HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)

Transkript

1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Kode GM utgave HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er en direkte fluorescerende in situhybridiseringsanalyse (FISH) som er utformet for kvantitativ påvisning av HER2-genamplifikasjon i formalinfikserte, parafininnstøpte (FFPE) prøver av brystkreftvev og FFPE-prøver fra pasienter med metastatisk gastrisk adenokarsinom eller adenokarsinom i gastroøsofageal overgang. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) indikeres som et tillegg til HercepTest i bedømmelsen av pasienter som det vurderes Herceptin -behandling for. Flasken inneholder tilstrekkelig reagens til 20 tester. Tilleggsreagenser for bruk med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): Kode Produktnavn GM300 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) GM301 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) GM302 ISH Pepsin (Dako Omnis) GM303 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) GM304 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 1/54

2 Innholdsfortegnelse Side Tiltenkt bruk... 3 Prosedyreprinsipp bryst... 4 Reagenser bryst... 5 Forholdsregler bryst... 6 Lagring bryst... 6 Prøveklargjøring bryst... 7 BRUKSANVISNING bryst... 8 A. Reagensklargjøring bryst... 8 B. Fargingsprosedyre bryst Kvalitetskontroll bryst Tolkning av farging bryst Begrensninger bryst Ytelsesegenskaper bryst Feilsøking bryst Tillegg 1 bryst Tillegg 2 Bryst Sammendrag og forklaring gastrisk Prosedyreprinsipp gastrisk Reagenser gastrisk Forholdsregler gastrisk Lagring gastrisk Prøveklargjøring gastrisk BRUKSANVISNING gastrisk A. Reagensklargjøring gastrisk B. Fargingsprosedyre gastrisk Kvalitetskontroll gastrisk Tolkning av farging gastrisk Begrensninger gastrisk Metodeegenskaper gastrisk Feilsøking gastrisk Tillegg 3 gastrisk Tillegg 4 Gastrisk Tillegg 5 Gastrisk Referanser Symbolforklaringer ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 2/54

3 Tiltenkt bruk Til in vitro-diagnostisk bruk. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er hybridiseringsproben for den automatiserte, direkte analysen av fluorescerende in situ-hybridisering på Dako Omnis-instrumenter og er, sammen med tilleggsreagensenheter, utformet for kvantitativ påvisning av HER2-genamplifikasjon i formalinfikserte, parafininnstøpte (FFPE) brystkreftvevsprøver og FFPE-prøver fra pasienter med adenokarsinom i magen, inkludert gastroøsofageal overgang. HER2 IQFISH pharmdx indikeres som et tillegg til HercepTest i bedømmelsen av pasienter som det vurderes Herceptin -behandling (trastuzumab) for (se pakningsvedlegg for Herceptin ). Resultater fra HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er ment for bruk som supplement til den klinikopatologiske informasjonen som for tiden brukes til å beregne prognose i fase II hos nodepositive brystkreftpasienter. Adenokarsinom med gastrisk overgang eller gastroøsofageal overgang kalles også magekreft i dette dokumentet. For bruksområdet brystkreft, se side For bruksområdet magekreft henvises det til side Viktig: Vær oppmerksom på forskjeller for brystkreftvev og magekreftvev, spesielt i tolkningen av fargingsseksjoner ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 3/54

4 Brystkreft Sammendrag og forklaring bryst Det humane HER2-genet (kalles også ERBB2 og NEU) befinner seg på kromosom 17 og koder HER2-proteinet eller p185 HER2. HER2-proteinet er en membranreseptor-tyrosinkinase med homologi til den epidermiske vekstfaktorreseptoren (EGFR eller HER1) (1-2). HER2-genet finnes i to kopier i alle normale diploide celler. I en fraksjon av pasienter med brystkreft amplifiseres HER2-genet som en del av prosessen ved malign transformasjon og tumorprogresjon (3-8). HER2-genamplifikasjonen fører generelt til overuttrykk av HER2-proteinet på overflaten av brystkreftceller (9). Amplifikasjon av HER2-genet og/eller overuttrykk av dets protein har blitt demonstrert i % av brystkrefttilfellene (10). Denne oppreguleringen er forbundet med dårlig prognose, økt risiko for tilbakevending samt forkortet overlevelse. Flere studier har vist at HER2-status korrelerer med sensitivitet eller resistens overfor bestemte kjemoterapiregimer (11). Demonstrasjon av høyt HER2-proteinoveruttrykk eller HER2 -genamplifikasjon er avgjørende for å begynne terapi med Herceptin, et monoklonalt antistoff for HER2-protein. Kliniske undersøkelser har vist at pasienter med tumorer som har høyt overuttrykk av HER2-protein og/eller amplifikasjon av HER2-genet, har størst fordel av Herceptin (12). Dette produktet (HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)) er en IQISH-probeblanding for automatisert, direkte FISH som påviser HER2-genamplifikasjon. Dette produktet skal brukes sammen med de angitte tilleggsreagensene i Dako Omnis og er avledet fra den manuelt utførte HER2-genamplifikasjonsanalysen, HER2 IQFISH pharmdx, kode K5731. Prosedyreprinsipp bryst HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er en IQISH-probeblanding som består av en blanding av Texas Red-merkede DNA-prober som dekker en 218 kb-region, inkludert HER2-genet på kromosom 17, og en blanding av fluoresceinmerkede peptidnukleinsyre (PNA)(13)-prober som retter seg mot den sentromeriske regionen av kromosom 17 (CEN-17). Den spesifikke hybridiseringen til de to målene fører til dannelse av et tydelig, rødt fluorescenssignal ved hvert HER2-genlocus og et tydelig, grønt fluorescenssignal ved alle kromosom 17-sentromerer. Vurdering av HER2-genamplifikasjon ved bruk av HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er en helautomatisert metode i Dako Omnis-instrumentet. Det kan velges tre ulike, validerte HER2 FISH-fargingsprotokoller i programvaren for Dako Link Omnis Workstation. Protokollene skiller seg bare fra hverandre i pepsinnedbrytningstid. Derfor kan det velges pepsinnedbrytning i 10 minutter (den korte protokollen), 15 minutter (den middels lange protokollen) eller 20 minutter (den lange protokollen) (mer informasjon nedenfor). Den middels lange protokollen anbefales for innledende analyse. Etter farging i Dako Omnis monteres prøvene med Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) med 4',6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) og dekkglass. Ved bruk av et fluorescensmikroskop som er utstyrt med de nødvendige filtrene (se tillegg 2), lokaliseres tumorceller, og de røde (HER2) og grønne (CEN-17) signalene telles. Deretter beregnes HER2/CEN-17-forholdet. Normale celler i den analyserte vevsseksjonen fungerer som en intern, positiv fargingskontroll. Se avsnittet Tolkning av farging for mer informasjon. Se brukerhåndboken/-bøkene for Dako Omnis for detaljert informasjon om innlasting og fjerning av objektglass, ISH-lokk (Dako Omnis), reagenser, volumvæsker og avfall. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 4/54

5 Brystkreft Reagenser bryst HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og tilleggsreagenser kan bestilles separat som enkeltreagenser. Materialer som følger med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): 1,6 ml, bruksklar blanding av Texas Red-merkede HER2 DNA-prober og fluoresceinmerkede CEN-17 PNA-prober, leveres i IQISHhybridiseringsbuffer. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) sendes på tørris. For å stadfeste at reagensen ikke har blitt utsatt for høye temperaturer under transport, skal det fortsatt være igjen tørris ved mottak. Reagenshetteglass med tint innhold skal alltid lagres og håndteres i stående stilling. Reagenshetteglasset inneholder en gullbelagt metallkule for blanding ved hjelp av Dako Omnis Mixing Device (se brukerhåndboken for Dako Omnis Mixing Device). Det er viktig at reagensen er grundig blandet før den lastes inn i Dako Omnis. Materialer som er nødvendige, men som ikke følger med Tilleggsreagenser Følgende reagenser må finnes i Dako Omnis-instrumentet for analyse av HER2-genamplifikasjon med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis): 175 ml, konsentrert 20x, skal fortynnes 1 : 20 i en Dako Omnis 3,5 l volumflaske (kode GC109). Produktet inneholder et antimikrobielt middel og en inert grønnfarge for enkel identifikasjon og brukervennlighet. ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis): 14 ml 96 % etanol (klar til bruk). ISH Pepsin (Dako Omnis): 7 ml Pepsin A-løsning (klar til bruk), ph 2,0, inneholder stabilisator og et antimikrobielt middel. Pepsin sendes på tørris. For å stadfeste at reagensen ikke har blitt utsatt for høye temperaturer under transport, skal man kontrollere at det fortsatt er tørris igjen ved mottak. ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis): 175 ml buffer av salt-natriumcitratbuffer konsentrert 20x, skal fortynnes 1 : 20 i en Dako Omnis 3,5 l volumflaske (kode GC109). Produktet inneholder et antimikrobielt middel og en inert gulfarge for enkel identifikasjon og brukervennlighet. Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis): 0,8 ml fluorescerende monteringsmedium (klart til bruk) med DAPI. Selv om reagensene ovenfor ikke leveres med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), er de beskrevet kort nedenfor. Se bruksanvisningen for hver enhet for mer informasjon. Tilleggsreagenser og -enheter Dako Omnis, kode GI100 Wash Buffer (20x) (Dako Omnis), kode GC807 Clearify, kode GC810 Dako Omnis Mixing Device, kode GC116 ISH-lokk, kode GC102 ISH Cleaning Solution, kode GC207 Glassdekkglass for montering (24 x 50 mm) Se de grunnleggende og avanserte brukerhåndbøkene for Dako Omnis angående bruk av tilleggsreagenser og -enheter. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 5/54

6 Brystkreft Mikroskoputstyr og -tilbehør Filtre for fluorescensmikroskop: DAPI- og FITC/Texas Red-dobbeltfilter eller FITC- og Texas Red-monofiltre se tillegg 2 for mer informasjon. Bruk av DAPI-filter ved høy forstørrelse påvirker signalintensitet negativt. Unngå lange eksponeringstider. Det bør brukes et fluorescensmikroskop med en kvikksølvlampe på 100 watt. Det anbefales ikke å bruke andre lyskilder med disse filtrene. Objektglassmappe på mikroskopet (pappbrett for 20 objektglass med hengslet deksel eller lignende). Forholdsregler bryst 1. Til in vitro-diagnostisk bruk. 2. For profesjonelle brukere. 3. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) inneholder 10 <25 % etylenkarbonat og 3 <5 % sodium chloride. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er merket: Advarsel H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Gir alvorlig øyeirritasjon. Bruk vernebriller eller ansiktsvern. Vask hendene grundig etter håndtering. VED KONTAKT MED ØYNENE: Skyll forsiktig med vann i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser dersom dette enkelt lar seg gjøre. Fortsett skyllingen. Som en generell regel har ikke personer under 18 år tillatelse til å arbeide med dette produktet. Brukerne må instrueres nøye i riktig arbeidsprosedyre, de farlige egenskapene til produktet og de nødvendige sikkerhetsinstruksjonene. Se sikkerhetsdatabladet hvis du vil ha ytterligere informasjon. 4. Vevsprøver, før og etter fiksering, og alle materialer som eksponeres for dem, skal håndteres som om de kan overføre smitte, og kasseres under relevante forholdsregler (14). Pipetter aldri reagenser med munnen, og unngå at reagenser og prøver kommer i kontakt med hud eller slimhinner. Hvis reagenser kommer i kontakt med følsomme områder, må det vaskes med rikelige mengder vann. 5. Minimer mikrobiell kontaminasjon av reagensen for å unngå feilaktige resultater. 6. Andre vevsfikseringsmetoder og prøvetykkelser enn de som er spesifisert, kan påvirke vevsmorfologi og/eller signalintensitet. 7. Reagenser er fortynnet optimalt. Ytterligere fortynning kan føre til tap av ytelse. 8. Bruk egnet personlig verneutstyr for å unngå kontakt med øyne og hud. Se sikkerhetsdatabladet (HMS-databladet) for ytterligere informasjon. 9. Ubrukt løsning skal kasseres i henhold til lokale, nasjonale og europeiske forskrifter. Lagring bryst Lagre HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ved < 18 C ( 18 til 25 C anbefales) og mørkt. Sørg for at glasset med tint reagens alltid er i stående stilling. Reagensen kan fryses og tines opptil ti ganger uten at det påvirker ytelsen. Ikke oppbevar denne komponenten ved romtemperatur. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og tilleggsreagensene ISH pepsin (Dako Omnis) og Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) kan påvirkes negativt av varme. Ikke oppbevar disse komponentene ved romtemperatur. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 6/54

7 Brystkreft HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og tilleggsreagensen Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) kan påvirkes negativt av sterkt lys. Ikke oppbevar disse komponentene eller utfør analyse i sterkt lys, for eksempel direkte sollys. Lagre tilleggsreagensene ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis), ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) og Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) mørkt ved 2 8 C. Lagre ISH Pep sin (Dako Omnis) ved 18 8 C. Hetteglasslokket og vippelokket skal være lukket for alle reagenser under lagring. Fortynningsløsninger (ISH Stringent Wash Buffer-arbeidsløsning og ISH Pre-Treatment Solutionarbeidsløsning) kan lagres ved 2 8 C i 30 dager. Ikke bruk reagenser etter utløpsdatoen som er stemplet på reagensbeholderen. Under lagring skal reagenslokket, også vippelokket, være lukket. Hvis reagenser oppbevares under andre forhold enn de som er angitt, må brukeren validere reagensytelsen (15). Det er ingen tydelige tegn på at dette produktet er ustabilt. Derfor er det viktig å evaluere normale celler i det analyserte vevssnittet. Kontakt Dakos tekniske tjenester hvis det observeres et uventet fluorescensmønster som ikke kan forklares, og det mistenkes et problem med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) eller tilleggsreagensene. Stabilitet i Dako Omnis-instrumentet Stabiliteten til HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og tilleggsreagensene ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) og ISH Pepsin (Dako Omnis) i instrumentet er 80 timer. Stabiliteten til fortynnet ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) og ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) i instrumentet er 7 dager. Gjenværende intern stabilitet spores av Dako Omnisprogramvaren. Bruk av utløpte reagenser vil føre til en advarsel i Dako Omnis-instrumentet: Alle objektglass som er farget med den utløpte reagensen, endrer status til mistenkelig, og objektglassloggen på arbeidsstasjonen viser at en utløpt reagens har blitt brukt. Prøveklargjøring bryst Prøver fra biopsier, eksisjoner eller reseksjoner må håndteres slik at vevet bevares for FISHanalyse. Standardmetoder for vevsbehandling ved immunocytokjemisk farging skal brukes på alle prøver (16). Parafininnstøpte vevssnitt Kun vevssnitt som er preservert i nøytral, bufret formalin og parafininnstøpt, egner seg for bruk. Prøver skal f.eks. være blokkert til en tykkelse på 3 eller 4 mm og fiksert i timer i nøytral, bufret formalin. Vevet dehydreres deretter i en gradert serie med etanol og xylen, etterfulgt av infiltrering med smeltet parafin som holdes på maksimalt 60 C. Riktig fiksert og innstøpt vev holder seg ubegrenset før oppdeling og montering på objektglass hvis det lagres på et kjølig sted (15 25 C) (16-17). Andre fiksativer egner seg ikke. Vevsprøver skal skjæres i snitt på 4 6 µm. Objektglassene som kreves for analyse av HER2-genamplifikasjon og verifisering av tilstedeværelsen av en tumor, skal klargjøres samtidig. Det anbefales minst to seriesnitt, ett snitt for tilstedeværelse av tumor farget med hematoksylin og eosin (H&E-farging), og ett snitt for analyse av HER2-genamplifikasjon. Det anbefales at vevssnitt monteres på Dako FLEX IHC Microscope Slides, kode K8020. Superfrost Plus-objektglass (Thermo Fischer Scientific, J1800AMNZ) kan også brukes. Kontroller at objektglassene ikke har passert utløpsdatoen. Prøver skal analyseres innen seks måneder etter snitting ved lagring ved 2 25 C. MERK: Vevsprøvene må plasseres på glasset innenfor det definerte området for farging av objektglass. Informasjon om målene til området for farging av objektglass finnes i den grunnleggende brukerhåndboken for Dako Omnis. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 7/54

8 BRUKSANVISNING bryst Brystkreft A. Reagensklargjøring bryst A.1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-hetteglasset inneholder en gullbelagt metallkule for blanding. Reagensen må tines og blandes grundig før hetteglasset lastes inn i Dako Omnis, siden den skiller seg under frysing. Bruk Dako Omnis Mixing Device for probeblanding. Følg prosedyren nedenfor for probeblanding på Dako Omnis Mixing Device, og se brukerhåndboken for blandeapparatet for mer informasjon. 1. Ta HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-hetteglasset ut av fryseren. 2. Last hetteglasset på Dako Omnis Mixing Device. 3. Koble til blandeapparatet, og kontroller at det grønne statuslyset er på Velg programmet Thaw + mix (Tin + bland). Viktig: Hetteglass lagret under 25 C skal tines (rett) før glasset lastes på Dako Omnis Mixing Device, og man skal bruke programmet Mix (Bland). 4. Fjern hetteglasset fra blandeapparatet. 5. Åpne vippelokket, bøy det bakover, og klikk det inn i sikkerhetsposisjonen (se den grunnleggende brukerhåndboken for Dako Omnis for mer informasjon). 6. Sett umiddelbart hetteglasset inn i Reagent Storage Module (Modul for reagensoppbevaring) på Dako Omnis-instrumentet. Hvis funksjonen for kontinuerlig reagenslasting brukes under fargingskjøringen, må man sørge for at det går minst ti minutter fra blanding til aspirasjon av hetteglasset på Dako Omnis. Proben HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) kan tines på nytt og brukes opptil ti ganger. Bland alltid probeblandingen HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) rett før den lastes på instrumentet. Skal ikke ristes. Den totale stabiliteten til ISH HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er 80 timer ved lagring i Reagent Storage Module (Modul for reagensoppbevaring) på Dako Omnis. Gjenværende intern stabilitet spores av Dako Omnis-programvaren (se ovenfor). HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) skal etter fjerning fra Dako Omnis umiddelbart overføres til < 18 C ( 18 til 25 C anbefales). A.2 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) Klargjør en arbeidsløsning ved å fortynne ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis)- konsentratet 1 : 20 på følgende måte: 1. Fyll en volumflaske på 3,5 liter fra Dako Omnis, merket PTB (blå etikett), med avionisert vann opp til påfyllingslinjen (3,325 l). Sørg for å plassere volumflasken på en horisontal overflate før påfyllingen. 2. Tøm én ISH Pre-Treatment Solution (20x)-konsentratflaske (Dako Omnis) på 175 ml i volumflasken. 3. Flytt den avtakbare etiketten fra konsentratflasken til volumflasken. Sett på lokket til volumflasken, og snu volumflasken forsiktig opp ned 2 3 ganger. 4. Identifiser reagensen ved hjelp av den håndholdte Dako Omnis-strekkodeskanneren (skann den avtakbare etiketten og volumflasken). 5. Last volumflasken inn i Dako Omnis-instrumentet umiddelbart. Den fortynnede løsningen kan brukes innen sju dager når den lagres internt i Dako Omnis. Gjenværende intern stabilitet spores av Dako Omnis-programvaren (se ovenfor). Ubrukt fortynnet løsning kan lagres ved 2 8 C i 30 dager. Etter kal d lagring må den fortynnede løsningen nå minst 18 C før den lastes på Dako Omnis. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 8/54

9 MERK: Kast fortynnet løsning som ser grumsete ut. Brystkreft A.3 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Forbered en arbeidsløsning ved å fortynne ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) - konsentratet 1 : 20 på følgende måte: 1. Fyll en volumflaske på 3,5 liter fra Dako Omnis, merket PTB (blå etikett), med avionisert vann opp til påfyllingslinjen (3,325 l). Sørg for å plassere volumflasken på en horisontal overflate før påfyllingen. 2. Tøm én ISH Stringent Wash Buffer (20x)-konsentratflaske (Dako Omnis) på volumflasken. 3. Flytt den avtakbare etiketten fra konsentratflasken til volumflasken. Sett på lokket til volumflasken, og snu volumflasken forsiktig opp ned 2 3 ganger. 4. Identifiser reagensen ved hjelp av den håndholdte Dako Omnis-strekkodeskanneren (skann den avtakbare etiketten og deretter volumflasken). 5. Last volumflasken i Dako Omnis-instrumentet umiddelbart. Den fortynnede løsningen kan brukes innen sju dager når den lagres internt i Dako Omnis. Gjenværende intern stabilitet spores av Dako Omnis-programvaren (se ovenfor). Brukt fortynnet løsning kan lagres ved 2 8 C i opptil 30 dager. Etter kald lagring må den fortynnede løsningen nå minst 18 C før den lastes på Dako Omnis. MERK: Kast fortynnet løsning som ser grumsete ut. A.4 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) er en reagens som er klar til bruk. Før lasting på Dako Omnis, åpner man hetteglassets vippelokk, bøyer det bakover og klikker det på plass i sikkerhetsposisjonen. Den totale stabiliteten til ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) i instrumentet er 80 timer ved lagring i Reagent Storage Module (Modul for reagensoppbevaring) på Dako Omnis. Gjenværende intern stabilitet spores av Dako Omnis-programvaren (se ovenfor). Etter kjøringen kan ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) overføres til lagringstemperatur (2 8 C) for at den interne stabiliteten skal bevares. A.5 ISH Pepsin (Dako Omnis) ISH Pepsin (Dako Omnis) er en reagens som er klar til bruk. Før lasting på Dako Omnis, må man forsikre seg om at reagensen er tint. Deretter åpner man hetteglassets vippelokk, bøyer det bakover og klikker det på plass i sikkerhetsposisjonen. Den totale stabiliteten til ISH Pepsin (Dako Omnis) i instrumentet er 80 timer ved lagring i Reagent Storage Module (Modul for reagensoppbevaring) på Dako Omnis. Gjenværende intern stabilitet spores av Dako Omnis-programvaren (se ovenfor). Etter kjøringen bør ISH Pepsin (Dako Omnis) overføres til lagringstemperatur ( 18 8 C) for at stabiliteten i instrumentet skal bevares. A.6 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) er et monteringsmedium som er klart til bruk. stabilitet utenfor Dako Omnis-instrumentet. Overfør Fluorescence Mounting Medium til lagringstemperatur (2 8 C) umiddelbart etter bruk. A.7 Ytterligere tilbehør Følgende tilbehør bør også lastes inn i Dako Omnis: avionisert vann, fortynnet Wash Buffer 20x (Dako Omnis), kode GC807, Clearify, kode GC810, ISH Cleaning Solution, kode GC207 og ISH-lokk (Dako Omnis), kode GC102 som angitt i brukerhåndboken/-bøkene for Dako Omnis. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 9/54

10 Brystkreft B. Fargingsprosedyre bryst B.1 Prosedyremerknader HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er hybridiseringsproben for den automatiserte, direkte analysen av fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) i Dako Omnis-instrumentet og er, sammen med tilleggsreagensene GM300, GM301, GM302, GM303 og GM304 (GM304 utenfor instrumentet), lagd for kvantitativ påvisning av HER2-genamplifikasjon. Brukeren skal lese alle instruksjonene nøye og gjøre seg kjent med alle komponentene og deres forholdsregler før bruk. Den automatiserte FISH-fargingsprosedyren på Dako Omnis omfatter avparafinisering av vevssnitt, målhenting, pepsinnedbrytning, hybridisering og grundig vasking. Objektglassene overføres til tørrutlastingsstasjonen. Alle protokolltrinn er forhåndsprogrammert i Dako Omnisprogramvaren. Se brukerhåndboken/-bøkene for Dako Omnis for instruksjoner om lasting av objektglass, ISHlokk, reagenser osv. Tre validerte HER2 IQFISH-protokoller: HER2 IQFISH Pepsin Short, HER2 IQFISH Pepsin Medium og HER2 IQFISH Pepsin Long, som bare skiller seg fra hverandre når det gjelder pepsinnedbrytningstid, er forhåndsprogrammert i Dako Omnis-programvaren og kan velges for hvert av de fem objektglassene i objektglasstativet. Dette muliggjør optimalisering av vevsnedbrytningen, som kan avhenge av forhold før analysen. Protokollen HER2 IQFISH Pepsin Medium anses for å være standardprotokollen. De ulike fargingsprotokollene kan vises på Dako Link Omnis Workstation. B.2. Prosedyre før farging 1. Velg HER2 IQFISH-protokollen som skal brukes for hvert objektglass, fra Dako Link Omnis Workstation-programvaren, under IQFISH-protokoller. 2. Skriv ut objektglassetiketter og fest dem på objektglassene. 3. Plasser objektglassene i objektglasstativet. Se den grunnleggende brukerhåndboken for Dako Omnis for mer informasjon. Et objektglasstativ kan inneholde fra ett til fem objektglass. Det anbefales at det farges minst to objektglass i en HER2 IQFISH-fargingskjøring. 4. Plasser objektglasstativet på Dako Omnis. 5. Plasser ISH-lokk (ett ISH-lokk per objektglasstativ) på Dako Omnis. 6. Kontroller at det er volumflasker i Dako Omnis-instrumentet, og at de er registrert av instrumentet. Volumflaskevæsker: Clearify (klaringsmiddel), fortynnet ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis), fortynnet ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) og fortynnet Wash Buffer (Dako Omnis). 7. Last ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) og ISH Pepsin (Dako Omnis), den nylig blandede HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og ISH Cleaning Solution inn i Reagent Storage Module (Modul for reagensoppbevaring). Sørg for at hetteglassenes vippekorker er åpne. 8. Følg instruksjonene på berøringsskjermen, og trykk på Done (Ferdig) for å starte fargingsprosedyren. B.3. Fargingsprosedyre HER2 IQFISH-fargingsprosedyren på Dako Omnis-instrumentet (oppsummert i tabell 1) kan overvåkes på Dako Link Omnis Workstation: Tabell 1. Forenklet oversikt over HER2 IQFISH-fargingsprotokolltrinnene. Trinn Reagens Tid og temperatur Dewax (Avvoksing) Target retrieval (Målhenting) Clearify (klaringsmiddel) 10 minutter, 38 C ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) Wash (Vask) ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) 15 minutter, 97 C 2 x 3 minutter, 32 C ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 10/54

11 Brystkreft Digestion (Nedbrytning)* ISH Pepsin (Dako Omnis) 10, 15 eller 20 minutter Drying (Tørking) 15 minutter, 45 C Denaturation (Denaturering) Hybridization (Hybridisering) Stringent Wash (Grundig vask) HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) 10 minutter, 66 C 75 minutter, 45 C 10 minutter, 61 C *Det kan velges tre validerte pepsinnedbrytningstider ved bruk av HER2 IQFISH-protokollene ovenfor. Hvis det ikke skal utføres flere ISH-farginger i umiddelbar fremtid, skal alle reagensene overføres til de anbefalte lagringstemperaturene. B.4. Prosedyre etter farging Fjern objektglassene, og påfør opptil 30 µl Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) med DAPI i målområdet på objektglasset. Vevssnittet må være helt dekket av Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis). Legg på et glassdekkglass. MERKNAD: Objektglassene kan avleses etter 15 minutter eller innen 7 dager etter montering. Det oppstår imidlertid blekning hvis objektglassene utsettes for lys eller høye temperaturer. Oppbevar objektglassene på et mørkt sted ved 18 8 C for å minimere blekning. Kvalitetskontroll bryst 1. Signalene må være lyse, tydelige og enkle å evaluere. 2. Normale celler muliggjør en intern kontroll av fargingskjøringen. Normale celler skal ha 1 2 klart synlige, grønne signaler som indikerer at hybridiseringen av CEN-17 PNA-proben til den sentromeriske regionen på kromosom 17 var vellykket. Normale celler skal også ha 1 2 klart synlige, røde signaler som indikerer at hybridiseringen av HER2 DNA-proben til HER2 -genet/-genene var vellykket. På grunn av vevsoppdeling vil noen normale celler ha mindre enn de forventede to signalene av hver farge. At det ikke oppdages signaler i normale celler, indikerer analysefeil, og resultatene skal anses som ugyldige. 3. Nukleær morfologi må være intakt ved evaluering med et DAPI-filter. Mange fantomceller og en generelt dårlig nukleær morfologi indikerer for kraftig nedbrytning av prøven, noe som fører til tap av signalfragmentering. Slike prøver må anses som ugyldige. 4. Minst 20 tumorceller må kunne vurderes. 5. Forskjeller i vevsfiksering, -behandling og -innstøping i brukerens laboratorium kan føre til variasjoner i resultatene og gjøre det nødvendig med regelmessig evaluering av de interne kontrollene. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 11/54

12 Brystkreft Tolkning av farging bryst Vev som kan vurderes Kun prøver fra pasienter med invasivt karsinom skal testes. I tilfeller med karsinom in situ og invasivt karsinom i samme prøve skal kun den invasive komponenten telles. Unngå områder med nekrose og områder der de nukleære grensene er tvetydige. Ikke inkluder kjerner som krever subjektiv bedømmelse. Hopp over kjerner med svak signalintensitet og ikke-spesifikk eller høy bakgrunn. Signaltelling Finn tumoren innenfor konteksten til det H&E-fargede objektglasset, og evaluer det samme området på det FISH-fargede objektglasset. Skann flere områder med tumorceller for å ta høyde for mulig heterogenitet. Velg et område som har god fordeling av cellekjerner. Start analysen i øvre venstre kvadrant i det valgte området, skann fra venstre til høyre, og tell antallet signaler innenfor den nukleære grensen for hver evaluerte cellekjerne i samsvar med retningslinjene nedenfor (se også tillegg 2). Flytt fokuset opp og ned for å finne alle signalene i de enkelte cellekjernene. Tell to signaler som har samme størrelse og er atskilt med en avstand som er mindre enn eller lik diameteren til signalet, som kun ett signal. I cellekjerner med høye nivåer av HER2-genamplifikasjon kan HER2-signalene være posisjonert svært nært hverandre og danne en signalgruppe. I slike tilfeller kan ikke antallet HER2-signaler telles, men de må beregnes. Det må vies spesiell oppmerksomhet til de grønne signalene, siden grupper av HER2-signaler kan dekke de grønne signalene, slik at det blir umulig å se dem. I tvilstilfeller skal de grønne signalene kontrolleres med et spesifikt FITCfilter. Ikke tell cellekjerner uten signaler eller med signaler med kun én farge. Tell bare cellekjerner med ett eller flere FISH-signaler av hver farge. Veiledning i signaltelling 1 Skal ikke telles. Cellekjerner overlapper, ikke alle cellekjerneområder er synlige. 2 To grønne signaler, ikke tell cellekjerner med signaler i kun én farge. 3 Tell som 3 grønne og 12 røde signaler (gruppeberegning). 4 Tell som 1 grønt og 1 rødt signal. To signaler som har samme størrelse og er atskilt med en avstand som er mindre enn eller lik diameteren til ett signal, telles som ett. 5 Ikke tell (over- eller undernedbrutte kjerner). eller Manglende signaler i midten av cellekjerner (smultringformede kjerner). 6 Tell som 2 grønne og 3 røde signaler. To signaler som har samme størrelse og er atskilt med en avstand som er mindre enn eller lik diameteren til ett signal, telles som ett. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 12/54

13 Brystkreft 7 Tell som 1 grønt og 5 røde signaler. 8 Tell som 3 grønne (1 grønt ute av fokus) og 3 røde signaler. 9 Gruppe med røde signaler skjuler grønne signaler, kontroller de grønne signalene med et spesifikt FITCfilter, eller ikke tell dem. Registrer antallene i en tabell som vist i tillegg 1. Tell 20 cellekjerner per vevsprøve, fra tydelige tumorområder hvis det er mulig (18). Beregn HER2/CEN-17-forholdet ved å dele det totale antallet røde HER2-signaler med det totale antallet grønne CEN-17-signaler. Prøver med et HER2/CEN-17-forhold på 2 eller mer skal anses som HER2-genamplifiserte (3, 18-20). Resultater ved eller i nærheten av grensen (1,8 2,2) skal tolkes med forsiktighet. Hvis forholdet ligger i grenseområdet (1,8 2,2), skal det telles ytterligere 20 cellekjerner, og forholdet skal beregnes på nytt for de 40 cellekjernene. I tvilstilfeller skal objektglassprøven telles på nytt. For grensetilfeller er det nødvendig med en konsultasjon mellom patologen og den behandlende legen. Begrensninger bryst 1. Kun for automatisert bruk på Dako Omnis-instrumenter. 2. Det er nødvendig med spesialopplæring for vevsutvelgelse, fiksering og klargjøring av objektglass og for tolkning av IQFISH-farging. Tolkning av HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-farginger skal ikke utføres av personer med fargeblindhet. 3. FISH-resultater er avhengige av håndteringen og behandlingen av vevet før det farges. Uriktig fiksering, vasking, tørking, oppvarming eller snitting eller kontaminasjon fra annet vev eller væsker kan påvirke probehybridiseringen. Inkonsekvente resultater kan skyldes variasjoner i fikserings- og innstøpingsmetoder eller iboende uregelmessigheter i vevet. 4. Ytelsen til HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-analysen har ikke blitt evaluert for brysttumorprøver med mikroforkalkninger. Ytelsesegenskaper bryst Hybridiseringseffektivitet Hybridiseringseffektivitet for HER2 IQFISH pharmdx ble undersøkt ved bruk av 180 formalinfikserte, parafininnstøpte vevssnitt testet på tre studiesteder. Alle de 180 vevssnittene kunne telles i henhold til retningslinjene for produkttelling. Hybridiseringseffektiviteten var 100 %. HER2/CEN-17-forholdene beregnet og brukt i studiene av ytelsesegenskaper, er basert på telling av signaler i 20 cellekjerner ved bruk av retningslinjene for telling gitt i avsnittet Tolkning av farging i denne bruksanvisningen. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 13/54

14 Brystkreft Analytisk sensitivitet Den analytiske sensitiviteten til HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ble undersøkt ved bruk av 20 ulike vevsprøver fra brystkarsinom (10 prøver med amplifisert HER2-genstatus og 10 ikkeamplifiserte prøver). Forholdet mellom antallet HER2-signaler og CEN-17-signaler ble beregnet basert på telling av signaler i 20 cellekjerner i normale celler i vevsprøven. HER2/CEN-17- forholdet for normale celler identifisert i de 20 vevsprøvene fra brystkarsinom, var i området 0,97 1,11. Analytisk spesifisitet HER2 DNA-probene i HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) har blitt sluttsekvensiert og tilordnet for å bekrefte en total dekning på 218 kb, inkludert HER2-genet. CEN-17 PNA-probene i HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) har blitt testet med FISH, enkeltvis og kombinert, for å bekrefte deres spesifikke hybridisering til den sentromeriske regionen til kromosom 17. For å utelukke kryss-hybridisering til andre kromosomer enn kromosom 17, ble det gjennomført studier om metafasespredninger ifølge standard Dako kvalitetskontrollprosedyrer. Totalt 275 metafasespredninger med distinkte signaler ble evaluert for spesifikk hybridisering av HER2 DNA- og CEN-17 PNA-probeblandingene. I alle de 275 tilfellene var hybridiseringen spesifikk for kromosom 17. Det ble ikke observert krysshybridisering til steder på andre kromosomer i noen av de 275 tilfellene. Probespesifisiteten var dermed 100 % (275 av 275). For å måle IQFISH-analysens evne til utelukkende å identifisere målstoffene HER2 og CEN-17 uten interferens fra andre stoffer utførte man studier av vevsprøver fra brystkarsinom gjennom å utelukke HER2-og CEN-17-probene fra hybridiseringsblandingen og bare bruke hybridiseringsbufferen. Totalt ble det evaluert 20 prøver for tilstedeværelse av signaler som ikke var relatert til probeblandingen. Det ble ikke observert påvisning av andre kromosommål med nært relaterte stoffer i noen av de 20 prøvene. Robusthetsstudier Robustheten til HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-analysen ble testet ved å variere PNAprobekonsentrasjon, målhentingstid, pepsininkubasjonstid, nedbrytningstid, hybridiseringstid og tid og temperatur for stringensvask. De ulike parametrene ble testet på fem FFPE-vevsprøver fra brystkreft (både amplifiserte og ikke-amplifiserte vevsprøver var representert). Alle parametre ble testet både under og over standard protokollinnstillinger, med unntak av PNAprobekonsentrasjon og temperatur for stringensvask, der den standard protokollinnstillingen var inkludert i oppsettet. Testparametrene var: PNA-probekonsentrasjon: Testet ved 100 % og +/ 17 %. Målhentingstid: Testet ved 13 minutter og 45 sekunder og 16 minutter og 15 sekunder. Pepsininkubasjonstid: Testet ved 14 minutter og 45 sekunder og 16 minutter og 15 sekunder. Nedbrytningstid: Testet ved 9 minutter og 45 sekunder og 10 minutter og 45 sekunder. Hybridiseringstid: Testet ved 70 minutter og 80 minutter. Tid for stringensvask: Testet ved 8 minutter og 45 sekunder og 11 minutter og 15 sekunder. Temp. for stringensvask: Testet ved 59 C, 61 C og 63 C. De tre PNA-probekonsentrasjonene ble vurdert i en fraksjonert eksperimentell design (DOE) (JMP-verktøy, SAS), som ble utført med tolv ulike fargingsprotokoller som angitt i tabell 2. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 14/54

15 Tabell 2. Tolv ulike fargingsprotokoller brukt i robusthetsstudien. Brystkreft Testparameter Robusthetsprotokollnr. Målhentingstid (min) Pepsintid (min) Nedbrytningstid (min) Hybridiseringstid (min) Tid for stringensvask (min) Temp. for stringensvask ( 0 C) PNA-kons. i probeblanding 1 16,25 16,25 9, , % 2 13,75 14,75 10, , % 3 16,25 14,75 9, , % 4 13,75 14,75 10, , % 5 13,75 14,75 9, , % 6 13,75 16,25 10, , % 7 13,75 16,25 10, , % 8 16,25 14,75 9, , % 9 13,75 16,25 9, , % 10 16,25 16,25 10, , % 11 16,25 16,25 10, , % 12 16,25 14,75 10, , % Alle de fem vevsprøvene ble farget med alle de tolv protokollene. Utlesingen for robusthetsstudien var signalintensitet og morfologikvalitet. Alle protokollene produserte farging i alle vevsprøvene (60 totalt) med signaler som var klare, distinkte og enkle å evaluere, og som derfor egnet seg for signaltelling. I tillegg testet man virkningen av vevstykkelse på HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)- analyseresultatene ved å variere snittykkelsen til FFPE-vevsprøver fra brystkreft. Det ble testet totalt fem påfølgende snitt fra fem prøver av humant brystkarsinom med ulike tykkelser (3, 4, 5, 6 og 7 µm) med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Den gjennomsnittlige variasjonskoeffisienten til HER2/CEN-17-forholdet var 5,8 % (området var 4,3 til 7,1 %). ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 15/54

16 Brystkreft Reproduserbarhet Reproduserbarheten fra dag-til-dag og parti-til-parti innen laboratoriet ble testet med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Studien ble utformet som en intern, blindet, randomisert studie av HER2/CEN-17-forhold ved bruk av snitt fra åtte ulike formalinfikserte, parafininnstøpte prøver fra brystkreft med ulike nivåer av HER2-genamplifikasjon. De åtte prøvene hadde vært testet med HercepTest og representerte to prøver med HER2 IHC 0/1+, to prøver med HER2 IHC 2+, to prøver med HER2 IHC 3+ og to prøver med forhåndsbestemt HER2/CEN-17 FISHforhold på mellom 1,5 og 2,5, innhentet ved bruk av HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731). Hver prøve ble farget med tre ulike partier av HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) på fem ikke påfølgende dager. Siden hver kombinasjon ble farget duplisert, ble det behandlet totalt 240 vevsfarginger. Variasjon i forhold mellom dager og partier er illustrert i figur 1. Det ble analysert data ved bruk av Box-Cox-transformasjon via en modell for stokastisk virkning for bestemmelse av homogenitet for datavarians. Den totale variasjonskoeffisienten ble anslått til 4,3 %, og det ble funnet at dag- og partivariasjon bidro med henholdsvis 1,5 og 0 %. Figur 1. HER2/CEN-17-forhold innhentet i en studie av reproduserbarhet innen laboratoriet på HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), inkludert endepunkter for reproduserbarhet fra parti til parti og dag til dag. I tillegg testet man reproduserbarheten fra dag til dag og sted til sted for HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) eksternt i en stratifisert og blindet studie gjennomført på tre steder (et sted i USA og to steder i Europa), på vevssnitt fra tolv ulike formalinfikserte, parafininnstøpte prøver fra brystkreft. Tre prøver var HER2 IHC 0/1+, tre prøver var HER2 IHC 2+, tre prøver var HER2 IHC 3+, og tre prøver hadde forhåndsbestemt HER2/CEN-17 FISH-forhold på mellom 1,5 og 2,5, innhentet ved bruk av HercepTest og HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731). Prøvene ble farget og analysert på studiestedene. Hver prøve ble farget minst fem ganger på fem ikke påfølgende dager og talt av én observatør på hvert sted. 192 snitt ble farget og inkludert i den statistiske analysen. Det ble analysert data ved bruk av Box-Cox-transformasjon, og det ble beregnet varianskomponenter. Den totale variasjonskoeffisienten basert på øvre 95 %- konfidensgrense var 15 %. Figur 2 viser variasjon i HER2/CEN-17-forhold for dag og sted. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 16/54

17 Brystkreft Figur 2. Variabilitetsdiagram over HER2/CEN-17-forhold i ikke-transformerte enheter innhentet i studien av reproduserbarhet fra dag til dag og sted til sted av HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) på vevsprøver fra brystkreft. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-analysen ble testet for reproduserbarhet fra observatør til observatør som en del av den internt utførte metodesammenligningsstudien ved bruk av tre observatører for uavhengige tellinger av de fargede prøvene. Det ble testet reproduserbarhet på 140 ulike prøver av humant brystkarsinom med enten ikke-amplifisert eller amplifisert HER2-genstatus. Det ble analysert data ved bruk av Box-Cox-transformasjon. Den gjennomsnittlige variasjonskoeffisienten fra observatør til observatør var 9 %. Repeterbarhet Man testet repeterbarheten innen laboratoriet for HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) med påfølgende snitt av åtte prøver fra humant brystkarsinom med enten ikkeamplifisert eller amplifisert HER2-genstatus. Det ble testet i duplikater på fem ikke påfølgende dager med tre ulike partier, totalt 240 objektglass (120 dupliserte snitt). Modellen for stokastisk virkning brukt for dataanalyse resulterte i varians som kan tilskrives dager og partier (som indikert i den interne studien av reproduserbarhet). Restvariansen tilsvarer variansen mellom kopier og dermed repeterbarhet. Den øvre 95 %-konfidensgrensen for koeffisienten for repeterbarhet var 4,4 %. Metodesammenligningsstudier Sammenligning av HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-resultater med HER2 IQFISH pharmdx -resultater HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ble sammenlignet med HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731) i en komparativ studie på 140 vevsprøver fra humant brystkarsinom. Prøvene bestod av 77 HER2-ikke-amplifiserte tilfeller og 63 HER2- amplifiserte tilfeller med kjent HercepTest -resultat som vist i tabell 3. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 17/54

18 Tabell 3. Fordeling av prøver basert på HercepTest -resultat og HER2 FISH-resultat (HER2- genstatus), innhentet med HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731). Brystkreft Tabell 4 viser resultater av krysstabuleringen av HER2-genstatus innhentet med de to analysene med beregning av total prosentoverensstemmelse (OPA), positiv prosentoverensstemmelse (PPA) og negativ prosentoverensstemmelse (NPA). Figur 3 viser korrelasjon mellom HER2/CEN-17-forhold ved bruk av de to analysene. Tabell 4. Krysstabulering av HER2-genstatus innhentet ved bruk av HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731) og HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Ikke-amplifisert HER2-genstatus (K5731) Amplifisert Totalt HercepTest fargingsresultat Totalt n HER2 FISH-status Amplifisert Ikke-amplifisert Total FISH-testede prøver HER2- genstatus Ikke-amplifisert (Dako Omnis) Amplifisert Totalt OPA: 100 % PPA: 100 % NPA: 100 % Figur 3. Korrelasjon mellom HER2/CEN-17-forhold ved bruk av HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731) på 140 prøver av brystkreft (lineær tilpasning: y = 0,11 + 0,95 * x. R 2 = 0,97. Vektet med inversvarians for å muliggjøre lineær tilpasning). HER2/CEN-17-forhold ble loggtransformert for analyse. 95 %-konfidensintervallet for den gjennomsnittlige forskjellen mellom de to fargingsmetodene ved HER2/CEN-17-forhold = 2, ble funnet å være [0,002, 0,031]. Det betyr at det ikke forventes en forskjell på mer enn 3 % med 95 % konfidens. Kvadratisk gjennomsnittsfeil (RMSE) ble funnet å være 9 % og indikerer den gjennomsnittlige fluktuasjonen rundt gjennomsnittsverdien. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 18/54

19 Brystkreft Sammenligning av HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-resultater med PathVysion HER-2 DNA Probe Kit-resultater HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ble sammenlignet med PathVysion HER-2 DNA Probe Kit i en komparativ studie på 140 vevsprøver fra humant brystkarsinom. Prøvene bestod av 80 HER2-ikke-amplifiserte tilfeller og 80 HER2-amplifiserte tilfeller med kjent HercepTest -resultat som vist i tabell 5. Tabell 5. Fordeling av prøver basert på HercepTest -resultat og HER2 FISH-resultat (HER2-genstatus) innhentet med HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731). Tabell 6 viser resultater av krysstabuleringen av HER2-genstatus innhentet med de to analysene med beregning av total prosentoverensstemmelse (OPA), positiv prosentoverensstemmelse (PPA) og negativ prosentoverensstemmelse (NPA). Figur 4 viser korrelasjon mellom HER2/CEN-17-forholdene ved bruk av de to analysene. Tabell 6. Krysstabulering av HER2-genstatus innhentet ved bruk av PathVysion HER-2 DNA Probe Kit og HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Ikke-amplifisert HER2-genstatus (PathVysion) Amplifisert Totalt HercepTest fargingsresultat Totalt n HER2 FISH-status Amplifisert Ikke-amplifisert Total FISH-testede prøver HER2- genstatus Ikke-amplifisert (Dako Omnis) Amplifisert Totalt OPA: 100 % PPA: 100 % NPA: 100 % ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 19/54

20 Brystkreft Figur 4. Korrelasjon mellom HER2/CEN-17-forhold ved bruk av HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og PathVysion på 140 prøver av brystkreft (lineær tilpasning: y = 0,01 + 0,98 * x, R 2 = 0,96. Vektet med inversvarians for å muliggjøre lineær tilpasning). HER2/CEN-17-forhold ble loggtransformert for analyse. 95 %-konfidensintervallet for den gjennomsnittlige forskjellen mellom de to fargingsmetodene ved HER2/CEN-17-forhold = 2, ble funnet å være [0,001, 0,031]. Det betyr at det ikke forventes en forskjell på mer enn 3 % med 95 % konfidens. Kvadratisk gjennomsnittsfeil (RMSE) ble funnet å være 10% og indikerer den gjennomsnittlige fluktuasjonen rundt gjennomsnittsverdien. Klinisk nytte ved valg av pasienter for Herceptin (trastuzumab)-behandling HER2 FISH pharmdx Kit ble undersøkt i komparative studier både med PathVysion HER-2 DNA Probe Kit og Dako HercepTest. Resultater av HER2 FISH-testing er tilgjengelig for totalt 940 brystkreftprøver. Sammenligning av HER2 FISH pharmdx Kit-resultater med PathVysion HER-2 DNA Probe Kit-testresultater Det har blitt utført tre studier som sammenligner resultatene fra HER2 FISH pharmdx Kit-testen med resultatene fra PathVysion HER-2 DNA Probe Kit-testen (se tabell 7). Studiene ble utført på geografisk adskilte steder, og det var ingen overlapping i bruk av prøver. Det har blitt testet totalt 328 prøver. Tabell 7. Sammendragsdata for sammenligningsstudier for FISH-metoden. Studiebetegnelse Samsvar (95 %- konfidensintervall) Positiv prosentoverensstemmelse (95 %-konfidensintervall) Negativ prosentoverensstemmelse (95 %-konfidensintervall) Samsvarsstudie (danske prøver, N = 190) 93,68 % (90,22 97,14 %) 86 % (77,34 95,08 %) 97 % (94,05 99,89 %) Samsvarsstudie (japanske prøver, N = 52) 96,15 % 97 % 96 % *Det ble gitt sammenligningsdata i artikkelen, men HER2 FISH-analysen ble ikke identifisert. Samsvarsstudie (franske prøver, N=86) (21)* Det var totalt tolv avvikende resultater mellom HER2 FISH pharmdx Kit-testen og PathVysion HER-2 DNA Probe-testen for de danske kliniske prøvene (se tabell 8). ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 20/54

21 Tabell 8. Sammendrag av data for de tolv avvikende testresultatene. HER2 FISH(positive)/PathVysion(negative) IDnr. HER2 FISHforhold PathVysionforhold HercepTestresultat IDnr. HER2 FISHforhold 160 2,10* 1, ,68 (1,82-2,51) (1,39-1,68) (1,38 1,83) 208 3,61 1, ,44 (2,95-4,73) (1,51-1,82) (1,07 1,83) 306 2,20* 1, ,7 (1,79-2,24) (1,18-1,44) (1,52 1,95) 846 2,58 1, ,44 (2,06-3,50) (1,42-1,76) (1,16 1,83) 735 1,68 (1,40 1,99) 746 1,05 (0,96 1,83) 837 1,52 (1,48 1,79) 881 1,83* (1,15 2,69) *CI for gjennomsnittlig loggforhold, inkludert 2,0. Tall i parentes er 95 % CI Brystkreft HER2 FISH (negative)/pathvysion (positive) PathVysionforhold 2,02* (1,84-2,29) 2,21* (1,94-2,64) 2,15 (2,02-2,45) 2,55 (2,38-3,26) 2,03* (1,89-2,19) 4,53 (4,27-5,17) 2,15 (2,10-2,67) 2,68 (2,39-3,14) HercepTestresultat ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 21/54

22 Brystkreft I denne avviksanalysen ble det brukt loggede forhold. 95 %-konfidensintervallet ble beregnet for de 60 loggede forholdene fra cellekjernene som ble brukt til å beregne PathVysion HER-2 DNA Probe-forholdet. For de fire tilfellene der HER2 FISH pharmdx Kit var positiv, og PathVysion HER-2 DNA Probe var negativ, var det ingen intervaller som inneholdt den kritiske verdien 2. Av de åtte tilfellene der HER2 FISH pharmdx Kit var negativ, og PathVysion HER-2 DNA Probe var positiv, inneholdt 95 % CI for tre av dem (nr. 234, 284 og 735) den kritiske verdien 2. Tilsvarende ble 95 %- konfidensintervallet beregnet for de loggede forholdene fra cellekjernene som ble brukt til å beregne HER2 FISH pharm Dx Kit-forholdet. For de fire tilfellene der HER2 FISH pharmdx Kit var positiv, og PathVysion HER-2 DNA Probe var negativ, inneholdt to av dem den kritiske verdien 2 (nr. 160 og 306). Av de åtte tilfellene der HER2 FISH pharmdx Kit var negativ, og PathVysion HER-2 DNA Probe var positiv, inneholdt 95 % CI for ett av dem (nr. 881) den kritiske verdien 2. Sammenligning av HER2 FISH pharmdx Kit-resultater med HercepTest -resultater Det er utført fire studier som sammenligner HER2 FISH pharmdx Kit med HercepTest -resultater. Det er sammenlignet totalt 940 prøver ved bruk av 3+fargingsresultat som et positivt IHC-resultat i HercepTest -analysen (se tabell 9). Tabell 9. Sammendrag av sammenligningsstudier av HER2 FISH pharmdx Kit og IHC (HercepTest ). Studiebetegnelse Samsvar (95 %-konfidensintervall) Positiv prosentoverensstemmelse (95 %-konfidensintervall) Negativ prosentoverensstemmelse (95 %-konfidensintervall) Danske kliniske prøver (N = 682) 93,11 % (91,21 95,01 %) 91 % (87,39 94,57 %) 94 % (92,12 96,46 %) Japanske prøver (N = 52) Fransk studie (N = 86) (31) Dansk pilotstudie (N = 120) (22) 96,15 % 87,21 % 93,33 % 96 % 87 % 84 % 96 % 87 % 97 % Tabell 10 inneholder fordelingsdata for HercepTest - og HER2 FISH-testresultater for de danske kliniske prøvene. Tabell 10. Fordeling av HER2-status fra HercepTest og HER2 FISH pharmdx Kit. HercepTest -fargingsresultat Totalt n % % HER2 FISH-status Amplifisert Ikke-amplifisert Total FISH-testede prøver ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 22/54

23 Brystkreft Feilsøking bryst Problem Sannsynlig årsak Foreslått handling 1. Ingen signaler eller svake signaler 1a. Reagensene har vært utsatt for høye temperaturer under forsendelse eller lagring 1b. Mikroskopet fungerer ikke som det skal Feil filtersett Feil lampe For gammel kvikksølvlampe Skitne og/eller sprukne samlelinser Uegnet immersjonsolje 1a. Kontroller lagringsforholdene. Kontroller om det var igjen tørris da forsendelsene av IQISHprobeblanding og pepsin ble mottatt. Kontroller at reagensene har blitt lagret som angitt. 1b. Kontroller mikroskopet, og kontroller at de brukte filtrene egner seg for bruk med probeblandingens fluorokromer, og at kvikksølvlampen er riktig og ikke har blitt brukt utover forventet levetid (se tillegg 2). Kontakt den lokale mikroskopsforhandleren hvis du er i tvil. 1c. Bleke signaler 1c. Unngå lang mikroskopisk undersøkelse, og minimer eksponering for sterke lyskilder. 1d. Buffere identifisert feil 1d. Bytt volumbufferne, og sørg for riktig registrering (på arbeidsstasjonen) og identifikasjon (på berøringsskjermen) av volumbufferne. Se den grunnleggende brukerhåndboken for Dako Omnis for mer informasjon. Merk: ISH Pre-Treatment Solution er grønn, og ISH Stringent Wash Buffer er gul. 2. Områder uten signal 2. Det har kommet til luftbobler under montering 2. Unngå luftbobler. Hvis dette oppdages, banker man dem forsiktig bort med en pinsett. 3. Overflødig bakgrunnsfarging 3a. Feil vevsfiksering 3a. Sørg for at det kun brukes formalinfikserte, parafininnstøpte vevssnitt. 3b. Langvarig eksponering av 3b. Unngå lang mikroskopisk undersøkelse, og ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 23/54

24 Brystkreft Problem Sannsynlig årsak Foreslått handling hybridisert snitt for sterkt lys. minimer eksponeringen for sterkt lys. 4. Dårlig vevsmorfologi 5. Høyt nivå av autofluorescens på objektglass, inkludert områder uten FFPE-vev 4a. Feil pepsinbehandling 4a. Bytt til en annen av de tre fargingsprotokollene. Sørg for at ISH Pepsin (Dako Omnis) lagres ved riktig temperatur. 4b. For lang pepsinbehandling eller svært tynne snitt kan føre til at det dukker opp fantomceller eller smultringceller. 5. Bruk av utløpte eller ikke anbefalte objektglass 4b. Prøv med en fargingsprotokoll med kortere pepsininkubasjonstid. Kontroller at snittykkelsen er 4 6 µm. 5. Kontroller at objektglassene er i henhold til spesifikasjonene. Kontroller at objektglassene ikke har passert utløpsdatoen. MERK: Kontakt Dakos tekniske tjenester for ytterligere hjelp hvis problemet ikke kan tilskrives noen av årsakene ovenfor, eller hvis den foreslåtte løsningen ikke løser problemet. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 24/54

25 Brystkreft Tillegg 1 bryst HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), kode GM333 Scoringsskjema Kjøringsdato: Logg-ID for fargingskjøring: HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-parti: Prøve-ID: Cellekjernenr. HER2-score (rød) Signaltelling i 20 cellekjerner CEN-17- score (grønn) Cellekjernenr Totalt (1 10) Totalt (11 20) HER2- score (rød) CEN-17- score (grønn) For bestemmelse av HER2/CEN-17-forholdet teller man antallet HER2-signaler og antallet CEN-17-signaler i de samme 20 cellekjernene og deler det totale antallet HER2-signaler med det totale antallet CEN-17-signaler. Hvis HER2/CEN-17-forholdet er i grenseområdet (1,8 2,2), skal det telles ytterligere 20 cellekjerner, og forholdet for de 40 cellekjernene skal beregnes på nytt. Et forhold på eller i nærheten av grenseverdien (1,8 2,2) skal tolkes med forsiktighet (se tellingsveiledningen). Total score (1 20) HER2 CEN-17 HER2/CEN-17-forhold ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 25/54

26 Brystkreft Cellekjernenr. HER2-score (rød) Signaltelling i 20 ekstra cellekjerner CEN-17- score (grønn) Cellekjernenr Sum (21-30) Sum (31-40) HER2- score (rød) CEN-17- score (grønn) Beregn HER2/CEN-17-forholdet på grunnlag av de 40 talte cellekjernene Total score (1-40) HER2 CEN-17 HER2/CEN-17-forhold Forhold < 2: HER2-genamplifikasjon ble ikke observert Forhold 2: HER2-genamplifikasjon ble observert Dato og signatur, tekniker: Dato og signatur, patolog: Se Tolkning av farging for retningslinjer for telling. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 26/54

27 Brystkreft Tillegg 2 Bryst HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), kode GM333 Fluorescensmikroskop spesifikasjoner Dako anbefaler følgende utstyr for bruk med HER2 IQFISH pharmdx, (Dako Omnis), GM333: 1. Mikroskoptype Epifluorescensmikroskop 2. Lampe 100 watt kvikksølvlampe (hold oversikt over brennetid) 3. Mål Til screening av vevet er 16X- eller 20X-oljeimmersjonsobjektiver egnet For høy strømforstørrelse og signaltelling anbefales kun oljeimmersjonsobjektiver, f.eks. 100x. 4. Filtre Filtrene er individuelt utformet for spesifikke fluorokromer og må velges tilsvarende. Dako anbefaler bruk av et spesifikt DAPI-filter i kombinasjon med et Texas Red/FITC-dobbeltfilter av høy kvalitet. DAPI-filter, f.eks. Chroma-filter nr Texas Red/FITC-FITC dobbeltfilter, f.eks. Omega Optical-filter nr. XF53 eller Chromafilter nr Texas Red- og FITC-enkeltfiltre kan brukes for bekreftelse og for telling. Fluorokrom Eksitasjonsbølgelengde Emisjonsbølgelengde FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filtre er spesifikke for hver mikroskoptype, og bruk av egnede filtre er avgjørende for tolkningen. Kontakt mikroskopleverandøren eller Dako-representanten ved behov for mer informasjon. 5. Olje Ikke-fluorescerende olje Forholdsregler En 50 watts kvikksølvlampe anbefales ikke Rodaminfiltre kan ikke brukes Trippelfiltre anbefales ikke Et ikke-optimalisert mikroskop kan forårsake problemer ved avlesing av fluorescenssignalene Det er viktig at lyskilden ikke har passert utløpsdatoen, og at den er riktig rettet inn og fokusert. Kunder skal overvåke kvikksølvlampen og følge produsentens anbefalinger. Mikroskopet skal være vedlikeholdt og kvikksølvlampen justert før tolkning av resultater. Prøv å utsette prøven for så lite eksitasjonslys som mulig for å minimere blekningen av det fluorescerende lyset. Vi anbefaler at du drøfter oppsettet av det bestemte mikroskopet med produsenten før den fluorescerende in situ-hybridiseringen startes. Du kan også se litteraturen. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 27/54

28 Magekreft Sammendrag og forklaring gastrisk Det humane HER2-genet (kalles også ERBB2 og NEU) befinner seg på kromosom 17 og koder HER2-proteinet eller p185 HER2. HER2-proteinet er en membranreseptor-tyrosinkinase med homologi til den epidermiske vekstfaktorreseptoren (EGFR eller HER1) (1-2). HER2-genet finnes i to kopier i alle normale diploide celler. Overuttrykk av HER2-proteinet og amplifikasjon av HER2-genet ved magekreft har blitt vist i et stort antall studier (gjennomgått i (23)). HER2-positivitet kan påvises hos omtrent 20 % av pasientene, enten med IHC eller FISH (23). Prekliniske in vitro- og in vivo-studier har vist at trastuzumab (Herceptin ) er effektivt i ulike magekreftmodeller, og har dermed ført til igangsetting av flere kliniske studier (23-27). Alle pasientene i fase III-studien BO18255 (ToGA, en open-label, randomisert, multisenter, fase III-studie av traustuzumab i kombinasjon med et fluoropyrimidin og cisplatin kontra bare kjemoterapi som førstelinjebehandling for pasienter med HER2-positiv, fremskreden magekreft), en studie sponset av Hoffmann-La Roche AG, ble valgt ved bruk av Dako HercepTest (IHC) og Dako HER2 FISH pharmdx Kit (FISH), med HER2 positivt definert som IHC 3+ eller FISH+ (HER2/CEN-17 2,0). Studien viste den kliniske nytten både av HercepTest (IHC) og HER2 FISH pharmdx Kit (FISH) for vurdering av HER2-status hos pasienter med fremskredent karsinom med gastrisk overgang eller gastroøsofageal overgang som man vurderer å behandle med trastuzumab (28). Det ble ikke tatt med noen pasienter med tumorer som ikke var genamplifisert, men med svakt til sterkt overuttrykk av HER2-protein [FISH(-)/IHC 2+]. Derfor er det uklart om pasienter med tumorer som ikke er genamplifisert, men som overuttrykker HER2-protein [dvs. FISH(-), IHC 2+ or 3+], vil ha nytte av Herceptin -behandling. Studien viste også at genamplifikasjon (FISH) og overuttrykk av protein (IHC) ikke er like korrelert som med brystkreft. Derfor bør det ikke brukes én enkelt metode til å fastslå HER2-status. Dette produktet (HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)) er en IQISH-probeblanding for automatisert, direkte FISH som påviser HER2-genamplifikasjon. Dette produktet skal brukes sammen med de angitte tilleggsreagensene i Dako Omnis og er avledet fra den manuelt utførte HER2-genamplifikasjonsanalysen, HER2 IQFISH pharmdx, kode K5731. Prosedyreprinsipp gastrisk HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er en IQISH-probe som består av en blanding av Texas Red-merkede DNA-prober som dekker en 218 kb-region, inkludert HER2-genet på kromosom 17, og en blanding av fluoresceinmerkede peptidnukleinsyre (PNA)(13)-prober som retter seg mot den sentromeriske regionen av kromosom 17 (CEN-17). Den spesifikke hybridiseringen til de to målene fører til dannelse av et tydelig, rødt fluorescenssignal ved hvert HER2-genlocus og et tydelig, grønt fluorescenssignal ved alle kromosom 17-sentromerer. Vurdering av HER2-genamplifikasjon ved bruk av HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er en helautomatisert metode i Dako Omnis-instrumentet. Det kan velges tre ulike, validerte HER2 FISH-fargingsprotokoller i programvaren for Dako Link Omnis Workstation. Protokollene skiller seg bare fra hverandre i pepsinnedbrytningstid. Derfor kan det velges pepsinnedbrytning i 10 minutter (den korte protokollen), 15 minutter (den middels lange protokollen) eller 20 minutter (den lange protokollen) (mer informasjon nedenfor). Den middels lange protokollen anbefales for innledende analyse. Etter farging i Dako Omnis monteres prøvene med Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) med 4',6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) og dekkglass. Ved bruk av et fluorescensmikroskop som er utstyrt med de nødvendige filtrene (se tillegg 5), lokaliseres tumorceller, og de røde (HER2) og grønne (CEN-17) signalene telles. Deretter beregnes HER2/CEN-17-forholdet. Normale celler i det analyserte vevssnittet vil tjene som en indre, positiv kontroll for forhåndsbehandling og hybridiseringseffektivitet. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 28/54

29 Se avsnittet Tolkning av farging for mer informasjon. Magekreft Se brukerhåndboken/-bøkene for Dako Omnis for detaljert informasjon om innlasting og fjerning av objektglass, ISH-lokk (Dako Omnis), kode GC102, reagenser, volumvæsker og avfall. Reagenser gastrisk HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og tilleggsreagenser kan bestilles separat som enkeltreagenser. Materialer som følger med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): 1,6 ml, bruksklar blanding av Texas Red-merkede HER2 DNA-prober og fluoresceinmerkede CEN-17 PNA-prober, leveres i IQISHhybridiseringsbuffer. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) sendes på tørris. For å stadfeste at reagensen ikke har blitt utsatt for høye temperaturer under transport, skal man kontrollere at det fortsatt er tørris igjen ved mottak. Reagenshetteglass med tint innhold skal alltid lagres og håndteres i stående stilling. Reagenshetteglasset inneholder en gullbelagt metallkule for blanding ved hjelp av Dako Omnis Mixing Device (se brukerhåndboken for Dako Omnis Mixing Device). Det er viktig at reagensen er grundig blandet før den lastes inn i Dako Omnis. Materialer som er nødvendige, men som ikke følger med Tilleggsreagenser Følgende reagenser må finnes i Dako Omnis-instrumentet for analyse av HER2-genamplifikasjon med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis): 175 ml, konsentrert 20x, skal fortynnes i en Dako Omnis 3,5 l volumflaske (kode GC109). Produktet inneholder et antimikrobielt middel og en inert grønnfarge for enkel identifikasjon og brukervennlighet. ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis): 14 ml 96 % etanol (klar til bruk). ISH Pepsin (Dako Omnis): 7 ml Pepsin A-løsning (klar til bruk), ph 2,0, inneholder stabilisator og et antimikrobielt middel. Pepsin sendes på tørris. For å stadfeste at reagensen ikke har blitt utsatt for høye temperaturer under transport, skal man kontrollere at det fortsatt er tørris igjen ved mottak. ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis): 175 ml buffer av salt-natriumcitratbuffer konsentrert 20x, skal fortynnes 1 : 20 i en Dako Omnis 3,5 l volumflaske (GC109). Produktet inneholder et antimikrobielt middel og en inert gulfarge for enkel identifikasjon og brukervennlighet. Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis): 0,8 ml fluorescerende monteringsmedium (klart til bruk) med DAPI. Selv om reagensene ovenfor ikke leveres med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), er de beskrevet kort nedenfor. Se bruksanvisningen for hver enhet for mer informasjon. Tilleggsreagenser og -enheter Dako Omnis, kode Gl100 Wash Buffer (20x) (Dako Omnis), kode GC807 Clearify TM, kode GC810 Dako Omnis Mixing Device, kode GC116 ISH-lokk, kode GC102 ISH Cleaning Solution, kode GC207 Glassdekkglass for montering (24 x 50 mm) ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 29/54

30 Se de grunnleggende og avanserte brukerhåndbøkene for Dako Omnis angående bruk av tilleggsreagenser og -enheter. Magekreft Mikroskoputstyr og -tilbehør Filtre til fluorescensmikroskop: DAPI- og FITC/Texas Red-dobbeltfilter, eller FITC- og Texas Red-monofiltre se tillegg 5 for mer informasjon. Bruk av DAPI-filter ved høy forstørrelse påvirker signalintensitet negativt. Unngå lange eksponeringstider. Det bør brukes et fluorescensmikroskop med en kvikksølvlampe på 100 watt. Det anbefales ikke å bruke andre lyskilder med disse filtrene. Objektglassmappe på mikroskopet (pappbrett for 20 objektglass med hengslet deksel eller lignende). Forholdsregler gastrisk 1. Til in vitro-diagnostisk bruk. 2. For profesjonelle brukere. 3. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) inneholder 10 <25 % etylenkarbonat og 3 <5 % sodium chloride. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er merket: Advarsel H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Gir alvorlig øyeirritasjon. Bruk vernebriller eller ansiktsvern. Vask hendene grundig etter håndtering. VED KONTAKT MED ØYNENE: Skyll forsiktig med vann i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser dersom dette enkelt lar seg gjøre. Fortsett skyllingen. Som en generell regel har ikke personer under 18 år tillatelse til å arbeide med dette produktet. Brukerne må instrueres nøye i riktig arbeidsprosedyre, de farlige egenskapene til produktet og de nødvendige sikkerhetsinstruksjonene. Se sikkerhetsdatabladet hvis du vil ha ytterligere informasjon. 4. Vevsprøver, før og etter fiksering, og alle materialer som eksponeres for dem, skal håndteres som om de kan overføre smitte, og kasseres under relevante forholdsregler (14). Pipetter aldri reagenser med munnen, og unngå at reagenser og prøver kommer i kontakt med hud eller slimhinner. Hvis reagenser kommer i kontakt med følsomme områder, må det vaskes med rikelige mengder vann. 5. Minimer mikrobiell kontaminasjon av reagensen for å unngå feilaktige resultater. 6. Andre vevsfikseringsmetoder og prøvetykkelser enn de som er spesifisert, kan påvirke vevsmorfologi og/eller signalintensitet. 7. Reagenser er fortynnet optimalt. Ytterligere fortynning kan føre til tap av ytelse. 8. Bruk egnet personlig verneutstyr for å unngå kontakt med øyne og hud. Se databladet for materialsikkerhet (SDS) for ytterligere informasjon. 9. Ubrukt løsning skal kasseres i henhold til lokale, nasjonale og europeiske forskrifter. 10. På grunn av den heterogene naturen til gastriske kreftprøver er det viktig å utføre en grundig skanning av hele prøven for å evaluere signaldistribusjon før valg av område for signalopptelling. 11. Det anbefales ikke å evaluere svært små prøver (dvs. at prøver må ha intakt morfologi og tilstrekkelig antall cellekjerner for opptelling). 12. Hvis HER2 FISH-analysen utføres på en biopsiprøve, skal flere (7 8) evaluerbare biopsiprøver fra ulike regioner av tumoren analyseres, slik at man sikrer pålitelig bestemmelse av HER2-status. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 30/54

31 Magekreft 13. For identifikasjon av vevsscore i en biopsiprøve er det viktig å inspisere det H&E-fargede objektglasset. 14. HER2-genamplifikasjon og overuttrykk av HER2-protein er ikke like godt korrelert ved magekreft. Derfor bør det ikke brukes én enkelt metode til å fastslå HER2-status. Lagring gastrisk Lagre HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ved < 18 C ( 18 til 25 C anbefales) og mørkt. Sørg for at glasset med tint reagens alltid er i stående stilling. Reagensen kan fryses og tines opptil ti ganger uten at det påvirker ytelsen. Ikke oppbevar denne komponenten ved romtemperatur. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og tilleggsreagensene ISH Pepsin (Dako Omnis) og Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) kan påvirkes negativt av varme. Ikke oppbevar disse komponentene ved romtemperatur. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og tilleggsreagensene Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) kan påvirkes negativt av sterkt lys. Ikke oppbevar disse komponentene eller utfør analyse i sterkt lys, for eksempel direkte sollys. Lagre tilleggsreagensene ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis), ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) og Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) mørkt ved 2-8 C. Lagre ISH Pep sin (Dako Omnis) ved 18 8 C. Hetteglasslokket og vippelokket skal være lukket for alle reagenser under lagring. Fortynningsløsninger (ISH Stringent Wash Buffer-arbeidsløsning og ISH Pre-Treatment Solutionarbeidsløsning) kan lagres ved 2 8 C i 30 dager. Ikke bruk reagensene etter utløpsdatoen som er stemplet på reagensbeholderen. Under lagring skal lokket, også vippelokket, være lukket. Hvis reagenser oppbevares under andre forhold enn de som er angitt, må brukeren validere reagensytelsen (15). Det er ingen tydelige tegn på at dette produktet er ustabilt. Derfor er det viktig å evaluere normale celler i det analyserte vevssnittet. Kontakt Dakos tekniske avdeling hvis det observeres et uventet fluorescensmønster som ikke kan forklares, og det mistenkes et problem med HER2 IQFISH pharmdx. Stabilitet i Dako Omnis-instrumentet Stabiliteten til HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og tilleggsreagensene ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) og ISH Pepsin (Dako Omnis) i instrumentet er 80 timer. Stabiliteten til fortynnet ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) og ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) i instrumentet er 7 dager. Gjenværende intern stabilitet spores av Dako Omnisprogramvaren. Bruk av utløpte reagenser vil føre til en advarsel i Dako Omnis-instrumentet: Alle objektglass som er farget med den utløpte reagensen, endrer status til mistenkelig, og objektglassloggen på arbeidsstasjonen viser at en utløpt reagens har blitt brukt. Prøveklargjøring gastrisk Prøver av karsinom med gastrisk overgang eller gastroøsofageal overgang fra biopsier, eksisjoner eller reseksjoner må håndteres slik at vevet bevares for FISH-analyse. Standardmetoder for vevsbehandling ved immunhistokjemisk farging skal brukes for alle prøver (16). Ved testing av små biopsiprøver skal man kontrollere intakt tumormorfologi og tilstedeværelse av tilstrekkelig antall cellekjerner for signaltelling. Hvis HER2 FISH-analysen utføres på en biopsiprøve, skal flere (7 8) evaluerbare biopsiprøver fra ulike regioner av tumoren analyseres, slik at man sikrer pålitelig bestemmelse av HER2-status. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 31/54

32 Magekreft Parafininnstøpte vevssnitt Kun vevssnitt som er preservert i nøytral, bufret formalin og parafininnstøpt, egner seg for bruk. Prøver skal f.eks. være blokkert til en tykkelse på 3 eller 4 mm og fiksert i timer i nøytral, bufret formalin. Biopsiprøver ble fiksert i 6 8 timer i ToGA-forsøket [for studiereferanse, se (28)]. Vevet dehydreres deretter i en gradert serie med etanol og xylen, etterfulgt av infiltrering med smeltet parafin som holdes på maksimalt 60 C. Riktig fiksert og innstøpt vev holder seg ubegrenset før oppdeling og montering på objektglass hvis det lagres på et kjølig sted (15 25 C) (16-17). Andre fiksativer egner seg ikke. Vevsprøver skal skjæres i snitt på 3-6 µm. Objektglassene som kreves for analyse av HER2-genamplifikasjon og verifisering av tilstedeværelsen av en tumor, skal klargjøres samtidig. Det anbefales minst to seriesnitt, ett snitt for tilstedeværelse av tumor farget med hematoksylin og eosin (H&E-farging), og ett snitt for analyse av HER2-genamplifikasjon. Det anbefales at vevssnitt monteres på Dako FLEX IHC Microscope Slides, kode K8020. Superfrost Plus-objektglass (Thermo Fischer Scientific, J1800AMNZ) kan også brukes. Kontroller at objektglassene ikke har passert utløpsdatoen. Prøver skal analyseres innen seks måneder etter snitting ved lagring ved 2 25 C. MERK: Vevsprøvene må plasseres innenfor det definerte området for farging av objektglass på glassobjektglasset. Informasjon om målene til området for farging av objektglass finnes i den grunnleggende brukerhåndboken for Dako Omnis. BRUKSANVISNING gastrisk A. Reagensklargjøring gastrisk A.1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-hetteglasset inneholder en gullbelagt metallkule for blanding. Reagensen må tines og blandes grundig før hetteglasset lastes inn i Dako Omnis, siden den skiller seg under frysing. Bruk Dako Omnis Mixing Device for probeblanding. Følg prosedyren nedenfor for probeblanding på Dako Omnis Mixing Device, og se brukerhåndboken for blandeapparatet for mer informasjon. 1. Ta HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-hetteglasset ut av fryseren. 2. Last hetteglasset på Dako Omnis Mixing Device. 3. Koble til blandeapparatet, og kontroller at det grønne statuslyset er på 4. Velg programmet Thaw + mix (Tin + bland). Viktig: Hetteglass lagret under 25 C skal tines (rett) før glasset lastes på Dako Omnis Mixing Device, og man skal bruke programmet Mix (Bland). 5. Fjern hetteglasset fra blandeapparatet. 6. Åpne vippelokket, bøy det bakover, og klikk det inn i sikkerhetsposisjonen (se den grunnleggende brukerhåndboken for Dako Omnis for mer informasjon). 7. Sett umiddelbart hetteglasset inn i Reagent Storage Module (Modul for reagensoppbevaring) på Dako Omnis-instrumentet. Hvis funksjonen for kontinuerlig reagenslasting brukes under fargingskjøringen, må man sørge for at det går minst ti minutter fra blanding til aspirasjon av hetteglasset på Dako Omnis. Proben HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) kan tines på nytt og brukes opptil ti ganger. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 32/54

33 Magekreft Bland alltid probeblandingen HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) rett før den lastes på instrumentet. Skal ikke ristes. Den totale stabiliteten til ISH HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er 80 timer ved lagring i Reagent Storage Module (Modul for reagensoppbevaring) på Dako Omnis. Gjenværende intern stabilitet spores av Dako Omnis-programvaren (se ovenfor). HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) skal etter fjerning fra Dako Omnis umiddelbart overføres til < 18 C ( 18 til 25 C anbefales). A.2 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) Klargjør en arbeidsløsning ved å fortynne ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis)- konsentratet 1 : 20 på følgende måte: 1. Fyll en volumflaske på 3,5 liter fra Dako Omnis, merket PTB (blå etikett), med avionisert vann opp til påfyllingslinjen (3,325 l). Sørg for å plassere volumflasken på en horisontal overflate før påfyllingen. 2. Tøm én ISH Pre-Treatment Solution (20x)-konsentratflaske (Dako Omnis) på 175 ml i volumflasken. 3. Flytt den avtakbare etiketten fra konsentratflasken til volumflasken. Sett på lokket til volumflasken, og snu volumflasken forsiktig opp ned 2 3 ganger. 4. Identifiser reagensen ved hjelp av den håndholdte Dako Omnis-strekkodeskanneren (skann den avtakbare etiketten og volumflasken). 5. Last volumflasken inn i Dako Omnis-instrumentet umiddelbart. Den fortynnede løsningen kan brukes innen sju dager når den lagres internt i Dako Omnis. Gjenværende intern stabilitet spores av Dako Omnis-programvaren (se ovenfor). Ubrukt fortynnet løsning kan lagres ved 2 8 C i 30 dager. Etter kald lagring må den fortynnede løsningen nå minst 18 C før den lastes på Dako Omnis. MERK: Kast fortynnet løsning som ser grumsete ut. A.3 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Forbered en arbeidsløsning ved å fortynne ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) - konsentratet 1 : 20 på følgende måte: 1. Fyll en volumflaske på 3,5 liter fra Dako Omnis, merket PTB (blå etikett), med avionisert vann opp til påfyllingslinjen (3,325 l). Sørg for å plassere volumflasken på en horisontal overflate før påfyllingen. 2. Tøm én ISH Stringent Wash Buffer (20x)-konsentratflaske (Dako Omnis) på volumflasken. 3. Flytt den avtakbare etiketten fra konsentratflasken til volumflasken. Sett på lokket til volumflasken, og snu volumflasken forsiktig opp ned 2 3 ganger. 4. Identifiser reagensen ved hjelp av den håndholdte Dako Omnis-strekkodeskanneren (skann den avtakbare etiketten og deretter volumflasken). 5. Last volumflasken i Dako Omnis-instrumentet umiddelbart. Den fortynnede løsningen kan brukes innen sju dager når den lagres internt i Dako Omnis. Gjenværende intern stabilitet spores av Dako Omnis-programvaren (se ovenfor). Ubrukt fortynnet løsning kan lagres ved 2 8 C i op ptil 30 dager. Etter kald lagring må den fortynnede løsningen nå minst 18 C før den las tes på Dako Omnis. MERK: Kast fortynnet løsning som ser grumsete ut. A.4 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) er en reagens som er klar til bruk. Før lasting på Dako Omnis, åpner man hetteglassets vippelokk, bøyer det bakover og klikker det på plass i sikkerhetsposisjonen. Den totale stabiliteten til ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) i instrumentet er 80 timer ved lagring i Reagent Storage Module (Modul for reagensoppbevaring) på Dako Omnis. Gjenværende intern stabilitet spores av Dako Omnis-programvaren (se ovenfor). Etter kjøringen ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 33/54

34 Magekreft kan ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) overføres til lagringstemperatur (2 8 C) for at den interne stabiliteten skal bevares. A.5 ISH Pepsin (Dako Omnis) ISH Pepsin (Dako Omnis) er en reagens som er klar til bruk. Før lasting på Dako Omnis, må man forsikre seg om at reagensen er tint. Deretter åpner man hetteglassets vippelokk, bøyer det bakover og klikker det på plass i sikkerhetsposisjonen. Den totale stabiliteten til ISH Pepsin (Dako Omnis) i instrumentet er 80 timer ved lagring i Reagent Storage Module (Modul for reagensoppbevaring) på Dako Omnis. Gjenværende intern stabilitet spores av Dako Omnis-programvaren (se ovenfor). Etter kjøringen bør ISH Pepsin (Dako Omnis) overføres til lagringstemperatur ( 18 8 C) for at stabiliteten i instrumentet skal bevares. A.6 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) er et bruksklart monteringsmedium som brukes utenfor Dako Omnis-instrumentet. Overfør Fluorescence Mounting Medium til lagringstemperatur (2 8 C) umiddelbart etter bruk. A.7 Ytterligere tilbehør Følgende tilbehør bør også finnes i Dako Omnis: avionisert vann, fortynnet Wash Buffer 20x (Dako Omnis), kode GC807, Clearify (Dako Omnis), kode GC810, ISH Cleaning Solution, kode GC207 og ISH-lokk (Dako Omnis), kode GC102, som angitt i brukerhåndboken/-bøkene for Dako Omnis. B. Fargingsprosedyre gastrisk B.1 Prosedyremerknader HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er hybridiseringsproben for den automatiserte, direkte analysen av fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) i Dako Omnis-instrumentet og er, sammen med tilleggsreagensene GM300, GM301, GM302, GM303 og GM304 (GM304 utenfor instrumentet), lagd for kvantitativ påvisning av HER2-genamplifikasjon. Brukeren skal lese alle instruksjonene nøye og gjøre seg kjent med alle komponentene og deres forholdsregler før bruk. Den automatiserte prosedyren på Dako Omnis omfatter avparafinisering av vevssnitt, målhenting, pepsinnedbrytning, hybridisering og stringensvask. Objektglassene overføres til tørrutlastingsstasjonen. Alle protokolltrinn er forhåndsprogrammert i Dako Omnis-programvaren. Se brukerhåndboken/-bøkene for Dako Omnis for instruksjoner om lasting av objektglass, ISHlokk, reagenser osv. Tre validerte HER2 IQFISH-protokoller: HER2 IQFISH Pepsin Short, HER2 IQFISH Pepsin Medium og HER2 IQFISH Pepsin Long, som bare skiller seg fra hverandre når det gjelder pepsinnedbrytningstid, er forhåndsprogrammert i Dako Omnis-programvaren og kan velges for hvert av de fem objektglassene i objektglasstativet. Dette muliggjør optimalisering av vevsnedbrytningen, som kan avhenge av forhold før analysen. Protokollen HER2 IQFISH Pepsin Medium anses for å være standardprotokollen. De ulike fargingsprotokollene kan vises på Dako Link Omnis Workstation. B.2. Prosedyre før farging 1. Velg HER2 IQFISH-protokollen som skal brukes for hvert objektglass, fra Dako Link Omnis Workstation-programvaren, under IQFISH-protokoller. 2. Skriv ut objektglassetiketter og fest dem på objektglassene. 3. Plasser objektglassene i objektglasstativet. Se den grunnleggende brukerhåndboken for Dako Omnis for mer informasjon. Et objektglasstativ kan inneholde fra ett til fem objektglass. Det anbefales at det farges minst to objektglass i en HER2 IQFISH-fargingskjøring. 4. Plasser objektglasstativet på Dako Omnis. 5. Plasser ISH-lokk (ett ISH-lokk per objektglasstativ) på Dako Omnis. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 34/54

35 Magekreft 6. Kontroller at det er volumflasker i Dako Omnis-instrumentet, og at de er registrert av instrumentet. Volumflaskevæsker: Clearify (klaringsmiddel), fortynnet ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis), fortynnet ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) og fortynnet Wash Buffer (Dako Omnis). 7. Last ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) og ISH Pepsin (Dako Omnis), den nylig blandede HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og ISH Cleaning Solution inn i Reagent Storage Module (Modul for reagensoppbevaring). Sørg for at hetteglassenes vippekorker er åpne. 8. Følg instruksjonene på berøringsskjermen, og trykk på Done (Ferdig) for å starte fargingsprosedyren. B.3. Fargingsprosedyre HER2 IQFISH-fargingsprosedyren på Dako Omnis-instrumentet (oppsummert i tabell 11) kan overvåkes på Dako Link Omnis Workstation: Tabell 11. Forenklet oversikt over HER2 IQFISH-fargingsprotokolltrinnene. Trinn Reagens Tid og temperatur Dewax Clearify (klaringsmiddel) 10 minutter, 38 C (Avvoksing) Target retrieval ISH Pre-Treatment Solution 15 minutter, 97 C (Målhenting) (Dako Omnis) Wash (Vask) ISH Ethanol Solution, 96% 2 x 3 minutter, 32 C (Dako Omnis) Digestion ISH Pepsin (Dako Omnis) 10, 15 eller 20 minutter (Nedbrytning)* Drying (Tørking) 15 minutter, 45 C Denaturation 10 minutter, 66 C (Denaturering) Hybridization HER2 IQFISH pharmdx 75 minutter, 45 C (Hybridisering) (Dako Omnis) Stringent Wash (Grundig vask) ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) 10 minutter, 61 C *Det kan velges tre validerte pepsinnedbrytningstider ved bruk av HER2 IQFISH-protokollene ovenfor. Hvis det ikke skal utføres flere ISH-farginger i umiddelbar fremtid, skal alle reagensene overføres til de anbefalte lagringstemperaturene. B.4. Prosedyre etter farging Fjern objektglassene, og påfør opptil 30 µl Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) med DAPI i målområdet på objektglasset. Vevssnittet må være helt dekket av Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis). Legg på et glassdekkglass. MERKNAD: Objektglassene kan avleses etter 15 minutter eller innen 7 dager etter montering. Det oppstår imidlertid blekning hvis objektglassene utsettes for lys eller høye temperaturer. Oppbevar objektglassene på et mørkt sted ved 18 8 C for å minimere blekning. Kvalitetskontroll gastrisk 1. Signalene må være lyse, tydelige og enkle å evaluere. 2. Normale celler muliggjør en intern kontroll av fargingskjøringen. Normale celler skal ha 1 2 klart synlige, grønne signaler som indikerer at hybridiseringen av CEN-17 PNA-proben til den sentromeriske regionen på kromosom 17 var vellykket. Normale celler skal også ha 1 2 klart synlige, røde signaler som indikerer at hybridiseringen av HER2 DNA-proben til HER2 -genet/-genene var vellykket. På grunn av vevsoppdeling vil noen normale celler ha mindre enn de forventede to signalene av hver farge. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 35/54

36 Magekreft Dersom signalene ikke ses i normale celler, indikerer dette analysefeil og resultatene må betraktes som ugyldige. 3. Nukleær morfologi må være intakt ved evaluering med et DAPI-filter. Mange fantomceller og en generelt dårlig nukleær morfologi indikerer for kraftig nedbrytning av prøven, noe som fører til tap av signalfragmentering. Slike prøver må anses som ugyldige. 4. Minst 20 tumorceller må kunne vurderes. 5. Forskjeller i vevsfiksering, -behandling og -innstøping i brukerens laboratorium kan føre til variasjoner i resultatene og gjøre det nødvendig med regelmessig evaluering av de interne kontrollene. Tolkning av farging gastrisk Vev som kan vurderes Finn tumoren innenfor konteksten til det H&E-fargede objektglasset, og evaluer det samme området på det FISH-fargede objektglasset (i DAPI-filteret). Det er kun prøver fra pasienter med karsinom med gastrisk overgang eller gastroøsofageal overgang som skal analyseres. I tilfeller med intestinal metaplasi og adenokarsinom i samme prøve skal kun karsinomkomponenten scores. Unngå områder med alvorlig inflammasjon eller nekrose og områder der de nukleære grensene er tvetydige. Ikke inkluder cellekjerner som krever subjektiv bedømmelse. Ikke inkluder cellekjerner med lav signalintensitet og ikke-spesifikk eller høy bakgrunn. Start med en mikroskopvurdering av hele den FISH-fargede seksjonen, og fortsett med området som er tilordnet på H&E-seksjonen. Noter den totale signaldistribusjonen (homogen eller heterogen) på signaltellingsarket før telling av den FISH-fargede seksjonen. Noter i tilfelle heterogen distribusjon om fokal amplifikasjon eller enkeltcelleamplifikasjon (mosaikk) er til stede. 1) Homogen signaldistribusjon Hvis signaldistribusjonen er homogen, teller man antallet kromosomsentromerer (grønne signaler) og antallet HER2-gener (røde signaler) fra 20 celler i 1 2 representative tumorområder. 2) Heterogen signaldistribusjon Hvis signaldistribusjonen er heterogen. teller man totalt 20 celler fra valgte områder som angitt nedenfor: A) Hvis fokal amplifikasjon eksisterer, skal områder med amplifiserte celler velges. B) Hvis mosaikkdistribusjon eller amplifiserte, polysomale og disomale celler er til stede, teller man i områder med amplifiserte celler. I slike områder skal ikke bare amplifiserte celler, men også tilstøtende, ikke-amplifiserte celler telles totalt 20 celler. Ikke velg overlappende områder, hvis det er mulig. Se bort fra farging av bakterielt DNA Et antall spesialiserte celler (mastceller og makrofager) som finnes spredt i det gastriske vevet, utviser et høyt nivå av farging av HER2-proben på grunn av tilstedeværelse av bakterielt DNA. Dette fører til svært røde, fluorescerende celler som skiller seg klart fra tumorceller med høy HER2-genamplifikasjon. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 36/54

37 Magekreft Signaltelling Når et område har blitt valgt for signalopptelling, begynner man analysen i en av de 20 tilstøtende, valgte cellekjernene. Deretter teller man celle for celle og utelater kun cellekjerner som ikke oppfyller kvalitetskriteriene. Finn tumoren innenfor konteksten til det H&E-fargede objektglasset, og evaluer det samme området på det FISH-fargede objektglasset. Skann hele det fargede objektglasset for å ta høyde for mulig heterogenitet. Velg et område som har god fordeling av cellekjerner. Start analysen i øvre venstre kvadrant i det valgte området, skann fra venstre til høyre, og tell antallet signaler innenfor den nukleære grensen for hver evaluerte cellekjerne i samsvar med retningslinjene nedenfor (se også tillegg 5). Flytt fokuset opp og ned for å finne alle signalene i de enkelte cellekjernene. Tell to signaler som har samme størrelse og er atskilt med en avstand som er mindre enn eller lik diameteren til signalet, som kun ett signal. Avstanden må være minst lik diameteren til et signal med normal størrelse for å telle som to individuelle signaler. Hvis avstanden mellom to signaler er mindre enn diameteren til et signal, skal de telles som ett. I cellekjerner med høye nivåer av HER2-genamplifikasjon kan HER2-signalene være posisjonert svært nært hverandre og danne en signalgruppe. I slike tilfeller kan ikke antallet HER2-signaler telles, men de må beregnes. Det må vies spesiell oppmerksomhet til de grønne signalene, siden grupper av røde HER2-signaler kan dekke de grønne signalene, slik at det blir umulig å se dem. Hvis det er tvil, skal de grønne signalene kontrolleres med et spesifikt FITC-filter. Ikke tell cellekjerner uten signaler eller med signaler med kun én farge. Tell bare cellekjerner med ett eller flere FISH-signaler av hver farge. Veiledning i signaltelling 1 Skal ikke telles. Cellekjerner overlapper, ikke alle cellekjerneområder er synlige. 2 To grønne signaler, ikke tell cellekjerner med signaler i kun én farge. 3 Tell som 3 grønne og 12 røde signaler (gruppeberegning). 4 Tell som 1 grønt og 1 rødt signal. To signaler som har samme størrelse og er atskilt med en avstand som er mindre enn eller lik diameteren til ett signal, telles som ett. 5 Ikke tell (over- eller undernedbrutte kjerner). eller Manglende signaler i midten av cellekjerner (smultringformede kjerner). 6 Tell som 2 grønne og 3 røde signaler. To signaler som har samme størrelse og er atskilt med en avstand som er mindre enn eller lik diameteren til ett signal, telles som ett. 7 Tell som 1 grønt og 5 røde signaler. 8 Tell som 3 grønne (1 grønt ute av fokus) og 3 røde signaler. 9 Gruppe med røde signaler skjuler grønne signaler, kontroller de grønne signalene med et spesifikt FITC-filter, eller ikke tell dem. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 37/54

38 Registrer antallene i en tabell som vist i tillegg 3 og 4. Tell 20 cellekjerner per vevsprøve, fra tydelige tumorområder der det er mulig. Magekreft Beregn HER2/CEN-17-forholdet ved å dele det totale antallet røde HER2-signaler med det totale antallet grønne CEN-17-signaler. Prøver med et HER2/CEN-17-forhold på 2 eller mer skal anses som HER2-genamplifiserte (29). Resultater ved eller i nærheten av grensen (1,8 2,2) skal tolkes med forsiktighet. Hvis forholdet er i grenseområdet (1,8-2,2), skal det telles 40 ulike cellekjerner, og forholdet for de 40 cellekjernene skal beregnes. Hvis tellingen fortsetter å være på grensen, er resultatet for den andre evalueringen gyldig. Hvis tilgjengelig, skal den immunohistokjemiske fargingen av HER2 inkluderes for bedre orientering under den andre tellingen. I tvilstilfeller skal objektglassprøven telles på nytt. For grensetilfeller er det nødvendig med en konsultasjon mellom patologen og den behandlende legen. Begrensninger gastrisk 1. Kun for automatisert bruk på Dako Omnis-instrumenter. 2. Det er nødvendig med spesialopplæring for klargjøring av vev og objektglass og for tolkning av IQFISH-farging. Tolkninger av HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-farginger skal ikke utføres av personer med fargeblindhet. 3. FISH-resultater er avhengige av håndteringen og behandlingen av vevet før det farges. Uriktig fiksering, vasking, tørking, oppvarming eller snitting eller kontaminasjon fra annet vev eller væsker kan påvirke probehybridiseringen. Inkonsekvente resultater kan skyldes variasjoner i fikserings- og innstøpingsmetoder eller iboende uregelmessigheter i vevet. Metodeegenskaper gastrisk Hybridiseringseffektivitet Hybridiseringseffektivitet for HER2 IQFISH pharmdx ble undersøkt ved bruk av 180 formalinfikserte, parafininnstøpte vevssnitt testet på tre studiesteder. Alle de 180 vevssnittene kunne telles i henhold til retningslinjene for produkttelling. Hybridiseringseffektiviteten var 100 %. HER2/CEN-17-forholdene beregnet og brukt i studiene av ytelsesegenskaper, er basert på telling av signaler i 20 cellekjerner ved bruk av retningslinjene for telling gitt i avsnittet Tolkning av farging i denne bruksanvisningen. Analytisk sensitivitet Den analytiske sensitiviteten til HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ble undersøkt ved bruk av 20 ulike prøver fra gastrisk kreftadenokarsinom (10 prøver med amplifisert HER2-genstatus og 10 ikke-amplifiserte prøver). Forholdet mellom antallet HER2-signaler og CEN-17-signaler ble beregnet basert på telling av signaler i 20 cellekjerner i normale celler i vevsprøven. HER2/CEN- 17-forholdet for de 20 vevsprøvene av gastrisk kreftadenokarsinom var mellom 0,94 og 1,19. Analytisk spesifisitet HER2 DNA-probene i HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) har blitt sluttsekvensiert og tilordnet for å bekrefte en total dekning på 218 kb, inkludert HER2-genet. CEN-17 PNA-probene i HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) har blitt testet enkeltvis og i kombinasjon for å bekrefte deres spesifikke hybridisering til den sentromeriske regionen til kromosom 17. For å utelukke kryss-hybridisering til andre kromosomer enn kromosom 17, ble det gjennomført studier om metafasespredninger ifølge standard Dako kvalitetskontrollprosedyrer. Det ble evaluert totalt 275 metafasespredninger med distinkte signaler for spesifikk hybridisering av ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 38/54

39 HER2 DNA- og CEN-17 PNA-probeblandingene. I alle de 275 tilfellene var hybridiseringen spesifikk for kromosom 17. Det ble ikke observert krysshybridisering til steder på andre kromosomer i noen av de 275 tilfellene. Probespesifisiteten var da 100 % (275 av 275). Magekreft For å måle IQFISH-analysens evne til utelukkende å identifisere målstoffene HER2 og CEN-17 uten interferens fra andre stoffer utførte man studier av prøver av gastrisk adenokarsinom gjennom å utelukke HER2-og CEN-17-probene fra hybridiseringsblandingen og bare bruke hybridiseringsbufferen. Totalt ble det evaluert 20 prøver for tilstedeværelse av signaler som ikke var relatert til probeblandingen. Det ble ikke observert påvisning av andre kromosommål med nært relaterte stoffer i noen av de 20 prøvene. Robusthetsstudier Man testet robustheten til HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-analysen ved å variere PNAprobekonsentrasjon, målhentingstid, pepsininkubasjonstid, nedbrytningstid, hybridiseringstid og tid og temperatur for stringensvask. De ulike parametrene ble testet på tre ulike FFPEkreftvevsprøver fra gastrisk adenokarsinom og to FFPE-vevsprøver fra gastroøsofageal overgang (GEJ) (det var representert både amplifiserte og ikke-amplifiserte vevsprøver i hver gruppe). Alle parametre ble testet både under og over standard protokollinnstillinger, med unntak av PNAprobekonsentrasjon og temperatur for stringensvask, der den standard protokollinnstillingen var inkludert i oppsettet. Testparametrene var: PNA-probekonsentrasjon: Testet ved 100 % og +/ 17 %. Målhentingstid: Testet ved 13 minutter og 45 sekunder og 16 minutter og 15 sekunder. Pepsininkubasjonstid: Testet ved 14 minutter og 45 sekunder og 16 minutter og 15 sekunder. Nedbrytningstid: Testet ved 9 minutter og 45 sekunder og 10 minutter og 45 sekunder. Hybridiseringstid: Testet ved 70 minutter og 80 minutter. Tid for stringensvask: Testet ved 8 minutter og 45 sekunder og 11 minutter og 15 sekunder. Temp. for stringensvask: Testet ved 59 C, 61 C og 63 C. De tre PNA-probekonsentrasjonene ble vurdert i en fraksjonert eksperimentell design (DOE) (JMP-verktøy, SAS), som ble utført med tolv ulike fargingsprotokoller som angitt i tabell 12. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 39/54

40 Magekreft Tabell 12. Tolv ulike fargingsprotokoller brukt i robusthetsstudien. Testparameter Robusthetsprotokollnr. Målhentingstid (min) Pepsintid (min) Nedbrytningstid (min) Hybridiseringstid (min) Tid for stringensvask (min) Temp. for stringensvask ( 0 C) PNA-kons. i probeblanding 1 16,25 16,25 9, , % 2 13,75 14,75 10, , % 3 16,25 14,75 9, , % 4 13,75 14,75 10, , % 5 13,75 14,75 9, , % 6 13,75 16,25 10, , % 7 13,75 16,25 10, , % 8 16,25 14,75 9, , % 9 13,75 16,25 9, , % 10 16,25 16,25 10, , % 11 16,25 16,25 10, , % 12 16,25 14,75 10, , % Alle de fem vevsprøvene ble farget med alle de tolv protokollene. Utlesingen for robusthetsstudien var signalintensitet og morfologikvalitet. Alle protokollene produserte farging i alle vevsprøvene (60 totalt) med signaler som var klare, distinkte og enkle å evaluere, og som derfor egnet seg for signaltelling. I tillegg testet man virkningen av vevstykkelse på HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)- analyseresultatene ved å variere snittykkelsen til FFPE-vevsprøver frå magekreft. Det ble testet totalt seks påfølgende snitt fra prøver av gastrisk adenokarsinom med ulike tykkelser (2, 3, 4, 5, 6 og 7 µm) med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Den gjennomsnittlige varianskoeffisienten til HER2/CEN-17-forholdet var 3,9 % (området var 3,2 til 5,0 %). Reproduserbarhet Reproduserbarheten fra dag-til-dag og parti-til-parti innen laboratoriet ble testet med HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Studien ble utformet som en intern, blindet, randomisert studie av HER2/CEN-17-forhold ved bruk av snitt fra åtte ulike formalinfikserte, parafininnstøpte prøver fra magekreft, inkludert gastroøsofageal overgang (GEJ), med ulike nivåer av HER2- genamplifikasjon. De åtte prøvene hadde vært testet med HercepTest og representerte to prøver med HER2 IHC 0/1+, to prøver med HER2 IHC 2+, to prøver med HER2 IHC 3+ og to prøver med forhåndsbestemt HER2/CEN-17 FISH-forhold på mellom 1,5 og 2,5, innhentet ved bruk av HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731). Hver prøve ble farget med tre ulike partier av HER2 IQFISH pharmdx TM (Dako Omnis) på fem ikke påfølgende dager. Siden hver kombinasjon ble farget duplisert, ble det behandlet totalt 240 vevsfarginger. Variasjoner i forhold mellom dager og partier er illustrert i figur 8. Det ble analysert data ved bruk av Box-Cox-transformasjon via en modell for stokastisk virkning for bestemmelse av homogenitet for datavarians. Den totale variasjonskoeffisienten ble anslått til 6,5 %, og det ble funnet at dag- og partivariasjon bidro med henholdsvis 0,7 og 0,8%. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 40/54

41 Magekreft Figur 8. HER2/CEN-17-forhold innhentet i en studie av reproduserbarhet innen laboratoriet på HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), inkludert endepunkter for reproduserbarhet fra parti til parti og dag til dag. Middelverdien for hver vevsprøve er vist med en horisontal linje. I tillegg testet man reproduserbarheten fra dag til dag og sted til sted for HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) eksternt i en stratifisert og blindet studie gjennomført på tre steder (et sted i USA og to steder i Europa), på vevssnitt fra tolv ulike formalinfikserte, parafininnstøpte prøver fra gastrisk adenokarsinom, inkludert gastroøsofageal overgang (GEJ). Tre prøver var HER2 IHC 0/1+, tre prøver var HER2 IHC 2+, tre prøver var HER2 IHC 3+, og tre prøver hadde forhåndsbestemt HER2/CEN-17 FISH-forhold på mellom 1,5 og 2,5, innhentet ved bruk av HercepTest TM og HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731). Prøvene ble farget og analysert på studiestedene. Hver prøve ble farget minst sju ganger på sju ikke-påfølgende dager og talt av én observatør på hvert sted. 314 snitt ble farget og inkludert i den statistiske analysen. Det ble analysert data ved bruk av Box-Cox-transformasjon, og det ble beregnet varianskomponenter. Den totale varianskoeffisienten basert på øvre 95 %-konfidensgrense var 24 %. Figur 9 viser variasjon i HER2/CEN-17-forhold for dag og sted. Figur 9. Variabilitetsdiagram over HER2/CEN-17-forhold i ikke-transformerte enheter innhentet i studien av reproduserbarheten fra dag til dag og sted til sted av HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) på vevsprøver fra magekreft. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-analysen ble testet for reproduserbarhet fra observatør til observatør som en del av den internt utførte metodesammenligningsstudien ved bruk av tre observatører for uavhengige tellinger av de fargede prøvene. Det ble testet reproduserbarhet på 139 ulike prøver av gastrisk adenokarsinom med enten ikke-amplifisert eller amplifisert HER2- genstatus. Det ble analysert data ved bruk av Box-Cox-transformasjon. Den gjennomsnittlige variasjonskoeffisienten fra observatør til observatør var 18 %. Prøvene av gastrisk ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 41/54

42 Magekreft adenokarsinom bestod av 96,4 % reseksjons- og 5,6 % biopsiprøver. 81,3 % av prøvene ble tatt fra magen, og 18,7 % var fra gastroøsofageal overgang. Repeterbarhet Man testet repeterbarheten innen laboratoriet for HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) med påfølgende snitt fra åtte prøver av gastrisk adenokarsinom med enten ikkeamplifisert eller amplifisert HER2-genstatus. Det ble testet vevsduplikater på fem ikkepåfølgende dager med tre ulike partier på totalt 240 objektglass (120 dupliserte snitt). Modellen for stokastisk virkning ble brukt for dataanalyse og resulterte i varians som kan tilskrives dager og partier (se studien av intern reproduserbarhet ovenfor). Restvariansen tilsvarer variansen mellom kopier og dermed repeterbarhet. Den øvre 95 %- konfidensgrensen for koeffisienten for repeterbarhet var 7,1 %. Metodesammenligningsstudie Sammenligning av HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) med HER2 IQFISH pharmdx (K5731) Studien omfattet 140 prøver av magekreft bestående av de ulike vevstypene i gastrisk adenokarsinom, dvs. mage eller gastroøsofageal overgang (GEJ) og reseksjoner eller biopsier med homogen eller heterogen signaldistribusjon (fokal eller mosaikk) som vist i tabell 13. Tabell 13. Fordeling av prøver ved magekreft (mage eller GEJ), kategori av signaldistribusjon (homogen eller heterogen) og vevstype (reseksjon eller biopsi). Antall prøver Antall prøver Vevstype Antall prøver Mage 113 Homogen 58 Reseksjon 134 Magekrefttype Signaldistribusjon Gastroøsofageal overgang (GEJ) 27 Heterogen fokal Heterogen mosaikk Biopsi 6 Totalt 140 Totalt 140 Totalt 140 Prøvene bestod av 76 HER2-ikke-amplifiserte tilfeller og 64 HER2-amplifiserte tilfeller med kjent HercepTest -resultat som vist i Tabell 14. Tabell 14. Fordeling av prøver basert på HercepTest -resultat og HER2 FISH-resultat innhentet med HER2 FISH pharmdx Kit (K5731). HercepTest Totalt fargingsresultat n HER2 FISH-status Amplifisert Ikke-amplifisert Total FISH-testede prøver Resultater av krysstabuleringen av HER2-status innhentet med de to analysene med beregning av total prosentoverensstemmelse (OPA), positiv prosentoverensstemmelse (PPA) og negativ prosentoverensstemmelse (NPA) er vist i Tabell 15. Figur 10 viser korrelasjon mellom HER2/CEN-17-forhold ved bruk av de to analysene. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 42/54

43 Magekreft Tabell 15. Krysstabulering av HER2-genstatus innhentet ved bruk av HER2 IQFISH pharmdx (K5731) og HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Ikkeamplifisert HER2- genstatus (Dako Omnis) Ikke-amplifisert HER2-genstatus (K5731) Amplifisert Totalt Amplifisert Totalt OPA: 99,3 % PPA: 98,4 % NPA: 100 % Figur 10. Korrelasjon mellom HER2/CEN-17-forhold fra HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) og HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731) på 140 prøver av magekreft (lineær tilpasning: y = 0,06 + 0,97 * x. R 2 = 0,97. Vektet med inversvarians for å muliggjøre lineær tilpasning). 95 %-konfidensintervallet for den gjennomsnittlige forskjellen mellom de to fargingsmetodene ved HER2/CEN-17-forhold = 2, ble funnet å være [0,007, 0,022]. Det betyr at det ikke forventes en forskjell på mer enn 2 %. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 43/54

44 Magekreft Kliniske data Den kliniske sikkerheten og effektiviteten til trastuzumab (Herceptin ) har blitt demonstrert i BO18255-studien (ToGA-forsøket. en open-label, randomisert, multisenter fase III-studie av trastuzumab i kombinasjon med cisplatin og et fluoropyrimidin (capecitabin eller 5-fluorouracil) (FC+H) kontra bare kjemoterapi (FC) som førstelinjebehandling for pasienter med HER2-positiv, fremskreden magekreft) (28). Studien ble utformet som en open-label, randomisert, multisenter fase III-studie hos HER2-positive pasienter med fremskredent gastrisk adenokarsinom eller adenokarsinom i gastroøsofageal overgang. I BO18255-studien ble HER2-positiv definert enten som IHC-positiv (3+) ved bruk av HercepTest (Dako) og/eller FISH-positiv (HER2/CEN-17 2,0) ved bruk av HER2 FISH pharmdx Kit (Dako). Etter opptak i studien ble pasientene randomisert til å motta kjemoterapi (5-FU eller capecitabine og cisplatin) eller kjemoterapi pluss trastuzumab. Den viktigste effektivitetsmålingen var total overlevelse (OS overall survival) analysert med stratifisert loggrangeringstest. Den endelige OS-analysen basert på 351 dødsfall var statistisk signifikant (nominelt signifikansnivå på 0,0193). Ett år etter den endelige analysen ble det i tillegg utført en oppdatert OS-analyse. Gjennomsnittlig total overlevelse på 13,5 måneder på Herceptin pluss kjemoterapiarmen var betydelig lengre enn medianen for total overlevelse på 11,0 måneder bare på kjemoterapiarmen. Effektivitetsresultatene både for den endelige og den oppdaterte analysen er oppsummert i tabell 16 og figur 11. Tabell 16. Total overlevelse i Intention to Treat (ITT)-populasjon. Endelig total overlevelse Nr. Dødsfall (%) Gjennomsnittlig 95 % CI (mnd.) Fareforhold 95 % CI p-verdi*, tosidig Oppdatert total overlevelse Nr. Dødsfall (%) Gjennomsnittlig 95 % CI (mnd.) Fareforhold 95 % CI FC-arm N = (62,2 %) 11,0 (9,4, 12,5) 227 (76,7 %) 11,7 (10,3, 13,0) *Sammenligning med det nominelle signifikansnivået på 0,0193 0,73 (0,60, 0,91) 0,0038* 0,80 (0,67, 0,97) FC- + H-arm N = (56,0 %) 13,5 (11,7, 15,7) 221 (74,2 %) 13,1 (11,9, 15,1) ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 44/54

45 Magekreft Figur 11. Oppdatert total overlevelse hos pasienter med metastatisk magekreft En undersøkende analyse av OS basert på testing av genamplifikasjon (FISH) og proteinoveruttrykk (IHC) er oppsummert i tabell 17. Tabell 17. Undersøkende analyse av HER2-status med resultater for oppdatert total overlevelse. FISH+ / IHC 0, 1+-undergruppe (N = 133) Nr. Dødsfall / n (%) Gjennomsnittlig OS-varighet (mnd.) 95 % CI (mnd.) FC N = 296 a 57/71 (80,3 %) 8,8 (6,4, 11,7) FC + H N = 298 b 56/62 (90,3 %) 8,3 (6,2, 10,7) Fareforhold (95 % CI) 1,33 (092, 1,92) FISH+ / IHC2+-undergruppe (N = 160) Nr. Dødsfall / n (%) Gjennomsnittlig OS-varighet (mnd.) 95 % CI (mnd.) 65/80 (81 %) 10,8 (6,8, 12,8) 64/80 (80%) 12,3 (9,5, 15,7) Fareforhold (95 % CI) 0,78 (0,55, 1,10) FISH+ eller FISH-/IHC3+ c -undergruppe (N = 294) 104/143 (73 %) Nr. Dødsfall / n (%) 13,2 Gjennomsnittlig OS-varighet (mnd.) (11,5, 15,2) 95 % CI (mnd.) Fareforhold (95 % CI) 0,66 (0,5, 0,87) 96/151 (64 %) 18,0 (15,5, 21,2) Gjennomsnittlig overlevelse ble beregnet ut fra Kaplan-Meier-kurver. a To pasienter på FC-armen som var FISH+, men hadde ukjent IHC-status, ble utelukket fra analysen. b Fem pasienter på Herceptin -armen som var FISH+, men hadde ukjent IHC-status, ble utelukket fra analysen. c Inkluderer 6 pasienter på kjemoterapiarmen, 10 pasienter på Herceptin -armen med FISH-, IHC3+ og 8 pasienter på kjemoterapiarmen, åtte pasienter på Herceptin -armen med ukjent FISH-status, IHC3+. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 45/54

46 Magekreft Feilsøking gastrisk Problem Sannsynlig årsak Foreslått handling 1. Ingen signaler eller svake signaler 1a. Reagensene har vært utsatt for høye temperaturer under forsendelse eller lagring 1b. Mikroskopet fungerer ikke som det skal Feil filtersett Feil lampe For gammel kvikksølvlampe Skitne og/eller sprukne samlelinser Uegnet immersjonsolje 1a. Kontroller lagringsforholdene. Kontroller om det var igjen tørris da forsendelsene av IQISH-probeblanding og pepsin ble mottatt. Kontroller at reagensene har blitt lagret som angitt. 1b. Kontroller mikroskopet, og kontroller at de brukte filtrene egner seg for bruk med probeblandingens fluorokromer, og at kvikksølvlampen er riktig og ikke har blitt brukt utover forventet levetid (se tillegg 5). Kontakt den lokale mikroskopsforhandleren hvis du er i tvil. 1c. Bleke signaler 1c. Unngå lang mikroskopisk undersøkelse, og minimer eksponering for sterke lyskilder. 1d. Buffere identifisert feil 1d. Bytt volumbufferne, og sørg for riktig registrering (på arbeidsstasjonen) og identifikasjon (på berøringsskjermen) av volumbufferne. Se den grunnleggende brukerhåndboken for Dako Omnis for mer informasjon. Merk: ISH Pre-Treatment Solution er grønn, og ISH Stringent Wash Buffer er gul. 2. Områder uten signal 2. Det har kommet til luftbobler under montering 2. Unngå luftbobler. Hvis dette oppdages, banker man dem forsiktig bort med en pinsett. 3. Overflødig bakgrunnsfarging 3a. Feil vevsfiksering 3a. Sørg for at det kun brukes formalinfikserte, parafininnstøpte vevssnitt. 3b. Langvarig eksponering av hybridisert snitt for sterkt lys. 3b. Unngå lang mikroskopisk undersøkelse, og minimer eksponeringen for sterkt lys. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 46/54

47 Problem Sannsynlig årsak Foreslått handling 4. Dårlig vevsmorfologi Magekreft 4a. Feil pepsinbehandling 4a. Bytt til en annen av de tre fargingsprotokollene. Sørg for at ISH Pepsin lagres ved riktig temperatur. 4b. For lang pepsinbehandling eller svært tynne snitt kan føre til at det dukker opp fantomceller eller smultringceller. 4b. Prøv med en fargingsprotokoll med kortere pepsininkubasjonstid. Kontroller at snittykkelsen er 3 6 µm. 5. Høyt nivå av autofluorescens på objektglass, inkludert områder uten FFPE-vev 5. Bruk av utløpte eller ikke anbefalte objektglass. 5. Kontroller at objektglassene er i henhold til spesifikasjonene. Kontroller at objektglassene ikke har passert utløpsdatoen. MERK: Kontakt Dakos tekniske tjenester for ytterligere hjelp hvis problemet ikke kan tilskrives noen av årsakene ovenfor, eller hvis den foreslåtte løsningen ikke løser problemet. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 47/54

48 Magekreft Tillegg 3 gastrisk HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), kode GM333 Scoringsskjema Kjøringsdato: Logg-ID for fargingskjøring: HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-parti: Prøve-ID: Karakterisering av signaldistribusjon i vev: Homogen: Heterogen fokal: eller heterogen mosaikk: Signaltelling i 20 cellekjerner Cellekjernenr. HER2- score (rød) CEN-17- score (grønn) Cellekjernenr. HER2- score (rød) CEN-17- score (grønn) Totalt (1 10) Totalt (11 20) For bestemmelse av HER2/CEN-17-forholdet teller man antallet HER2-signaler og antallet CEN-17-signaler i de samme 20 cellekjernene og deler det totale antallet HER2- signaler med det totale antallet CEN-17-signaler. Hvis HER2/CEN-17-forholdet er i grenseområdet (1,8 2,2), skal det telles 40 ulike cellekjerner, og forholdet for de 40 cellekjernene skal beregnes på nytt (se skjemaet for gjentatt scoring i tillegg 4). Et forhold på eller i nærheten av grenseverdien (1,8 2,2) skal tolkes med forsiktighet (se tellingsveiledningen). ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 48/54

49 Magekreft Total score (1 20) HER2 CEN-17 HER2/CEN-17- forhold Forhold < 2: HER2-genamplifikasjon ble ikke observert Forhold 2: HER2-genamplifikasjon ble observert Dato og signatur, tekniker: Dato og signatur, patolog: Se Tolkning av farging for retningslinjer for telling. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 49/54

50 Magekreft Tillegg 4 Gastrisk HER2 IQFISH pharmdx, kode GM333 Nytellingsscoringsskjema Kjøringsdato: Logg-ID for fargingskjøring: HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)-parti: Prøve-ID: Signaler i 40 ekstra cellekjerner (1 40) HER2 (rødt) CEN17 (grønt) HER2 (rødt) CEN-17 (grønt) HER2 (rødt) CEN-17 (grønt) Cellekjernenr. Cellekjernenr. Cellekjernenr. Cellekjernenr. HER2 (rødt) CEN-17 (grønt) Totalt (1 10) Totalt (11 20) Totalt (21 30) Totalt (31 40) For bestemmelse av HER2/CEN-17-forholdet teller man antallet HER2-signaler og antallet CEN-17- signaler i de samme 40 cellekjernene og deler det totale antallet HER2-signaler med det totale antallet CEN-17-signaler. Rapporter total score fra de 1 40 cellekjernene i tabellen nedenfor. Total score (1-40) HER2 CEN-17 HER2/CEN-17-forhold Forhold < 2: HER2-genamplifikasjon ble ikke observert Forhold 2: HER2-genamplifikasjon ble observert Dato og signatur, tekniker: Dato og signatur, patolog: Se Tolkning av farging for retningslinjer for telling. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 50/54

51 Magekreft Tillegg 5 Gastrisk HER2 IQFISH pharmdx, kode GM333 Fluorescensmikroskop spesifikasjoner Dako anbefaler følgende utstyr for bruk med HER2 IQFISH pharmdx, (Dako Omnis), GM333: 1. Mikroskoptype Epifluorescensmikroskop 2. Lampe 100 watt kvikksølvlampe (hold oversikt over brennetid) 3. Mål Til screening av vevet er 16X- eller 20X-oljeimmersjonsobjektiver egnet For høy strømforstørrelse og signaltelling anbefales kun oljeimmersjonsobjektiver, f.eks. 100x. 4. Filtre Filtrene er individuelt utformet for spesifikke fluorokromer og må velges tilsvarende. Dako anbefaler bruk av et spesifikt DAPI-filter i kombinasjon med et Texas Red/FITC-dobbeltfilter av høy kvalitet. DAPI-filter, f.eks. Chroma-filter nr Texas Red/FITC-FITC dobbeltfilter, f.eks. Omega Optical-filter nr. XF53 eller Chromafilter nr Texas Red- og FITC-enkeltfiltre kan brukes for bekreftelse og for telling. Fluorokrom Eksitasjonsbølgelengde Emisjonsbølgelengde FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filtre er spesifikke for hver mikroskoptype, og bruk av egnede filtre er avgjørende for tolkningen. Kontakt mikroskopleverandøren eller Dako-representanten ved behov for mer informasjon. 5. Olje Ikke-fluorescerende olje Forholdsregler En 50 watts kvikksølvlampe anbefales ikke Rodaminfiltre kan ikke brukes Trippelfiltre anbefales ikke Et ikke-optimalisert mikroskop kan forårsake problemer ved avlesing av fluorescenssignalene Det er viktig at lyskilden ikke har passert utløpsdatoen, og at den er riktig rettet inn og fokusert. Kunder skal overvåke kvikksølvlampen og følge produsentens anbefalinger. Mikroskopet skal være vedlikeholdt og kvikksølvlampen justert før tolkning av resultater. Prøv å utsette prøven for så lite eksitasjonslys som mulig for å minimere blekningen av det fluorescerende lyset. Vi anbefaler at du drøfter oppsettet av det bestemte mikroskopet med produsenten før den fluorescerende in situ-hybridiseringen startes. Du kan også se litteraturen. ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 51/54

52 Referanser 1. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science. 1985;230: Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet. 1997;76: Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, Thor A, Chen LC, Smith HS, et al. ERBB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89: King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science. 1985;229: Persons DL, Bui MM, Lowery MC, Mark HF, Yung JF, Birkmeier JM, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of HER-2/neu amplification in breast cancer: a multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci. 2000;30: Rennstam K, Baldetorp B, Kytola S, Tanner M, Isola J. Chromosomal rearrangements and oncogene amplification precede aneuploidization in the genetic evolution of breast cancer. Cancer Res. 2001;61: Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol. 1999;9: Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 1987;235: Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, Clark GM, Ferno M, Fuqua SA, et al. HER-2/neu amplification predicts poor survival in node-positive breast cancer. Cancer Res. 1990;50: Ross JS, Slodkowska EA, Symmans WF et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-her-2 therapy and personalized medicine. Oncologist 2009;14: Nichols DW, Wolff DJ, Self S, Metcalf JS, Jacobs D, Kneuper-Hall R, et al. A testing algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer. Ann Clin Lab Sci. 2002;32: Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol. 2003;16: Nielsen PE, Egholm M, editors. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Norfolk NR18 0EH, England: Horizon Scientific Press Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, FR 7163, February Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 52/54

53 17. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer. 2001;92: Ellis IO, Dowsett M, Bartlett J, Walker R, Cooke T, Gullick W, et al. Recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol. 2000;53: Hanna W. Testing for HER2 status. Oncology. 2001;61 Suppl 2: Ginestier C, Charafe-Jauffret E, Penault-Llorca F, Geneix J, Adelaide J, Chaffanet M, et al. Comparative multi-methodological measurement of ERBB2 status in breast cancer. J Pathol. 2004;202(3): Olsen KE, Knudsen H, Rasmussen BB, Baslev E, Knoop A, Ejlertsen B, et al. Amplification of HER2 and TOP2A and deletion of TOP2A genes in breast cancer investigated by new FISH probes. Acta Oncol. 2004;59: Jorgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology. 2010;78: Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mori K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol. 2007;59: Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh do Y, Im SA, Lee D, et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol. 2008;32: Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol. 2005;27: Tanner M, Hollmen M, Junttila TT, Kapanen AI, Tommola S, Soini Y, et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol. 2005;16: Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A, et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet. 2010; 376(9742): Hofmann M, Stoss O, Shi D, Buttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology. 2008;52: ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 53/54

54 Symbolforklaringer Katalognummer Temperaturbegrensing Bruk innen Medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk Unngå sollys (se avsnittet om oppbevaring) Produsent Se bruksanvisningen Partikode GHS-piktogram (se avsnittet om forholdsregler) Produsert av: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Danmark Tlf Faks Forhandlet i USA av: Dako North America Inc Via Real Carpinteria, CA 93013, USA Tlf. 805/ , Gratis: 800/ Bestillingsinformasjon Tlf. 800/ Faks 805/ Tekniske tjenester: Tlf. 800/ ( ) P04125NO_01_GM333/ s. 54/54