(12) Translation of european patent specification (11) NO/EP 2451951 B1 (19) NO NORWAY (51) Int Cl. C12N 15/10 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) C40B 40/06 (2006.01) C40B 50/06 (2006.01) Norwegian Industrial Property Office (21) Translation Published 2016.08.22 (80) Date of The European Patent Office Publication of the Granted Patent 2016.04.13 (86) European Application Nr. 09845944.9 (86) European Filing Date 2009.09.18 (87) The European Application s Publication Date 2012.05.16 (30) Priority 2009.06.11, US, 483089 2009.06.11, WO, PCT/US09/004704 (84) Designated Contracting States: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK SM TR (73) Proprietor Codexis, Inc., 200 Penobscot Drive, Redwood City, CA 94063, US-USA (72) Inventor COLBECK, Jeffrey, 240 Waverly Street 5, Menlo ParkCalifornia 94025, US-USA MIJTS, Benjamin, 1010 Hill Street, BelmontCalifornia 94002, US-USA GIVER, Lorraine Joan, 101 West Ferndale Avenue, SunnyvaleCalifornia 94085, US- USA FOX, Richard, J., 21 Homewood Drive, KirkwoodMissouri 63122, US-USA MITCHELL, Vesna, 200 Penobscot Drive, Redwood City, CA 94063, US-USA PAK, Bumshik, Robert, 200 Penobscot Drive, Redwood City, CA 94063, US-USA GILSON, Lynne, 163 Grandview Avenue, Encinitas, CA 94024, US-USA (74) Agent or Attorney Oslo Patentkontor AS, Postboks 7007 Majorstua, 0306 OSLO, Norge (54) Title COMBINED AUTOMATED PARALLEL SYNTHESIS OF POLYNUCLEOTIDE VARIANTS (56) References Cited: WO-A1-01/12802 WO-A1-98/32845 WO-A1-98/58080 WO-A1-03/106679 WO-A1-2009/146892 WO-A1-2009/152336 WO-A2-02/34762 WO-A2-03/010183 WO-A2-2006/047669 WO-A2-2006/105082 JP-A- 2005 095 083 US-A- 6 153 410 US-A1-2006 160 138 GE L ET AL: "SIMULTANEOUS INTRODUCTION OF MULTIPLE MUTATIONS USING OVERLAP EXTENSION PCR", BIOTECHNIQUES, INFORMA HEALTHCARE, US, vol. 22, no. 1, 1 January 1997 (1997-01-01), page 28,30, XP000676361, ISSN: 0736-6205
WEISBERG E P ET AL: "SIMULTANEOUS MUTAGENESIS OF MULTIPLE SITES: APPLICATION OF THE LIGASE CHAIN REACTION USING PCR PRODUCTS INSTEAD OF OLIGONUCLEOTIDES", BIOTECHNIQUES, INFORMA HEALTHCARE, US, vol. 15, no. 1, 1 July 1993 (1993-07-01), pages 68-70,72, XP000385832, ISSN: 0736-6205 OSUNA J ET AL: "Combinatorial mutagenesis of three major groove-contacting residues of EcoRI: single and double amino acid replacements retaining methyltransferase-sensitive activities", GENE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 106, no. 1, 30 September 1991 (1991-09- 30), pages 7-12, XP023541527, ISSN: 0378-1119, DOI: 10.1016/0378-1119(91)90559-T [retrieved on 1991-09-30] LING M M ET AL: "Approaches to DNA Mutagenesis: An Overview", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, ACADEMIC PRESS INC, NEW YORK, vol. 254, no. 2, 15 December 1997 (1997-12-15), pages 157-178, XP027124938, ISSN: 0003-2697 [retrieved on 1997-12-15] WATARU I ET AL: "A general method for introducing a series of mutations into cloned DNA using the polymerase chain reaction", GENE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 102, no. 1, 15 June 1991 (1991-06-15), pages 67-70, XP023541646, ISSN: 0378-1119, DOI: 10.1016/0378-1119(91)90539-N [retrieved on 1991-06-15]
Enclosed is a translation of the patent claims in Norwegian. Please note that as per the Norwegian Patents Acts, section 66i the patent will receive protection in Norway only as far as there is agreement between the translation and the language of the application/patent granted at the EPO. In matters concerning the validity of the patent, language of the application/patent granted at the EPO will be used as the basis for the decision. The patent documents published by the EPO are available through Espacenet (http://worldwide.espacenet.com) or via the search engine on our website here: https://search.patentstyret.no/ NO/EP2451951
1 Patentkrav 5 10 15 20 1. Fremgangsmåte for syntetisering av et antall polynukleotidvarianter som hver har minst én definert nukleotid-forskjell i forhold til en polynukleotid referansesekvens hvor referansepolynukleotidet koder for et referansepolypeptid og hver av antallet polynukleotidvarianter koder for et polypeptid som har minst én aminosyre-sekvensforskjell i forhold til referansepolypeptidet, hvor fremgangsmåten omfatter: (a) separat å amplifikere et referansepolynukleotodtemplat som har hver av et antall par av fremadrettede og reverse primere, hvor antallet par av fremadrettede og reverse primere omfatter antallet av definerte nukleotidforskjeller og hvor hvert par genererer et amplikon omfattende en sekvens som er i stand til å binde til en hosliggende overlappende sekvens av minst ett annet amplikon; b) separat å sette sammen et antall sett av amplikoner hvor hvert sett omfatter amplikoner med sideliggende overlappende sekvenser som er i stand til binding for å danne referansepolynukleotidsekvensen av full lengde; c) replikere antallet sett av sammensatte amplikoner for derved å syntetisere et antall polynukeotidvarianter hvor hver av polynukleotidvariantene har minst én aminosyresekvensforskjell i forhold til referansepolypeptidet; og d) kombinere antallet polynukleotidvarianter. 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor hvert av antallet par av fremadrettede og reverse primere omfatter minst én av de definerte nukleotidforskjeller. 25 30 3. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 2, hvor fremgangsmåten ytterligere omfatter: (i) trinnet separat å klone antallet polynukleotidvarianter inn i ekspresjonsvektorer før de kombineres; (ii) trinnet å klone det kombinerte antallet polynukleotidvarianter inn i en ekspresjonsvektor for derved å genere et antall kombinerte ekspresjonsvektorer hver omfattende en polynukleotodvariant; og/eller (iii) transformere celler med det kombinerte antallet ekspresjonsvektorer. 4. Fremgangsmåte ifølge krav 3(iii), hvor fremgangsmåten ytterligere omfatter å undersøke de transformerte celler for aktivitet av polypeptidene kodet av polynukleotidvariantene.
2 5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, ytterligere omfattende å isolere minst ett polypeptid kodet av polynukleotidvariantene. 6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 5, hvor antallet par av fremadrettede og reverse primere omfatter minst én degenerert primer. 5 10 7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, hvor den degenererte primer omfatter: (i) minst ett degenerert kodon ved en posisjon av en nukleotidforskjell valgt fra gruppen bestående av NHT, NNB, NNG, NNK, NNN, NNS, NNT, NDT, RMG, RNG, RRS, SNT, VNS, VNT og VWG; eller (ii) ved en posisjon av en nukleotidforskjell i kodonene som koder for 20 forskjellige aminosyrer. 8. Fremgangsmåte ifølge krav 7(ii), hvor kodonene som koder for de 20 forskjellige aminosyrer består av NNT, VWG og TGG. 15 20 25 9. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kavene 1 8, hvor: (i) antallet polynukleotidvarianter omfatter minst 20 forskjellige polynukleotidvarianter; (ii) antallet polynukleotidvarianter omfatter minst 200 forskjellige polynukleotidvarianter; (iii) antallet polynukleotidvarianter omfatter minst 1000 forskjellige polynukleotidvarianter; (iv) antallet polynukleotidvarianter omfatter minst 20 forskjellige polynukleotidvarianter hver omfattende en forskjellig definert nukleotidforskjell ved én av 20 forskjellige utvalgte posisjoner; (v) antallet polynukleotidvarianter omfatter minst 46 forskjellige polynukleotidvarianter hver omfattende én av 23 forskjellige kodoner ved én av 2 forskjellige utvalgte posisjoner; og/eller (vi) antallet polynukleotidvarianter omfatter minst 460 forskjellige polynukleotidvarianter hver omfattende én av 23 forskjellige kodoner ved én av 20 forskjellige utvalgte posisjoner. 30 10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor minst 75% av de syntetiserte antallet polynukleotidvarianter omfatter den korrekte sekvens. 11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor minst ett av antallet sett av amplikoner omfatter minst 5 forskjellige degenererte amplikoner.
3 12. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 11, hvor: (i) lengdene av de fremadrettede og reverse primere er fra omkring 20 til omkring 50 nukleotider; og/eller (ii) lengden av referansepolynukleotidsekvensen er minst 1000 bp. 5 10 15 13. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kavene 1 12, hvor sekvenser av antallet fremadrettede og reverse primersekvenser er dannet ved: (i) identifisering av en første definert forskjell i polynukleotid variantsekvensen i forhold til referansesekvensen og bestemmelse av nærheten av den nærmeste nabo definerte forskjell i polynukleotidsekvensen; (ii) utvelgelse av en fremadrettet primer med en sekvens omfattende den første definerte nukleotidforskjell; (iii) identifisering av en neste definert forskjell i polynukleotid variantsekvensen i forhold til referansesekvensen og bestemme nærheten av den nærmeste nabo definert forskjell i polynukleotidsekvensen eller identifisering av at enden av polynukleotidvarianten har blitt nådd; (iv) velge ut en revers primer med en sekvens omfattende den neste definerte nukleotidforskjell; og (v) gjenta trinnene (iii) til (iv) for hver definert forskjell i polynukleotidvariantsekvensen slik at alle definerte forskjeller er til stede på primere. 20 14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, hvor trinn (ii) omfatter å inkludere enhver nærmeste-nabo definerte forskjell i samme fremadrettede primer dersom proksimat til den neste definerte nukleotidforskjell. 25 15. Fremgangsmåte ifølge krav 13, hvor trinn (iv) omfatter å inkludere enhver nærmeste-nabo definert forskjell i samme reverse primer dersom proksimat til den neste definerte nukleotidforskjell. 16. Fremgangsmåte ifølge krav 13, hvor fremgangsmåten ytterligere omfatter å velge ut ikke-mutagene reverse og fremadrettede oligonukleotidprimere for polynukleotidsegmenter som ikke er definert av de fremadrettede og reverse primere av (ii) og (iv).