RESTMENGDER, FORBUDTE OG FORURENSENDE STOFFER I FISK. (Fremmedstoffprogrammet for fisk (96/23) ÅRSRAPPORT 2006

RESTMENGDER, FORBUDTE OG FORURENSENDE STOFFER I FISK (Fremmedstoffprogrammet for fisk (96/23) ÅRSRAPPORT 2006 Helge Torbjørn Hove, Kåre Julshamn, Amund Måge og Bjørn Tore Lunestad 1. september 2007 Nasjonalt institutt for ernærings- og sjømatforskning Adresse: Postboks 2029 Nordnes, 5817 Bergen, Norway Telefon: +47 55 90 51 00 Faks: +47 55 90 52 99 E-post: postmottak@nifes.no

2 2

3 OVERVÅKNINGSPROGRAM FOR MEDISINRESTER OG ANDRE FREMMEDSTOFFER I NORSKE AKVAKULTURPRODUKTER, ÅRSRAPPORT 2006 INNLEDNING... 4 ANTALL PRØVER PLANLAGT OG ANALYSERT I 2006... 5 TERMINOLOGI OG ENHETER... 6 ANALYSEMETODER... 8 Gruppe A-forbindelsene... 8 A6 forbindelser og annex iv... 9 Gruppe B forbindelsene... 9 B1, Antibakterielle forbindelser... 9 B2, Anthelmintika... 10 B3a, Organoklorforbindelser... 11 B3b, Organofosforforbindelser... 12 B3c, Elementanalyse ved ICP/MS (metallene)... 13 B3e, Fargestoff... 13 B3f, Andre forbindelser (antioksidanter)... 13 RESULTATER OG KOMMENTARER... 18 Gruppe A1 stoffer... 18 Gruppe A3 stoffer... 18 Gruppe A6 og annex IV stoffer... 18 Gruppe B1, antibakterielle stoffer... 19 Gruppe B2a, Anthelmintika... 19 Gruppe B3a, organoklorforbindelser... 20 Gruppe B3b, organofosforforbindelser... 24 Gruppe B3c, elementanalyse (metaller)... 24 Gruppe B3d, mykotoksiner... 25 Gruppe B3e, fargestoff (malakittgrønt)... 26 Gruppe B3f, andre forbindelser (syntetiske antioksidanter)... 26 KONKLUSJON... 27 3

Innledning Denne rapporten av 1. september 2007 erstatter en raport med samme tittel datert 1. juni 2007 da en feil ble oppdaget i avsnittet om PCB. Overvåkingsprogrammet for fremmedstoffer i oppdrettsfisk er en del av et større EU initiert overvåkingsprogram for animalske matvarer. Det er Mattilsynet som etter opprettelsen i 2004, er ansvarlig for at dette direktivet blir gjennomført i Norge. For den delen av animalsk matproduksjon som skjer på marin side (akvakultur) har NIFES fått ansvar for en stor del av det analyttiske arbeidet. NIFES har også ansvaret for sammenfating av rapporten for den marine del av programmet. Veterinærinstituttet har tilsvarende ansvar på landdyrsiden. Aktiviteten som er beskrevet i denne rapporten er gjennomført i henhold til kravene gitt i direktiv 96/23/EF On measures to monitor certain substances and residues thereof in live animals and animal products. Dette direktivet ble vedtatt i 1996. Fremmedstoffer innbefatter i denne sammenheng et utvalg fra følgende stoffklasser: Lovlig brukte legemidler til dyr i matproduksjon (antibakterielle midler og midler mot parasitter, stoffklassene B1 og B2), ulovlige legemidler (stoffklasse A6), stilbener (stoffklasse A1), steroider (stoffklasse A3), organiske klorforbindelser (stoffklasse B3a), organiske fosforforbindelser (stoffklasse B3b) og kjemiske elementer (stoffklasse B3c). Det ble også inkludert analyser av enkelte fargestoffer (stoffklasse B3e) og stoffklassen andre forbindelser (B3f). Denne årsrapporten sammenfatter analyseresultatene fra undersøkelser av muskel eller lever fra oppdrettsfisk i 2006. Ingen fôrprøver inngikk i prosjektet for 2006. Men noen fôrprøver ble analysert både for legemidler og mykotoksiner i fôrprogrammet. Analysene som er beskrevet i denne rapporten er utført ved Nasjonalt institutt for ernærings- og sjømatforskning (NIFES), Norsk Matanalyse sin avdeling i Ålesund og Hormonlaboratoriet ved Aker universitetssykehus. Prøvetakingen for 2006 baserte seg på planer som ble satt opp av Mattilsynet. Teknisk ansvarlig for programmet ved NIFES har vært Annette Bjordal og Eva Torgilstveit. Eva Torgilstveit har vært ansvarlig for prøvemottak, fordeling og prøveflyt, mens Elin Kronstad, Manfred Torsvik, Vidar Fauskanger i tillegg til Eva Torgilstveit har stått for prøve preparering. Lene K. Støten, vært ansvarlig for bestemmelse av medisinrester med kjemiske metoder i samarbeid med Merat Bezadzadeh. Karstein Heggstad, Tadesse T. Negsash, Dagmar Nordgård, Lene H. Johannessen, Edel Erdal, Per Erik Hagen og Kari Breisten Sæle har vært ansvarlig for prøveopparbeidelse og bestemmelse av organiske miljøgifter. Jorun Haugsnes, Siri Bargård, Tonja Lill Eidsvik og Berit Solli har utført bestemmelser av metaller som har inngått i programmet. Tone Galluzzi og Magne Stusdal har vært ansvarlige for analyser av antibakterielle midler ved hjelp av mikrobiologisk metodikk. Ved Norsk Matanalyse i Ålesund har Trygg Barnung og Kari Mette Tolås Veblungsnes vært ansvarlige for analyser av antibakterielle midler ved hjelp av mikrobiologisk metodikk.

5 5 Bestemmelsene av hormonlignende stoffer (stilbener og steroider) har vært utført ved Hormonlaboratoriet ved Aker universitetssykehus. Følgende personer var involvert i dette arbeidet: Berit Øen, Randi Aarsand, Kjersti Helle og Astrid Andersen. Antall prøver planlagt og analysert i 2006 I henhold til regelverket var det planlagt et prøveantall som tilsvarte produksjonskvantum i 2003: 1 prøve per 100 tonn for laks og regnbueørret og 1 prøve per ca 25 tonn for andre arter. Mattilsynet, ved Nasjonalt senter for fisk og sjømat, har vært ansvarlig for planlegging av prøveuttaket. Ved uttak ble prøvene anonymisert og de var bare merket med seglnummer ved ankomst til laboratoriene. I rapporten kan vi derfor ikke relatere analyseresultatene til regionen der prøvene kommer fra. Gruppe A-prøver skal brukes til analyse av virkestoff som er ulovlig å bruke til dyr i matproduksjon, og ble av den grunn tatt ut som filetprøver fra fisk fanget og slaktet på selve oppdrettsanlegget. Analysene skal avdekke eventuell ulovlig aktivitet og forvarsel blir ikke gitt til anleggene. Prøver kan tas i alle fiskenes vekstfaser, ikke bare av slakteklar fisk. B-prøvene analyseres for stoffer der grenseverdier er etablert eller tilbakeholdelsestid etter medisinering er fastsatt og for stoffer som av andre grunner er ønsket overvåket. Gruppe B-prøvene taes ut som stikkprøver av slaktet fisk på slakteri eller pakkeanleggene. Disse prøvene skal være representative for kommersiell fisk. Gruppe A og B stoffene er inndelt i undergrupper av forbindelser i henhold til gjeldende EU regelverk, og merkes som for eksempel A1 eller B3a. Denne inndelingen blir brukt i denne rapporten. Fiskefilet ble sendt inn i pakker hver med fem fisk fra samme merd eller samme parti. Ved ankomst til laboratoriet ble disse slått samme og homogenisert til en samleprøve. Bruken av samleprøve sikrer at et stort antall fisk kan inngå i overvåkingen, uten at antallet analyser behøver å være like stort. Samleprøver gir som resultat en analyseverdi som er lik middelverdien som ville fremkomme om de inngående prøvene var analysert enkeltvis. Leverprøver ble også sendt inn i pakker på fem fisk. Hver prøve avsettes i en vekstskål, som fem ulike vevsbiter, en fra hver fisk. Dette kan lett gi noe forvirring siden skålen tilsvarer den innsendte prøven på samme måte som samleprøvene for kjemisk analyse. Men i motsetning til samleprøvene for kjemisk analyse så ble hver enkelt leverbit (fisk) faktisk testet individuelt ved mikrobiologisk analyse. Tabell 2 (side 16) lister antall fisk som er datagrunnlaget for hver enkelt parameter. Summen av antall fisk i datagrunnlagene ble 5345 Antall analytiske målinger er 4325. 5

6 6 Terminologi og enheter I denne rapporten brukes ordet «filet» der det i tidligere års rapporter har vært brukt ordet «fiskemuskel». I 2005 ble prøvetakingsprosedyren endret til å ta ut hele fileten i stedet for kotelett. Tallene fra kotelett og filet er derfor fullt ut sammenlignbare. Bly, arsen, kadmium og kvikksølv er eksempler på tungmetaller. DDT, dioksiner, PCB er og toksafener er eksempler på organiske forbindelser som er lite nedbrytbare i naturen. Den engelske forkortelsen POP's, for «persistent organic pollutants» blir ofte brukt om denne typen forbindelser. Tørrvekt og våtvekt viser til hvorvidt prøven er tørket ved 105 C før veiing. Våtvekt betyr altså: Vekten av prøve i naturlig tilstand. I litteraturen brukes ofte enhetene/ skalaene ppm og ppb som mål på små konsentrasjoner av for eksempel medisinrester eller forurensing. Disse enhetene er som prosent og promille et utrykk for relativt mengdeforhold mellom to enheter i samme skala. Enheten ppm (part per million) betyr milliondeler (10-6 ) og ppb (part per billion) betyr milliarddeler (10-9 ). Enheten ng/g, nanogram per gram, vil derfor kunne skrives som ppb. Men globalt er ikke ordet milliard entydig forstått. Noen leser det som en million millioner (10 12 ) Det er derfor klokt å unngå enheten ppb. Forstavelsene deci (d), centi (c), milli (m), mikro (µ), nano (n) og pico (p) er internasjonalt entydige. Innholdet av tungmetallene har tradisjonelt vært rapportert som (mikrogram = 10-6 g) eller som mg/kg (milligram= 10-3 g) mens organiske miljøgifter ofte blir rapportert som ng/g (nanogram = 10-9 g). Det er verd å merke seg at enhetene og ng/g faktisk er like, de gir samme skala. Denne rapporten benytter om ikke annet er spesifisert. Dioksiner, furaner og dioksinliknende PCB måles i pg/g, tilsvarende ng/kg. Denne skalaen er en faktor på 1000 lavere enn. For bestemmelsesgrense eller kvantifiseringsgrense brukes den internasjonale forkortelsen LOQ, limit of quantitation. Dette til forskjell fra påvisningsgrense, LOD, limit of detection. Det er viktig å vite at dette er to ulike størrelser. LOQ er normalt en faktor på 3 til 3.3 ganger høyere enn LOD. En kan derfor omtrentlig regne seg fra den ene størrelsen til den andre. For forbudte forbindelser er LOD mest relevant siden enhver sikker påvisning (>95% sannsynlighet) ville være viktig informasjon. For miljøgifter er tilstedeværelsen oftest påvist tidligere. Spørsmålet er ikke lenger om forbindelsen finnes i prøven, men om den målte konsentrasjonen er et pålitelig tall. Da brukes LOQ som er nedre grense for sikker måling.. Nivåer som er så lave at de ikke kan kvantifiseres med akseptabel sikkerhet blir rapportert som: <LOQ. Med kongener vises det til de ulike forbindelsene innenfor klassene PCBer, dioksiner, furaner og toksafener. Betegnelsen kongener viser at det innad i hvar klasse er nært slektskap i molekylstruktur mellom forbindelsene. Kongenerne har ID-nummer for identifikasjon, for eksempel PCB-147 og TOX-62. 6

7 7 Forskjellene mellom kongenerne i samme klasse ligger i antall og posisjon av kloratomene i molekylet. Strukuren til ulike kongenere er ellers helt like 7

8 8 Analysemetoder Det benyttes anerkjente analysemetoder med moderne og avansert utrustning. Kun et fåtall av metodene er akkrediterte. Men også disse er kvalitetssikrete og pålitelige metoder. Kvalitetssikring: Til hver av disse metodene er det rutine at en kontrollprøve med kjent sammensetning kjøres som del av hver analyseserie (normalt det antall prøver som opparbeides en analysedag). Måleresultatet for kontrollprøven skal ligge innenfor definerte grenseverdier før resultatene til de andre prøvene i serien blir godkjente. For mange av metodene kjøres også blankanalyse rutinemessig. Dette er en fiktiv prøve uten prøvemateriale. Eventuelle positive verdier for denne prøven vil avdekke forurensinger i reagenser eller utrustning som vil kunne påvirke resultatene. Alle metodene verifiseres ved jevnlig å delta i sammenlignende laboratorieprøver (SLP), og ved å analysere sertifisert referansemateriale av relevant prøvemateriale (SRM). Resultatene for disse verifiseringene skal ligge innenfor definerte grenser før metoden godkjennes for fortsatt bruk. Det er samleprøver bestående av fem fisk som analyseres, om ikke annet blir skrevet. Bruk av samleprøver sikrer at datagrunnlag omfatter flere fisk. Ulempen ved bruk av samleprøver er at vi mister muligheten for å tallfeste variasjonen mellom enkeltfisk. Hver samleprøve kommer fra samme anlegg og samme merd. Den gir et tall som er representativ for merden på samme måte som om fem enkeltprøver ble analysert og middelverdi beregnet. Gruppe A-forbindelsene Gruppe A-prøver ble analysert for hormonlignende stoffer i gruppene stilbener (A1) og steroider (A3), for det ulovlige legemiddelet kloramfenikol (A6) og for fire nitrofuraner (annex iv). A1 stoffene som består av dietylstilbestrol, dienestrol og heksestrol ble analysert i Hormonlaboratoriet, Aker Universitetssykehus. A3 stoffene nortestosteron og α-/ß- trenbolone ble analysert samme sted. Analysemetoden består av en enzymatisk hydrolyse av prøvene, fulgt av ekstraksjon og avfetting. Hydrolyserte stoffer renses videre med væske/væske ekstraksjon og fast fase ekstraksjoner før derivatisering og endepunktsmåling med GC-MS. Om positive funn skal resultatene bekreftes. Prøvene renses da i tillegg på HPLC før derivatisering og kjøring på GC-MS. Denne analysen følger hovedprinsippene for Hormonlaboratoriets akkrediterte metode for påvisning av steroider og stilbener i muskelvev i ulike dyrearter. Kloramfenikol og nitrofuranene furazolidon, furaltadon, nitrofurantion og nitrofurazon, ble analysert ved NIFES. Malakittgrønt er et stoff som nå er klassifisert i gruppe B3E. Men det er en diskusjon om dette skal endres til gruppe A. Det er i dag ikke en forbudt forbindlse. Av datagrunnlaget i denne rapporten for malakittgrønt, og metabolitten leucoalakittgrønt er 125 fisk/ 25 samleprøver samlet inn på anleggene på samme måte som gruppe A prøvene. 8

9 9 A6 forbindelser og annex iv Kloramfenikol Den homogeniserte prøven ekstraheres med etylacetat og ekstraktet dampes til tørrhet. Det tilsettes saltvann. Fettet og fettløslige komponenter skilles fra analytten ved å vaske løsningen med heksan. Etylacetat tilsettes, og i det resulterende tofasesystemet skilles analytten fra vannløselige komponenter. Etylacetatløsningen dampes inn og prøven løses til slutt i mobilfase. Prøven analyseres på LC/MS med elektrospray ionisering (API-ES-MS) med negativt landete ionefragmenter (SIM). Nitrofuraner De fire forbindelser furaltadon, furazolidon, nitrofurantoin, nitrofurazon metaboliseres raskt. Det er derfor metabolitter som måles (ofte identifisert med kodene AMOZ, AOZ, AHD og SEM). Eventuelle moderforbindelser vil også bli målt om de skulle være tilstede. Den homogeniserte prøven ekstraheres med acetonitril. Fettet fjernes fra ekstraktet med heksan. Acetonitrilløsningen inndampes til tørrhet og løses i mobilfase. Forbindelsene bestemmes på omvendt fase HPLC med polymerkolonne. Deteksjon skjer ved "diode array" detektor, men måles primært ved 375 nm. Kvantifisering er basert på ekstern standard metode. Gruppe B forbindelsene B-prøvene ble analysert for antibakterielle substanser (B1), anthelmintika (B2a), organiske klorforbindelser (B3a), organiske fosforforbindelser (B3b), elementene (bly, kadmium og kvikksølv) (B3c) og fargestoffer (B3e). Alle stoffene under B ble analysert ved NIFES. Mikrobiologisk metode for lovlige antibakterielle midler (B1) ble dessuten utført ved Norsk matanalyses laboratorium i Ålesund. B1, Antibakterielle forbindelser Innhold av antibakterielle midler ble undersøkt med en 3-plate mikrobiologisk metode. Denne suppleres med HPLC basert analyse ved eventuelle positive funn. På hver plate avsettes leverprøver fra 5 forskjellige fisk. Ulikt de kjemiske metodene er det for hver innsendt prøve fem individuelle fisk som måles. Kjemisk analyse av Oksolinsyre og flumequin Prøvene ekstraheres i basisk miljø med acetonitril og saltes deretter ut i vannfase med natriumklorid. Etter surgjøring av vannfasen ekstraheres analytten over i kloroform og analyseres ved hjelp av høytrykks væskekromatografi (LC-MS-API-ES). Kvantifisering skjer ved bruk av intern standard metode. 9

10 10 B2, Anthelmintika Diflubenzuron og teflulubenzuron Prøven tilsettes intern standard og ekstraheres med aceton. Ekstraktet vaskes med heptan, før det dampes inn. Det løses i heptan før rensing på silicakolonne med dietyleter/heptan mobilfase. Etter inndamping løses prøven i acetonitril/vann og analyseres i reversfase HPLC. Detektesjon skjer ved electron spray negative ion MS (API-ES-MS), med negativt landete ionefragmenter (SIM). Kvantifisering skjer ved intern standard metode. Ivermectin og emamectin Prøven tilsettes intern standard og ekstraheres med acetonitril. Ekstraktet tilsettes vann og vaskes med heptan. Den polare fasen renses på polymer SPE kolonne og elueres med acetonitril/vann. Prøven analyseres i reversfase HPLC og detekteres ved electron spray negative ion MS (API-ES-MS), med negativt landete ionefragmenter (SIM). Kvantifisering skjer ved intern standard metode. Cypermethrin Prøven ekstraherses med aceton. Vannløselige komponenter fjernes ved væske/væske separasjon mellom aceton/saltvann og sykloheksan. Fettet fjernes fra sykloheksanfasen ved rensing på en GPC kolonne. Siste finrensing skjer på fluresil SPE kolonne. Prøven analyseres og kvantifiseres på GC/MS med electron impact ionisering og SIM måling av positivt ladde fragmention. Kvantifiseringen skjer ved intern standard metode. Deltamethrin Homogenisert prøve ekstraherses med aceton. Vannløselige komponenter fjernes fra ekstraktet ved væske/væske separasjon mellom aceton/saltvann og sykloheksan. Sykloheksanfasen inneholder fettfraksjonen inklusive deltamethrin. Fettet fjernes fra denne ved rensing på en GPC kolonne. Siste finrensing skjer på fluresil SPE kolonne. Prøven analyseres og kvantifiseres på GC/MS med electron impact ionisering og SIM måling av positivt ladde ionefragmenter. Kvantifiseringen skjer ved intern standard metode. Fenbendazole Homogenisert prøve ekstraheres med metanol/vann. Ekstraktet vaskes med petroleumseter. Det polare ekstraktet tilsettes natriumdihydrogenfosfat og en blanding av dietyleter/ etylacetat før risting og sentrifugering. Øvre sjikt samles opp og dampes inn. Prøven løses deretter i mobilfase før analyse på reversfase HPLC. Deteksjon skjer ved MS (LC/MS ved positive ion APCI/MS ). Kvantifisering skjer ved ekstern standard metode. 10

11 11 Praziquantel Homogenisert prøve ekstraheres med aceton/vann. Etter sentrifugering av ekstraktet ekstraheres analytten over i en blanding av dietyleter og heksan. Etter inndamping løses prøven i mobilfase og analyseres på omvendt fase HPLC med UV detektor ved 205 nm bølgelengde. Kvantifisering skjer ved ekstern standard metode. B3a, Organoklorforbindelser PCB-7 og pesticidene DDT Også PCB og DDT er grupper av forbindelser som inneholder flere nær beslektede forbindelser. PCB har hele 209 kongenere. Av disse er et antall på 7 valgt ut av ICES til marine overvåkingsformål. Denne listen er kjent som PCB-7, eller som ICES-7. I tillegg til forbindelsene på denne listen blir noen PCB kongenere bestemt som del av dioksinmetoden. Disse omtales senere. Prosedyre: Ca. 3 g prøve (våtvekt) veies inn, og en blanding av egnete PCB kongenere blandes inn som internstandarder før prøven frysetørkes. Porøsitetsmiddel (hydromatrix) blandes i før ekstraksjon med heksan under hevet trykk og temperatur i en ASE 300 (Sunnyvale, CA, USA). Fettet fjernes oksidativt ved at et lag svovelsur silica er lagt inn i ekstraksjonskolonnen under prøven. Heksanen dampes av i en TurboVap Concentration Workstation, (Zymark, USA) og erstattes med isooktan. Prøven konsentreres og er klar for analyse på gasskromatograf/massespektrometer (GC/MS). I gasskromatografen skjer den analytiske atskillelsen av de enkelte stoffer i prøven, mens massespektrometeret identifiserer og mengdebestemmer de enkelte komponentene. PCB-7 er et utvalg bestående av følgende kongenere: PCB- 28, -52, -101, -118, -138, -153 og -180. Dioksiner (PCDD/PCDF), non-orto PCB og mono-orto-pcb: Metoden er en tilpasning av US-EPA (Environmental Protection Agency) metoder nr 1613 og 1668. Prøven homogeniseres og fettinnholdet bestemmes. En mengde homogenisert prøve tilsvarende ca. 3 g fett veies inn, og en blanding av 13 C merkete kongenere blandes i som internstandarder før prøven frysetørkes. Porøsitetsmiddel (hydromatrix) tilsettes før ekstraksjon med heksan under hevet trykk og temperatur i en ASE 300 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA). I opprensingen på en Power-Prep (FMS-USA) fjernes først fettet ved nedbryting på svovelsur silica. Deretter skjer det en suksessiv kromatografisk opprensing ved inn og utkopling av tre kolonner: "Multi layered silica", basisk alumina og aktivt kull. Mobilfasen skiftes suksessivt: Heksan, 2% diklormetan (DCM) i heksan, 50% DCM i heksan, etylacetat og til slutt backflush med toluen. PCDD/PCDF og non-orto PCB (NO-PCB) eluerer i toluenfraksjonen. Mono-orto PCB (MO- PCB) eluerer i en DCM/ heksan fraksjon. Etter inndamping i en TurboVap Concentration Workstation, (Zymark, USA) av aktuell fraksjon til 10 µl tilsettes to 13 C merkete kongenere som recovery standards før analyse på høyoppløselig GC/MS (HRGC/HRMS). Metoden kvantifiserer til sammen 17 kongenere av 11

12 12 PCDD/PCDF valgt ut av Verdens Helserådets liste (WHO), fire kongenere med non-orto substitusjonsmønster: PCB -77, 81, 126 og 169 og åtte kongenere med mono-orto substitusjonsmønster: PCB 105, 114, 118, 123, 156, 157, 167 og 189. Resultatene er gitt som Upperbound sum av toksiske ekvivalenter (TE). Upperbound vil si at verdier som er lavere enn kvantifiseringsgrensen i summen erstattes med kvantifiseringsgrensen. Denne måten å summere på sikrer at metodiske begrensninger ikke gir kunstig lave tall. Dette er i samsvar med den praksis EU krever for dioksindata. Konsentrasjonen oppgis i toksiske ekvivalenter, TE (engelsk TEQ). Dette indikerer at alle konsentrasjoner er multiplisert med en toksisitetsfaktor (engelsk: TEF value) før summering. Resultater oppgis som WHO-TE siden toksitetsfaktorene er gitt av WHO. Enheten er pg/g, pikogram per gram (10-12 g/g, tilsvarer ng/kg). Kvantifiseringen skjer ved intern standard metode med isotopmerkete internstandarder. Felles metode for flere pesticider ved GC/MS Metoden bestemmer følgende pesticider: HCB, HCH, heptaklor-a, aldrin, dieldrin,endrin, oxy-chlordan, trans-klordan, cis-klordan, endosulfan-a, Endosulfan-B, endosulfansulfat, trans nonaklor, cis-nonaklor og toksafen kongenerne TOX-23, 32, 50 og 62 Prøvematerialet blir innveid til å gi ca. 0,5 g fett. Prøvene tilsettes en mikstur av 13 C merkede pesticider som fungerer som internstandarder (Cambridge Isotope Laboratories, USA). Etter homogenisering ekstraheres prøven med heksan i en Accelerated Solvent Extractor (ASE 300, Dionex, USA). Deretter oppkonsentreres ekstraktet ved hjelp av nitrogen og varme (Turbovap II Zymark, USA). Videre opprenses ekstraktet på tre ulike SPE-kolonner; først en Chem Elut kolonne, deretter en BondElut C18-kolonne og tilslutt en BondElut Florisil-kolonne. ved å benytte acetonitril, 2% dietyleter i heksan og 7,5% aceton i heksan på et automatisert SPE system, ASPEC XL4 (Gilson, Middleton WI, USA). Selve analysen utføres ved gasskromatografi/massespektrometri i negativ kjemisk ionisering SIM modus. GC kolonnen er en HP-5ms (Agilent J&W). LOQ for de forskjellige pesticidene er listet i tabell 4, sammen med analysedataene. Kvantifiseringen skjer ved intern standard metode med isotopmerkete internstandarder. HCH forbindelsen finnes i flere molekylære varianter (romstruktur). Disse er kjent ved de greske bokstavene α, β og γ. Det er γ-hch (gamma) som har størst biologisk effekt. Denne er også kjent under handelsnavnet lindan. B3b, Organofosforforbindelser Diclorvos Prøven ekstraheres med en blanding av sykloheksan og aceton. Ekstraktet renses med gel permeation chromatography (GPC). Det rensete ekstraktet dampes inn og løses i egnet løsemiddel før kvantifisering på GC/MS med electron impact ionisering og SIM måling av positivt ladde fragmention. I tillegg til 12

13 13 kvalitetskontroll ved kontrollprøve i hver analyseserie, verifiseres elueringstiden på GPC, og det utføres gjenvinningsforsøk med en prøve. Azamethiphos Den homogeniserte prøven ekstraheres med etylacetat. Etter inndamping vaskes fettet vekk med heksan i et væske/væske fordelingstrinn mellom acetonitril, vann og heksan. Siste opprensing skjer på en C-18 SPE kolonne. Det rensete ekstraktet analyseres ved omvendt fase HPLC med fluorescens-detektor. Kvantifisering er basert på ekstern standard metode. B3c, Elementanalyse ved ICP/MS (metallene) Det ble veid inn to paralleller fra hver prøve. Prøvene ble så dekomponert i ekstra ren salpetersyre tilsatt hydrogenperoksid ved oppvarming i en lukket beholder i mikrobølgeovn (Milestone-MLS-1200 mikrobølgeovn). Analyttene bestemmes kvantitativ ved ICP-MS på en Agilent 7500c induktiv koplet plasma-massespektrometer (ICP-MS). Følgende metaller ble målt: Arsen, kadmium, kvikksølv og bly. Rodium ble anvendt som intern standard for å korrigere for eventuell drift i instrumentet. Riktighet og presisjon for spormetallbestemmelsene ble utført ved at to sertifiserte referanse materialer (SRM) fra National Research Council (Ottawa, Canada), Tort-2 (hepatopankreas av hummer) og Dorm-2 (muskel av pigghå) analyseres som del av hver analyseserie. B3e, Fargestoff Malakittgrønt (MG) er en trifenylmetanforbindelse som tidligere ble brukt for behandling av fisk eller fiskeegg mot parasitt og soppinfeksjoner i ferskvannsfasen. Stoffet har ingen risikovurdering i EU og er derfor ikke tillatt brukt til matproduserende dyr i EØS-området. MG blir metabolisert i fiskevev, særlig lever, til den reduserte formen leuco malachite green (LMG). Mens MG derfor forsvinner raskt fra fiskevevet vil metabolitten LMG holde seg lenge i fisken. Derfor er det hensiktmessig å bruke LMG som en markør for kvalitativ bestemmelse. MG og LMG ekstraheres med 0,01 mm perklorsyre i acetonitril og diklormetan og renses ved hjelp av en SCX bond elut kolonne. MG og LMG elueres fra kolonnen med 10% ammoniakk i acetonitril. LC/MS benyttes så til analyse av LMG. Kjemisk ionisering (AP-CI) med positive SIM (selective ion monitor) ioner brukes i MS. Total MG (MG + LMG) analyseres etter at all LMG i prøven er oksidert til MG med PbO 2. B3f, Andre forbindelser (antioksidanter) Ethoxyquin og BHT er syntetiske antioksidanter som er godkjent for bruk i fôr. Ethoxyquin kan også opptre som dimer (to molekyler som hekter seg sammen). De-etylert ethoxyquin er også normalt til stede. De relative mengdene mellom disse variantene endrer seg fra det som finnes i foret til det som igjenfinnes i 13

14 14 fisken. ( Carry over. ) For noen publiserte data er konsentrasjonen av ethoxyquin listet uten nærmere spesifikasjon. Det er da vanskelig å vite hva som er målt, om dette er summen eller om det bare er moderforbindelsen. Denne rapporten liser både summen og enkeltkonsentrasjonene. Ethoxyquin Prøven skjermes mot lys. Pyrogallol, askorbinsyre og EDTA tilsettes for å beskyttes mot oksidasjon. Analyttene ekstraheres med acetonitril tilsatt litt ascorbinsyre. Deretter blir fettet i prøven hydrolysert (forsåpet) i en blanding av etanol, NaCl og NaOH ved 100 C. Det uforsåpbare materiale ekstraheres med heksan. Løsningen dampes inn og løses deretter i acetonitril inneholdende 0.1% askorbinsyre. Ethoxyquin, og dimer kvantifiseres ved hjelp av reversfase HPLC og fluorescensdeteksjon. Metoden er akkreditert m.h.p ethoxyquin og dimer. Den er ikke tilstrekkelig kvalitetssikret med hensyn på de-ethylert ethoxyquin til at data vil bli rapportert. Kvantifisering skjer ved ekstern standard metode. BHT Forbindelsen brytes ned av lys og oksyderes v luft. En grundig skjerming mot lyseksponering er påkrevd for alle analysetrinn etter at forbindelsen er ekstrahert ut av fiskemuskelen. Pyrogallol, askorbinsyre og EDTA tilsettes tidlig i prosedyren for å beskyttes mot oksidasjon. Analytten ekstraheres med acetonitril tilsatt litt ascorbinsyre. Ekstraktet sentrifugeres og filtreres gjennom mikrofilter før kvantifisering ved hjelp av reversfase HPLC og fluorescensdeteksjon. Kvantifisering skjer ved ekstern standard metode. 14

15 15 Tabell 1, Oppsummering av analysemetoder (i henhold til EUs standard for rapportering). Gruppe av forbindelser A1: Stilbenes Forbindelser Matrise Metode Deteksjons grense LOD () Akkreditert Metode Dietylstilboestrol Muskel GC/MS Se tabell 3 Ja Dienoestrol Muskel GC/MS Se tabell 3 Ja Hexoestrol Muskel GC/MS Se tabell 3 Ja A3: Nortestosteron Muskel GC/MS Se tabell 3 Ja Steroids Trenbolone Muskel GC/MS Se tabell 3 ja Laboratorie Hormon lab., Aker Sykehus. Hormon lab., Aker Sykehus A6 Chloramphenikol Muskel LC/MS 0,30 Ja NIFES Annex IV Nitrofuraner og Muskel LC/MS/MS 0,5 Ja NIFES Substances metabolitter: Furazolidon Muskel LC/MS/MS 0,5 JA Furaltadone Muskel LC/MS/MS 0,5 Ja B1: Oxolinic acid Muskel LC/MS 10 Ja antibactriel Flumequine Muskel LC/MS 2 Ja substancer Oxolinic acid Liver 3- plate and 200 Ja HPLC Flumequine Liver 200 Ja Florfenikol Liver 200 Nei 3 NIFES Sulfonamides Liver 400 Ja B2a: Anthelmintics Teflubenzorone Muskel LC/MS 5,0 Ja Diflubenzorone Muskel LC/MS 10,0 Ja Cypermethrine Muskel GC/MS 5,0 Nei NIFES Praziquantel Muskel LC/DAD 50,0 Ja Fenbendazole Muskel LC/MS 5,0 Nei Emamectin Muskel LC/MS 2,5 Ja Ivermectin Muskel LC/MS 25,0 Ja Delthamethrin Muskel GC/MS 5,0 Nei B3a: organochlorines HCB Muskel GC/MS NCI 0,02 HCH Muskel GC/MS NCI 0,2 Heptachlor Muskel GC/MS NCI 1,0 De fleste prøvene var analysert før akkreditering var invilget NIFES Heptachlor-a Muskel GC/MS NCI 0,16 Aldrin Muskel GC/MS NCI 0,2 Dieldrin Muskel GC/MS NCI 0,1 Endrin Muskel GC/MS NCI 0,3 oxy-chlordan Muskel GC/MS NCI 0,4 trans-chlordan Muskel GC/MS NCI 0,2 Cis-Chlordan Muskel GC/MS NCI 0,15 α-endosulfan Muskel GC/MS NCI 0,15 Endosulfansulfate Muskel GC/MS NCI 0,16 β-endosulfan Muskel GC/MS NCI 0,10 Cis-Nonachlor Muskel GC/MS NCI 0,2 Trans-Nonachlor Muskel GC/MS NCI 0,15 Toxaphene 26 Muskel GC/MS NCI 1,0 Toxaphene 32 Muskel GC/MS NCI 0,5 Toxaphene 50 Muskel GC/MS NCI 1,0 Toxaphene 62 Muskel GC/MS NCI 1,5 HCH/ Lindan Muskel GC/MS NCI 0,6 15

16 16 Gruppe av forbindelser Forbindelser Matrise Metode Deteksjons grense LOD () Akkreditert Metode DDTs and metabolites Muskel GC/MS Se tabell 6 Ja Dioksins Muskel GC/HRMS Se teksten Ja Dioksinlignende PCBer Muskel GC/HRMS Ja PCB kongere (9) Muskel GC/MS Se tabell 7 Ja Laboratorie B3b: Dichlorvos Muskel GC/MS 5,0 Nei phosphorous compounds Azamethiphos Muskel LC/MS 1,5 Nei NIFES B3c: chemical elements Pb Muskel ICP/MS 0,04 Ja Cd Muskel 0,01 Ja Hg Muskel 0,03 Ja NIFES As Muskel 0,03 Ja B3e: Dyes B3f Leuco Malachite Green Malachite green Muskel LC/MS LC/DAD BHT Muskel LC/UV 14 Nei NIFES Ethoxyquine Muskel LC/UV 0,02 Ja NIFES EQ-dimer 0,1 1 LOD og ikke LOQ gitt her siden tabellen følger en EU spesifikasjon. 1,0 1,0 Ja NIFES 16

17 17 Tabell 2, Datagrunnlaget (antall analyserte prøver) for resultater av medisinrester og fremmedstoff i oppdrettsfisk i 2006 A (filet) Stoffgruppe Parameter Antall Fisk Antall analyser/ bestemmelser A1 Stillebener 260 52x2=104 A3 Steroider 265 53x3=159 A6 Kloramfenikol 125 25 Anex iv Furazolidon 1 Furaltadon 1 Nitrofurantoin 1 Nitrofurazon, 1 865 173*692 (B3e) 1 Leucomalakittgrønt og malakittgrønt 125 25x2=50 Sum A 1515 1030 B (filet) B2 Teflubenzuron 65 13 Diflubenzuron 55 11 Cypermethrine 305 61 Praziquantel 205 41 Fenbendazole 70 14 Emamectin 320 64 Ivermectin 55 11 Deltamethrin 275 55 B3a HCB 135 27x19=513 HCH Heptachlor Heptachlor-a Aldrin Dieldrin Endrin oxy-chlordan trans-chlordan Cis-Chlordan α-endosulfan Endosulfansulfate β-endosulfan Cis-Nonachlor Trans-Nonachlor Toxaphene 26 Toxaphene 32 Toxaphene 50 Toxaphene 62 DDT forbindelsene 120 24x6=144 Dioksiner 125 25x29=725 Dioksinlignende PCBer B3b Diklorvos 25 5 Azamethiphos 25 5 B3d Pb 645 129x4=516 Cd Hg As B3e Malakittgrønt 500 100 B3f BHT 170 34 Ethoxyquin 195 39*2=78 Sum B (filet) 2 2925 2390 B (lever) B1 Oksolinsyre Utføres kun ved positiv Flumequine Resultat på mikrobiologisk Florfenicol screening. Teracykliner Sulfonamider 0 0 Mikrobiologisk 905 905 Antibakteriel Påvisning Totalsum lever 905 905 Totalsum filet 4440 3420 Totalt antall fisk 5345 4325 1 Noen gruppe A prøver ble analysert for malakittgrønt og leucomalakittgrønt. 1 Alle nitrofuranene blir målt som metabolitter. 17

18 18 Resultater og kommentarer Gruppe A1 stoffer Innholdet av gruppe A1 stoffene dietyl-stilbestrol, dienestrol og heksestrol ble alle undersøkt i filetprøver fra 53 fisk, analysert som samleprøver. Analysene ble utført av Hormonlaboratoriet, Akers sykehus. Resultatene er listet i tabell 3. Ingen av stoffene ble påvist i noen av prøvene. Gruppe A3 stoffer Innhold av gruppe A3 stoffene nortestosteron og trenbolone ble undersøkt i filetprøver fra 52 fisk, analysert som samleprøver. Analysene ble utført av Hormonlaboratoriet, Akers sykehus. Resultatene er listet i tabell 3. Ingen av stoffene ble påvist i noen av prøvene. Gruppe A6 og annex IV stoffer Resultatene er listet i tabell 3. A6 stoffet kloramfenikol og de fire annex-iv forbindelsene ble analysert på to sett prøver hvert bestående av 173 samleprøver (865 fisk). Det ble ikke påvist rester av stoffene i noen av prøvene. Påvisningsgrensene (LOD) er oppført i tabellen. Tabell 3. Innhold av gruppe A, forbudte stoffer. Forbindelse Grp Prøve Analyse LOD* Antall Antall type Verdi () samleprøver fisk Hexesterol A1 filet <LOD 0,67 53 265 Ienesterol A1 filet <LOD 0,62 53 265 Dietylstilbestrol A1 filet <LOD 1,07 53 265 β-nandrolon A3 filet <LOD 2,26 52 260 β-trenbolon A3 filet <LOD 3,9 52 260 Kloramfenikol A6 filet <LOD 0,3 50 250 Furazolidone Anex iv filet <LOD 10 173 865 Furaltadon Anex iv filet <LOD 10 173 865 Nitrofurantion Anex iv filet <LOD 10 173 865 Nitrofurazon Anex iv filet <LOD 10 173 865 * LOD, limit of determination, påvisningsgrensen per kg våtvekt prøve. 18

19 19 Gruppe B1, antibakterielle stoffer I klasse B1 ble de antibakterielle forbindelsene oksolinsyre, flumequin, florfenikol og oksytetrasyklin, målt i lever fra 975 prøver ved bruk av mikrobiologisk metode. Resultatene er listet i tabell 4. Prøvene ble analysert hos NIFES og ved Norsk Matanalyses laboratorium i Ålesund. Det var ingen positive analyser (påvisning) ved noen av laboratoriene. Deteksjonsgrensen, LOD, for den mikrobiologiske påvisningsmetoden var estimert for alle antibakterielle substanser til å være 200. Leveren har en sentral funksjon i avgiftning og eliminasjon av legemidler. Konsentrasjonen av disse legemidlene vil derfor være betydelig høyere i lever enn i filet. Dette kompenserer i noen grad for den relativt sett høyere deteksjonsgrensen (LOD) som mikrobiologisk metodikk har sammenlignet med den aktuelle kjemisk metoden som analyserer filet. Tabell 4. Innhold av gruppe antibakterielle stoffer, gruppe B1, i leverprøver Forbindelse Grp Prøve Analyse LOD* Antall fisk type Verdi () Oksolinsyre B! lever <LOD 200 905 Flumequin B1 lever <LOD 200 905 Florfenikol B1 lever <LOD 200 905 Oksytetrasyklin B1 lever <LOD 200 905 * LOD, limit of determination, påvisningsgrensen per kg våtvekt prøve. Gruppe B2a, Anthelmintika Innholdet av B2a stoffene teflubenzurone, diflubenzurone, cypermethrine, praziquantel, fenbendazole, emamectine, ivermectin og delthamethrin ble analysert i samleprøver av filet. Resultatene står i tabell 5. Det ble ikke påvist rester av noen av komponentene i noen av prøvene. Deteksjonsgrensene (LOD) for stoffene er oppgitt i tabellen. Siden forbindelsene ikke ble påvist er det denne som er interessant. 19

20 20 Tabell 5. Innhold av medisinrester i gruppe B Forbindelse Grp Prøve Analyse LOD* Antall Antall type Verdi () samleprøver fisk Malakittgrønt** A ** Filet <LOD 1,0 25 125 Malakittgrønt B Filet <LOD 1,0 100 500 Cypermetrin B Filet <LOD 10 61 305 Deltamethrin B Filet <LOD 15 55 275 Praziquantel B Filet <LOD 50 41 205 Fenbendazole B filet <LOD 5 14 70 Teflubenzuron B filet <LOD 5 13 65 Diflubenzuron B filet <LOD 10 11 55 Azamethophos B filet <LOD 10 5 25 Diklorvos B filet <LOD 10 5 25 Emamectin B filet <LOD 2,5 64 320 Ivermectin B filet <LOD 25 11 55 * LOD, limit of determination, påvisningsgrensen per kg våtvekt prøve. (Ikke LOQ.) ** Malakittgrønt er prøvetatt både på anlegg (gruppe A) og på slakterier (gruppe B) Gruppe B3a, organoklorforbindelser Innholdet av B3a, organoklorforbindelsene, ble bestemt for følgende parametre: PCB-7, DDT og dets metabolitter, HCH, HCB, dioksiner og furaner. Dessuten pesticidene heptaklor, aldrin, dieldrin, endrin, klordan, nonaklor og toxaphene. Resultatene er listet i tabellene 6, 7 og 8. Sum DDT og DDT metabolitter Verdiene som er funnet i filet er listet i tabell 6. De viser en variasjon i sum DDT fra 7,5 til 18,2 våtvekt med. I 2005 var variasjonen 0,5 til 22,3. Gjennomsnittet var på 11,8. (12,6 i 2005, 10,9 i 2004 og 15,0 i 2003) De høyeste verdiene ble i 2006 som for perioden 2003-2005 funnet for pp-dde. Resultatene for sum DDT i dette arbeidet er tilsvarende de resultater som blant annet ble funnet i Nordsjøsild og NVG sild av NIFES og presentert i en artikkel i tidsskriftet Food Additives & Contaminants. Resultatene stammer fra overvåkningsprogrammet Miljødatabasen, nå Sjømatdata i perioden 1995 til 2001. Resultatene er også tilsvarende de som er rapportert for laksefilet i Sjømatdata for årene 2002 til 2005. 20

21 21 Tabell 6 Innhold av DDT samt metabolittene DDD og DDE i laksefilet. Middel Verdi Standard avvik Maks. Verdi Min. Verdi LOQ (våt v.) Antall Samle prøver op-ddt () 0,5 0,2 1,1 0,2 0,18 24 pp-ddt () 1,5 0,4 2,6 1,0 0,24 24 op-ddd () 0,4 0,1 0,7 0,17 0,09 24 pp-ddd () 2,8 0,8 4,5 1,7 0,09 24 op-dde () 0,27 0,06 0,38 <LOQ 0,15 24 pp-dde () 6 2 11 4 0,12 24 Sum DDT () 11,8 3,21 18,2 7,5 -- 24 * LOQ, limit of quantitation, kvantifiseringsgrensen per gram våtvekt prøve. Tabell 7 Innhold av PCB-7 i filet av oppdrettsfisk. Forbindelse Middel Verdi Standard avvik Maks Verdi Min. Verdi LOQ (våt v.) Antall Samle prøver PCB-28 0,3 0,1 0,51 0,12 0,06 24 PCB-52 0,9 0,2 1,25 0,53 0,09 24 PCB-101 1,4 0,5 2,37 0,83 0,09 24 PCB-118 1,1 0,3 1,65 0,67 0,09 24 PCB-138 2,3 0,7 3,79 1,0 0,12 24 PCB-153 2,4 0,8 4,16 1,2 0,09 24 PCB-180 0,6 0,2 1,16 0,26 0,15 24 Sum PCB-7 8,9 2,4 13,6 4,8 -- 24 PCB-7 Verdiene i filet for sum PCB-7 og verdiene for de sju enkeltkongenerne er listet i tabell 7. Summen varierte i 2006 fra 4,8 til 13,6 µg /kg mot en variasjon fra 0,5 til 19,3 µg/i 2005, 2,3 til 22,7 i 2004 og 2,4 til 15,9 i 2003. Gjennomsnittsverdien var i 2006 8,9 mot 8,5 i 2005, 9,2 i 2004 og 8,3 i 2003. I hele denne perioden er det PCB-138 og PCB-153 som har de største bidragene til summen (feiltrykk i rapporten for 2004.) Tabell 7 lister også LOQ for hver enkelt kongener. Innholdet av sum PCB- 7 funnet i denne undersøkelsen er tilsvarende de resultatene som er rapportert i laksefilet fra Miljødatabasen i 2002 til 2005. Det er tilsynelatende ingen utviklingstrend over tid i perioden 2003-2007 for sum PCB-7. Verdiene ligger i det samme tallområdet i hele perioden. EU har foreløpig ikke satt noen øvre grenseverdi for PCB-7 i fiskefilet. Derimot har Nederland satt en øvre grenseverdier for både de enkelte kongenerne og for sum PCB-7. Grensen for sum PCB er satt til 620 våtvekt i filet. 21

22 22 Heksaklorsykloheksan (HCH) 24 prøver ble analysert for denne parameteren. Resultatene er listet i tabell 8. Kun α-hch er funnet i målbar konsentrasjon. Dette er ikke den mest biologisk aktive varianten. Middelverdien for α-hch er 1.1 våtvekt, maksverdien er 2,1 og minimum er 0,3 våtvekt. Forbindelsen måles nå ved en ny og forbedret metode. Tallene fra tidligere års rapporter har større analytisk usikkerhet. Heksaklorbenzen (HCB) Forbindelsen måles hos NIFES i to metoder og er derfor målt i totalt 51 prøver (mer enn spesifisert i kontrakten). Analyserte verdier av HCB er vist i tabell 8. Verdiene varierte fra 0,3 til 2 våtvekt i 2006 mot fra 0,3 til 1,5 i 2005. Gjennomsnittet i 2006 var på 1,1 våtvekt mot på 1,0 i 2005 og 1,8 i 2004. Kanskje vi ser en synkende trend. Andre pesticider Resultatene for heptaklor, aldrin, dieldrin, endrin, klordan, nonaklor og toxaphene forbindelsene er vist i tabell 8. Verdiene er under eller ned mot kvantifiseringsgrensen for nær alle analyser. Kun for toxaphenenene er det målt en verdi over 4 µg /kg våtvekt. Høyeste verdi, 10 våtvekt er målt for en prøve for toxaphene-50 Middelverdiene for de forbindelsene som er listet er beregnet som upper bound ; Ved beregning av middelverdi er verdien for LOQ er satt inn for alle tall som er mindre enn LOQ. Dette gir pesimistiske tall. 22

23 23 Tabell 8. Innhold av andre klorerte pesticider i filet av oppdrettsfisk. Forbindelse Middel Verdi * Standard Avvik (s) * Maks Verdi Min. Verdi LOQ (våt v.) Antall Samle prøver Alfa-HCH 1,1 0,5 2,1 0,3 0,6 24 Gama-HCH ** <LOQ 2,0 24 HCB 1,0 1,1 0,5 1,5 2,1 0,3 0,3 0,07 0,12 27 24 Heptaklor ** <LOQ 2,5 27 heptaklor-a ** <LOQ 0,5 27 Aldrin ** <LOQ 0,6 27 Dieldrin ** <LOQ 0,3 27 Endrin ** <LOQ 1,0 27 oxy-klordan ** <LOQ 1,3 27 trans-klordan ** <LOQ 0,7 27 Cis-klordan 1,4 0,8 3,3 <LOQ 0,5 27 endosulfan-a ** <LOQ 0,3 27 Endosulfan-sulfat ** <LOQ 0,5 27 endosulfan-b ** <LOQ 0,3 27 trans-nonaklor 1,6 1,0 1,4 <LOQ 0,5 27 Cis-nonaklor ** <LOQ 0,7 27 toxaphene-26 1,7 1,1 5,2 <LOQ 1,0 27 toxaphene-32 ** <LOQ 0,7 27 toxaphene-50 3,5 1,9 10 <LOQ 2,5 27 toxaphene-62 ** <LOQ 1,5 27 *Upper bound mean value: I beregning av middelveridene er LOQ substituert for alle resultater mindre enn LOQ **For få tall til meningsfullt å beregne en middelverdi Dioksiner, furaner og dioksinliknende PCBer Alle kongenere av dioksiner og furaner som står på WHO sin liste ble målt i filet. Verdiene er listet i tabell 9. Merk at enheten her til forskjell fra de andre tabellene er pikogram/gram (pg/g). Beregning av summene er upper bound som gir en worst case verdi for alle inngående tall som er <LOQ. LOQ for den enkelte kongener ligger i området 0,006 0,2 pg/g. Den målte verdien vil etter kvantifisering bli multiplisert med TEF faktoren for å gi verdien i WHO-TE/g prøve, som er de tabulerte verdiene. 23

24 24 Som det fremgår av tabell 9 viser sum WHO-TE for dioksiner og furaner (PCDD og PCDF) en variasjon fra 0,2 til 0,5 pg/kg våtvekt i 2006 mot 0,07 til 0,47 i 2005 og 0,15 til 0,37 pg/g i 2004. Middelverdien for sum WHO-TE var på 0,32 pg/kg våtvekt i 2006 mot 0,25 pg/g våtvekt i 2005 og 0,26 pg/g i 2004. De dioksinliknende PCB kongenerne (mono-orto og non-orto PCB, til sammen 12 forbindelser) viser tilsvarende en variasjon i sum WHO-TE fra 0,6 til 1,5 pg/kg våtvekt i 2006 mot 0,30 til 1,8 pg/g våtvekt i 2005 og 0,58 til 1,2 pg/g i 2004. Gjenomsnittet for sum WHO-TE var 1,2 pg/kg våtvekt i 2006 mot 0,95 pg/g våtvekt i 2005 og 0,82 pg/g i 2004. Resultatene bekrefter at nivået for sum WHO-TE er høyere for PCBene enn for PCDD/ PCDF kongenerne. De rapporterte verdiene for både PCDD/PCDF og de dioksinlignende PCBene er ikke vesentlig forskjellig fra verdiene for laks som ligger i databasen Sjømatdata for årene 2002 til 2004. Tabell 9. Innholdet av dioksiner og dioksinliknende PCB gitt som pg/g upperbound sum WHO-TE. Forbindelses Klasse Middelverdi Standard avvik Maks verdi Min verdi Antall målinger EU grenseverdi Dioksiner: Sum 0,3 0,1 0,5 0,2 25 4.0 PCDD+PCDF Sum Dioksinlikn.PCB 1,2 0,3 1,5 0,6 25 Total sum TE 1.5 8.0 1) 1) Gjeldende fra 2006 Gruppe B3b, organofosforforbindelser Innholdet av B3b stoffene azamethiphos og dichlorvos ble analysert i samleprøver av filet. Resultatene står i tabell 4. Forbindelsene ble ikke påvist i noen av prøvene. Deteksjonsgrensene (LOD) for stoffene er listet i tabellen. Siden forbindelsene ikke ble påvist er det denne som er interessant. Gruppe B3c, elementanalyse (metaller) Innholdet av B3c stoffene arsen, kadmium, kvikksølv og bly ble hver bestemt i 112 samleprøver laget av filet fra 560 fisk. Resultatene er listet i tabell 9. Merk at enheten er mg/kg, altså en faktor på 1000 større enn de fleste andre tabellene. Arsen Innholdet av totalt arsen i prøvene varierte fra 0,5 til 2,3 mg/kg våtvekt i 2006 mot 0,54 til 3,7 mg/kg i 2005 og 0,65 til 6,3 mg/kg i 2004 og 1,2 til 4,4 mg/kg i 2003. Gjennomsnittet var 1,4 mg/kg våtvekt i 24

25 25 2006 mot 2,0 mg/kg våtvekt i 2005 og 2,1, 2,2 og 1,3 mg/kg i henholdsvis 2004,2003 og 2002. Innholdet av arsen i filetene i 2003, til 2006 har derfor vært rimelig stabilt i perioden. Tabell 10. Innhold av arsen, kadmium kvikksølv og bly i laksefilet (mg/kg våtvekt) samt bestemmelsesgrense og EUs øvre grenseverdier. Arsen (mg/kg) Kadmium (mg/kg) Kvikksølv (mg/kg) Bly (mg/kg) Gjennomsnitt 1,4 <LOQ 0,04 <LOQ Standard avvik (s) 0,3 0,02 Maks 2,3 0,23 0,06 Min 0,5 0,017 LOQ Antall samleprøver 129 129 129 129 Kvantifiseringsgrense 0,009 0,003 0,009 0,012 EUs øvre grenseverdi 0,05 0,5 0,2 Kadmium Dette metallet ble sterkt fokusert i 2005 siden en av fôrleverandørene da hadde et problem med kontaminert fôr. Dette ble fulgt opp med utestenging fra det rusiske markedet ut fra påstått forhøyde verdier målt i filet fra norsk laks. Ingen av prøvene i 2005 eller nå i 2006 viste konsentrasjoner for kadmium høyere enn kvantifiseringsgrensen på 0,003 mg/kg våtvekt. Til sammenligning er EUs øvre grenseverdi på 0,05 mg/kg våtvekt. Kvikksølv Konsentrasjonene av total kvikksølv varierte fra 0,02 til 0,23 mg/kg våtvekt i 2006 mot 0,011 til 0,10 mg/kg våtvekt i 2005. Gjennomsnittet var 0,04 mg/kg våtvekt som i 2005 og 2004. Til sammenligning er EUs øvre grenseverdi på 0,5 mg/kg våtvekt for de fleste fisk inklusive laks, ørret og torsk. Bly Ingen av prøvene viste konsentrasjoner høyere enn kvantifiseringsgrensen på 0,012 mg/kg våtvekt. Til sammenligning er EUs øvre grenseverdi på 0,2 mg/kg våtvekt. Gruppe B3d, mykotoksiner Ingen prøver ble analysert for 2006 rapporten. 25

26 26 Gruppe B3e, fargestoff (malakittgrønt) Prøver av gruppe A, prøvetatt på oppdrettsanleggene (125 fisk/ 25 samleprøver) og prøver fra gruppe B, prøvetatt på slakteriene (500 fisk / 100samleprøver) ble analysert. Det ble ikke påvist malakittgrønt eller metabolitter av denne i noen av prøvene som ble analysert. Påvisningsgrensen (LOD) er 1 våtvekt. Gruppe B3f, andre forbindelser (syntetiske antioksidanter) BHT og etoxyquin Resultatene er vist i tabell 11. Konsentrasjonen av BHT varierte fra 793 til 9500 våtvekt i 2006 mot fra 100 til 3800 våtvekt i 2005. Middelverdien i 2006 var 3827 mot 2300 våtvekt i 2005. Variasjonen mellom prøvene er svært stor tatt i betraktning at dette er samleprøver. Dette gjenspeseiler at prøvenene kommer fra forskjellige anlegg. Japan har fåreslått en MRL-grense på 10 mg/kg, altså 10 000. Det er verd å merke seg at høyeste verdi vi har målt her er ikke langt under denne grensen. Summen av konsentrasjonene av etoxyquin og etoxyquin dimer varierte fra 90 til 1840 µg /kg våtvekt i 2006 i 2006 mot 260 til 490 i 2005. Middelverdien for summen var i 2006 var 630 våtvekt mot 370 i 2005. Her har Japan foreslått en grense på 1 mg/kg = 1000. Dette har vi påpekt kan være problematisk dersom hele kvoten av antioksidant i fôret kun er etoxyquin. De foreliggende data her synes å avkrefte dette. Som forventet finner man relativt høye verdier av antioksidanter særlig av BHT, sammenlignet med alle de andre forbindelsene i dette prosjektet. Her er det snakk om restverdier av fettløselige antioksidanter som etter en toksikologisk vurdering er godkjent brukt i fôr med opp mot 150 mg/kg. Av ethoxyquinene er det særlig dimer som har de høyeste konsentrasjonene. Fortsatt er det ønskelig med flere data for denne gruppen av forbindelser for å kunne danne grunnlag for evenuelle norske innspill i saken. Tabell 11. Innholdet av BHT og etoxyquin Forbindelses Klasse Middelverdi SD Maks verdi Min verdi Antall saml. prøver BHT 3830 2160 9500 790 34 Ethoxyquin 28,8 27 130 6,4 39 Etoxyquin dimer 600 390 1710 80 39 Sum etoxyquin 630 1840 90 39 26

27 27 Konklusjon Med økende volum av produsert oppdrettsfisk er den marine delen av overvåkingsprogrammet for animalsk mat i henhold til EU direktiv 96/23/EC blitt meget omfattende. Det inngår totalt et datagrunnlag på 5345 fisk i denne rapporten. Det er derfor en meget omfattende overvåking som er utført. Resultatene viser at det ikke var påvisbare rester av forbudte eller lovlig brukte legemidler eller fargestoffer i noen av de undersøkte prøvene. Videre viste analyseresultatene for hormonlignende stoffer og vekstfremmere at det heller ikke kunne påvises noen av de analyserte forbindelsene i gruppe A prøvene. Innholdet av organiske forurensingsstoffer som dioksiner, PCB og peticider for 2005 var av tilsvarende størrelse som resultatene fra dette programmet for 2003, 2004 og 2005 og som verdiene som er rapportert for laksefilet i Miljødatabasen, nå Sjømatdata. Disse er tilgjengelig på NIFES sine hjemmesider. (www.nifes.no). Antallet organiske pesticidene som inngikk i overvåkingen er nå betydelig. DDT med en rekke derivater er i tabell for seg selv fordi dette er en meget omtalt forbindelse. Verdiene for 2006 tilsvarer hva som er funnet i 2003, 2004 og 2005. Heptaklor, aldrin, dieldrin, endrin, klordan, nonaklor og fire toxapheneforbindelser er nå inkludert. Flere av navnene i denne listen representerer en gruppe av forbindelser. Upper bound middlverdiene for alle disse fobindelsene lå i området 0,8 til 1,2 våtvekt. Men flertallet av forbindelsene hadde ikke mange nok resultater over LOQ til at en meningsfull middelverdi kunne beregnes. Høyeste enkeltmåling for alle disse organiske pesticidene var en prøve der toxaphene-50 ble målt til 2,6 våtvekt Innholdet av arsen var i perioden 2002 til 2006 stabil. For kadmium og bly hadde alle prøver en konsentrasjon under metodens bestemmelsesgrense, mens for kvikksølv var alle verdier lavere enn 0,3 mg/kg. Målte konsentrasjoner ligger betydelig lavere enn EUs øvre grenseverdier for kadmium, bly og kvikksølv. Fra 2006 er de syntetiske antioksidanter, BHT og ulike etoxyquin forbindelser inkludert i prosjektet. Dette er lovlige tilsettinger til fôr. Vi kan slutte at det er en tydelig carry over fra fôret til fileten. De målte verdiene lå under alle eksisterende relevante grenseverdier, men ikke med rommelig margin. Denne gruppen forbindelser bør fortsatt gis høy prioritet i overvåkingen. 27