3) Prostata (3) Spyttkjertel (3) Skjelettmuskel (3) Hud (3) Tynntarm (3) Milt (3) Mage (3) Testis (3) Thymus (3) Skjoldbruskkjertel (3) Tonsill (3) Livmor (3) Brystkjertel (1 av 3 vev, 1+ fargingsintensitet) Tubuler av nyremarg (3 av 3 vev, 1-2+ i 5-50 % av celler, cytoplasmisk Prostatakjertel/-kanaler (3 av 3 vev, 1+ fargingsintensitet, 50 % av celler, cytoplasmisk) Svettekjertler (1 av 3 vev, 1+, 30 % av celler, cytoplasmisk) Søyleformet epitel, overflate (1 av 3 vev, 2+ fargingsintensitet, 25 % av celler) Epitel (1 av 3 vev, 1+ fargingsintensitet, 25 % av celler) Skvamøse epitel (3 av 3 vev, 1+ fargingsintensitet, 80 % av celler) Rapportert farging i alle vev var membran, med mindre annet er oppgitt. Alle tre prøvene av hver vevstype hadde samme fargingsintensitet med mindre annet er bemerket. ( ) P04087NO_01_K / s. 21/52

22 Brystkreft Feilsøking - Bryst Se avsnittet om Feilsøking i Dakos tidligere henviste Håndbok (19) for korrigerende handling, eller ta kontakt med Dakos tekniske serviceavdeling for å rapportere uvanlig farging. Problem Mulig årsak Foreslått tiltak 1. farging av objektglass 1a. Programmeringsfeil. Reagenser ikke brukt i riktig rekkefølge 1a. Kontroller programmeringsnett for å verifisere at fargekjøringen ble programmert riktig. 2. Svak farging av objektglass 1b. Reagensflasker ble ikke lastet på de riktige stedene i reagensstativene. 1c. Utilstrekkelig med reagens i reagensflasken. 1d. Natriumazid i Wash Solution 1e. Overdreven oppvarming av monterte vevsnitt før deparafinisering og varmeindusert antigenavmasking kan føre til tap av synlig HER2 immunoreaktivitet. 2a. Utilstrekkelig epitophenting 2b. Utilstrekkelig reagensinkuberingstider. 2c. Feil fikseringsmetode brukt. 2d. Overdreven oppvarming av monterte vevsnitt før deparafinisering og varmeindusert antigenavmasking kan forårsake betydelig reduksjon av synlig HER2 immunoreaktivitet 2e. Utilstrekkelig reagensvolum brukt 1b. Kontroller reagenskart for å verifisere riktig plassering av reagensflaskene. 1c. Se til at nok reagens lastes i reagensflaskene før kjøringen begynnes. Se reagenskart for nødvendig volum. 1d. Bruk fersk preparering av Wash Buffer som finnes i settet. 1e. Lufttørk vevsnittene ved romtemperatur i minst 12 timer eller inntil de er tørre. Alternativt kan de tørkes ved 37 C over natten eller ved 60 C i maksimalt én time. Tørking av vevsnitt ved økte temperaturer må kun utføres i en kalibrert ovn med enhetlig varme-fordeling (17). 2a. Verifiser at Epitope Retrieval Solution når C i hele 40 minutter og får kjøle seg ned i enda 20 minutter. 2b. Gå gjennom fargeprosedyreinstruksjonene. 2c. Se til at pasientvev ikke overfikseres eller at et alternativ fiksativ ikke ble brukt. 2d. Lufttørk vevsnittene ved romtemperatur i minst 12 timer eller inntil de er tørre. Alternativt kan de tørkes ved 37 C over natten eller ved 60 C i maksimalt én time. Tørking av vevsnitt ved økte temperaturer må kun utføres i en kalibrert ovn med enhetlig varme-fordeling (17). 2e. Kontroller størrelsen på vevsnitt (22 mm x 22 mm) og reagensvolum som er brukt ( ) P04087NO_01_K / s. 22/52

23 Problem Mulig årsak Foreslått tiltak 3. Overflødig bakgrunnsfarging av objektglass 3a. Parafin ikke fullstendig fjernet. Brystkreft 3a. Bruk ferske klaringsløsninger, og følg prosedyren slik som skissert i avsnitt B.1 3b. Stivningstilsetningsmidler brukt ved montering av snitt til objektglass. 3c. Objektglassene er ikke godt nok skyllet. 3d. Snittene tørket i løpet av fargeprosedyren. 3e. Snittene tørket mens Autostainer ble lastet. 3b. Unngå bruk av stivningstilsetningsmidler for å feste snitt til objektglassene. Mange tilsetningsmidler er immunoreaktive. 3c. Kontroller at Autostainer er riktig primet før kjøringen. Kontroller for å sikre at det finnes nok buffer for hele kjøringen. Bruk ferske løsninger med buffer og vask. 3d. Verifiser at riktig volum av reagensen påføres objektglassene. Se til at Autostainer kjøres med hetten i lukket posisjon og ikke utsettes for overflødig varme eller trekk. 3e. Se til at snittene holder seg våte med buffer under lasting og før kjøringen startes. 3f. Feil fikseringsmetode brukt. 3g. Uspesifikk binding av reagenser til vevet. 3f. Se til at godkjent fiksativ brukes. Alternativ fiksativ kan forårsake overflødig bakgrunnsfarging. 3g. Kontroller fikseringsmetoden på prøven og tilstedeværelsen av nekrose. 4. Vev løsner fra objektglass 4a. Bruk av feil objektglass. 4a. Bruk silaniserte objektglass, slik som Dako Silanized Slides, Kode S3003, SuperFrost Plus eller poly-l-lysin-belagte objektglass 5. Overdreven sterk spesifikk farging. 5a. Feil fikseringsmetode brukt. 5a Se til at kun godkjente fiksativer og fikseringsmetoder brukes. 5b. Bruk av feil varmekilde for epitophenting, dvs. dampkoker, mikrobølgeovn eller autoklav. 5c. Reagensinkubasjonstider for lange. 5d. Bruk av feil vaskeløsning. 5b. Se til at kun vannbad brukes til epitophentingstrinnet. 5c. Gå gjennom fargeprosedyreinstruksjonene. 5d. Bruk kun Wash Buffer som anbefales for settet. ( ) P04087NO_01_K / s. 23/52

24 Problem Mulig årsak Foreslått tiltak 6. Svak farging av 1+kontrollglasscellelinje 6a. Feil epitophentingsprotokoll fulgt. Brystkreft 6a. Neddykk objektglassene i den forhåndsoppvarmede Epitope Retrieval Solution. Bring temperaturen til Epitope Retrieval Solution tilbake til C og forhåndsbehandle i hele 40 inutter. 7. Epitope Retrieval Solution får tåkete utseende ved oppvarming 8. Epitope Retrieval Solution får tåkete utseende ved oppbevaring (før oppvarming) 6b. Mangel på reaksjon med Substrate-Chromogen Solution (DAB) 6c. Degradering av kontrollobjektglass 7. Ved oppvarming får løsningen et tåkete utseende 8. Løsningen har blitt lagret på feil måte, eller utløpsdatoen på løsningen er overskredet 6b. Se til at den fullstendige 10-minutters inkubasjonstiden brukes. Se til at det kun er én dråpe DAB Chromogen som ble tilført 1 ml DAB Buffered Substrate. 6c. Kontroller settets utløpsdato og oppbevaringsforhold på utsiden av pakningen. 7. Dette er normalt og påvirker ikke fargingen 8. Kontroller settets utløpsdato og oppbevaringsforhold på utsiden av pakningen. Kast Epitope Retrieval Solution MERK: Hvis problemet ikke kan tilknyttes noen av årsakene ovenfor, eller hvis det foreslåtte tiltaket ikke løser problemet, vennligst ring Dakos tekniske avdeling for ytterligere assistanse. Ekstra informasjon om fargingsteknikker og prøveklargjøring kan finnes i den tidligere henviste Håndboken (19) (tilgjengelig fra Dako), Atlas of Immunohistology (30) og Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis (31). ( ) P04087NO_01_K / s. 24/52

25 Magekreft Sammendrag og forklaring - Gastrisk Bakgrunn Det humane HER2-genet (også kjent som ERBB2 eller NEU) koder et protein som ofte kalles HER2-protein eller p185 HER2. HER2-proteinet er en membranreseptor-tyrosinkinase med homologi til den epidermiske vekstfaktorreseptoren (EGFR eller HER1) (1 8). HER2-proteinet er en normal komponent som uttrykkes av en rekke forskjellige epiteliale celletyper (8). Overuttrykk av HER2-proteinet og amplifikasjon av HER2-genet ved magekreft har blitt vist i et stort antall undersøkelser (32). HER2-positivitet kan påvises i omtrent 20 % av pasientene, enten med IHC eller FISH (32). Prekliniske in vitro- og in vivo-studier har vist at trastuzumab (Herceptin ) er effektiv i ulike magekreftmodeller og førte dermed til initieringen av flere kliniske undersøkelser (32-36). I en fase III-undersøkelse BO18255, ToGA-studien, ble HER2-positive pasienter med uopererbar lokalt avansert, tilbakevendende og/eller metastatisk adenokarsinom i magen eller den gastroøsofageale overgangen randomisert til å motta 5-FU eller capecitabine og cisplatin enten enkeltstående eller i kombinasjon med trastuzumab. En statistisk betydelig økning i helhetlig overlevelse (OS) ble sett i pasientene som mottok den kombinerte behandlingen med trastuzumab og kjemoterapi (37, 38). Trastuzumab er et humanisert monoklonalt antistoff som binder med høy affinitet til HER2-proteinet og har blitt vist å inhibere proliferasjon av humane tumorceller som overuttrykker HER2-proteinet in vitro og in vivo (33 36). Egenskaper 3803 pasienter har blitt screenet for HER2-status for opptak i ToGA-studien. I denne studien ble både HER2-proteinoveruttrykk via IHC (HercepTest, Dako) og HER2-genamplifikasjon via FISH (HER2 FISH pharmdx, Dako) målt. Gyldige testresultater ble oppnådd med 3665 prøver med enten ICH- eller FISH-tester og i 3280 prøver med begge tester. Resultatene fra studien viste at 22,1 % av pasientene med avansert magekreft var HER2- positive som påvist med enten IHC eller FISH ifølge definisjonen av ToGA HER2- utvelgelseskriteriene (38). Med hensyn til bruk av HercepTest i vurderingen av pasienter som trastuzumabbehandling vurderes for, vennligst se pakningsvedlegget for Herceptin for mer informasjon. Prosedyreprinsipp - Gastrisk HercepTest inneholder reagenser som kreves for å fullføre en totrinns immunocytokjemisk fargeprosedyre for rutinemessig behandlede, parafininnstøpte prøver. Etter inkubasjon med primært antistoff fra kanin til humant HER2-protein, bruker dette settet en bruksklar Visualization Reagent basert på dekstran-teknologi. Denne reagensen består av både sekundære anti-kanin immunoglobulinmolekyler fra geit og pepperrotperoksidasemolekyler som er linket til en vanlig dekstran-polymerryggrad, og utelukker dermed behovet for sekvensiell applikasjon av linkantistoff og peroksidasekonjugert antistoff. Kryssreaksjon av Visualization Reagent med humane immunoglobuliner og serum fra kalvefostre har blitt fjernet ved solidfaseabsorpsjon. Den enzymatiske konverteringen av det deretter tilførte kromogenet resulterer i dannelsen av et synlig reaksjonsprodukt på antigenstedet. Prøven kan deretter kontrastfarges, og et dekkglass kan legges på. Resultatene tolkes ved bruk av et lysmikroskop. Kontrollobjektglass som inneholder tre formalinfikserte, parafininnstøpte humane brystkreftcellelinjer med fargeintensitetsscoringer på 0, 1+ og 3+ medfølger for å validere fargekjøringer. Fargingsintensiteten på disse cellelinjene har blitt korrelert til antall reseptorer pr. celle. HercepTest, Kode K5207, brukes til automatisert farging ved bruk av Autostainer. ( ) P04087NO_01_K / s. 25/52

26 Magekreft Reagenser - Gastrisk Materialer som følger med Materialene som er opplistet nedenfor er tilstrekkelig for 50 tester (50 objektglass inkubert med primært antistoff for HER2-protein og 50 objektglass inkubert med tilhørende Negative Control Reagent). Antallet tester er basert på bruk av 200 µl per vevsnitt (22 mm x 22 mm) fra flaskenr. 1, 2, 3 og 4, samt av Substrate-Chromogen Solution (DAB). Settet gir materialer som er tilstrekkelig til maksimalt 15 enkelte fargekjøringer. Flaskenr. Mengde Beskrivelse 1 2 x 11 ml 2 1 x 12 ml 3 2 x 11 ml 4 1 x 12 ml 5 15 x 11 ml 6 3 x 3 ml 7 3 x 3 ml 8 2 x 1 L Peroxidase-Blocking Reagent: 3 % hydrogenperoksid som inneholder 15 mmol/l natriumazid (NaN 3 ). Rabbit Anti-Human HER2 Protein: Bruksklart affinitetsisolert antistoff. Leveres i 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, inneholder stabiliserende protein. Immunogen: Syntetisk C-terminalfragment (intracytoplasmisk del) av HER2-proteinet forbundet med keyhole-limpet hemocyanin. Spesifisitet: HER2-protein. Rensemetode: Antistoffet affinitetsisoleres ved bruk av et immobilisert HER2-proteinpeptid. Visualization Reagent: Dekstranpolymer konjugert med pepperrotperoksidase og affinitetsisolerte anti-kanin immunoglobuliner fra geit. Leveres i Tris/HCl-buffer som inneholder stabiliserende protein og et antimikrobielt middel. Negative Control Reagent: Immunoglobulinfraksjon av normalt serum fra kanin ved en tilsvarende proteinkonsentrasjon som antistoffet for HER2-protein. Leveres i 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 ol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, inneholder stabiliserende protein. DAB Buffered Substrate: Substratbufferløsning, ph 7,5, som inneholder <0,1 % hydrogenperoksid, stabilisatorer, akseleratorer og et antimikrobielt middel. DAB Chromogen: 5 % 3,3 -diaminobenzidintetrahydroklorid kromogenløsning. Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x): 0,1 mol/l citratbuffer med et rengjøringsmiddel. Wash Buffer (10x): Tris/HCl-buffer med vaskemiddel og et antimikrobielt middel. ( ) P04087NO_01_K / s. 26/52

27 3 x 5 objektglass Magekreft Control Slides: Hvert kontrollobjektglass inneholder snitt av tre formalinfikserte, parafininnstøpte brystkarsinomcellelinjer som representerer ulike nivåer av HER2-proteinuttrykk: MDA-231 (0), MDA-175 (1+) og SK-BR-3 (3+). Kontrollobjektglassene har blitt forhåndsbehandlet for bedre binding av snittene til glassene. All ekstra varmebehandling av kontrollobjektglassene som utføres for å forbedre bindingen av snittene til glassene, kan forringe fargeresultatene. MERK: Alle reagenser, inkludert Epitope Retrieval Solution og Wash Buffer, er spesialformulerte for bruk med denne testen. For at testen skal yte som spesifisert, skal det ikke foretas erstatninger, unntatt av Wash Buffer, der Dako Kode S3006 kan brukes. Materialer som er nødvendige, men som ikke medfølger Ammoniumhydroksid, 15 mol/l fortynnet til 37 mmol/l Kontrastfarge: Hematoksylin, slik som vannbaserte Mayer's Hematoxylin, Dako Kode S3301 (se BRUKSANVISNING, A.4) Dekkglass Destillert eller avionisert vann (Washing Water) Tørkeovn som kan opprettholde 60 C eller mindre Etanol, absolutt og 95 % Lysmikroskop (4 40x objektivforstørrelse) Monteringsmedium, slik som Dako Faramount, Kode S3025, eller Glycergel, Kode C0563 Positive og negative vev til å bruke som prosesskontroller (se kvalitetskontrollavsnittet) Objektglass, SuperFrost Plus, poly-l-lysin-belagte objektglass eller Dako Silanized Slides, Kode S3003, (se Klargjøre prøve) Fargekyvetter eller -bad Stoppeklokke (som klarer 2 40 minutters intervaller) Vannbad med lokk (har evne til å opprettholde Epitope Retrieval Solution ved C) Xylen, toluen eller xylensubstitutter K5207 har blitt skreddersydd for bruk med Autostainer Immunostaining System, Kode S3400. Se brukerveiledningen til Autostainer for nødvendige komponenter til Autostainer. ( ) P04087NO_01_K / s. 27/52

28 Lagring - Gastrisk Lagres ved 2 8 C. Magekreft Ikke bruk settet etter utløpsdatoen som er stemplet utenpå pakningen. Hvis reagensene oppbevares under andre forhold enn de som er spesifisert i dette pakningsvedlegget, må de valideres av brukeren (14a, 14b). Merk at kontrollobjektglassene må oppbevares ved 2 8 C. Det er ingen tydelige tegn som indikerer at dette produktet er ustabilt. Positive og negative kontroller bør derfor kjøres samtidig med pasientprøver. Hvis det observeres uventet farging som ikke kan forklares med variasjoner i laboratorieprosedyrer, og det er mistanke om at det er et problem med HercepTest, ta kontakt med Dakos tekniske avdeling umiddelbart. Klargjøre prøve - Gastrisk Adenokarsinomprøver fra mage, inkludert gastroøsofageal overgang fra biopsier, eksisjoner eller reseksjoner må håndteres riktig, slik at vevet bevares til immuncytokjemisk farging. Standardmetoder for vevsbehandling skal brukes på alle prøver (15). Ved testing av små biopsiprøver, bestem intakt tumormorfologi og tilstedeværelse av tilstrekkelig tumorceller for IHC-evaluering. Hvis HercepTest analysen utføres på en biopsiprøve, skal flere (7 8) evaluerbare biopsiprøver fra ulike regioner av tumoren analyseres for å sikre pålitelig bestemmelse av HER2-status. Parafininnstøpte vevssnitt Vevssnitt som er preservert i bufret formalin og parafinnstøpt egner seg for bruk. Prøver skal f.eks. kuttes i blokker med en tykkelse på 3 eller 4 mm og fikseres i timer i nøytral bufret formalin. Biopsiprøver ble fiksert i 6 8 timer i ToGA-studien (for studiereferanse, se (37)). Vevene dehydreres i en serie av alkoholer og xylen, fulgt av infiltrering av smeltet parafin som ikke holder mer enn 60 C. Riktig fikserte og innstøpte v ev som uttrykker HER2-proteinet vil holde seg ubegrenset før snitt og objektglassmontering ved lagring på kjølig sted (15 25 C) (15, 16). I USA krever Clinical Laboratory Improvement Act av 1988, i 42 CFR (b) at Laboratoriet må oppbevare fargede objektglass i minst ti år fra undersøkelsesdatoen og beholde prøvebiter i minst to år etter undersøkelsesdatoen (16). Vevsprøver skal skjæres i snitt på 4 5 µm, monteres på objektglass og lufttørkes ved romtemperatur i minst 12 timer (eller inntil de er tørre) eller ved 37 C over natten eller ved 60 C i én time. FORSIKTIG: Overdreven oppvarming i mer enn én time ved 60 C kan forårsake en betydelig reduksjon i eller tap av spesifikk membrantilknyttet HER2 immunoreaktivitet (17). For å bevare antigenisitet, skal vevsnitt som er montert på objektglass (SuperFrost Plus, Poly- L-lysine eller silaniserte glass), farges innen 4 6 uker etter oppsnitting ved oppbevaring ved romtemperatur (20 25 C) (18). Objektglassene som kreve s for HER2-proteinevaluering og verifisering av tilstedeværelsen av en tumor, skal prepareres samtidig. Det anbefales minst 5 objektglass, 1 objektglass for tilstedeværelse av tumor, 2 objektglass for HER2- proteinevaluering (1 for inkubasjon med flaske nr. 2 og 1 for inkubasjon med flaske nr. 4), samt 2 objektglass for eserve. Bruk av HercepTest TM på avkalkede vev har ikke blitt validert, og anbefales ikke. Se Dakos Utdannelsesveiledning: Immunohistokjemiske fargemetoder (19) og referansene 15 og 16 for ytterligere detaljer om klargjøring av prøver. Behandling av vev før farging En spesifikk epitophentingsmetode i 10 mmol/l citratbuffer må brukes for optimal analyseytelse. Epitope Retrieval Solution medfølger i HercepTest kit. Denne metoden innbefatter oppvarming av vevssnitt som er montert på objektglass som neddykkes i 10 mmol/l citratbuffer (20) i et kalibrert vannbad som har evne til å opprettholde Epitope Retrieval Solution ved ønsket temperatur (95 99 C). Laboratorier som bef inner seg på høyere plan skal bestemme den beste metoden for å opprettholde den ønskede vannbadtemperaturen. Epitophentingen må utføres i vannbad. Andre oppvarmingsmetoder har blitt testet og gir ikke ( ) P04087NO_01_K / s. 28/52

29 Magekreft reproduserbare resultater. Start fargeprosedyren umiddelbart etter epitohentingen. Avvik fra beskrevet prosedyre kan påvirke resultatene. Forholdsregler - Gastrisk 1. Til in vitro-diagnostisk bruk. 2. For profesjonelle brukere. 3. Flaske 1, Peroxidase-Blocking Reagent, inneholder 3 % hydrogenperoksid. Sikkerhetsdatablad er tilgjengelig for profesjonelle brukere på forespørsel. 4. Flaske 6, DAB Chromogen, inneholder 5-<10% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride) og er merket: H350 H341 P201 P280 Fare P308 + P313 P405 P501 Kan forårsake kreft. Mistenkes for å kunne forårsake genetiske skader. Innhent særskilt instruks før bruk. Bruk vernehansker. Bruk vernebriller eller ansiktsvern. Bruk verneklær. Ved eksponering eller mistanke om eksponering: Søk legehjelp. Oppbevares innelåst. Disponer innholdet og emballasje i henhold til lokale, regionale, nasjonale og internasjonale forskrifter. Generelt sett har personer under 18 år ikke tillatelse til å arbeide med dette produktet. Brukerne må instrueres nøye i riktig arbeidsprosedyre, de farlige egenskapene til produktet og de nødvendige sikkerhetsinstruksjonene. Vennligst se databladet for materialsikkerhet (SDS) for ytterligere informasjon. 5. Flaske 8, Wash Buffer, inneholder 5-<10% 2-amino-2-(hydroksymetyl)propan-1,3- diolhydroklorid og 0.1-<0.2% 5-brom-5-nitro-1, 3-dioksan. Kan forårsake en allergisk reaksjon. Wash Buffer (10x) er merket: Advarsel H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Gir alvorlig øyeirritasjon. Bruk vernebriller eller ansiktsvern. Vask hendene grundig etter håndtering. VED KONTAKT MED ØYNENE: Skyll forsiktig med vann i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser dersom dette enkelt lar seg gjøre. Fortsett skyllingen. 6. Dette produktet inneholder natriumazid (NaN3), en svært giftig kjemikalie i ren form. Selv om produktkonsentrasjonene ikke klassifiseres som farlige, kan natriumazid reagere med bly- og kopperrør og danne metallazider som bygger seg opp og som er svært eksplosive. Ved avfallsbehandling skyll rikelig med vann for å forhindre ansamling av metallazid i rørene (21, 22). 7. Flaske 2, 3 og 4 inneholder materialer med dyreopprinnelse. Riktig håndteringsprosedyrer bør brukes i likhet med alle andre produkter derivert fra biologiske kilder. 8. Kontrollobjektglass og prøver, før og etter fiksering, og alle materialer som er utsatt for slike, skal håndteres som om de har evne til å overføre infeksjon og avhendes med riktige forholdsregler (23). Pipetter aldri reagenser med munnen, og unngå at reagenser og ( ) P04087NO_01_K / s. 29/52

30 Magekreft prøver kommer i kontakt med hud og slimhinner. Hvis reagens kommer i kontakt med følsomme områder, må det skylles med rikelige mengder vann. 9. Minimer mikrobiell kontaminering av reagenser for å unngå uspesifikk farging. 10. Andre inkubasjonstider og temperaturer, eller andre metoder enn dem som er spesifisert, vil kunne gi feilaktige resultater. Overdreven tørking i mer enn én time ved 60 C kan forårsake en betydelig reduksjon i eller tap av spesifikk membrantilknyttet HER2 immunoreaktivitet (17). 11. Reagenser har blitt optimalt fortynnet. Ytterligere fortynning kan forårsake tap av antigenfarging. 12. Alle reagenser, inkludert Epitope Retrieval Solution og Wash Buffer, er spesialformulerte for bruk med denne testen. For at testen skal yte som spesifisert, skal det ikke foretas erstatninger, unntatt av Wash Buffer, der Kode S3006 kan brukes. 13. Visualization Reagent og DAB chromogen kan påvirkes ufordelaktiv ved eksponering for unødige lysnivåer. Ikke oppbevar systemkomponentene eller utfør farging i sterkt lys, slik som direkte sollys. 14. Bruk egnet personlig verneutstyr for å unngå kontakt med øyne og hud. Se databladet for materialsikkerhet (SDS) for ytterligere informasjon. 15. Parafinrester kan føre til falske negative resultater. 16. For nøyaktig tolkning av HercepTest -resultater på fargede biopsiprøver fra adenokarsinom i magen, inkludert gastroøsofageal overgang, anbefales en gruppering på minst 5 fargede tumorceller. En gruppering på minst 5 fargede tumorceller består av 5 forbundede HER2-fargede tumorceller. 17. På grunn av den heterogene naturen til gastriske kreftprøver er det viktig å utføre HER2 IHC-testing på flere deler (7 8) av biopsien fra ulike regioner av tumoren for å oppnå et pålitelig resultat. 18. Bruk av andre reagensvolumer enn de som er anbefalt, kan føre til tap av synlig HER2 immunoreaktivitet. Vevsnitt som er større enn 22 mm x 22 mm vil kreve 2-3x 200 µl av reagens brukt i 2-3 automatiske bruksområder. ( ) P04087NO_01_K / s. 30/52

31 Magekreft BRUKSANVISNING - Gastrisk A. Reagenspreparering Det er praktisk å klargjøre følgende reagenser før farging: A.1 Epitope Retrieval Solution Fortynn en tilstrekkelig mengde av flaske 7 (Epitope Retrieval Solution x 10) 1:10 ved bruk av destillert eller avionisert vann for fargeprosedyren som er planlagt. Ubrukt fortynnet løsning kan oppbevares ved 2 8 C i én måned. Kast fortynnet løsning hvis den får et tåkete utseende. A.2 Wash Buffer Fortynn en tilstrekkelig mengde flaske 8 (Wash Buffer x 10) 1:10 ved bruk av destillert eller avionisert vann for vasketrinnene. Ubrukt fortynnet buffer kan oppbevares ved 2 8 C i én måned. Kast bufferen hvis den får et tåkete utseende. Autostainer er programmert til å skylle vevsnittene etter Peroxidase-Blocking Reagent og Substrate-Chromogen Solution. Merk at det for disse skylletrinnene kan brukes enten destillert (eller avionisert) vann eller Wash Buffer. Alle de andre skylletrinnene krever bruk av Wash Buffer. A.3 Substrate-Chromogen Solution (DAB) Klargjør Substrate-Chromogen Solution ved å tilføre 11 dråper (25 30 µl per dråpe) DAB Chromogen fra flaske 6 til en flaske 5 som inneholder DAB Buffered Substrate (11 ml), og bland. Klargjort Substrate-Chromogen Solution (DAB) er stabil i omtrent 5 dager hvis den oppbevares ved 2 8 C. Denne løsningen skal blandes godt før bruk. Bunnfall som utvikler seg i løsningen påvirker ikke fargekvaliteten. MERK: Fargen på DAB Chromogen i flaske 6 kan variere fra klar til lys lavendelbrun. Dette vil ikke påvirke ytelsen til dette produktet. Vennligst fortynn etter veiledningen i dette pakningsvedlegget. Tilsetning av overflødig DAB Chromogen til DAB Buffered Substrate vil føre til forringelse av det positive signalet. A.4 Kontrastfarge Det fargede sluttproduktet av DAB-fargereaksjonen er uløselig i alkohol og vann. Bruk en hematoksylinkontrastfarge og juster hematoksylinfargeintensiteten til et lignende nivå som vist i Dakos Tolkningshåndbok for HercepTest Magekreft. Hematoksylin, enten alkohol- eller vannbasert, slik som f.eks. Dako Mayer's Hematoxylin, Kode S3301, kan brukes. Følg hematoksylin-kontrastfarging med en grundig skylling i destillert eller avionisert vann, og neddykk deretter objektglassene i et bad med 37 mmol/l ammoniakkvann (se avsnitt B.2, trinn 3). Ammoniakkvann (37 mmol/l) klargjøres ved å blande 2,5 ml av 15 mol/l (konsentrert) ammoniumhydroksid med 1 liter destillert eller avionisert vann. Ubrukt 37 mmol/l ammoniakkvann kan lagres ved romtemperatur (20 25 C) i en tett lu kket flaske i inntil 12 måneder. A.5 Monteringsmedium Ikke-vandig, permanent monteringsmedium anbefales. Men vannholdig montering kan også aksepteres. Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, bruksklar, Kode S3025, eller Glycergel Mounting Medium, Kode C0563, anbefales for vannholdig montering. Kondenser Glycergel ved å varme opp til omtrent 40 (±5) C før b ruk. B. Fargeprosedyre som utføres på Autostainer B.1 Prosedyremerknader Brukeren skal lese disse instruksjonene nøye og gjøre seg kjent med alle komponentene og instrumentene før bruk (se Forholdsregler). Alle reagenser skal stabiliseres ved romtemperatur (20 25 C) før immunofarging. Likedan skal alle inkubasjoner utføres ved romtemperatur. Ikke la vevssnitt tørke mens objektglassene lastes på Autostainer eller i løpet av fargeprosedyren. Tørkede vevssnitt kan vise økt uspesifikk farging. ( ) P04087NO_01_K / s. 31/52

32 Magekreft Hvis fargeprosedyren avbrytes, kan objektglassene oppbevares i bufferbad etter inkubasjon av det primære antistoffet i inntil 1 time ved romtemperatur (20 25 C) uten at fargeytelsen påvirkes. Avparafinisering og rehydrering: Før fargingen, må vevsnittene avparafiniseres for å fjerne innstøpningsmedium og rehydreres. Unngå ufullstendig fjerning av parafin. Resterende innstøpnings-medium vil føre til økt ikke-spesifikk farging. Dette trinnet skal utføres ved romtemperatur (20 25 C). 1. Plasser objektglassene i et xylenbad og inkuber i 5 (±1) minutter. Skift bad og gjenta én gang. 2. Bank forsiktig av overflødig væske, og plasser objektglassene i absolutt etanol i 3 (±1) minutter. Skift bad og gjenta én gang. 3. Bank forsiktig av overflødig væske, og plasser objektglassene i 95 % etanol i 3 (±1) minutter. Skift bad og gjenta én gang. 4. Bank forsiktig av overflødig væske, og plasser objektglassene i destillert eller avionisert vann i minst 30 sekunder. Begynn fargeprosedyren slik som skissert i avsnitt B.2, trinn 1, epitophenting. Xylen- og alkoholløsningene skal skiftes etter 40 objektglass. Toluen eller xylensubstitutter, slik som Histoclear, kan brukes i stedet for xylen. MERK: Reagenser og instruksjoner som medfølger i dette settet er designet for optimal ytelse. Ytterligere fortynning av reagenser eller endring av inkubasjonstemperaturer kan gi feilaktige eller ikke-samsvarende resultater. Forskjeller i vevsbehandling og tekniske prosedyrer i brukerens laboratorium kan gjøre analyseresultatene ugyldige til bruk for utvelging av pasienter til Herceptin -behandling. B.2 Fargingsprotokoll Utføres ved romtemperatur, C. Trinn 1: Epitophenting Fyll fargingsglassene, f.eks. Coplin-glass, med fortynnet Epitope Retrieval Solution (se RUKSANVISNING, avsnitt A.1). Plasser fargingsglassene som inneholder Epitope Retrieval Solution i vannbad. Varm opp vannbadet og Epitope Retrieval Solution til C. Ved oppvarming får Epitope Retrieval Solution et tåkete utseende. Dekk til glassene med lokk for å stabilisere temperaturen og unngå fordampning. Neddykk de romtempererte avparafiniserte snittene i den forhåndsoppvarmede Epitop Retrieval Solution i fargingsglassene. BRING TEMPERATUREN PÅ VANNBADET OG EPITOPE RETRIEVAL SOLUTION TILBAKE TIL C. Inkuber i 40 (±1) minutter ved C. Fjern hele glasset med objektglassene fra vannbadet. La objektglassene kjøle seg ned i Epitope Retrieval Solution i 20 (±1) minutter ved romtemperatur. Dekanter Epitope Retrieval Solution og skyll snittene i Wash Buffer (se BRUKSANVISNING, avsnitt A.2). For optimal ytelse, neddykk snittene i Wash Buffer i 5 20 minutter etter epitophenting og før farging. MERK: Epitope Retrieval Solution er utformet kun til engangsbruk. Skal ikke brukes på nytt. ( ) P04087NO_01_K / s. 32/52

33 Trinn 2: Autostainer-prosedyre 1. Bruk Autostainer-produsert kart på HercepTest autoprogram for ønskede programtider og reagensvolum (se punkt 4 nedenfor for spesifikke volum). 2. Plasser Autostainer-reagensflaskene i Autostainer-reagensstativ etter dataprodusert reagenskart. 3. Plasser objektglassene i Autostainer ifølge dataprodusert objektglasskart. Magekreft 4. Still inn programmet og begynn HercepTest -programmet. Her følger en oversikt over programkjøringen: Skylling 200 µl Peroxidase-Blocking Reagent 5 minutter Skylling 200 µl Primary Anti-HER2 Protein (eller Negative Control Reagent) 30 minutter Skylling 200 µl Visualization Reagent 30 minutter Skylling Skylling Bytte 200 µl Substrate-Chromogen Solution (DAB) 10 minutter Skyll objektglassene i avionisert vann etter substratkromogentrinnet. MERK: Autostainer Hardware versjon 01 skyller objektglassene i buffer. Derfor må objektglassene skylles med avionisert vann etter at de er fjernet fra Autostainer. Trinn 3: Kontrastfarging (instruksjonene er for hematoksylin) Fjern objektglassene fra Autostainer og utfør kontrastfarging i hematoksylin slik som beskrevet nedenfor. Neddykk objektglassene i et bad med hematoksylin. Inkuber i 2 5 minutter, avhengig av styrken på brukt hematoksylin. Skyll forsiktig i destillert eller avionisert vannbad. Pass på at all resterende hematoksylin har blitt fjernet. Valgfritt: Dypp objektglassene 10 ganger i et bad på 37 mmol/l ammoniakkvann (se avsnitt A.4). Skyll objektglassene forsiktig i et bad med destillert eller avionisert vann i 2 5 minutter. MERK: Avhengig av inkubasjonstiden og styrken av det benyttede hematoxylinet, vil kontrastfarging gi en blek til mørk blå farging av cellenuklein. Overdreven eller ufullstendig motfarging kan gjøre det vanskelig å tolke resultatene riktig. Trinn 4: Montering Ikke-vandig, permanent monteringsmedium anbefales. Ellers kan vannholdig montering også aksepteres. Prøvene kan monteres og dekkes med vannbasert monteringsmedium, slik som Dako Faramount, Kode S3025 eller Glycergel, Kode C0563. MERK: Objektglassene kan leses når det passer. Men det kan oppstå noe blekning hvis objektglassene har dekkglass med vannholdig monteringsmedium og utsettes for sterkt lys over en periode på én uke. For å minimere blekning, skal objektglassene oppbevares på et mørkt sted i romtemperatur (20 25 C). ( ) P04087NO_01_K / s. 33/52

34 Magekreft Kvalitetskontroll - Gastrisk Forskjeller i vevsfiksering, -prosessering og innstøpning i brukerlaboratoriet, kan frembringe signifikant variasjon i resultatene og gjør det påkrevd med regelmessige interne kontroller i tillegg til kontrollobjekt-glassene fra Dako. I USA, se retningslinjer for kvalitetskontroll fra College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry, se også CLSI (tidligere NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24), samt referanse 25 for ytterligere informasjon. Tabell 8. Formål med daglig kvalitetskontroll Vev: Fiksert og prosessert som pasientprøve Spesifikt antistoff og sekundært antistoff Uspesifikt antistoff eller buffer pluss samme sekundært antistoff som bruk med spesifikt antistoff Positiv kontroll: Vev eller celler som inneholder målantigen som skal påvises (kan finnes i pasientvev). Den ideelle kontrollen er svakt positivt vev som er mest sensitivt for antistoff eller antigendegradering. Kontrollerer alle trinnene i analysen. Validerer reagens og prosedyrer som brukes for HER2-proteinfarging. Påvisning av uspesifikk bakgrunnsfarging. Negativ kontroll: Vev eller celler forventes å være negative (kan finnes i pasientens vev eller positivt kontrollvev). Påvisning av utilsiktet kryssreaktivitet av antistoff til celler/cellekomponenter. Påvisning av uspesifikk bakgrunnsfarging. Pasientvev Påvisning av spesifikk farging. Påvisning av uspesifikk bakgrunnsfarging. Kontrollobjektglass levert av Dako Kun kontrollfargeprosedyre. * Serum fra samme art som det spesifikke antistoffet, men ikke rettet mot samme målantigen. For å oppdage uspesifikk antistoffbinding, f.eks. binding av Fc-del av antistoff ved vevet. Kontrollobjektglass (medfølger): Hvert av de medfølgende kontrollobjektglassene inneholder tre pelleterte, formalinfikserte, parafininnstøpte humane brystkreftcellelinjer med fargeintensitetsscoringer på 0, 1+ og 3+. Ett objektglass skal farges i hver fargekjøring. Evalueringen av kontrollobjektglassenes cellelinjer som leveres av Dako indikerer validiteten til fargekjøringen. Positiv vevskontroll: Kontroller bør være fra nylig obduksjon/biopsi/kirurgiske prøver som er fiksert, behandlet og innstøpt så snart som mulig på identisk måte som pasientprøven(e). Positive vevskontroller er avgjørende for korrekt klargjorte vev og riktige fargeteknikker. En positiv vevskontroll for hvert sett testbetingelser skal inkluderes i hver fargekjøring. De positive vevskontrollene skal gi svak positiv farging, slik at de kan påvise forsiktige endringer i sensitiviteten til det primære antistoffet. Kontrollobjektglassene som medfølger dette settet, eller prøver som er prosessert på annen måte enn pasientprøven(e), validerer kun reagensytelsen og verifiserer ikke klargjøringen av vev. Bruk tidligere påvist HER2-protein 2+ som overuttrykker adenokarsinomvev for magen, inkludert gastroøsofageal overgang som ideell positiv vevskontroll. MERK: Vevskontroller som er kjent positive, bør bare brukes ved overvåking av korrekt yteevne for prosesserte vev og testreagenser og IKKE som hjelp til å stille spesifikk diagnose i pasientprøver. Hvis den positive vevskontrollen ikke gir tilstrekkelig positiv farging, bør resultater med pasientprøvene betraktes som ugyldige. Negativ vevskontroll: Bruk en negativ vevskontroll (kjent for å være HER2-proteinnegativ) som skal fikseres, behandles og innstøpes på en måte som er identisk med pasientens prøve(r) med hver fargingsomgang for å verifisere spesifisiteten til det primære antistoffet og gi en indikasjon på spesifikk bakgrunnsfarging. Kolon, lever eller tyroid egner seg til negativt kontrollvev. Variasjonen av ulike celletyper som kan finnes i de fleste vevssnitt, gir rom for negativ kontroll (dette må verifiseres av brukeren). ( ) P04087NO_01_K / s. 34/52

35 Hvis det forekommer spesifikk farging i den negative vevskontrollen, bør resultater med pasientprøvene betraktes som ugyldige, og testen må kjøres på nytt. Magekreft Uspesifikk Negative Control Reagent: Bruk den medfølgende Negative Control Reagent i stedet for primærantistoffet med et snitt av hver pasientprøve til å evaluere uspesifikk farging og gi bedre tolkning av spesifikk farging ved antigenstedet. Inkubasjonsperioden for Negative Control Reagent bør være lik inkubasjonsperioden for primærantistoffet. Analyseverifisering: Før innledende bruk av et antistoff eller fargesystem i en diagnostisk prosedyre, skal brukeren verifisere antistoffets spesifisitet ved å teste den på en serie interne vev med kjente immunocytokjemiske ytelsesegenskaper som representerer kjente positive og negative vev. Se kvalitetskontrollprosedyrene som tidligere ble skissert i dette avsnittet av produktvedlegget og anbefalte kvalitetskontroller i CAP-sertifiseringsprogrammet for immunohistokjemi, og/eller CLSI (tidligere NCCLS) kvalitetssikring for immunocytokjemi, godkjent retningslinje (24). Disse kvalitetskontrollprosedyrene bør gjentas for hver produksjonsserie av et nytt antistoff, eller hver gang det gjøres en endring i analyseparametrene. Adenokarsinomer i mage, inkludert gastroøsofageal overgang, med kjent HER2-proteinfargingsintensitet fra 0 3+ og negative vev, f.eks. kolon, lever eller tyroid, egner seg for analyseverifisering. ( ) P04087NO_01_K / s. 35/52

36 Magekreft Tolkning av farging - Gastrisk For påvisning av HER2-proteinuttrykk skal kun membranfargingsintensiteten og mønsteret evalueres ved bruk av skalaen som finnes i tabell 9. Evaluering av objektglass skal utføres av en patolog ved bruk av et lysmikroskop. For å evaluere den immunohistokjemiske fargingen og scoringen, egner det seg med et objektiv på 10x forstørrelse. Bruk av en 5 40x objektivforstørrelse er nyttig for å bekrefte scoringen. Cytoplasmisk farging skal betraktes som uspesifikk og skal ikke inkluderes i vurderingen av membranfargingsintensiteten (8). For å hjelpe til med differensieringen av 0, 1+, 2+ og 3+ farging, se Dakos Tolkningshåndbok for HercepTest Magekreft for representative bilder av fargingsintensiteten og -mønstrene. Det er kun prøver fra pasienter med adenokarsinom i mage, inkludert gastroøsofageal overgang, som skal scores. I tilfeller med intestinal metaplasi og gastrisk adenokarsinom i samme prøve skal kun den gastriske adenokarsinomkomponenten scores. For HercepTest -tolkning av fargede biopsier anbefales en gruppering på minst 5 fargede tumorceller. En gruppering på minst 5 fargede tumorceller består av 5 forbundede HER2-fargede tumorceller. Tabell 9. Tolkning og scoring av HER2 immunohistokjemisk farging Scoring Kirurgisk prøve - Fargingsmønster Biopsiprøve - Fargingsmønster HER2 overuttrykkvurdering 0 reaktivitet eller ingen membranreaktivitet i < 10 % av tumorcellene reaktivitet eller ingen membranreaktivitet i noen (eller < 5 grupperte) tumorcelle Negativ 1+ Svak/knapt synlig membranreaktivitet i 10 % av tumorcellene; cellene er kun reaktive i deler av membranen Tumorcellegruppering ( 5 celler) med en svak/knapt synlig membranreaktivitet uavhengig av prosentandel fargede tumorceller Negativ 2+ En blek til moderat fullstendig, basolateral eller lateral membranreaktivitet 10 % av tumorcellene. Tumorcellegruppering ( 5 celler) med en svak til moderat fullstendig basolateral eller lateral membranreaktivitet uavhengig av prosentandel fargede tumorceller Ekvivokal 3+ Sterk fullstendig, basolateral eller lateral membranreaktivitet 10 % av tumorcellene. Tumorcellegruppering ( 5 celler) med en sterk fullstendig basolateral eller lateral membranreaktivitet uavhengig av prosentandel fargede tumorceller Positiv Retningslinjer basert på Hofmann et al. (40). HercepTest tolkes som negativ for HER2-proteinoveruttrykk (0- og 1+-scoring), ekvivokal (2+-scoring) og positiv (3+-scoring). HercepTest er ikke ment for å gi prognoseinformasjon til pasienten og legen, og har ikke blitt validert til det formålet. For hver fargekjøring, skal objektglassene undersøkes i den rekkefølgen som presenteres i tabell 10 for å bestemme validiteten på fargekjøringen og aktivere halvkvantitativ vurdering av fargeintensitet på prøvevevet. ( ) P04087NO_01_K / s. 36/52

37 Magekreft Tabell 10. Rekkefølge på objektglassevalueringen. Avlesingsrekkefølge for objektglass Rasjonal 1. Kontrollobjektglasset inneholder de tre cellelinjene Tilstedeværelse av 3+ brun cellemembranfarging (rimming) i 3+ kontrollcellelinjen SK-BR-3, delvis brun rimming i 1+ kontrollcellelinjen MDA-175 samt ingen farging i 0 kontrollcellelinjen MDA-231, indikerer en gyldig analyse Punktvis og avbrutt membranfarging finnes i et lite til et moderat antall av cellene i den svakt positive 1+ kontrollcellelinjen MDA Også punktaktig immunofarging av Golgi-regionen av cytoplasma kan observeres i denne cellelinjen. Tilstedeværelse av brun farging i 0 kontrollcellelinjen MDA-231 (negativ for HER2-proteinfarging) indikerer at det var en uspesifikk farging i løpet av analysen. Analyseresultatene kan være ugyldige på grunn av overfarging. 2. Positivt kontrollvev Tilstedeværelse av brun membranfarging skal observeres. Farging av cytoplasma og negative vev skal ikke være mer enn Negativt kontrollvev MANGLENDE spesifikk farging i den negative vevskontroll en bekrefter manglende kryssreaktivitet for settet til celler/cellekomponenter. Hvis det forekommer spesifikk membranfarging i de negative vevskontrollene, bør resultater med pasientprøvene betraktes som ugyldige. 4. Pasientvev ble farget ved bruk av negativ kontrollreagens Fravær av spesifikk membranfarging verifiserer den spesifikke merkingen av målantigenet gjennom det primære antistoffet. Annen brunaktig eller brun farging som oppstår i cytoplasmaet til prøven som behandles med Negative Control Reagent, slik som i bindevev, leukocytter, erytrocytter eller nekrotisk vev, skal betraktes som uspesifikk bakgrunnsfarging og skal rapporteres under kommentardelen av dataregnearket 5. Pasientvev ble farget ved bruk av primært antistoff Der HER2-proteinoveruttrykk påvises i prøven, vil dette vises som brun rimming som befinner seg på cellemembranen på tumorceller som er behandlet med det primære antistoffet. 1. Kontrollobjektglass (medfølger): Kontrollen som er farget med HercepTest skal undersøkes først for å få bekreftet at alle reagenser fungerer riktig. Tilstedeværelsen av brunt (3,3 diaminobenzidin, DAB) reaksjonsprodukt ved cellemembranen er et tegn på positiv reaktivitet. Tilstedeværelse av perifer brun cellemembranfarging (rimming) i 3+ kontrollcellelinjen SK-BR- 3, delvis brun rimming i 1+ kontrollcellelinjen MDA-175 samt ingen farging i 0 kontrollcellelinjen MDA-231, indikerer en gyldig analyse. Hvis noen av kontrollcellelinjene yter utenfor disse kriteriene, bør alle resultatene for pasientprøvene betraktes som ugyldige. 2. Positiv vevskontroll: Deretter skal objektglasset med den positive vevskontrollen undersøkes. Dette objektglasset verifiserer at fikseringsmetoden og epitop-hentingsprosessen er effektive. Bruk intakte celler ved tolking av fargingsresultater, da nekrotiske eller degenererte celler ofte farges uspesifikt (26). Farging skal observeres i tumorvev som brun cellemembranfarging. Brun farging av cytoplasma og negative vev innenfor prøven skal ikke være mer enn tilsvarende 1+ fargeintensitetsscoring. 3. Negativ vevskontroll: Den negative vevskontrollen bør undersøkes etter den positive vevskontrollen for å bekrefte den spesifikke merkingen av målantigenet av primærantistoffet. Manglende spesifikk farging i den negative vevskontrollen bekrefter manglende kryssreaktivitet for settet til celler/celle-komponenter. Hvis det forekommer spesifikk farging i de negative vevskontrollene, bør resultater med pasientprøvene betraktes som ugyldige. Alternativt kan negative deler av det positive kontrollvevet tjene som negativt kontrollvev, men dette må verifiseres av brukeren. Merk at en svak reaksjon (0 1+ fargingsintensitet) kan observeres i de fleste normale epiteliale vev. Mulige negative kontrollvev inkluderer: kolon, lever og tyroid. Uspesifikk farging, hvis dette forekommer, har diffust utseende. Sporadisk farging i bindevev vil også kunne observeres i vevssnitt som er fiksert for lenge i formalin. ( ) P04087NO_01_K / s. 37/52

38 Magekreft Pasientvev: Undersøk pasientprøvene som er farget med HercepTest til slutt. Positiv fargingsintensitet bør vurderes i lys av eventuell ikke-spesifikk bakgrunnsfarging i den negative reagenskontrollen. På samme måte som for alle andre immunocytokjemiske tester, betyr et negativt resultat at antigenet ikke ble påvist, ikke at antigenet ikke var tilstede i cellene/det analyserte vevet. Se Sammendrag og forklaring, Begrensninger og Karakteristikker for ytelsesegenskaper for spesifikk informasjon angående HercepTest immunoreaktivitet. Ekstra anbefalinger for tolkning av HercepTest -farging Adenokarsinomer i mage, inkludert gastroøsofageal overgang som testes for HER2-proteinoveruttrykk gis en scoring på 0 til 3+. Mens 0 og 3+-tilfellene er tydelige, kan en mindre andel av de gjenstående 1+- og 2+-prøvene være vanskeligere å tolke. Bruk følgende retningslinjer for tolkning av HercepTest -farging ved ditt laboratorium. Evaluer kontrollcellelinjene for å validere analyseytelsen. Evaluer objektglassene for positive og negative kontroller. En hematoksylin og eosin (H&E) farging av vevsprøven anbefales for den første evalueringen. (Tumoren er kanskje ikke tydelig når du ser på prøven som er farget med HercepTest. Et H&E-farget objektglass kreves fra patologen for å verifisere tilstedeværelsen av tumoren.) HercepTest TM skal utføres på et paret snitt (seriesnitt) fra samme parafinblokk av prøven. Evaluer snittene som er farget for HER2-proteinoveruttrykk ved lite strøm først. De fleste av de positive tilfellene vil være tydelige ved liten forstørrelse. For 1 +-tilfeller brukes 40x objektivforstørrelse for å verifisere membranfarging. For 2+-tilfeller bruk 10x-20x objektivforstørrelse for å verifisere membranfarging. Kirurgisk prøve Godt bevarte og svært fargede områder av prøven skal brukes til å foreta en bestemmelse av prosenten positive tumorceller. Hvis de fleste tumorceller demonstrerer fullstendig, basolateral eller lateral membranfarging, er fargingen enten 2+ eller 3+. Hvis det er fullstendig, basolateral eller lateral membranfarging ved en sterk intensitet i mer enn 10 % av tumorcellene i kirurgiske prøver, er scoringen på prøven 3+. Hvis det er fullstendig, basolateral eller lateral membranfarging ved en svak til moderat intensitet i mer enn 10 % av tumorcellene i kirurgiske prøver, er scoringen på prøven 2+. Hvis lik eller mer enn 10 % av tumorcellene i kirurgiske prøver, farget kun i deler av membranen, har en svak/knapt synlig intensitet, er scoringen på prøven 1+. Hvis mindre enn 10 % av tumorcellene i kirurgiske prøver har farging, uansett fargemønster (f.eks. fullstendig, basolateral, lateral eller en del av membranen), er scoringen 0. Hvis det ikke observeres noen farging, er scoringen på den kirurgiske prøven 0. Biopsiprøve En gruppering på minst 5 fargede tumorceller består av 5 forbundede HER2-fargede tumorceller. Hvis det er en tumorcellegruppering på minst 5 fargede tumorceller med en sterk fullstendig, basolateral eller lateral membranfarging, er scoringen på biopsiprøven 3+, uavhengig av prosentandel tumorceller som ble farget. Hvis det er en tumorcellegruppering på minst 5 fargede tumorceller med en svak til moderat fullstendig, basolateral eller lateral membranfarging, er scoringen på biopsiprøven 2+, uavhengig av prosentandel tumorceller som ble farget. Hvis det er en tumorcellegruppering på minst 5 fargede tumorceller med en svak/knapt synlig membranfarging og celler kun er farget i deler av membranen, er scoringen på biopsiprøven 1+, uavhengig av prosentandel tumorceller som ble farget. ( ) P04087NO_01_K / s. 38/52

39 Hvis det ikke observeres noen farging, er scoringen på biopsiprøven 0. Hvis membranfarging (uavhengig av fargingsintensitet) observeres i mindre enn 5 grupperte tumorceller, er scoringen på biopsiprøven 0. Magekreft Begrensninger - Gastrisk Generelle begrensninger 1. Immunocytokjemi er en diagnostisk prosess i flere trinn som krever spesialisert opplæring i valg av egnede reagenser og vev, fiksering, prosessering, preparering av det immunocytokjemiske glasset samt tolking av fargeresultatene. 2. Vevsfargingen er avhengig av håndteringen og prosesseringen av vevet før det farges. Uriktig fiksering, dypfrysing, opptining, vask, tørking, oppvarming, snitting eller kontaminasjon med annet vev eller væsker kan frembringe artefakter, antistoffopphopning eller falske, negative resultater. Inkonsistente resultater vil kunne være en konsekvens av variasjoner i fikserings- og innstøpingsmetoder, eller uregelmessigheter i vevet. 3. Overdreven eller ufullstendig motfarging kan gjøre det vanskelig å tolke resultatene riktig. 4. Klinisk tolking av positiv farging eller fraværet av slikt må evalueres i lys av klinisk presentasjon, morfologi og andre histopatologiske kriterier. Klinisk tolking av farging eller fraværet av dette, må suppleres med morfologiske undersøkelser og riktige kontroller i tillegg til andre diagnostiske tester. En kvalifisert patolog skal ha ansvar for å ha grundig kjennskap til antistoffene, reagensene og metodene som brukes til å tolke det fargede preparatet. Farging må utføres i et sertifisert, akkreditert laboratorium under oppsyn av en patolog som har ansvar for å gjennomgå de fargede objektglassene og sikre at de negative og positive kontrollene er adekvate. 5. Vev fra personer som er infisert med Hepatitt B-virus og som har hepatitt B overflate-antigen (HBsAg), vil kunne utvise uspesifikk farging med peroksidase fra pepperrot (27). Reagensene vil kunne vise uventede reaksjoner i vevstyper som tidligere ikke har vært testet. Muligheten for uventede reaksjoner, selv i vevstyper som testes, kan ikke helt utelukkes på grunn av biologisk variabilitet i antigenuttrykket i neoplasmer eller andre patologiske vev (28). Kontakt Dakos tekniske avdeling med dokumentert, uventet reaksjon. 6. Falske positive resultater kan sees på grunn av ikke-immunologisk proteinbinding eller substratreaksjonsprodukter. De kan også være forårsaket av pseudoperoksydase-aktivitet (erytrocytter) og endogen peroksydase-aktivitet (cytokrom C) (28). 7. Fargeprosedyren skal utføres ved en omgivelsestemperatur på C. Produktspesifikke begrensninger 1. Antigenet som er til stede i 1+ kontrollcellelinjen MDA-175 er underlagt degradering over tid. Vurder kontrollglassresultatene i forbindelse med utløpsdatoen på kontrollobjektglasset. Negativ farging av MDA-175-celler kan kun indikere at kontrollglasset er degradert. Kontrollobjektglassene må oppbevares ved 2 8 C. 2. Falske negative resultater kan forårsakes av degradering av antigen i vev over tid. Prøver skal farges innen 4 6 uker etter montering av vev på objektglass ved lagring i romtemperatur (20 25 C) (29). 3. For optimale og reproduserbare resultater, krever HER2-proteinet varmeindusert epitophenting når vev fikseres rutinemessig (nøytralbufret formalin) og parafininnstøpes. Denne forhåndsbehandlingen må fullføres ved begynnelsen av hele fargeprosessen. Se Klargjøre prøver, Behandling av vev før farging for instruksjoner. 4. Varmeindusert epitophenting av HER2-proteinet skal kun gjøres ved bruk av et kalibrert vannbad. Andre oppvarmingsmetoder har blitt testet og gir ikke reproduserbare resultater. ( ) P04087NO_01_K / s. 39/52

40 Magekreft 5. Ikke skift ut settets reagenser med reagenser som har andre partinumre eller med reagenser fra andre produsenter. Det eneste unntaket er Wash Buffer, som kan erstattes med Dako Wash Buffer, Kode S Falske resultater kan oppnås ved evaluering av cytoplasmafarging. Vurder kun intensiteten på cellemembranfarging ved tolkning av resultater. 7. Fargede kontrollglass skal kun brukes til validering av fargekjøringen og ikke som en rettledning for å score fargereaksjonen i vevssnitt. 8. Sterkt fokusert farging (3+), f.eks. hot spots, kan ses av og til. Dette kan være resultatet av ujevn fiksering og/eller prosessering av vev. Immunofarging av en annen vevsblokk fra samme prøve anbefales. 9. Bruk av HercepTest på prøver som er fiksert i andre fiksativer enn nøytralbufret formalin, har ikke blitt validert. 10. Merk at normalt tonsill- og øsofagepitel kan farge inntil 2+-intensitet. 11. Bruk av knuste magekreftprøver og tolkning av kunstig farging rundt en biopsikant skal unngås. Metodeegenskaper - Gastrisk Bakgrunn Sikkerheten og effektiviteten til trastuzumab (Herceptin ) har blitt demonstrert i en klinisk studie (ToGA-studien) (38, 39). Studien ble designet som en åpen merket, randomisert, flersenters fase III-studie i HER2-positive pasienter med uopererbar lokalt avansert, tilbakevendende og/eller metastatisk adenokarsinom i magen eller den gastroøsofageale overgangen. I ToGA-studien ble HER2-positiviteten definert som å være enten IHC-positiv (3+) (HercepTest, Dako) og/eller positiv via HER2 FISH (HER2/CEN17 2,0) (HER2 FISH pharmdx Kit, Dako). Etter opptak i studien ble pasientene randomisert til å motta kjemoterapi (5-FU eller capecitabine og cisplatin) eller kjemoterapi pluss trastuzumab. Det primære endepunktet i studien var helhetlig overlevelse (OS). I studien ble totalt 594 pasienter randomisert og 584 pasienter mottok studiemedikamentet og ble inkludert i det fullstendige analysesettet (FAS). For det primære endepunktet viste kombinasjonen av kjemoterapi pluss trastuzumab seg å være statistisk overlegen til kun kjemoterapi. Median OS økte fra 11,1 til 13,8 måneder (p=0,0046) med en et fareforhold på 0,74 (95 % CI: 0,60 0,91). Kaplan-Meier-kurver for OS vises i figur 1. ( ) P04087NO_01_K / s. 40/52

41 Magekreft Overlevelsessannsynlighet 1,0 0,9 0,8 0,7 Logg-rank-test P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 Tid (måneder) Ant. resterende Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Behandlingsgruppe Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figur 1. Kaplan-Meier-kurve for OS (n=584). Forhåndsspesifiserte utforskende undergruppeanalyser via HER2-status ble gjennomført med en gang data ble tilgjengelig. To nye HER2-undergrupper ble definert post hoc basert på IHC-scoring: Gruppe 1 ( lav HER2- uttrykksgruppe ): Gruppe 2 ( høy HER2- uttrykksgruppe ): IHC 0/FISH+ og IHC 1+/FISH+ (n=131) IHC 2+/FISH+ og IHC 3+ (FISH+ eller FISHeller FISH ikke noe resultat) (n=446) Når den primære analysen for OS ble gjentatt post hoc for høy HER2-uttrykksgruppe (n=446) var fordelen i favør av den kombinerte behandlingen enda større. Median OS for gruppen av pasienter som hadde mottatt kjemoterapi pluss trastuzumab økte til 16,0 måneder sammenlignet med 11,8 måneder for pasienter på kun kjemoterapi. Fareforholdet for denne analysen sank til 0,65 (95 % CI: 0,51 0,83). Kaplan-Meierkurver for OS for høy HER2-uttrykksgruppe vises i figur 2. ( ) P04087NO_01_K / s. 41/52

42 Magekreft Overlevelsessannsynlighet 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 Tid (måneder) Ant. resterende Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Behandlingsgruppe Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figur 2. Kaplan-Meier-kurver for OS for høy HER2-uttrykksgruppe (n=446). ToGA-studien har vist at kombinasjonen med IHC- og FISH-testingen er forutsigbar for virkningen av den kombinerte behandlingen med kjemoterapi og trastuzumab, men den utforskende post hoc-analysen ser ut til å indikere at pasienter med høyere nivåer av HER2-proteinuttrykk (IHC2+/FISH+ og IHC3+) avleder større fordel. Dette kan forklares med det faktum at proteinet er målet for trastuzumab. For ytterligere informasjon om ToGA-studien, vennligst se pakningsinnlegget for Herceptin. Reproduserbarhet Intern reproduserbarhet: Intern reproduserbarhet ble testet i et laboratorium med 3 prøver av ulik IHC-fargingsscoringer. Hver prøve ble kjørt i tre eksemplarer. Denne protokollen ble brukt med automatisert farging. Alle prøver ga 100 % reproduserbare resultater. Intern reproduserbarhet ble testet i et laboratorium med 11 prøver av ulike IHC-fargingsscoringer. Hver prøve ble kjørt i tre eksemplarer. Denne protokollen ble brukt med manuell farging. Alle prøver ga 100 % reproduserbare resultater. ( ) P04087NO_01_K / s. 42/52

43 Magekreft Reproduserbarhet mellom kjøringer og mellom laboratorier: HercepTest -analyse av 60 ulike magekreftprøver som er tatt fra magen eller de gastroøsofageale overgangsområdene som representerer kirurgiske reseksjoner og biopsier, ble utført på fem ikke-etterfølgende dager ved tre studiesteder. De 60 prøvene i studien ble fordelt likt i de tre HER2- statuskategoriene. Totalt 2040 HER2-scoringer ble utført av seks patologer. Dag-til-dag-overensstemmelse (negativ, ekvivokal, positiv) varierte fra 83,1 % til 98,3 %. I 47 av 60 mulige sammenligninger var overensstemmelsene ved 90 % eller mer. I Tabell 11 vises spesifikke eksempler på dag-til-dag-sammenligningene med gjennomsnittlige overensstemmelser på 91,2 %, 92,5 % og 92,5 % for de tre stedene. Sted-til-sted-overensstemmelsene var på henholdsvis 82,7 %, 75,0 % og 88,0 %, for parvis stedssammenligning (se Tabell 12). Ifølge Fishers eksakte test var ikke resultatene forskjellige mellom stedene. Observatør-til-observatør-overensstemmelser mellom patologene ved hvert sted var henholdsvis 88,0 %, 83,6 % og 81,0 % for de tre studiestedene (tabell 13). Som konklusjon viste HercepTest -analysen av magekreftprøver ved tre studiesteder bra overensstemmelse mellom observasjonen med hensyn til dager, steder og observatører. Tabell 11. Dag-til-dag helhetlige overensstemmelser i prosent et undersett på 12 av 60 sammenligninger Observatør 1 Observatør 2 Gjennomsnitt Overensstemmelse CI95 LL 1 Overensstemmelse CI95 LL 1 Overensstemmelse Sted 1 Dag 1 vs. dag 2 85,0 74,4 93,3 84,9 Dag 3 vs. dag 4 93,3 84,9 93,3 84,9 91,2 Sted 2 Dag 1 vs. dag 2 95,0 87,3 83,1 72,0 Dag 3 vs. dag 4 96,7 89,7 95,0 87,3 Sted 3 Dag 1 vs. dag 2 90,0 80,5 91,7 82,7 Dag 3 vs. dag 4 96,7 89,7 91,7 82,7 1 CI95 LL: 95 % nedre grense sikkerhetsintervall. 92,5 92,5 Tabell 12. Sted-til-sted helhetlige overensstemmelser i prosent Overensstemmelse CI95 LL 1 Gjennomsnittlig overensstemmelse Sted 1 vs. sted 2 Sted 1 vs. sted 3 Sted 2 vs. sted 3 Dag 1 vs. dag 1 83,3 72,4 Dag 2 vs. dag 2 85,0 74,4 Dag 3 vs. dag 3 85,0 74,4 Dag 4 vs. dag 4 81,7 70,5 Dag 5 vs. dag 5 78,3 66,7 Dag 1 vs. dag 1 80,0 68,6 Dag 2 vs. dag 2 73,3 61,2 Dag 3 vs. dag 3 78,3 66,7 Dag 4 vs. dag 4 68,3 55,9 Dag 5 vs. dag 5 75,0 63,0 Dag 1 vs. dag 1 88,3 78,5 Dag 2 vs. dag 2 86,7 76,4 Dag 3 vs. dag 3 90,0 80,5 Dag 4 vs. dag 4 86,7 76,4 Dag 5 vs. dag 5 88,3 78,5 82,7 75,0 88,0 ( ) P04087NO_01_K / s. 43/52

44 Magekreft 1 CI95 LL: 95 % nedre grense sikkerhetsintervall. ( ) P04087NO_01_K / s. 44/52

45 Magekreft Tabell 13. Observatør-til-observatør overensstemmelser i prosent Overensstemmelse CI 95 LL 1 Gjennomsnittlig overensstemmelse Sted 1 Dag 1 91,7 82,7 Dag 2 91,7 82,7 Dag 3 93,3 84,9 Dag 4 83,3 72,4 Dag 5 80,0 68,6 Sted 2 Dag 1 86,4 76,0 Dag 2 83,3 72,4 Dag 3 83,3 72,4 Dag 4 83,3 72,4 Dag 5 81,7 70,5 Sted 3 Dag 1 80,0 68,6 Dag 2 78,3 66,7 Dag 3 80,0 68,6 Dag 4 78,3 66,7 Dag 5 90,0 80,5 1 CI95 LL: 95 % nedre grense sikkerhetsintervall. 88,0 83,6 81,0 ( ) P04087NO_01_K / s. 45/52

46 Immunoreaktivitet Magekreft Tabell 14 oppsummerer HercepTest immunoreaktivitet med anbefalt panel av normale vev. Alle vev var formalinfiksert og parafininnstøpt og farget med HercepTest ifølge instruksjonene i pakningsvedlegget. Tabell 14. Sammendrag av normal vevsreaktivitet for HercepTest. Vevstype (Ant. testet) Positiv vevselementfarging og fargemønster Binyre (3) Benmarg (3) Hjerne/cerebellum (3) Hjerne/cerebrum (3) Bryst (3) Cervix uteri (3) Kolon (3) Spiserør (3) Hjerte (3) Nyre (3) Lever (3) Lunge (3) Mesoteliale celler (3) Eggstokk (3) Bukspyttkjertel (3) Skjoldbruskkjertel (3) Perifer nerve (3) Hypofyse (3) Prostata (3) Spyttkjertel (3) Skjelettmuskel (3) Hud (3) Tynntarm (3) Milt (3) Mage (3) Testis (3) Thymus (3) Skjoldbruskkjertel (3) Tonsill (3) Livmor (3) Brystkjertel (1 av 3 vev, 1+ fargingsintensitet) Tubuler av nyremarg (3 av 3 vev, 1-2+ i 5-50 % av celler, cytoplasmisk Prostatakjertel/-kanaler (3 av 3 vev, 1+ fargingsintensitet, 50 % av celler, cytoplasmisk) Svettekjertler (1 av 3 vev, 1+, 30 % av celler, cytoplasmisk) Søyleformet epitel, overflate (1 av 3 vev, 2+ fargingsintensitet, 25 % av celler) Epitel (1 av 3 vev, 1+ fargingsintensitet, 25 % av celler) Skvamøse epitel (3 av 3 vev, 1+ fargingsintensitet, 80 % av celler) Rapportert farging i alle vev var membran, med mindre annet er oppgitt. Alle tre prøvene av hver vevstype hadde samme fargingsintensitet med mindre annet er bemerket. ( ) P04087NO_01_K / s. 46/52

47 Magekreft Feilsøking - Gastrisk Se avsnittet om Feilsøking i Dakos tidligere henviste Håndbok (19) for korrigerende handling, eller ta kontakt med Dakos tekniske serviceavdeling for å rapportere uvanlig farging. Problem Mulig årsak Foreslått tiltak 1. farging av objektglass 2. Svak farging av objektglass 1a. Programmeringsfeil. Reagenser ikke brukt i riktig rekkefølge 1b. Reagensflasker ble ikke lastet på de riktige stedene i reagensstativene. 1c. Utilstrekkelig med reagens i reagensflasken. 1d. Natriumazid i Wash Solution 1e. Overdreven oppvarming av monterte vevsnitt før deparafinisering og varmeindusert antigenavmasking kan føre til tap av synlig HER2 immunoreaktivitet. 2a. Utilstrekkelig epitophenting 2b. Utilstrekkelig reagensinkuberingstider. 2c. Feil fikseringsmetode brukt. 2d. Overdreven oppvarming av monterte vevsnitt før deparafinisering og varmeindusert antigenavmasking kan forårsake betydelig reduksjon av synlig HER2 immunoreaktivitet 2e. Utilstrekkelig reagensvolum brukt 1a. Kontroller programmeringsnett for å verifisere at fargekjøringen ble programmert riktig. 1b. Kontroller reagenskart for å verifisere riktig plassering av reagensflaskene. 1c. Se til at nok reagens lastes i reagensflaskene før kjøringen begynnes. Se reagenskart for nødvendig volum. 1d. Bruk fersk preparering av Wash Buffer som finnes i settet. 1e. Lufttørk vevsnittene ved romtemperatur i minst 12 timer eller inntil de er tørre. Alternativt kan de tørkes ved 37 C over natten eller ved 60 C i maksimalt én time. Tørking av vevsnitt ved økte temperaturer må kun utføres i en kalibrert ovn med enhetlig varme-fordeling (17). 2a. Verifiser at Epitope Retrieval Solution når C i hele 40 minutter og får kjøle seg ned i enda 20 minutter. 2b. Gå gjennom fargeprosedyreinstruksjonene. 2c. Se til at pasientvev ikke overfikseres eller at et alternativ fiksativ ikke ble brukt. 2d. Lufttørk vevsnittene ved romtemperatur i minst 12 timer eller inntil de er tørre. Alternativt kan de tørkes ved 37 C over natten eller ved 60 C i maksimalt én time. Tørking av vevsnitt ved økte temperaturer må kun utføres i en kalibrert ovn med enhetlig varme-fordeling (17). 2e. Kontroller størrelsen på vevsnitt (22 mm x 22 mm) og reagensvolum som er brukt ( ) P04087NO_01_K / s. 47/52

48 3. Overflødig bakgrunnsfarging av objektglass 3a. Parafin ikke fullstendig fjernet. 3b. Stivningstilsetningsmidler brukt ved montering av snitt til objektglass. 3c. Objektglassene er ikke godt nok skyllet. 3d. Snittene tørket i løpet av fargeprosedyren. 3e. Snittene tørket mens Autostainer ble lastet. 3f. Feil fikseringsmetode brukt. 3g. Uspesifikk binding av reagenser til vevet. Magekreft 3a. Bruk ferske klaringsløsninger, og følg prosedyren slik som skissert i avsnitt B.1 3b. Unngå bruk av stivningstilsetningsmidler for å feste snitt til objektglassene. Mange tilsetningsmidler er immunoreaktive. 3c. Kontroller at Autostainer er riktig primet før kjøringen. Kontroller for å sikre at det finnes nok buffer for hele kjøringen. Bruk ferske løsninger med buffer og vask. 3d. Verifiser at riktig volum av reagensen påføres objektglassene. Se til at Autostainer kjøres med hetten i lukket posisjon og ikke utsettes for overflødig varme eller trekk. 3e. Se til at snittene holder seg våte med buffer under lasting og før kjøringen startes. 3f. Se til at godkjent fiksativ brukes. Alternativ fiksativ kan forårsake overflødig bakgrunnsfarging. 3g. Kontroller fikseringsmetoden på prøven og tilstedeværelsen av nekrose. 4. Vev løsner fra objektglass 4a. Bruk av feil objektglass. 4a. Bruk silaniserte objektglass, slik som Dako Silanized Slides, Kode S3003, SuperFrost Plus eller poly-l-lysin-belagte objektglass 5. Overdreven sterk spesifikk farging. 5a. Feil fikseringsmetode brukt. 5a Se til at kun godkjente fiksativer og fikseringsmetoder brukes. 5b. Bruk av feil varmekilde for epitophenting, dvs. dampkoker, mikrobølgeovn eller autoklav. 5c. Reagensinkubasjonstider for lange. 5d. Bruk av feil vaskeløsning. 5b. Se til at kun vannbad brukes til epitophentingstrinnet. 5c. Gå gjennom fargeprosedyreinstruksjonene. 5d. Bruk kun Wash Buffer som anbefales for settet. ( ) P04087NO_01_K / s. 48/52

49 6. Svak farging av 1+kontrollglasscellelinje 7. Epitope Retrieval Solution får tåkete utseende ved oppvarming 8. Epitope Retrieval Solution får tåkete utseende ved oppbevaring (før oppvarming) 6a. Feil epitophentingsprotokoll fulgt. 6b. Mangel på reaksjon med Substrate-Chromogen Solution (DAB) 6c. Degradering av kontrollobjektglass 7. Ved oppvarming får løsningen et tåkete utseende 8. Løsningen har blitt lagret på feil måte, eller utløpsdatoen på løsningen er overskredet Magekreft 6a. Neddykk objektglassene i den forhåndsoppvarmede Epitope Retrieval Solution. Bring temperaturen til Epitope Retrieval Solution tilbake til C og forhåndsbehandle i hele 40 minutter. 6b. Se til at den fullstendige 10-minutters inkubasjonstiden brukes. Se til at det kun er én dråpe DAB Chromogen som ble tilført 1 ml DAB Buffered Substrate. 6c. Kontroller settets utløpsdato og oppbevaringsforhold på utsiden av pakningen. 7. Dette er normalt og påvirker ikke fargingen 8. Kontroller settets utløpsdato og oppbevaringsforhold på utsiden av pakningen. Kast Epitope Retrieval Solution. MERK: Hvis problemet ikke kan tilknyttes noen av årsakene ovenfor, eller hvis det foreslåtte tiltaket ikke løser problemet, vennligst ring Dakos tekniske avdeling for ytterligere assistanse. Ekstra informasjon om fargingsteknikker og prøveklargjøring kan finnes i den tidligere henviste Håndboken (19) (tilgjengelig fra Dako), Atlas of Immunohistology (30) og Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis (31). ( ) P04087NO_01_K / s. 49/52

50 Referanser 1. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao Y-C, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985;230: King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985;229: Semba K, Kamata N, Toyoshima K, Yamamoto T. A v-erbb-related protooncogene, c-erbb-2, is distinct from the c-erbb-1/epidermal growth factor-receptor gene and is amplified in a human salivary gland adenocarcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 1985;82: Yamamoto T, Ikawa S, Akiyama T, Semba K, Nomura N, Miyajima N, et al. Similarity of protein encoded by the human c-erb-b-2 gene to epidermal growth factor receptor. Nature 1986;319: Schechter AL, Hung M-C, Vaidyanathan L, Weinberg RA, Yang-Feng TL, Francke U, et al. The neu gene: an erbb-homologous gene distinct from and unlinked to the gene encoding the EGF receptor. Science 1985;229: Bargmann CI, Hung M-C, Weinberg RA. The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor-related protein. Nature 1986;319: Natali PG, Nicotra MR, Bigotti A, Venturo I, Slamon DJ, Fendly BM, et al. Expression of the p185 encoded by HER2 oncogene in normal and transformed human tissues. Int J Cancer 1990;45: Press MF, Cordon-Cardo C, Slamon DJ. Expression of the HER-2/neu proto-oncogene in normal human adult and fetal tissues. Oncogene 1990;5: Lonardo F, Di Marco E, King CR, Pierce JH, Segatto O, Aaronson SA, et al. The normal erbb-2 product is an atypical receptor-like tyrosine kinase with constitutive activity in the absence of ligand. New Biologist 1990;2: Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JBB, Henner D, Wong WLT, et al. Humanization of an anti-p185 HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89: Hudziak RM, Lewis GD, Winget M, Fendly BM, Shepard HM, Ullrich A. p185 HER2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in vitro and sensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor. Mol Cell Biol 1989;9: Lewis GD, Figari I, Fendly B, Wong WL, Carter P, Gorman C, et al. Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185 HER2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 1993;37: Baselga J, Norton L, Albanell J, Kim Y-M, Mendelsohn J. Recombinant humanized anti-her2 antibody (Herceptin ) enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenografts. Cancer Res 1998;58: a. Medical Laboratories Particular requirements for quality and competence, ISO 15189:2003. b. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57CFR7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Company; Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory & practice. New York: Pergamon Press; Lundgaard Hansen B, Winther H, Moller K. Excessive section drying of breast cancer tissue prior to deparaffinisation and antigen retrieval causes a loss in HER2 immunoreactivity, Immunocytochemistry 2008;6, DakoCytomation California Inc., Data on file. 19. Key M. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Fifth Edition. Dako, Carpinteria, California; Leong AS-Y, Milios J, Leong FJ. Epitope retrieval with microwaves. A comparison of citrate buffer and EDTA with three commercial retrieval solutions. Appl Immunohistochem 1996;4: Procedures for decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides, Department of Health, Education, and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD, Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. Center for Disease Control Manual Guide: Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA, April 30, Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN ]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A ( ) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA; ( ) P04087NO_01_K / s. 50/52

51 25. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, et al. Special report: quality control in immunohistochemistry. Am J Clin Pathol 1989;92: Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase: Part I. The technique and its pitfalls. Lab Med 1983;14: Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980;73: Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Press MF, Hung G, Godolphin W, Slamon DJ. Sensitivity of HER-2/neu antibodies in archival tissue samples: potential source of error in immunohistochemical studies of oncogene expression. Cancer Res 1994;54: Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. In: Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; 1986: Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; Jørgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010;78: Tanner M, Hollmén M, Junttila TT, Kapanen AI, Tomola S, SoiniY et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase II alpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16: Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005; 27: Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mor K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007; 59: Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh DY, Im S-A, Lee D et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008; 32: Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-esophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomized controlled trial. Lancet Bang Y, Chung J, Xu J, Lordick F, Sawaki A, Lipatov O et al. Pathological features of advanced Gastric Cancer (GC): Relationship to human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) positivity in the global screening programme of the ToGA trial. J Clin Oncol 2009; 27:15s (suppl; abstr 4556). 39. Van Cutsem E, Kang YK, Chung HC, Shen L, Sawaki A, Lordick F, et al. Efficacy results from the ToGA trial: a phase III study of trastuzumab added to standard chemotherapy in first-line human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-positive advanced gastric cancer. (presentation ASCO 2009). 40. Hofmann M, Stoss O, Shi D, Büttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopath 2008;52: ( ) P04087NO_01_K / s. 51/52

52 Forklaring av symboler Katalognummer Temperaturbegrensning Lotnummer GHS-faresymbol (se avsnittet om forholdsregler) In vitro diagnostisk medisinsk utstyr Knuselig. Må behandles med forsiktighet Brukes innen GHS-faresymbol (se avsnittet om forholdsregler) Se bruksanvisningen Inneholder tilstrekkelig for <n> tester Produsent Produsert av Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Danmark Tel Fax Forhandlet i USA av Dako North America, Inc Via Real Carpinteria, California 93013, USA Tel. 805/ Gratis: 800/ Bestillingsinformasjon Tel. 800/ Faks 805/ Tekniske tjenester: Tel. 800/ HercepTest og Herceptin er varemerker som tilhører Genentech, Inc. underlagt lisenser som holdes av Dako Denmark A/S og F. Hoffmann-La Roche Ltd. ( ) P04087NO_01_K / s. 52/52