En oppdatering på arbeid med pancreas disease (PD) ved UiB. Linda Andersen

Transkript

1 PD En oppdatering på arbeid med pancreas disease (PD) ved UiB Linda Andersen

2 Pankreassykdom (PD) virussykdom hos laksefisk Forårsaket av salmonide alfavirus (SAV) 6 subtyper (SAV-6) Norge: kun SAV3 Norge; sykdom i sjø hos laks og regnbueørret Gir skader i bukspyttkjertel, hjerte og muskel

3 PD En oppdatering på arbeid med pancreas disease ved UiB 2 stipendiater: Marius Karlsen ( vår 20) Linda Andersen ( vår 20) + André Bratland (fullføringsfase) 2 masterstudenter: Sven Skotheim ( vår 2009) Ellen Sandvik Berg ( vår 2009)

4 PhD-prosjekt André Bratland; Alfavirus (Togaviridae) fra laksefisk i norsk oppdrett. Karakterisering, Potensiell vertikal overføring av NSAV i oppdrettslaks. vertikal overføring og studie av vevs-/ celletropisme". André Bratland, Are Nylund (submitted) Journal of Aquatic Animal Health Kan en følge viruset gjennom alle produksjonsstadiene?

5 Studie : Vertikal overføring i normal produksjonssyklus Stamfisk (26 92); 4 mnd ferskvann Fulgte kjønnsprodukter/ avkom inntil år i sjø; PD-diagnose Real-time RT-PCR Resultat; 0 2; positive. 2 SAV-positive øyerogn 4 SAV-positive yngel Ingen positive parr, presmolt, smolt/postsmolt. Ett anlegg som hadde mottatt smolt fra egg fra stamfisken i dette studiet; PDutbrudd i apr 2007 (i endemisk område) Vertikal overføring (definisjon); smitte fra foreldre til avkom Virus er. Inne i egget 2. I gonadevæske eller på utsiden av egget/ i melke

6 Studie 2- vertikal overføring Tidlig kjønnsmodne laks (22 9); rett fra sw. PD-utbrudd noen mnd tidligere. Embryo ble desinf. (Buffodine), ved 33 d C fraktet til UIBs fasiliteter. Øyerogn ved 262 d C + yngel etter 542, 724 og 843 d C etter befruktning ble undersøkt vha real-time RT-PCR. Resultat; 2 7 );SAV positive, positivt egg (før befruktning, N = 220 stk) positivt øyerogn (N = 220). 2 yngel SAV positive (N =430 stk)

7 Studie 3- screening av smolt SAV funnet i ferskvann (Nylund et al 2003) Hos Brunørret (Salmo trutta) parr i elver i Norge Fylke Rogaland Hordaland År N 4 Pos 2 (H.Plarre,pers.com) Hos brunørret i elver i Irland (N. Ruane et al 2008) Sogn og Fjordane av 35 anlegg inneholdt SAV positive individer!! Møre og Romsdal (2007; SAV i 2-4 g yngel for.gang i Nordland (0 av 4) og Troms ( av 0). Egg fra Hordaland, ingen sw tilsetning Nord-Trøndelag Nordland Troms Finnmark Total 35 6

8 Konklusjoner: Studie og 2 (vertikal overføring): Vanskelig å følge virus gjennom alle produksjonsstadiene Kan ikke sikkert konkludere med at vertikal overføring finner sted Andre studier tyder på det (Castric et al 2005) Nye forsøk med badsmitte bør gjøres!! Studie 3 (smoltscreening): - Virus til stede i flere smoltproduksjonsanlegg i en rekke fylker pga laks gyter i elvene kan en ikke avgjøre om det er grunnet horisontal eller vertikal spredning) - Konsekvenser? Utbrudd utenfor endemisk område grunnet smolttransport? - Tiltak; screening av smolt før flytting

9 Mål: PhD-prosjekt Marius Karlsen: Funksjonelle studier av SAV3 Samarbeid NVH (E.Rimstad), NVI (B.Dannevig). Identifisering og karakterisering av proteiner som er involvert i cytotoxisitet 2. Utvikling av et revers genetikk system for SAV3 (subtype 3) for å kartlegge funksjonene til gener med hittil ukjente oppgaver

10 PhD-prosjekt Marius Karlsen: 3. Utvikle et rekombinant SAV som ekspresjonssystem for fremmed RNA i fiskeceller, fortrinnsvis med tanke på vaksineutvikling og/eller terapi finne ut hvordan SAV forholder seg til celler som allerede er smittet av andre virus (superinfeksjon/dobbelinfeksjon) ( Masterstudent Sven Skotheim)

11 PhD-prosjekt prosjekt: : Linda Andersen Alfavirus i laksefisk; patogenese, replikasjon og celletropisme Mål: Identifisere målceller Identifisere introduksjonsvei/ exit for SAV i laks Smittedynamikk; effekt av reduserte oksygennivåer på alvorlighetsgraden til PD. Koinfeksjonsstudie (SAV/ PGI/ HSMB).

12 Målceller for PD-viruset: leting etter nålen i høystakken Alfavirus generelt har mange ulike Målceller Glatt og stripet muskulatur Synoviale celler (i ledd) Nerveceller Brune fettceller Chondrocytter (i brusk) Celler av lymfoid opphav (Strauss & Strauss 994, Griffin 200) Muskel-satelittceller (Ozden 2007) SAV? Skader i eksokrin pankreas, hjerte og muskel...men i hvilke celler?

13 Målsetting: introduksjonsvei/ utskillelse ( shedding ) for SAV i laks Via hvilket organ kommer viruset inn i laksen? Gjeller? Hud? Baktarm? Lakselus? Luktenerver? VEEV Finner? IHNV Gjeller? Fordøyelseskanal? Blod(lus)? Urin? Kjønnsprodukter? Hud/Slim? (Herpes simplex virus; asymptomatisk shedding) Virusutskillelse under viremi?

14 Identifisering av målceller/ introduksjonsvei for virus Nye verktøy; Digoxigenin (DIG)-merket probe (mot nsp2-genet) for in situ RNA- RNA hybridisering: SAV3/ SAV2 Masterstudent Ellen Sandvik Berg Brukes til: a) Smitte plommesekkyngel med SAV whole mount b) Skal benyttes på vev/organer tatt ut fra smitteforsøk parafinsnitt c) Replikasjon i lakselus? Evt undersøke andre potensielle vektorer (f.eks evertebrater i marin/akvatisk fauna)

15 Kan alvorlighetsgraden til PD bli påvirket av reduserte oksygennivåer er (hypoksi( hypoksi)? Smitteforsøk 2008 Kan alvorlighetsgraden til PD påvirkes av: A) Sirkulasjonssvikt som følge av HSMB? B) respirasjonsstress pga PGI? C) Reduserte oksygennivåer?

16 PD Ascites,hyperemi og blødninger i det periviscerale fettvevet Nekroser i eksokrin pankreas og i myocytter i hjerte og skjelettmuskulatur. Multifokale levernekroser SAV PD: Photo: FoMAS

17 PGI Antakelig multifaktorell sykdom; parasitter (flagellater, ciliater, amøber etc.), ulike bakterier og virus Ichthyobodo spp. Neoparamoeba sp. Hypertrofi og Piscichlamydia salmonis hyperplasi av gjelleepitel Chlamydialiknende bakterier (EpiteliocystisInflammasjon og agent) sirkulasjonssvikt Salmonid Gill Poxvirus (SGPV) Atlantic salmon paramyxovirus (ASPV) Photos: Are Nylund

18 HSMI Blekt hjerte, gul lever, ascites, svullen milt og punktblødninger i perivisceralt fettvev Inflammasjon og nekrose av myocytter i hjerte-og skjelettmuskulatur HSS type I HSS type II HSS-partikler Etiologi? Bakterier? Virus? Smittsom sykdom (overførbar)! Erythrocytic inclusion body syndrome (EIBS) Photos: Are Nylund

19 Hvorfor redusert oksygen? Større og mer kompakte anlegg krever mer av miljøet!! Strømforhold Fisketetthet Begroing. Også: høye vanntemperaturer i vår-sommer-høst månedene

20 Hvorfor gjellesykdom (PGI)? Screening avdekket store mengder av Piscichlamydia sp. (og andre PGI-agens) ofte i forbindelse med SAV Vev gjelle gjelle gjelle gjelle nsp 44,7 36,95 neg 39,4 Pch 27,9 27,04 25,6 26,4 EFa 9,23 8,7 8,95 9,6 Gjellesykdom medfører redusert oksygenopptak gjelle gjelle gjelle neg neg 37,0 27,62 28,02 27,74 8,87 9,38 20,49 gjelle neg 23,3 20,8 gjelle 40,33 26,9 8,42 gjelle 39, 24,43 8,7 gjelle neg 22,32 7,79 gjelle 35,0 23,5 8,6

21 Hvorfor HSMB? HSMB; gir alvorlig sirkulasjonssvikt; påvirker oksygenopptak og -transport i vev SAV gir skader i samme organer (synergistisk effekt?) Eller antagonistisk/ ekskluderende effekt? HSMB SAV

22 Forsøksdesign Hypotesen skal testes i 3 deler: ) SAV infisert laks skal holdes ved reduserte oksygennivåer (60-65 %) 2) Ko-infeksjon av laks med SAV og PGI infeksiøst materiale for å se om gjellesykdom vil øke alvorlighetsgraden til PD 3) Ko-infeksjon av laks med SAV og HSMB-infeksiøst materiale for å se om sirkulasjonssvikt vil øke alvorlighetsgraden til PD

23 Forsøksdesign N = 65 per kar, N total; 780 fisk, i.p smitte Kontroll SAV HSMB PGI Normal O Kontroll SAV HSMB PGI 60 % O2 Alle eksperimentelle grupper holdes under normale og reduserte oksygenforhold (60-65 %)

24 Eksperimentelt design 9 SAV + PGI SAV + PGI 0 SAV + HSMB Normal O 2 2 SAV + HSMB 260 fisk i.p smittet med PGI eller HSMB infeksiøst materiale Gjeller henges over natt i PGI kar ( 3 dager etter i.p smitte) Ved etablert sykdom (PGI/HSMB); her; 4 uker etter smitte, i.p. smittes 390 fisk med SAV (SAVH30/04 P6) 60 % O 2

25 Prøvetaking - for overvåking av smittedynamikk i vann og vev Histologi Real-time RT-PCR in situ hybridisering Bakterieutstryk Blod (plasma kortisol) Vannprøver; mod. Av VIRADEL-metoden elektropositive filtre H.salinarum

26 Foreløpige resultater Relativ mengde viralt RNA Vannfiltrering; Mengde i kar med virus SAV RNA i vann infisert fisk ved 45 normal oksygen: 40 vann filtrert annenhver dag etter smitte i 3 35 uker; 30 Funn; fiskegruppen skilte ut virus - Virustiter 4-0 dpi (topp 25 ved 6 dpi) Infeksjonsvindu? Kan nok variere med: - Smittevei - Isolat? - Vanntemperatur - Fiskestørrelse nsp Dager etter sm itte

27 Foreløpige resultater; dødelighet Antall døde i % 45 % 40 % 35 % 30 % 25 % 20 % 5 % 0 % 5 % 0 % 0 Kumulativ dødelighet hypoxiforsøk SAV-smitte 28 dpi Høyest dødelighet i SAV+ PGI gruppe, samt PGI ved red.o2 Dager etter smitte 33 % 36 % 40 % KNO K60 SNO S60 PNO P60 HNO H60 PSNO PS60 HSNO HS60 Oksygenreduksjon 30 dpi

28 Påstand: Den største årsaken til dødelighet i forbindelse med PD kommer ikke nødvendigvis av sykdommen i seg selv, men av at fisk allerede svekket av PD invaderes av opportunistiske bakterier.