RHD-typing fra føtalt DNA i mors blod St Olavs Hospital, Trondheim Nasjonal Blodbankkonferanse, Juni 2015

Transkript

1 RHD-typing fra føtalt DNA i mors blod St Olavs Hospital, Trondheim Nasjonal Blodbankkonferanse, Juni 2015 Ketil Thorstensen, Avdeling for Medisinsk Biokjemi

2 Bakgrunn RhD-proteinet og RHD-genet Sirkulerende DNA (eg. Nukleinsyrer) Testen

3 FUNDAMENT Det er ca svangerskap pr. år i Norge Av disse er ca. 15% (9000) med RhD negative mødre. Før 1970 var det nye Rh-immuniseringer pr. år (3-4%) Etter 1970, da anti-d profylakse ble startet (i.m. injeksjon av anti-d til mor innen 72 t etter fødsel av RhD positivt barn) sank tallet til (0.5%) I noen land gis nå anti-d under svangerskapet til alle RhD negative gravide, noe som senker antallet Rh-immuniseringer ytterligere, men som i ca. 40% av tilfellene er unødvendig. Medikamentet er dyrt, og det er i globalt underskudd RHD-typing av føtalt DNA i mors plasma vil gi nesten 100% treffsikkerhet, vil kunne brukes til å gi anti-d profylakse i svangerskapet, samt fjerne mesteparten (98%) av unødvendige anti-d injeksjoner

4 RhD-proteinet og RHD-genet Rhesus faktor RhD D-antigen (1939) weak D svakt uttrykt D (1946) partial D nedsatt antigenisitet, kvalitative varianter av D-antigen (1953) RhCE nesten identisk (>90%) med RhD Finnes kun i membranen til RBC Funksjon: Usikkert, men muligens ione-transport (ammonium)

5 Figure 2 - The Rhesus protein in the erythrocyte membrane. Both Rhesus proteins show 417 amino acids, shown here as circles. Mature proteins in the membrane lack the first amino acid. The amino acid substitutions which distinguish the RhD from the RhCE protein are shown in yellow, with the four amino acids which code for the C antigen in green and the one which codes for the E antigen in black. The single amino acid substitutions which code for partial D are in blue, those which code for weak D are in red. Willy A. Flegel (2007) The genetics of the Rhesus blood group system Blood Transfus 5: 50-57

6 GENET/GENENE RHCE beskrevet 1990 er det evolusjonsmessig opprinnelige RHD beskrevet 1992 oppstått som følge av genduplisering i utviklingen av pattedyr RHD- oppstått under utviklingen av hominider, er årsak til D negativ fenotype Organiseringen av RHCE og RHD genene forklarer bakgrunnen for hvordan både D-negativ og weak D oppstår

7 Duplication of the RH gene and deletion of the RHD gene. * The ancestral condition is shown as the RH gene locus in the mouse. The single RH gene is adjacent to the three genes SMP1, P29-associated protein (P) and NPD014 (N). * Duplication created a second, reversed RH gene in humans, which is located between N and SMP1. * At the insertion points before and after the RHD gene is a DNA segment about 9,000 nucleotides or base pairs (bp) long. * The two DNA segments flank the RHD gene and are termed the upstream or downstream Rhesus box. * In the RHD positive haplotype, the RHD gene could be lost again through recombination (next figure). Willy A. Flegel (2007) The genetics of the Rhesus blood group system Blood Transfus 5: 50-57

8 Deletion of the RHD gene. Deletion of the RHD gene resulted from recombination between an upstream and a downstream Rhesus box on two different chromosomes. This is termed an unequal crossover. When the two crossed strands separate (from A over the recombination site to B), the DNA at the RH gene site completely lacks the RHD gene (C). This haplotype (C) occurs in about 41% of the population. An individual homozygous for this haplotype (about 17% are) is D-negative. Willy A. Flegel (2007) The genetics of the Rhesus blood group system Blood Transfus 5: 50-57

9 partial D Category DVI as a result of gene conversion. The two RH genes lie on their chromosome pointing in opposite directions. (A) When the chromosome folds, the two RH genes are adjacent, now pointing in the same direction. This configuration allows gene conversion, whereby a DNA segment is transferred from one gene to another. The middle section of the RHD gene (yellow) is substituted by the corresponding homologous section of the RHCE gene (green) (B) This type of gene conversion is responsible for the RHD-CE(3-6)-D allele, which codes for the D category VI of the molecular type 3 (DVI type 3). (C) Exons 1 to 10 are drawn on both RH genes. Due to the contrary directions, the terminal exons of the two RH genes (RHD and RHCE exon 10) lie closest to each other. On the RHD gene, exons 3 to 6 are substituted by the homologous exons of the RHCE gene. Willy A. Flegel (2007) The genetics of the Rhesus blood group system Blood Transfus 5: 50-57

10 Plasma + plater Mononukleære celler Ficoll + Granuloc.. RBC Wapner R (2012) The next generation. Pdf-slides for teaching purposes.

11

12

13 Konsentrasjon av føtalt DNA i plasma øker utover i svangerskapet Estimat av total konsentrasjon av sirkulerende DNA varierer, men med et gjennomsnitt på ca 30 ng/ml Føtalt DNA utgjør 5 40% av total DNA, dvs ng/ml Føtalt DNA elimineres fra plasma i løpet av få timer etter fødselen

14 Principles of circulating fetal DNA analysis for prenatal diagnosis of single-gene disorders. a Release of fetal DNA into the maternal circulation. The numbers of paternally (red) and maternally inherited (green) DNA molecules are equal. b In maternal plasma, fetal DNA molecules circulate among a background of maternal DNA. Because the fetal DNA allele inherited from the mother (green) is genetically identical to the background maternal sequences (green), the allele inherited from the father (red) is the most readily distinguishable fetal-specific sequence in maternal plasma. c Non-invasive prenatal assessment of the fetal genotype could be made on the basis of the positive detection of a molecular feature (yellow star) that is unique to the paternally inherited fetal allele. Examples include the Y chromosome, RHD blood antigen (when the mother is RHD-negative) and paternally inherited mutations or polymorphisms. d Alternatively, non-invasive prenatal assessment could be made on the basis of excluding the inheritance of a molecular feature (yellow star) that is unique to the paternally inherited fetal allele. For example, assessment of an autosomal recessive disease could be achieved by excluding the fetal inheritance of the paternal mutation if mother and father carry different mutations. If they both carry an identical mutation, the disease could be excluded in the fetus through the detection of a polymorphism that is uniquely linked to the paternal wild-type allele.

15 TESTEN Fetus Rh+ Fetus Rh-

16 Bakgrunn: RhD-negativ (--) mor, potensielt RhD-positivt foster far ++ (45%) foster D-positivt (+-) (100%) i ca. 45% av svangerskap far +- (40%) foster D-positivt (+-) (50%) i ca. 20% av svangerskap far -- (15%) foster D-negativt (--) (100%) i ca. 35% av svangerskap Påvis RHD-genet i DNA fra fosteret foster er RHD+ Kan gjøres vha PCR enkel tankegang

17 Basert på metodikk beskrevet i: Report of the first nationally implemented clinical routine screening for fetal RHD in D- pregnant women to ascertain the requirement for antenatal RhD prophylaxis. Frederik Banch Clausen, Mette Christiansen, Rudi Steffensen, Steffen Jørgensen, Christian Nielsen,Marianne Antonius Jakobsen, Rikke Dyhrberg Madsen, Karina Jensen, Grethe Risum Krog,Klaus Rieneck, Ulrik Sprogøe, Keld Mikkelsen Homburg, Niels Grunnet,and Morten Hanefeld Dziegiel TRANSFUSION Volume 52, April 2012 og i samarbeid med Avdeling for Immunologi & Transfusjonsmedisin, OuS, Ullevål (Kirsten Sørensen, Cigdem A. Akkøk)

18 UTPRØVNING AV METODIKK FOR PÅVISNING AV RHD-GENET I cffdna (samarbeid med AIT v/aurora Espinosa) Plasmaprøver av RhD negative gravide uke og til AIT Resten av plasma til RHD-analyse Ekstra sentrifugering, x G Isoler DNA på MagnaPure robot Bruk 5 μl isolert DNA i PCR * PCR for exon 7 og 10 i duplex, med TaqMan-prober Triplikater GAPDH som kontroll-gen PCR-produkt RHD-genet påvist Fosteret er RHD+ Ikke PCR-produkt RHD-genet ikke påvist Fosteret er RHD Data fra PCR sammenholdes med data fra serologi på nyfødt * Plasma inneholder i gjennomsnitt 40 cffdna kopier/ml i 1. trimester og 250 kopier/ml i 3. trimester. Dette tilsvarer 5 25 kopier av RHD-genet pr. PCR-reaksjon

19 TOLKING Produkt i alle 3 replikater Positiv prøve Foster er RHD+ Ikke produkt i noen replikater Negativ prøve Foster er RHD Alle andre kombinasjoner Usikker prøve Reanalyser samme DNA Isoler nytt DNA Be om ny prøve

20 PRIMERE OG PROBER PROBE-PRINSIPP NAVN SEKVENS LOCUS RHDEX7S RHDEX7A 5 -CAGCTCCATCATGGGCTA CAA-3 5 -CCGGCTCCGACGGTATC-3 RHD EXON 7, SENS PRIMER RHD EXON 7, ANTISENS PRIMER *RHDEX7P 5 -FAM-CAGCACAATGTAGAT GATCTCTCCAAGCAG-BBQ-3' RHD EXON 7, PROBE RHDEX10S 5 -CCTCTCACTGTTGCCTGCA TT-3 RHD EXON 10, SENS PRIMER RHDEX10A 5 -AGTGCCTGCGCGAACATT-3 RHD EXON 10, ANTISENS PRIMER *RHDEX10P 5 -FAM-TACGTGAGAAACGCTC ATGACAGCAAAGTC-BBQ-3 RHD EXON 10, PROBE GAPDHS GAPDHA 5 -CCCCACACACATGCACTTA CC-3 5 -CCTAGTCCCAGGGCTTTGA TT-3 GAPDH, SENS PRIMER GAPDH, ANTISENS PRIMER *GAPDHP 5 -FAM-AAAGAGCTAGGAAGG ACAGGCAACTTGGC-BBQ-3 GAPDH, PROBE

21 EKSEMPLER PÅ PCR-KURVER Positiv Usikker Negativ

22 STED Nederland Danmark Sverige Finland St Olav Ullevål UKE > PERIODE Fra Juli mnd i Antall % Antall % Antall % Antall % Antall % Antall % SP SN FP FN US TOTALT

23 Kompliserende faktorer: Ikke produkt sant eller falskt negativ foster? er føtalt DNA tilstede? - SRY (bare gutter!) - annen sikker markør fra far eller foster - forskjell mor/barn mht metylering Falsk negativ mor: Mor er RhD negativ, men RHD-gen påvist (mye produkt) - weak D? - RHDΨ? 37 bp ins i exon 4 frameshift lavt uttrykk i membran (vanlig i Afrika) - nonsens mutasjon i exon 6 tidlig stop null protein -DEL splice site mutasjon meget lavt uttrykk i membran (30% i Øst-Asia) Mest et analytisk problem. Liten klinisk betydning som følge av noen få ekstra anti-d profylakse

24 KONKLUSJONER 1. Vi har analyse som kan påvise RHD-genet i cellefritt føtalt DNA fra mors plasma 2. Analysen har best resultater etter svangerskapsuke 20 med ca. 1% usikre tester, og svært få falske negative og falske positive resultater. Dette er omtrent tilsvarende som i andre land og større studier 3. Analysen er klar til å tas i bruk