LOKALISERING AV TITANDIOKSID NANOPARTIKLER I GINGIVALE FIBROBLASTER

Transkript

1 NANO100 STUDENTHOSPITERING LOKALISERING AV TITANDIOKSID NANOPARTIKLER I GINGIVALE FIBROBLASTER 30. april 2014 Anita Lien, Marius Helland og Erik Larsen Bachelorprogram i Nanoteknologi Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet Allégaten 41, 5007 Bergen Universitetet i Bergen - Veiledere: Julia Schölermann (PhD), Mihaela R. Cimpan (Førsteamanuensis), Paul Johan Høl (PhD) og Nils Roar Gjerdet (PhD) Institutt for klinisk odontologi - Biomaterialer Årstadveien 19, 5009 Bergen Universitetet i Bergen

2 Ansvarsområder: Introduksjon: Marius, metoder: Erik, resultat: Anita. 1 Introduksjon 1.1 Bakgrunnsinformasjon I dag ser man i større og større grad at man benytter nanopartikler (NP) og nanomaterialer i produkter man omgir seg i hverdagen. Disse produktene har fått forbedret egenskaper, og man nyter godt av nyvinningene nanoteknologi har gitt. Ett av de mest brukte materialene er titandioksid (TiO 2 ). Hvert år brukes omtrent 46 millioner tonn titandioksid som fargestoff i maling, lakk, papir, plastprodukter, blekk, mat, medisin (piller) og i mange tannkremer. Dette er på grunn av stoffets opasitet (ugjennomsiktighet), som blant annet i maling gjør at det har blitt kalt det perfekte hvitt [1]. Stoffet brukes også i kosmetikkindustrien; deriblant i tatoveringer, sminkeprodukter og i solkremer. Det brukes i så å si all solkrem på grunn av dets høye brytningsindeks, som gjør at det absorberer mesteparten av de skadelige UV-strålene, og omdanner dem til energi i form av varme. UV-absorberingsegenskapene har også ført til stor anvendelse i plastprodukter, der absorberingen gjør at plasten unngår skade fra UV-stråler [1]. Med nye fremskritt kommer også ulemper, nemlig de uønskete effektene av nanoteknologiske nyvinninger. I dag brukes begrepet nanotoksikologi som en samlebetegnelse på bivirkninger og skadelige effekter av nanopartikler og nanomaterialer. Levende organismer blir jevnlig utsatt for nanopartikler i naturen, disse oppstår blant annet i skogbranner, under vulkanutbrudd, produksjon av biogen magnetitt og virus er ofte på nanoskala. Det er store forskjeller på de fysikalske og kjemiske egenskapene til naturlige partikler og kunstig fremstilte partikler på nanoskalaen. Dette på grunn at naturlige partikler har stor variasjon i størrelse og svært kompleks kjemisk natur, mens de kunstig fremstilte partiklene har svært spesifikk størrelse og presise egenskaper. Når det gjelder toksikologiske egenskaper, er det fortsatt mye usikkerhet og mye forskning som gjenstår [2]. 1.2 Titandioksid i implantater Titan og dets legeringer brukes ofte i implantater, der det på overflaten dannes en film av titandioksid (TiO 2 ) over tid [3]. Denne filmen har lav motstandsdyktighet mot slitasje, og som et resultat av slitasjen frigis det partikler på både mikro- og nanonivå. Disse partiklene kan bli frigitt til det omkringliggende myke og harde vevet, og nå fjerntliggende organer som lever, milt og lunger. Bekymringene rundt helse- og miljørisikoen av disse partiklene er økende, og tallrike in vitro (latin: på glass) studier rapporterer at nanopartikler er mer biologisk aktive enn tilsvarende mikropartikler av samme kjemiske sammensetning [3]. Hittil har mange studier rundt TiO 2 konsentrert seg om å bestemme de fysikalsk-kjemiske egenskapene til nanopartiklene, og lite in vitro forskning på å undersøke deres biologiske effekter og hvordan partiklene oppfører og fordeler seg i kroppen [4]. 1.3 Problemstilling I odontologi brukes titan og titan-baserte legeringer i implantater, og det dannes titandioksid på overflaten av implantatene, 1

3 som beskytter mot korrosjon. Titan brukes i implantater fordi den er lett, korrosjonsresistent og har gode mekaniske og biologiske effekter. Dette er egenskaper som karakteriserer bulktitan, og til sammenligning kan nanopartiklene ha forskjellige egenskaper enn bulkmaterialer. Titanimplantater som erstatter tenner befinner seg i kjevebeinet, der nanopartiklene kan oppstå på grunn av slitasje og abrasjon (mekanisk skuring av en overflate)[5]. Problemstillingen er å observere om gingivale fibroblaster (GF) tar opp TiO 2 nanopartikler, og i så fall hvor nanopartiklene kan lokaliseres i cellene. I odontologisk sammenheng er det ofte interessant å se hvordan cellene fra bindevevet i tannkjøttet, som på fagspråket kalles gingivale fibroblaster (GF), blir påvirket. Hvilke konsekvenser NP kan ha på tannkjøttvevet og hvilke helserisiko det kan medbringe, er andre aktuelle forskningsfelt. størrelse og krystallografisk struktur. Titandioksid eksisterer i flere forskjellige faser (anatase, rutile og brookite) [4], og disse har forskjellige toksiske egenskaper. Partikler under 10 nm eksisterer stort sett i den mer photoaktive fasen anatase, mens større partikler eksisterer enten som ren anatase eller rutile, eller en mix av disse. Studier har vist at anatase TiO 2 NP er ca. 100 ganger mer toksiske enn tilsvarende rutile TiO 2 NP [6]. I tabellen kan man se hvilke NP som karakteriseres som rutile, anatase og mixture. Gjennomsnittlig diameter i cellekulturvæske til de forskjellige NP er nevnt under Hydrodynamic diameter*. Dette er størrelsen til NP i løsemiddel. Figuren er redigert i den forstand at (D) Ti4 er fjernet fra original figur, da denne partikkelen ikke ble brukt i studiet. 1.5 Fremgangsmåte 1.4 Hvordan blir celler i kroppen påvirket av Nanopartikler? Vi brukte 6 typer kommersielle TiO 2 nanopartikler som hadde forskjellige fysikalsk-kjemiske egenskaper, og som blir referert til som Ti1-3 og Ti5-7. Dette er de samme partiklene som ble brukt i artikkelen Allouni et al. 2012, med unntak av Ti4 (Tabell 1). Vi ønsket å se om NP i det hele tatt ble tatt opp i GF celler, og i så fall fastsette lokaliseringen, og deretter se om NP fordelte seg i f.eks. membranen, cytoplasmaet eller omkring nucleus (cellekjernen). De seks forskjellige partiklene vi har brukt har forskjellige fysikalsk-kjemiske egenskaper, blant annet form, For å ha en celleprøve å eksponere for NP, ble det dyrket GF celler fra tannkjøttvevet til en anonym donor. Etter 48 timer, da cellene ble 70-80% konfluente, ble de eksponert for nanopartiklene. 100% konfluent vil si at hele overflaten er dekket av celler, og at det ikke er mer rom for vekst. Cellene ble eksponert av fortynninger av stamløsningene, for lettere å detektere mulig agglomerering i cellene. For å klargjøre prøvene for mikroskopering med mørkefeltmikroskopi, ble det brukt en metode som heter Immunofluorescence. Det er en prosses som både fargelegger og fikserer cellene for å hemme videre vekst og celledeling. 2

4 Tabell 1: Fysikalsk-kjemiske data av TiO 2 NP brukt i studiet. Ti4 er ikke brukt i studiet (Tabellen er hentet fra [4]) 3

5 Figur 1: TEM bilder som viser morfologi og størrelse til TiO 2 NP. (A) Ti1, (B) Ti2, (C)Ti3, (E) Ti5, (F) Ti6, (G) Ti7. (Bildet er redigert, hentet fra [4]) 2 Metoder 2.1 Tining av celler og cellekultur Cellene som er brukt er GF-celler hentet fra en anonymisert pasient sitt tannkjøttvev. Cellene ble lagret i cellebank (IKO, UiB, Bergen) i flytende nitrogen. Cellene ble tint i vannbad ved 37 grader Celsius. Etter tining ble cellene dyrket i 75 cm 2 cellekultur flasker, i Dulbecco s Modified Eagle s Medium (DMEM), supplert med 10% fetal bovine serum (FBS), ved 37 grader Celsius, ved normal luftfuktighet, tilsatt 5% CO 2 (g). 4

6 Cellekulturmedium ble skiftet ut etter 2 timer og 24 timer og cellene ble dyrket på glassplater i 48 timer før eksponering. ca. 2,5 minutter før eksponering av celler. Ved å vende på stamløsningene etter sonikeringen, oppnådde man at alle stamløsningene beholdt sin homogene tilstand før eksponeringen. 2.3 Eksponering av celler med TiO 2 NP Figur 2: Lysmikroskopi av GF celler før NP eksponering. Pil 1: celle som ikke har festet seg til glassplaten, pil 2: celle som har festet seg til glassplaten, pil 3: celle som ikke har festet seg til glassplaten (blir antatt som død) og pil 4: celle som har festet seg til glassplaten og utfoldet. 2.2 Stamløsning Det ble laget seks stamløsninger med NP 1,0g/L, henholdsvis Ti1, Ti2, Ti3, Ti5, Ti6 og Ti7, samt én kontroll løsning, Cntl, som inneholdt destillert H 2 O(l). Konsentrasjonsforholdet, 1:200, gjorde at cellene ble eksponert med en konsentrasjon cirka lik 5 mg/l NP. I Tabell 2 under kan man se de eksakte verdiene som ble veid inn ved hjelp av en finvekt: Tabell 2: Innveide verdier til stamløsningene Titan Totalt i kolbe Tilsatt vann i kolbe 1 0,0379g 38,0mL 2 0,0210g 21,0mL 3 0,0245g 22,0mL 5 0,0244g 24,5mL 6 0,0251g 25,2mL 7 0,0200g 20,0mL For å unngå agglomerering til større partikler i stamløsningene, ble løsningene ultrasonikert i Runde glassplater ble rengjort ved bruk av Piraña acid i ca. 20 minutter. Piraña acid består av 1 del H 2 O 2 (l) + 3 deler H 2 SO 4 (l). Etter rengjøringen ble glassplatene skylt med destillert H 2 O(l) og lagt i testbrønner. Cellene ble lagt på glassplatene med litt cellekulturmedium (DMEM) med 10% FBS for å unngå celle-uttørking. Direkte etter ultrasonikeringen ble det laget en fortynning av NP stamløsningene i cellekulturmedium (+FBS) og vann i cellekulturmedium til kontrollprøven. Mediumet i brønnene ble så skiftet ut til medium med NP og vann (kontroll). Eksponeringstiden varte i ca. 48 timer. I eksponeringstiden ble cellene oppbevart ved 37 grader Celsius, normal luftfuktighet, tilsatt 5% CO 2 (g). Da eksponeringstiden var utgått startet immunofluoresence-prosessen. 2.4 Immunofluoresence Immunoflouresence er en metode for å fiksere og farge cellekomponenter med fluorescente markører, brukt i forbindelse med fluorescens mikroskopi. Prinsippet bak Immunoflouresence går enkelt forklart ut på å farge ulike deler av cellene, slik at delene fremtrer ved bruk av mikroskopi. De ulike delene i cellene kan fargelegges med én bestemt farge, slik at man kan skille for eksempel nucleus fra cellemembran, og mitokondrier fra ribosomer, etc. Metoden som ble brukt er i hovedsak femdelt; Fixation, Quenching, Permeabilisation, Blocking og Antibody: 5

7 Fixation: få cellene i samme status. Det ble tilsatt 4% Performaldehyd (PFA) til glassplatene der cellene lå. PFA er et polymer av formalin, som krosslinker primære aminer med hverandre. Enkelt forklart får cellene et slags plastlag rundt seg som gjør at cellene i praksis ikke er levende, da cellene ikke kan celledele eller bevege seg. Plastlaget er i dette tilfellet proteiner som har reagert med PFA som kobler seg sammen rundt cellene som en slags hinne. Etter ca. 20 minutter ble glassplatene vasket med PBS (Phosphate buffered saline). Quenching: få bort all resterende formalin som er på prøveplaten etter fixation. Det ble tilsatt en blanding av 0,1 M Glysin og PBS til glassplatene. Glysin binder seg til primære aminer, slik at man kan fjerne overskudd av formalin. Etter ca. 20 minutter ble overskudd av formalin vasket med PBS. Permeabilisation: lage hull i cellemembranen, slik at inneliggende strukturer, som for eksempel nucleus, kan markeres. Det ble tilsatt en blanding 0,5% TritonX og PBS til glassplatene. TritonX er en type zwitterion (dipolar ion) som interagerer med cellemembranene og lager små hull i den. Det gjør at man spesifikt kan markere de delene av cellene man ønsker. Etter ca. 5 minutter ble TritonX vasket vekk med PBS. Blocking: gjøre klart til markeringen. Det ble tilsatt 3 % BSA (Bovine Serum Albumin). BSA er et protein som er svært uspesifikt, som fester seg til alle cellulære strukturer via ikke-kovalente bindinger. Senere vil et antistoff feste seg til proteinet, som kan detekteres ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Etter ca. 30 minutter ble overskudd av BSA vasket med PBS. Antibody: tilsette et antistoff eller et annet molekyl som er spesifikk for en bestemt del av cellen og dermed fortrenger BSA. I dette tilfellet ble det tilsatt et stoff som kalles DAPI. Konsentrasjonen av DAPI var 1:1000, i blanding med BSA og PBS. DAPI festet seg til A-T regioner på DNA som befinner seg i nucleus. DAPI fargela nucleus blå, fordi den har absorbsjonsmaksimum ved bølgelengde 358 nm (UV) og emmisjonsmaksimum ved bølgelengde 461 nm (blå). Siden DAPI satt på nucleus (DNA) fremstod nucleus som blå da fotoner fra mikroskopet traff DAPI molekylet og ble emittert ved bølgelengde 461 nm (blå) [7]. 2.5 Mørkefelt mikroskopi Systemet (CytoViva TM 130, Auburn, USA) består av en modifisert kondensor (en høy oppløselig belyser) koblet til et optisk mikroskop (Olympus, BX41 mikroskop) og til en kraftig lyskilde (EXFO120, Photonic Solution). Den høyoppløselige belyseren erstattet den vanlige lys-felt kondensoren (sirkulær C-kondensor) med en kardioide ringformet kondensor (sirkulær A-kondensor). Belyseren var koblet til en lyskilde med en (optical fibre) væskeleder, som tillater transport av lys uten intensitetstap, og minimerer den termiske effekten på levende systemer [4]. I tillegg var det koblet til et sett med lysfiltre på mikroskopet slik at fluorescens mikroskopi var mulig. Dette fremstilte et mer fokusert diffraksjonsmønster, som tillatt høy kontrast og høy signal-til-støy mørkefelt-lignende bilder, med en oppløsning på opptil 90 nm [8]. 6

8 Systemet var utformet slik at fotonene som ble sendt fra belyseren, ikke traff linsen med mindre lyset ble diffraktert i noe materie. Det er altså kun lyset som blir diffraktert av partikler, og de markerte substansene, som når frem til linsen og gir fluoresence. Nanopartiklene lyste opp pga. dets høye brytningsindeks og DAPI lyste opp pga. dets egenskaper [7]. Bildene i Figur 3 og Figur 4 ble tatt med både 40x nedsenket objektiv og 100x olje-nedsenket objektiv. 40x og 100x refererer til forstørrelsen på objektivene. Jo mer forstørring, desto mindre fotoner blir inkorporerert i systemet. De digitale bildene ble tatt med et kamera (model XLMCT, Dage-MTI, USA) og DageXponent programvare (v. 1.3, Dage-MTI, USA). 2.6 Bildebearbeiding Figur 3 og Figur 4 ble redigert ved hjelp av programvaren Fiji Is Just ImageJ [9]. Figurene ble noe modifisert ved hjelp av programvaren. Det ble blant annet gjort noen endringer i kontraster, skarphet og størrelser for å gjøre figurene mer presentable. Her påpekes det at alle bildene i Figur 3 og Figur 4 ble endret likt. Etter bilderedigering i Fiji Is Just ImageJ, ble programvaren Adobe R Illustrator R CC Tryout, versjon (64-bit) brukt videre til plassering og merking. Figur 1, Figur 2, Figur 3 og Figur 4 ble redigert ved hjelp av programvaren, der piler, tall, bokstaver, plasseringer og målestokker ble lagt inn ved hjelp av programvaren. 3 Resultat 3.1 Tilstand til celler før eksponering Cellene etter to timers vekst, se venstre side av Figur 2, observeres normale. Ser at en del celler har festet seg til underlaget, som vist av pil 2. Pil 1 peker mot en celle som ikke er festet til underlaget. Ser at cellene til høyre i Figur 2, som viser cellene etter 48 timers vekst, har festet seg til underlaget og utfoldet seg, som vist av pil 4. Cellene som har festet seg ser ut til være i normal tilstand, også etter celledeling. Det finnes også noen celler som ikke festet seg til underlaget (pil 3), disse kan være døde. 3.2 Stamløsninger av NP Alle TiO 2 stamløsninger ble observert homogene og snøhvite i fargen før løsningene ble fortynnet med cellekulturvæske. Det ble ikke observert noen form for agglomerering. Likevel ble det observert noen forskjeller i stamløsningene, som for eksempel at Ti6 var mer lettløselig enn Ti3 i destillert H 2 O(l). Dette skyldes antageligvis forskjellig form og struktur til NP, se Figur Lokalisering av NP Det første bildet (Cntl) i Figur 3 og 4 er kontrollceller eksponert med destillert vann i cellekulturvæske 1:200. Her er det bare nucleus som er lyst opp i blått (pil 1). Sammenlignet med Ti1-7 i Figur 3 og Figur 4, ser man tydelig at cellene har tatt opp de ulike partiklene (lyst opp i hvitt) slik som pil 2 viser. Ut i fra Figur 3 ser det ut som om cellene tar opp Ti5, Ti6 og Ti7 NP i større grad. Figur 4 viser derimot et større opptak av Ti2, Ti6 og Ti7. Resultatene av cellene eksponert for Ti3 har en større unøyaktighet fordi mikroskoperingen viste at prøven bestod av svært få celler. Det var ikke mulig å ta bilde med 100x, ettersom cellene 7

9 ikke ble detektert. Bildet i Figur 3 viser likevel at cellen har tatt opp noen nanopartikler, men det er vanskelig å fastslå i hvilken grad. Det observeres forøvrig at partiklene på alle bildene agglomererer i større grad rundt og nær nucleus, noe som enklest kan observeres i Figur 4. 8

10 Figur 3: Mørke felt mikroskopi av gingivale fibroblaster etter 48 timer eksponert med titandioksid nanopartikler. Bildene er tatt med 40x nedsenket objektiv. Pil 1: nucleus i kontrollprøven, pil 2: nanopartikler i eksponert prøve, pil 3: nucleus i eksponert prøve. 9

11 Figur 4: Mørke felt mikroskopi av gingivale fibroblaster etter 48 timer eksponert med titandioksid nanopartikler. Bildene er tatt med 100x olje-nedsenket objektiv. Pil 1: nucleus i kontrollprøven, pil 2: nanopartikler i eksponert prøve, pil 3: nucleus i eksponert prøve. 4 Diskusjon Som nevnt i resultatet tar cellene opp TiO 2 NP. Ettersom det ikke er mulig å se cellenes membraner på bildene, vil det finnes en usikkerhet i hvor stor grad nanopartiklene tas opp i cellen, og partikler som ikke kan lokaliseres nær nucleus, vil være vanskelig å plassere. Det kan også se ut som om noen av partiklene er i selve nucleus. Sannsynligvis er disse lokalisert på utsiden av membranen, men fordi bildet mangler dybde vil ikke dette kunne avgjøres utfra disse 10

12 resultatene. Det kommer likevel tydelig frem at alle de ulike TiO 2 nanopartiklene blir tatt opp og legger seg nær nucleus. I dette området er endoplasmatisk retikulum, som blant annet kan bryte ned giftstoffer. Figur 3 og Figur 4 gir litt variasjon i hvilke nanopartikler det er størst opptak av i cellene, dette skyldes at enkelte celler kan ha tatt opp mer enn andre. Dersom bildet et tatt i ett område eller av en celle som har større opptak enn gjennomsnittlig, kan det være årsaken. På en annen side viser begge figurene at Ti6 og Ti7 har noe større opptak. Dersom vi sammenligner partiklenes opptaksmengde med de fysikalsk-kjemiske egenskapene i Tabell 1, er det ingen åpenlys sammenheng om partiklene som er mest tatt opp er anatase, rutile eller mixture. Av litteratur ble det forventet at en blanding av anatase og rutile (mixture) TiO 2 NP har mest opptak i cellene [4]. Ti6 i Figur 4 bekrefter dette, men likevel er det for lite resultat i dette studiet til å hevde at det oppstår i større grad enn anatase og rutile. Ettersom bildene av Ti2 er litt usikre i Figur 3 og Figur 4, kan man ikke i dette studiet påvise at det er en sammenheng. Ved å måle den hydrodynamiske diameteren til partiklene kan graden av agglomerering og dets innvirkning på opptak i celler detekteres. Det ser man blant annet ved at Ti2, Ti5 og Ti7, som har større hydrodynamisk diameter, altså en større grad av agglomerering i cellene. Ti2 ser ut til å agglomerere mest. Partiklene kan sees som større enn den faktiske størrelsen fordi de har høy brytningsindeks. Siden partiklene har så høy brytningsindeks, vil de diffraktere mer lys, og derfor se større ut, jfr. 2.5 Mørkefeltmikroskopi. Likevel ser det ut som Ti2 partiklene har reflektert mer lys enn de andre partiklene, mye sannsynlig på grunn av små endringer i lysinstillingene på mikroskopet eller i programvaren Fiji Is Just ImageJ. Det er interessant at Ti1 og Ti6 har en relativt lik diameter, men ulikt opptak av NP. Én årsak kan være at den hydrodynamiske diameteren ikke har så stor innvirkning på opptaket alene. 5 Konklusjon Studiet viser at nanopartiklene blir tatt opp i cellene og havner nær nucleus - dette var forventet av litteraturen [4]. Cellene har høyere opptak av noen nanopartikler, spesielt Ti6 og Ti7. I dette studiet klarte man ikke å se en klar trend mellom opptak og de ulike fysiokjemiske egenskaper til partiklene. 6 Takk for hjelp Forfatterne ønsker å takke Universitetet i Bergen for godt hospiteringsopplegg og deres satsing på nanoteknologistudiet. Spesielt vil vi takke Knut J. Børve (PhD) for administrering og undervisning i NANO100 emnet. Vi ønsker også spesielt å takke Mihaela R. Cimpan (Førsteamanuensis) og Julia Schölermann (PhD) for veiledning, korrekturlesing og gjennomføring av hospiteringen, og til Paul J. Høl (PhD) for introduksjon og undervisning i forskningen på titandioksid hofteproteser. Vi ønsker å rette stor takk til Institutt for klinisk odontologi ved Universitetet i Bergen for deres gode mottagelse og gjestfrihet, samt lån av deres fasiliteter. 11

13 Referanser [1] J. Winkler, Titanium dioxide / Jochen Winkler. Hannover : Vincentz Verlag, Includes bibliographical references and index. [2] G. Oberdörster, E. Oberdörster, and J. Oberdörster, Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles, Environmental health perspectives, vol. 113, no. 7, p. 823, [3] Z. E. Allouni, M. R. Cimpan, P. J. Høl, T. Skodvin, and N. R. Gjerdet, Agglomeration and sedimentation of tio 2 nanoparticles in cell culture medium, Colloids and surfaces B: Biointerfaces, vol. 68, no. 1, pp , [4] Z. E. Allouni, P. J. Høl, M. A. Cauqui, N. R. Gjerdet, and M. R. Cimpan, Role of physicochemical characteristics in the uptake of tio 2 nanoparticles by fibroblasts, Toxicology In Vitro, vol. 26, no. 3, pp , [5] M. R. Cimpan and N. R. Gjerdet, Hvor trygt er nano?, vol. 136, no. 03, pp., [6] C. M. Sayes, R. Wahi, P. A. Kurian, Y. Liu, J. L. West, K. D. Ausman, D. B. Warheit, and V. L. Colvin, Correlating nanoscale titania structure with toxicity: a cytotoxicity and inflammatory response study with human dermal fibroblasts and human lung epithelial cells, Toxicological Sciences, vol. 92, no. 1, pp , [7] J. Kapuscinski, Dapi: a dna-specific fluorescent probe, Biotechnic & Histochemistry, vol. 70, no. 5, pp , [8] A. Vainrub, O. Pustovyy, and V. Vodyanoy, Resolution of 90 nm (λ/5) in an optical transmission microscope with an annular condenser, Optics letters, vol. 31, no. 19, pp , [9] J. Schindelin, I. Arganda-Carreras, E. Frise, V. Kaynig, M. Longair, T. Pietzsch, S. Preibisch, C. Rueden, S. Saalfeld, B. Schmid, et al., Fiji: an open-source platform for biological-image analysis, Nature methods, vol. 9, no. 7, pp ,