2 INDIKASJONER FOR BRUK

PLATELIA Candida Ab Plus 96 TESTER 62785 PÅVISNING AV CANDIDA MANNAN-ANTIGEN ANTISTOFFER I HUMANT SERUM ELLER PLASMA VED BRUK AV IMMUNOENZYMATISK METODE 1 TESTENS FORMÅL Platelia Candida Ab Plus er en indirekte immunoenzymatisk mikroplateanalyse til påvisning av totale lg anti-mannan antistoffer i humant serum eller plasma. 2 INDIKASJONER FOR BRUK Diagnostiseringen av invasiv candidiasis må baseres på kombinasjonen av påvisning av antistoffer og påvisning av sirkulerende antigener. 13 Platelia Candida Ab Plus (kode 62785) er en test som, når brukt sammen med Platelia Candida Ag Plus (kode 62784), bidrar til å gi en tidligere og mer sensitiv diagnostisering innenfor rammen av en komplett diagnostisk tilnærming som omfatter intrinsiske og iatrogene risikofaktorer samt kliniske og mykologiske data 10, 13, 14. Den benyttes også innenfor rammen av et klinisk overvåkningssystem av pasienter, som hjelp ved terapeutiske beslutninger. 8 3 KLINISKE VERDIER Candida-infeksjoner er den hyppigste formen for nosokomiale soppinfeksjoner, og candidemier representerer den 4. hyppigste 12, 15, 16 årsaken til septikemier med utgangspunkt i nosokomiale infeksjoner. Klinisk sett er invasive candidiasis de mest alvorlige formene, med en mortalitetsrate på 30-70 % hos immunsupprimerte pasienter. Infeksjonene er vanskelige å diagnostisere fordi de kliniske symptomene er lite spesifikke, og fordi dyrkningen har lav sensitivitet. Vanligvis er det en hel rekke argumenter som gjør det mulig å påvise invasiv candidiasis og iverksette egnet behandling 2. I denne sammenhengen må diagnostiseringen av systemisk candidiasis alltid knyttes til serologiske teknikker med direkte mykologiske metoder. Ved bruk av serologisk oppfølging med anti-candida antistoffer, er det mulig å underbygge eller styrke diagnostiseringen med de mykologiske resultatene 10, 13, 14. Platelia Candida Ab Plus påviser antistoffer rettet mot Candida mannan-antigen antistoffer, hovedbestanddelen i gjærveggen av Candida-typen. Mannan er biomarkør for candidiasis og et svært immunogent polysakkarid. En jevnlig oppfølging av pasientene med risiko for invasiv candidiasis, kombinert med påvisning av mannan-antigen og antimannan antistoffer, er til hjelp ved diagnostiseringen av disse funksjonene. 9 4 PROSEDYREPRINSIPP Platelia Candida Ab Plus er en indirekte, immunoenzymatisk, totrinns mikroplateanalyse til påvisning av anti-mannan antistoffer i humant serum eller plasma. Fortynnede serum- eller plasmaprøver fordeles i mikroplatens brønner, som er belagt med renset mannan fra Candida albicans. Etter inkubasjon ved 37 C vaskes stripsene for å fjerne alt ubundet materiale. Konjugatet (polyklonalt antistoff av geit, humant anti-igg/iga/igm som er peroksidasemerket) tilsettes så i hver av mikroplatens brønner og inkuberes ved 37 C. tilsettes så i hver av mikroplatens brønner og inkuberes ved 37 C. Et kompleks dannes med tilstedeværelse av anti-mannan antistoffer i den humane prøven: mannan humant lg anti-mannan anti-humant antistoff/peroksidase IgG/IgA/IgM av geit. Stripsene vaskes for å fjerne alle gjenværende stoffer. Kromogen med peroksidasesubstrat tilsettes og inkuberes ved romtemperatur for å påvise eventuelle komplekser som bindes til veggen i mikrobrønnen. Den enzymatiske reaksjonen stanses ved tilsetning av svovelsyre 1N. Absorbansen (optisk densitet) av humane prøver og kalbiratoren avleses med et spektrofotometer innstilt på en bølgelengde på 450/620 nm. 5 REAGENSER Reagensene leveres i tilstrekkelig antall til å kunne utføre 96 analyser i maksimalt 9 serier. Kitet må oppbevares ved +2 8 C. Det er svært viktig at alle reagensene oppnår romtemperatur (+18 30 C) før bruk. Alle reagensene må tilbakeføres til +2 8 C rett etter bruk. Legg ubrukte strips tilbake i originalpakningen og lukk den godt. Tørkemiddelet må ikke fjernes. 1

R1 R2 Komponent Innhold Mengde/antall Microplate Concentrated Washing Solution (20x) R3 Calibrator 0 R4a Calibrator 5 R4b Calibrator 10 R4c Calibrator 20 R4d Calibrator 80 R6 R7a R7b R9 R10 Conjugate Sample Diluent 1 Sample Diluent 2 Chromogen TMB Stopping Solution Mikroplate: - 96 brønner (12 strips med 8 brønner i hver) belagt med renset 1 mannan fra Candida albicans. Konsentrert vaskeløsning (20 x): - TRIS-NaCl-buffer (ph 7,4) 1 x 70 ml - 2 %Tween 20 - Konserveringsmiddel: < 1,5 % ProClin 300 Kalibrator 0 AU/ml (bruksklar): 1 x 2,5 ml - Konserveringsmiddel: metylisotiazolon 0,02 %, bromonitrodioxan 0,02 %, < 1,5 % ProClin 300 Kalibrator 5 AU/ml (bruksklar): - Humant serum som inneholder anti-mannan Ab 1 x 2,5 ml - Konserveringsmiddel: metylisotiazolon 0,02 %, bromonitrodioxan 0,02 %, < 1,5 % ProClin 300 Kalibrator 10 AU/ml (bruksklar): - Humant serum som inneholder anti-mannan Ab 1 x 2,5 ml - Konserveringsmiddel: metylisotiazolon 0,02 %, bromonitrodioxan 0,02 %, < 1,5 % ProClin 300 Kalibrator 20 AU/ml (bruksklar): - Humant serum som inneholder anti-mannan Ab 1 x 2,5 ml - Konserveringsmiddel: metylisotiazolon 0,02 %, bromonitrodioxan 0,02 %, < 1,5 % ProClin 300 Kalibrator 80 AU/ml (bruksklar): - Humant serum som inneholder anti-mannan Ab 1 x 2,5 ml - Konserveringsmiddel: metylisotiazolon 0,02 %, bromonitrodioxan 0,02 %, < 1,5 % ProClin 300 Konjugat (bruksklar): - Peroksidasemerkede, humane, polyklonale anti-lg antistoffer fra geit 1 x 26 ml - Malakittgrønn - Konserveringsmiddel: <1,5 % ProClin 300 Prøvefortynner 1 (bruksklar): - 0,1 % Tween 20 1 x 28 ml - Fenolrød - Konserveringsmiddel: < 1,5 % ProClin 300 Prøvefortynner 2 (bruksklar): - 0,1 % Tween 20 1 x 26 ml - Bromtymolblå - Konserveringsmiddel: < 1,5 % ProClin 300 TMB-kromogenløsning (bruksklar): - Løsning med 3,3,5,5 -tetrametylbenzidin (< 0,1%), H 2 O 2 1 x 28 ml (<1,0%) Stoppløsning (bruksklar): - Svovelsyreløsning 1N 1 x 28 ml Klebende film 4 6 RETNINGSLINJER FOR HELSE OG SIKKERHET 1. Kun til in vitro-diagnostikk. 2. Kun til profesjonell bruk. 3. Bruk av denne testen med andre prøver enn humant serum eller plasma anbefales ikke. 2

4. Kalibratorene R4a, R4b, R4c og R4d tillages med bruk av humant serum som er testet og funnet å være negativt for anti- HIV 1, anti-hiv-2, anti-hcv-antistoffer samt HBs-antigen med CE-merkede tester. Alle reagenser må imidlertid håndteres som om de var potensielt smittefarlige. Alle tester må utføres i henhold til OSHA-standarden for patogene agenter som overføres hematogent, biosikkerhetsnivå 2 eller i samsvar med annen godkjent praksis for biosikkerhet. 5. Bruk vernetøy bestående av laboratoriefrakk, vernebriller og ansiktsbeskyttelse samt engangshansker (hansker i syntetisk materiale uten lateks anbefales), og håndter reagensene i kitet og pasientprøvene i henhold til god laboratoriepraksis (GLP). Vask hendene grundig når testen er utført. 6. Munnpipettering må ikke brukes. 7. Det må ikke røykes, drikkes eller spises på steder der prøver eller reagensene i kitet håndteres. 8. Unngå å søle prøver eller løsninger som inneholder prøver. 9. Søl av kontaminerende væske som ikke inneholder syre, må tørkes grundig opp med et effektivt desinfiseringsmiddel. Desinfiseringsmidler som kan brukes, omfatter (men er ikke begrenset til) en løsning med 10 % blekemiddel (0,5 % natriumhypoklorittløsning), 70 % etanol eller 0,5 % Wescodyne Plus. Materialer som er brukt til å tørke opp søl, må kasseres i en spesialbeholder for kontaminert avfall. FORSIKTIG: Løsninger som inneholder blekemidler, må ikke plasseres i autoklav. 10. Dersom den kontaminerende væsken er en syre, må overflatene tørkes eller nøytraliseres med natriumbikarbonat, og området må skylles godt og tørkes. Hvis den kontaminerende væsken inneholder biologisk farlig avfall, må området vaskes med kjemisk desinfiseringsmiddel. 11. Alle prøver og reagenser som er brukt i testingen, må kasseres som om det var potensielt smittefarlig avfall. Alle gjeldende bestemmelser om kassering av farlig kjemisk og biologisk avfall må overholdes. 12. FORSIKTIG: I det etterfølgende vises en liste over potensielle kjemiske risikoområder, som noen av kitets bestanddeler representerer (se kapittel 5 REAGENSER). Xi - Irriterende Noen reagenser inneholder ProClin 300 < 1,5 %: R43: Kan medføre sensibilisering ved kontakt med huden S23-24-37-60: Pust ikke inn damp/sprøytetåke. Unngå kontakt med huden. Bruk egnede vernehansker. Produktet og dets emballasje skal behandles som spesialavfall. 13. Sikkerhetsdatablad (SDB) kan fås på forespørsel. 7 FORSIKTIGSHETSREGLER VED BRUK 1. NEDFRYSTE, LAGREDE SERUM- ELLER PLASMAPRØVER SOM HAR VÆRT OPPBEVART UNDER UKJENTE FORHOLD, KAN GI FALSKE POSITIVE RESULTATER PÅ GRUNN AV KONTAMINERING SOM SKYLDES SOPP OG/ELLER BAKTERIER. 2. Kitet eller reagensene i kitet må ikke brukes etter den angitte utløpsdatoen. 3. Reagenser fra andre kit med andre partinumre må ikke blandes eller benyttes i én og samme serie. MERK: Det er mulig å benytte andre partier for vaskeløsning (R2, identifisert* 20 x i grønt), kromogenløsning (R9, identifisert* TMB i turkis) og stoppløsning (R10, identifisert* 1N i rødt) enn de som følger med settet, med forbehold om kun å benytte helt like reagenser fra ett og samme parti til én og samme serie. MERK: Vaskeløsningen (R2 identifisert* 20 x i grønt) kan ikke blandes med vaskeløsningen (R2 identifisert* 10 x i blått) som leveres med reagenskitene fra Bio-Rad. * på beholderens merkelapp 4. Før bruk må reagensene tilpasses romtemperatur (+18 30 C) i 30 minutter. 5. Bruk helst engangsmateriale. Hvis ikke engangsmateriale brukes, må det benyttes en helt ren glassplate som er vasket og skylt i destillert vann. 6. Kontroller at pipettene er nøyaktige og at utstyret som benyttes, fungerer korrekt. 7. Rekonstituer R2-reagensen grundig, sørg for å unngå kontaminering. 8. Den enzymatiske reaksjonen er svært følsom overfor alle metaller og metalliske ioner. Derfor må ingen metalliske elementer komme i kontakt med de ulike løsningene som inneholder konjugatet eller substratløsningen. 9. Ved manuell pipettering av kontroller og prøver, må individuelle pipettespisser brukes for hvert serum for å unngå kontaminering. 10. For å sikre adekvat vasking av brønnene, må anbefalt antall vaskesykluser brukes. Alle brønnene må fylles helt opp og deretter tømmes fullstendig. Vasking må utføres med en mikroplatevasker. 11. Mikroplaten må ikke tørke mellom slutten av vaskesyklusen og tilsetting av reagenser. 12. Ikke bruk samme beholder til konjugatet og substratløsningen. 13. Ikke la kromogenløsningen eller substratløsningen utsettes for sterkt lys under oppbevaring eller inkubering. Ikke la kromogenløsningene komme i kontakt med oksiderende stoffer. 14. Kromogenet (R9) må være fargeløst. Dersom en blåfarge vises, indikerer dette at reagensen er ubrukelig og må erstattes. 15. Stoppløsningen må ikke komme i kontakt med noen form for oksiderende stoffer, metall eller metalliske ioner. 16. Ikke hell ubrukt konjugat tilbake i originalbeholderen. 8 TILLAGING OG OPPBEVARING AV REAGENSER Mikroplate (R1) Hver plateholder inneholder 12 strips og er pakket i en pose. Klipp opp posen med en saks, like under sveisingen. Åpne posen og ta ut plateholderen. Legg plateholderen med ubrukte strips tilbake i originalpakningen. Lukk posen ordentlig og oppbevar den ved +2 8 C. 3

Etter at vakuumposen er åpnet, er stripsene stabile i 8 uker når de oppbevares ved +2 8 C i godt lukket originalpakning. Kontroller at tørkemiddelet medfølger. Vaskeløsning (R2) Vaskeløsningen prepareres ved å vanne ut den konsentrerte vaskeløsningen 20 ganger i destillert vann: 50 ml R2 i 950 ml destillert vann. (Bruk 650 ml fortynnet vaskeløsning til én hel plate med 12 strips, i tillegg til dødvolum for apparatet som benyttes). Etter fortynning kan vaskeløsningen oppbevares i 14 dager ved +2 30 C. Etter åpning vil den konsentrerte vaskeløsningen være stabil inntil utløpsdatoen som er angitt på etiketten, dersom den oppbevares ved +2 30 C og ikke kontamineres. Kalibrator 0 (R3), Kalibrator 5 (R4a), Kalibrator 10 (R4b), Kalibrator 20 (R4c), Kalibrator 80 (R4d): Kalibratorene er bruksklare. Etter åpning er reagensene stabile i 8 uker dersom de oppbevares ved +2 8 C og ikke kontamineres. Konjugat (R6), Prøvefortynner 1 (R7a), Prøvefortynner 2 (R7b), TMB-kromogenløsning (R9): Disse reagensene er bruksklare. Etter åpning er reagensene stabile i 8 uker dersom de oppbevares ved +2 8 C og ikke kontamineres. Stoppløsning (R10): Denne reagensen er bruksklar. Etter åpning vil denne reagensen være stabil inntil utløpsdatoen som er angitt på etiketten, dersom den oppbevares ved +2 8 C og ikke kontamineres. 9 PRØVETAKING 1. Testene utføres med prøver av serum eller plasma som er innhentet på antikoagulant av typen EDTA, heparin eller citrat. 2. Følgende anvisninger må respekteres ved prøvetaking, behandling og oppbevaring av disse blodprøvene: - Ta en blodprøve i henhold til vanlig praksis. - For serum må levringen dannes fullstendig før sentrifugering. - Rørene må oppbevares lukket. - Etter sentrifugering må serumet eller plasmaen skilles ut og oppbevares på lukket rør. - Prøvene kan oppbevares ved +2 8 C dersom testen utføres innen 4 dager. - Hvis det tar mer enn 4 dager, fryses prøvene ved -20 C (eller -80 C). - Det anbefales ikke å fryse/tine prøvene mer enn 3 ganger. Prøvene må blandes grundig etter tining og før testen gjennomføres. 3. Resultatene påvirkes ikke av prøver som inneholder 60 g/l humant albumin eller 120 g/l totale proteiner eller 200 mg/l ikkekonjugert bilirubin eller 200 mg/l konjugert bilirubin, lipemiske prøver som inneholder tilsvarende 30 g/l triolein (triglycerid) eller 5 g/l kolesterol eller hemolyserte prøver som inneholder 2 g/l hemoglobin. 4. Prøvene må ikke varmes opp. 10 PROSEDYRE Medfølgende materiale Se avsnitt 5 REAGENSER Nødvendig materiale som ikke medfølger 1. Sterilt destillert eller demineralisert vann til fortynning av konsentrert vaskeløsning. 2. Absorberende papir. 3. Engangshansker. 4. Vernebriller. 5. Natriumhypokloritt (blekemiddel) og natriumbikarbonat. 6. Pipetter eller multipipetter (automatiske eller halvautomatiske, justerbare eller ikke-justerbare), til oppmåling og pipettering av 10 μl 1000 μl, 1 ml, 2 ml og 10 ml. 7. Prøverør med gradering for 25 ml, 50 ml, 100 ml og 1000 ml. 8. Engangsrør. 9. Beholder for kontaminert avfall. 10. Blandeapparat av vortex-type. 11. Mikroplateinkubator som kan termostatstyres til 37 C ± 1 C (*). 12. Halvautomatisk eller automatisk mikroplatevasker (*). 13. Mikroplateavleser med 450 nm og 620 nm filtre (*). (*) Kontakt oss for nøyaktig informasjon angående de apparatene som er godkjente av vår tekniske avdeling. EIA-prosedyre Den foreslåtte protokollen må følges nøye. Følg god laboratoriepraksis: Gi alltid reagensene 30 minutter for å oppnå romtemperatur (18 30 C) før de tas i bruk. Bruk alle kalibratorene ved hver serie for å validere testens kvalitet. 4

Gå frem på følgende måte: 1. Lag en nøyaktig plan for fordeling og identifisering av kalibratorene og prøvene. 2. Rett i forkant utføres en fortynning av prøvene som skal testes i forholdet 1/20, det vil si 10 μl serum eller plasma + 190 μl prøvefortynner 1 (R7a). Fortynningen av prøvene gir en mørkerød farge. 3. Ta plateholderen og stripsene (R1) ut av den beskyttende pakningen. Legg ubrukte strips tilbake i pakningen og lukk den. 4. Fordel 190 μl prøvefortynner 2 (R7b) i brønnene som er reseptorer for prøvene som skal analyseres, og tilsett deretter 10 μl av prøvene som er fortynnet til 1/20, bland forsiktig ved suksjon 2 eller 3 ganger. NB: Fordelingen av prøvene kan kontrolleres på dette trinnet av prosessen. Etter tilsettingen av 10 μl av de fortynnede prøvene, vil brønnene som inneholder prøver, anta en brunfarge. En brønn som ikke inneholder prøve, vil ha en grønn farge. 5. Fordel de bruksklare kalibratorene med 200 μl pr. brønn i henhold til følgende plan: - A1: Kalibrator 0 UA/ml (R3) - B1: Kalibrator 5 UA/ml (R4a) - C1: Kalibrator 10 UA/ml (R4b) - D1: Kalibrator 20 UA/ml (R4c) - E1: Kalibrator 80 UA/ml (R4d) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R3 S4 S12 B R4a S5 C R4b S6 D R4c S7 E R4d S8 F S1 S9 G S2 S10 H S3 S11 6. Dekk mikroplaten med en klebende film, trykk godt over hele overflaten for å være sikker på at den er tett. 7. Inkuber straks mikroplaten i en tørr inkubator for mikroplater i 60 ± 5 minutter ved 37 C (± 1 C). 8. Lag den fortynnede vaskeløsningen (se avsnitt 8). 9. Fjern den klebende filmen. Aspirer innholdet fra hver brønn over i en beholder for kontaminert avfall (som inneholder natriumhypokloritt). 10. Vask mikroplaten 4 ganger med en mikroplatevasker med 800 μl fortynnet vaskeløsning. Etter siste vask snus mikroplaten opp-ned og bankes forsiktig mot absorberende papir for å fjerne gjenværende væske. 11. Bland R6-beholderens innhold ved å snu den opp-ned før bruk. Hvis multikanals-pipette skal benyttes, må det ikke tas mer enn nødvendig volum for å gjennomføre serien: Beregn 3,5 ml for to strips med 8 brønner hver. 12. Fordel 200 μl konjugatløsning R6 i hver brønn. 13. Dekk mikroplaten med en klebende film, trykk godt over hele overflaten for å være sikker på at den er tett. 14. Inkuber mikroplaten i en tørr mikroplateinkubator i 60 ± 5 minutter ved 37 C (± 1 C). 15. Fjern den klebende filmen. Aspirer innholdet fra hver brønn over i en beholder for kontaminert avfall (som inneholder natriumhypokloritt). 16. Vask mikroplaten 4 ganger med en mikroplatevasker med 800 μl fortynnet vaskeløsning. Etter siste vask snus mikroplaten opp-ned og bankes forsiktig mot absorberende papir for å fjerne gjenværende væske. 17. Fordel raskt 200 μl av TMB-kromogenløsningen (R9) i hver brønn, unngå at løsningen eksponeres for sterkt lys. 18. Inkuber mikroplaten mørkt ved romtemperatur (+18 30 C) i 30 ± 5 minutter. Ikke bruk klebende film i dette inkubasjonstrinnet. 19. Tilsett 100 μl stoppløsning (R10) i hver brønn, bruk samme rekkefølge og tempo som ved tilsetningen av kromogenløsningen. Bland godt. 20. Tørk godt av bunnen av hver plate. 21. Les av absorbansen (OD) for hver brønn ved 450 nm (referansefilter 620 nm) innen 30 minutter etter tilsettingen av stoppløsningen (stripsene må alltid oppbevares skjermet fra lys før avlesning). 22. Sørg for at det er samsvar mellom avlesningen og distribusjonsplanen for platene før resultatene registreres. 11 KVALITETSKONTROLL (VALIDITETSKRITERIER) Bruk kalibreringspunktene på hver mikroplate for hver analyse. Følgende kriterier må oppfylles for å validere testen: OD-verdi (optisk densitet / absorbans): OD R4a > 0,160 Forhold: OD-forhold R4a/OD R3 > 6,00 OD-forhold R4b/OD R4a > 1,20 OD-forhold R4c/OD R4b > 1,20 OD-forhold R4d/OD R4c > 1,20 5

12 TOLKNING AV RESULTATENE Etablere kalibreringskurven Kalibreringskurven plottes med de 5 kalibreringspunktene (kalibratorene) 0, 5, 10, 20 og 80 AU/ml. Kalibreringskurven [OD = funksjon (AU/ml)] etableres slik at kalibratorene R3, R4a, R4b, R4c og R4d plottes på den vertikale aksen (Y-aksen) og deres tilsvarende respektive konsentrasjon i AU/ml på den horisontale aksen (X-aksen). Benytt én kurve som punkt for punkt forbinder de ulike kalibreringspunktene. Bestemmelse av konsentrasjonen av anti-mannan antistoffer (AU/ml) i de analyserte prøvene Ved hjelp av kurven som ble trukket opp, kan man bestemme konsentrasjonen av anti-mannan antistoffer for hver av testprøvene, uttrykt i AU/ml. Tolkning av resultatene Prøver som har en konsentrasjon under 5 AU/mL (C < 5) anses som "negative" for anti-mannan antistoffer. Prøver med en konsentrasjon på mellom 5 og 10 AU/mL (5 C < 10) anses som "intermedierende" for anti-mannan antistoffer. Prøver med en konsentrasjon lik eller over 10 AU/mL (C 10) anses som "positive" for anti-mannan antistoffer. Kalibratorene som brukes til plotting av kalibreringskurven gjør det ikke mulig å titrere konsentrasjoner over 80 AU/ml. Testen må gjentas etter ytterligere fortynning av serumet eller plasmaen ved å tynne ut 1 (R7a) til 1/10. Etter denne siste fortynningen må prosedyren under avsnitt 10 følges (fortynning til 1/20 med R7a, deretter fortynning til 1/20 med R7b). Konsentrasjonen for klart positive prøver beregnes ved å multiplisere den oppnådde konsentrasjonen med 10. Et "intermedierende" resultat kan bekreftes med en ny prøvetaking hos pasienten i ukene som følger etter prøvetakingen som ga en intermedierende konsentrasjon. 13 BEGRENSNINGER VED BRUK 1. En negativ test kan ikke utelukke diagnose for invasiv candidiasis. Tolkningen av fraværet av antistoffer er vanskelig hos pasienter hvor immunsystemet har forandret seg. En diagnose for invasiv candidiasis kan kun stilles etter undersøkelse av kliniske, terapeutiske, radiologiske, cytologiske, direkte mykologiske og serologiske data. Hvert av disse må undersøkes separat før de tolkes med forsiktighet. 2. En negativ test for anti-mannan antistoffer må også ses i forhold til resultatet av testingen etter mannan-antigen: Selv i tilfeller med invasiv candidiasis er det vanskelig å påvise antigenet hos pasienter som tester positivt for anti-mannan antistoffer (se avsnitt 15 Ytelsesegenskaper). 3. Påvisningen av anti-mannan antistoffer i serum eller plasma er relatert til hvor ofte pasienten testes. For å øke testens sensitivitet og bidra til tidlig påvisning, anbefales regelmessig oppfølging av høyrisikopasienter samt screening med tanke på mannan-antigen. 4. Prosedyren og tolkningen av resultatene for Platelia Candida Ab Plus-testen må overholdes ved analysering av prøvene for anti-mannan antistoffer. Den som bruker kitet, bør lese pakningsvedlegget nøye før testen. Protokollen må spesielt følges nøye når det gjelder pipettering av prøvene og reagensene, vasking av mikroplaten og varigheten av inkubasjonstrinnene. 5. Hvis ikke prøver og reagenser tilsettes i henhold til anvisningene, kan det føre til falske negative resultater. En ny prøve fra samme pasient må vurderes analysert dersom det er klinisk mistanke om invasiv candidiasis eller prosedyrefeil. 6. Kontaminering av negative pasientbrønner med positive kontrollbrønner eller pasientprøvebrønner er mulig hvis innholdet i en brønn søles over i en annen på grunn av uvøren håndtering av mikroplaten eller dårlig pipetteringsteknikk under tilsetting av reagenser. 7. Ytelsesegenskapene for Platelia Candida Ab Plus har ikke blitt evaluert sammen med serum- eller plasmaprøver fra nyfødte eller små barn. 8. Ytelsesegenskapene for Platelia Candida Ab Plus har ikke blitt fastlagt for manuell avlesning og/eller visuell bestemmelse av resultatene. 9. Falske positive resultater har blitt rapportert når prøvene inneholdt et humant gammaglobulinnivå 60 g/l, samt for visse prøver som testet positivt for rheumatoid faktor eller positivt for anti-ds-dna antistoffer eller positivt for lgg anti-aspergillus. 14 FORVENTEDE VERDIER Forekomst av antistoffer rettet mot spesifikt Candida-mannan-antigen målt ved bruk av Platelia Candida Ab Plus-test har blitt vurdert ut fra et panel med 613 prøver fra 51 nederlandske pasienter (sykehus 1 - Nederland) behandlet for kreft (malign hemopati for 49 pasienter og ikke-hematologisk kreft for 2 pasienter) med intensiv kjemoterapi. Av 613 prøver var 114 positive og 136 intermedierende, det vil si en forekomst på 114/613 = 18,6 % [CI 95 %: 15,6 21,9 %] når intermedierende resultater betraktes som negative, og 250/613 = 40,8 % [CI 95 %: 36,9 44,8 %] når intermedierende resultater betraktes som positive. Av 51 testede pasienter ble det fra 14 påvist minst én positiv prøve, og 20 av pasientene hadde minst én intermedierende prøve uten noen positive, det vil si en forekomst på 14/51 = 27,5 % [CI 95 %: 15,9 41,7 %] når intermedierende resultater betraktes som negative, og 34/51 = 66,7 % [CI 95 %: 52,1 79,2 %] når intermedierende resultater betraktes som positive. Av disse 51 pasientene var det 30 (388 prøver) som ikke hadde dokumentert invasiv candidiasis. Av disse var 20 kolonisert av gjærsopp (12 av Candida albicans, 7 av Candida albicans tilknyttet en annen art av Candida og 1 kolonisert av minst én art av Candida ikke-albicans). 6

4 av disse pasientene hadde kliniske symptomer, samt en Candida overflateinfeksjon som var mikrobiologisk bevist. Alvorlige skader på slimhinnebarrierene ble påvist hos 24 av disse pasientene. Av 388 prøver var 53 positive og 95 intermedierende, det vil si en forekomst på 53/388 = 13,7 % [CI 95 %: 10,4 17,5 %] når intermedierende resultater betraktes som negative, og 148/388 = 38,1 % [CI 95 %: 33,3 43,2 %] når intermedierende resultater betraktes som positive. Av 30 testede pasienter ble det fra 7 påvist minst én positiv prøve, og 12 av pasientene hadde minst én intermedierende prøve uten noen positive, det vil si en forekomst på 7/30 = 23,3 % [CI 95 %: 9,9 42,3 %] når intermedierende resultater betraktes som negative, og 19/30 = 63,3 % [CI 95 %: 43,9 80,1 %] når intermedierende resultater betraktes som positive. 15 YTELSESEGENSKAPER A. Studier av reproduserbarhet Intra-analysepresisjon (repeterbarhet): For å evaluere den intra-analytiske repeterbarheten, ble 1 negativ prøve og 5 positive prøver analysert i 32 replikater i én og samme serie. Konsentrasjonen i AU/ml ble bestemt for hver prøve. Gjennomsnittet av konsentrasjonene, standardavviket (Standard Deviation, SD) og variasjonskoeffisienten (CV %) for hver prøve er oppgitt i følgende tabell: Intra-analysepresisjon (repeterbarhet) N=32 Gjennomsnitt for konsentrasjonene (AU/ml) Prøve prøve nr. 1 prøve nr. 2 prøve nr. 3 Middels positiv prøve Sterkt positiv prøve 3,14 7,91 10,17 10,06 38,42 67,62 SD 0,123 0,547 0,424 0,464 3,836 4,070 CV % 3,9 % 6,9 % 4,2 % 4,6 % 10,0 % 6,0 % Inter-analysepresisjon (reproduserbarhet): For å kunne evaluere den inter-analytiske reproduserbarheten, ble 6 prøver (1 negativ og 5 positive) testet i duplikat, i 2 serier pr. dag og over en periode på totalt 20 dager. Konsentrasjonen i AU/ml ble bestemt for hver prøve. Gjennomsnittet av konsentrasjonene, standardavviket (Standard Deviation, SD) og variasjonskoeffisienten (CV %) for hver prøve er oppgitt i følgende tabell: Inter-analysepresisjon (reproduserbarhet) Prøve N=80 Gjennomsnitt for konsentrasjonene (AU/ml) prøve nr. 1 prøve nr. 2 prøve nr. 3 Middels positiv prøve Sterkt positiv prøve 3,54 8,16 11,51 11,42 31,54 62,58 SD 0,332 0,814 1,481 1,452 6,55 7,162 CV % 9,4 % 10,0 % 12,9 % 12,7 % 20,8 % 11,4 % B. Kryssreaksjoner Patologi Antall testede prøver Antall positive Antall intermedierende Antall bekreftede positive ved kommersiell test Antall bekreftede intermedierende ved kommersiell test Anti-Aspergillus antistoffer 110 12 30 9/12 12/30 Anti-ds-DNA antistoffer 10 2 2 0/2 0/2 Positive ANA 10 0 1 NA 0/1 Myelom IgG/IgM 20 0 0 NA NA Anti-Toxoplasma IgG 10 1 1 0/1 1/1 Humane anti-mus antistoffer 12 1 1 0/1 0/1 Rheumatoid faktor 31 5 4 4/5 1/4 De prøvene som ut fra Platelia Candida Ab Plus-testen var positive eller intermedierende ble deretter testet i en kommersiell, konkurrerende test for påvisning av anti-candida antistoffer (som omfattet én test for påvisning av IgG anti-candida og én test for påvisning av IgM anti-candida). C. Linearitet Linearitetsområdet for Platelia Candida Ab Plus-testen er etablert mellom 2 og 78 AU/ml ut fra studier av fortynning som er utført på 5 positive prøver. D. Kliniske studier Ytelsesegenskapene for Platelia Candida Ab Plus-kitet har blitt evaluert ved 3 sykehus med totalt 836 prøver fra 489 pasienter. 7

SENSITIVITET Sensitiviteten for Platelia Candida Ab Plus-kitet har blitt bestemt ut fra et panel på 436 prøver fra 89 pasienter ved 2 sykehus i Nederland og Frankrike. Prøvenes fordeling er som følger: Sykehus1 (Nederland): 225 prøver fra 21 nederlandske pasienter på en onko-/hematologisk avdeling for behandling med intensiv kjemoterapi av malign hemopati (19 tilfeller) eller ikke-hematologisk kreft (2 tilfeller), etterfulgt av hematopoietiske stamcelletransplantasjoner i de tilfellene hvor dette var aktuelt. Alle disse pasientene hadde mikrobiologisk bevist invasiv candidiasis med grunnlag i minst én positiv Candida-kultur (blodkultur eller kultur med normalt steril vevsprøve). 17 Sykehus 2 (Frankrike): 211 prøver fra 68 franske sykehuspasienter innlagt ved ulike overvåkningsavdelinger eller onko- /hematologiske avdelinger, og med mikrobiologisk påvist invasiv candidiasis med grunnlag i minst én positiv blodkultur med Candida spp. NB: Prøvepanelene som ble brukt ved disse to studiene kommer fra pasienter hvor blodprøvene ble tatt mellom 1999 og 2007. Den relative stabiliteten av mannan-antigen og anti-mannan antistoffer i disse prøvene under nedfrysingstiden, samt etter hver nedfrysings- og opptiningssyklus, viser at de påviste resultatene avhenger av oppbevaringsstatusen for det analyserte panelet. Testens sensitivitetsverdier, som er bestemt innenfor rammen av retrospektive kliniske studier, kan derfor ligge under verdiene som oppnås for prøver som er tatt svært nylig for prospektive kliniske studier. Resultater fra sykehus 1 De 21 nederlandske pasientene som inkluderes i denne studien har blitt innlagt på sykehus for behandling med intensiv kjemoterapi av malign hemopati (akutt myeloblastisk leukemi, akutt lymfoblastisk leukemi, kronisk lymfatisk leukemi, myelom, myelodysplastisk syndrom, aplastisk anemi eller non-hodgkins lymfom) eller en ikke-hematologisk kreft, eventuelt etterfulgt av hematopoietiske stamcelletransplantasjoner 17. Disse 21 pasientene hadde mikrobiologisk bevist invasiv candidiasis med grunnlag i minst én positiv Candida spp-kultur (blodkultur eller kultur med normalt steril vevsprøve). Statusen for disse pasientene når det gjaldt forekomst av antistoffer rettet mot spesifikt Candida mannan-antigen påvist med Platelia Candida Ab Plus-testen, anses som positiv dersom minst én av pasientens prøver er positiv. Dersom det ikke påvises noen positiv prøve, anses status som intermedierende dersom minst én av pasientens prøver er intermedierende, og som negativ når alle pasientens prøver er negative. 17 Pasientkategorier 21 pasienter (225 prøver) viste minst én positiv kultur med Candida spp. Resultater for Platelia Candida Ab Plus Antall pasienter (antall Sensitivitet Sensitivitet prøver) (intermedierende (intermedierende Inter- ansett som ansett som medie- rende negative) positive) Positiv 7 (61) 8 (41) 6 (123) 33,3 % [14,6-57,0 %] 71,4 % [47,8-88,7 %] Parallelt med Platelia Candida Ab Plus-testen ble de samme prøvene testet for spesifikt Candida mannan-antigen med kitet Platelia Candida Ag Plus 9. Pasientens status når det gjelder forekomsten av mannan-antigen eller spesifikke Candida-antimannan antistoffer blir ansett som positiv dersom minst én av de to testene er positiv. Dersom det ikke påvises noen positiv test, anses status som intermedierende dersom minst én av de to testene er intermedierende, og som negativ når begge testene er negative. Pasientkategorier 21 pasienter (225 prøver) viste minst én positiv kultur med Candida spp. Kombinasjon av resultatene for Platelia Candida Ab Plus og Platelia TM Candida Ag Plus Antall pasienter (antall Sensitivitet Sensitivitet Positiv prøver) Intermedierende 15 (98) 4 (34) 2 (93) (intermedierende (intermedierende ansett som ansett som negative) positive) 71,4 % [47,8-90,5 %] 90,5 % [69,9-98,8 %] Resultater fra sykehus 2 De 68 franske pasientene som inkluderes i denne studien ble innlagt på ulike overvåkningsavdelinger (kirurgi, transplantasjon, brannskader, traumatologi, pneumologi osv.) eller onko-/hematologiske avdelinger (malign hemopati). Alle utviklet en mikrobiologisk bevist invasiv candidiasis med grunnlag i minst én positiv blodkultur med Candida (albicans, parapsilosis, norvegensis, glabrata, krusei eller tropicalis) 6, 7, 14 i dagene før eller etter den studerte blodprøven. Blodprøvene ble tatt i gjennomsnitt 6 dager etter den første positive blodkulturen med Candida (minimum 61 dager før, maksimalt 67 dager etter). Status for disse pasientene, når det gjaldt forekomst av antistoffer rettet mot spesifikt Candida mannan-antigen påvist med Platelia Candida Ab Plustesten, anses som positiv dersom minst én av pasientens prøver er positiv. Dersom det ikke påvises noen positiv prøve, anses status som intermedierende dersom minst én av pasientens prøver er intermedierende, og som negativ når alle pasientens prøver er negative. 8

Pasientkategorier 68 pasienter (211 prøver) viste minst én positiv blodkultur med Candida spp. Resultater for Platelia Candida Ab Plus Antall pasienter (antall Sensitivitet prøver) (intermedierende Inter- ansett som medie- rende negative) Positiv 30 (71) 13 (51) 25 (89) - hvorav 34 med C. albicans (113 prøver) 17 (45) 6 (31) 11 (37) - hvorav 15 med C. parapsilosis (37 prøver) 4 (5) 6 (15) 5 (17) - hvorav 12 med C. glabrata (32 prøver) 7 (15) 1 (4) 4 (13) 44,1 % [32,1 56,7 %] 50,0 % [32,4 67,6 %] 26,7 % [7,8 55,1 %] 58,3 % [27,7 84,8 %] Sensitivitet (intermedierende ansett som positive) 63,2 % [50,7 74,6 %] 67,6 % [49,5 82,6 %] 66,7 % [38,4 88,2 %] 66,7 % [34,9 90,1 %] - hvorav 4 med C. tropicalis (19 prøver) 2 (6) 0 (1) 2 (12) 50,0 % * 50,0 % * - hvorav 2 med C. krusei (8 prøver) 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0,0 % * 0,0 % * - hvorav 1 med C. norvegensis (2 prøver) 0 (0) 0 (0) 1 (2) 0,0 % * 0,0 % * * : Konfidensintervallet på 95 % kunne ikke beregnes på grunn av utilstrekkelig prøvemengde.. Parallelt med Platelia Candida Ab Plus-testen ble de samme prøvene testet for spesifikt Candida mannan-antigen med kitet Platelia Candida Ag Plus. Pasientens status når det gjelder forekomsten av mannan-antigen eller spesifikke Candida-antimannan antistoffer blir ansett som positiv dersom minst én av de to testene er positiv. Dersom det ikke påvises noen positiv test, anses status som intermedierende dersom minst én av de to testene er intermedierende, og som negativ når begge testene er negative. 17 Pasientkategorier 68 pasienter (211 prøver) viste minst én positiv blodkultur med Candida spp. Kombinasjon av resultatene for Platelia Candida Ab Plus og Platelia TM Candida Ag Plus Antall pasienter (antall Positiv prøver) Intermedierende 48 (122) 8 (40) 12 (49) - hvorav 34 med C. albicans (113 prøver) 28 (74) 2 (22) 4 (17) - hvorav 15 med C. parapsilosis (37 prøver) 5 (7) 6 (15) 4 (15) - hvorav 12 med C. glabrata (32 prøver) 11 (24) 0 (3) 1 (5) Sensitivitet (intermedierende ansett som negative) 70,6 % [58,3 81,0 %] 82,4 % [65,5 93,2 %] 33,3 % [11,8 61,6 %] 91,7 % [61,5 99,8 %] Sensitivitet (intermedierende ansett som positive) 82,4 % [71,2 90,5 %] 88,2 % [72,6 96,7 %] 73,3 % [44,9 92,2 %] 91,7 % [61,5 99,8 %] - hvorav 4 med C. tropicalis (19 prøver) 4 (17) 0 (0) 0 (2) 100,0 % * 100,0 % * - hvorav 2 med C. krusei (8 prøver) 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0,0 % * 0,0 % * - hvorav 1 med C. norvegensis (2 prøver) 0 (0) 0 (0) 1 (2) 0,0 % * 0,0 % * * : Konfidensintervallet på 95 % kunne ikke beregnes på grunn av utilstrekkelig prøvemengde. SPESIFISITET Spesifisiteten ble bestemt ut fra et panel med 400 prøver som kom fra 2 sykehus i Frankrike, og prøvene fordelte seg som følger: Sykehus 1: 200 prøver fra 200 franske pasienter med oppfølging innen toksoplasmose-serologi under svangerskapet og uten noen kliniske symptomer på Candida-infeksjon. Sykehus 2: 200 prøver fra 200 franske blodgivere. 9

Pasientkategorier 200 gravide kvinner (200 prøver) med oppfølging innen toxoplasmose-serologi Resultater for Platelia Candida Ab Plus Antall pasienter (antall Spesifisitet Spesifisitet prøver) (intermedierende (intermedierende Inter- ansett som ansett som medie- rende positive) negative) Positiv 9 35 156 200 blodgivere (200 prøver) 8 28 164 78,0 % [71,6 83,5 %] 82,0 % [76,0 87,1 %] 95,5 % [91,6 97,9 %] 96,0 % [92,3 98,3 %] 16 PRODUSENTENS KVALITETSKONTROLL Alle tilvirkede produkter som er markedsført av Bio-Rad settes i et kvalitetssikringssystem, som starter fra mottak av råmateriale til den endelige markedsføringen av produktet. Hvert parti gjennomgår en kvalitetskontroll og sendes kun ut på markedet etter at produktet har oppfylt akseptkriteriene. Dokumentasjonen som omhandler tilvirkning og kontroll av hvert enkelt parti, oppbevares hos produsenten. 17 LITTERATURREFERANSER 1- Alam, F.F., Mustafa, A.S., Khan, Z.U. 2007. Comparative evaluation of (1,3)-beta-D-glucan, mannan and anti-mannan antibodies, and Candidaspecies-specific snpcr in patients with candidemia. BMC Infectious Diseases 7(103):p. 1-9. 2- Ascioglu, S., Rex, J.H., de Pauw, B., Bennett, J.E., Bille, J., Crokaert, F., Denning, D.W., Donnelly, J.P., Edwards, J.E., Erjavec, Z., Fiere, D., Lortholary, O., Maertens, J., Meis, J.F., Patterson, T.F., Ritter, J., Selleslag,D., Shah, P.M., Stevens, D.A., Walsh,T.J. 2002. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: An international consensus. Clinical Infectious Diseases 34: p. 7 14. 3- Ellepola, A.N.B., Morrison, C.J. 2005. Laboratory Diagnosis of Invasive Candidiasis. Journal of Microbiology 43(No. S): p. 65-84. 4- Ellis, M., Al-Ramadi, B., Bernsen, R., Kristensen, J., Alizadeh, H., Hedstrom, U. 2009. Prospective evaluation of mannan and anti-mannan antibodies for diagnosis of invasive Candidainfections in patients with neutropenic fever. Journal of medical microbiology 58(5): p. 606-615. 5- Guery, B.P., Arendrup, M.C., Auzinger, G., Azoulay, E., Borges Sá, M.,Johnson, E.M., Müller, E., Putensen, C., Rotstein, C., Sganga, G., Venditti, M., Zaragoza Crespo, R., Kullberg, B.J. 2009. Management of invasive candidiasis and candidemia in adult non-neutropenic intensive care unit patients: Part I. Epidemiology and diagnosis. Intensive Care Med. 35: p. 55 62. 6- Nucci, M.,, Colombo, A.L. 2007. Candidemia due to Candida tropicalis: clinical, epidemiologic, and microbiologic characteristics of 188 episodes occurring in tertiary care hospitals. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 58: p. 77 82. 7- Oliveri, S., Trovato, L., Betta, P., Romeo, M.G., Nicoletti, G. 2008. Experience with the Platelia Candida ELISA for the diagnosis of invasive candidiosis in neonatal patients. Clinical Microbiology and Infection 14 (4): p. 377-397. 8- Pappas, P.G., Kauffman, C.A., Andes, D., Benjamin D.K.Jr., Calandra, T.F.,Edwards, J.E.Jr, Filler, S.G., Fisher, J.F., Kullberg, B.J., Ostrosky-Zeichner, L., Reboli, A.C., Rex, J.H., Walsh, T.J., Sobel, J.D. 2009. Clinical Practice Guidelines for the Management of Candidiasis: 2009 Update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases 48: p. 503 535. 9- Persat, F., Topenot, R., Piens, M.A., Thiebaut, A., Dannaoui, E., Picot, S. 2002. Evaluation of different commercial ELISA methods for the serodiagnosis of systemic candidiosis. Mycoses 45: p. 455 460. 10- Prella, M., Bille, J., Pugnale, M., Duvoisin, B., Cavassini, M., Calandra, T., Marchetti, O. 2005. Early diagnosis of invasive candidiasis with mannan antigenemia and antimannan antibodies. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 51: p. 95 101. 11- Rentz, A.M., Halpern, M.T., Bowden, R. 1998. The Impact of Candidemia on Length of Hospital Stay, Outcome, and Overall Cost of Illness. Clinical Infectious Diseases 27: p. 781 788. 12- Ruan, S.-Y., Hsueh, P.-R. 2009. Invasive Candidiasis: An Overview from Taiwan. J. Formos. Med. Assoc. 108(6): p. 443 451. 13- Sendid, B., Poirot, J.L., Tabouret, M., Bonnin, A., Caillot, D., Camus, D., Poulain, D. 2002. Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species. J. Med. Microbiol. 51: p. 433 442. 10

14- Sendid, B., Caillot, D., Baccouch-Humbert, B., Klingspor, L., Grandjean, M., Bonnin, A., Poulain, D. 2003. Contribution of the Platelia Candida-specific antibody and antigen tests to early diagnosis of systemic Candida tropicalis infection in neutropenic adults. Journal of Clinical Microbiology 41(10): p. 4551 4558. 15- Tortorano, A.M., Peman, J., Bernhardt, H., Klingspor, L., Kibbler, C.C., Faure, O., Biraghi, E., Canton, E., Zimmermann, K., Seaton, S., Grillot, R. 2004. Epidemiology of Candidaemia in Europe: Results of 28-Month European Confederation of Medical Mycology (ECMM) Hospital-Based Surveillance Study.Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 23: p. 317 322. 16- Vardakas, K. Z., Michalopoulos, A., Kiriakidou, K. G., Siampli, E. P., Samonis, G., Falagas, M. E. 2009. Candidaemia: incidence, risk factors, characteristics and outcomes in immunocompetent critically ill patients. Clin. Microbiol. Infect. 15: p. 289 292. 17- Verduyn Lunel, F.M., Donnelly, J.P., van der Lee, H. A. L., Blijlevens, N.M. A., Verweij, P. E. 2009. Circulating Candida-specific anti-mannan antibodies precede invasive candidiasis in patients undergoing myelo-ablative chemotherapy. Clin. Microbiol. Infect. 15(4): p. 380-386. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 881050 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 08/2009 11