Medisin stadium 1c Geir Slupphaug, IKM Regulering av genuttrykk

Medisin stadium 1c Geir Slupphaug, IKM Regulering av genuttrykk Grunnlaget for regulering av cellens funksjoner ligger lagret i arvematerialet - i DNA- molekylet For at genene skal utøve sin funksjon, må de imidlertid uttrykkes i form av et genprodukt. I de fleste tilfeller er endeproduktet et protein, men det kan også være RNA. Mengden av ett bestemt protein vil variere fra celletype til celletype, og i forskjellige stadier i cellens livssyklus. Reguleringen av mengden av et protein skjer på flere nivåer, og vil i hovedsak være differansen mellom det som syntetiseres og det som degraderes (unntatt proteiner som eksporteres fra cellen). Det er viktig for cellen at det til enhver tid er balanse mellom disse to prosessene

Bare et fåtall av genene uttrykkes i hver celle Det finnes ca 25 000 gener i det humane genomet. Bare en del av disse uttrykkes i hver celle (cellespesifikt uttrykk). Noen gener uttrykkes bare i fosterutviklingen (utviklingsgener). Andre gener uttrykkes i alle celler (husholdsgener), og danner proteiner som trengs for energiproduksjon osv. Proteinkodende gener transkriberes av RNA polymerase II, som trenger en rekke såkalte transkripsjonsfaktorer (TF) for å transkribere DNA I tillegg til de proteinkodende genene finnes også gener som har ulike typer RNA som sluttprodukt. Disse transkriberes av RNA polymerase I og III

Mange proteiner dannes i store mengder i spesialiserte celler, mens de ikke fins i andre celler. Dette gjelder for eksempel hemoglobin, som bare dannes i røde blodlegemer, eller immunglobuliner i B-celler. En typisk human celle syntetiserer 10 000-20-000 proteiner. Av disse utgjør ca 2 000 de vanlige proteinene (>50 000 kopier av hvert i hver celle), og mengden av disse er svært lik fra celle til celle Det viser seg altså at det bare er ulikheter i et relativt lite antall proteinmolekyler som trengs for å gi cellene helt ulikt utseende og funksjon En rekke sykdommer, som f. eks. ulike krefttyper og fødselsdefekter har vist seg å ha feil i det cellulære maskineriet som regulerer genekspresjon. Dette har derfor blitt et svært hot felt innen medisinsk forskning

Hva bestemmer hvilke proteiner som skal lages i en celle? Mengden av svært mange proteiner i cellen reguleres via signaler utenfra, f. eks. hormoner og vekstfaktorer. Disse binder til reseptorer i cellemembranen, som igjen aktiverer signalaskader inne i cellen, som til slutt aktiverer transkripsjonsfaktorer (aktivatorer eller repressorer) inne i kjernen DNA Transkripsjonsfaktor Eks: c-jun, ATF-2 Transkripsjon Signalkaskade (protein kinaser. EKS: Ras/Raf/MAP/ERK) Protein Reseptor Eks: Hormon/ vekstfaktor EGF-reseptor PDGF-reseptor Insulinreseptor

mirna Cellekjernen Transkripsjon DNA Kjerneproteiner Genuttrykket kan reguleres på alle nivåene, men transkripsjonshastigheten ser ut til å være viktigst for de fleste genprodukter mrna prosessering Primærtranskript snrna DNA Mitokondrier Modent mrna Andre mitok. proteiner rrna mrna trna rrna mrna trna Ribosomer Primært polypeptid Modent protein Sekretert protein Ribosomale mitokondrie- proteiner Til andre organeller og cytosol

TATA Selve transkripsjonsprosessen ved RNA polymerase II starter oftest ved at transkripsjonsfaktor TFIID gjenkjenner en kort nukleotidesekvens TATA som ligger ca 25 nukleotider oppstrøms for (før) transkripsjonsstartpunktet. Først når TFIID er bundet, kan andre transkripsjons-faktorer, sammen med RNA polymerasen, binde. Til slutt binder transkripsjonsfaktorern TFIIH, som fosforylerer RNA-polymerasen, slik at transkripsjon kan begynne. Det er mulig at en del gener er permanent bundet til deler av initieringskomplekset (bl. A TFIID), slik at de allerede er delvis aktiverte. IIE IIH IIH IID IID IIE IID IID IID IIB IIB IIF IIB Transkripsjonstart IIF RNA PolII Komplett initieringskompleks Transkripsjon P P P P

For ulike gener, kan inkorporeringen av de ulike transkripsjonsfaktorene utgjøre det hastighetsbegrensende trinnet i transkripsjonen. Sekve inkorporeringen kan imidlertid påskyndes av såkalte aktivatorer som gjenkjenner og binder til til enhancersekvenser foran genet. Disse kan ofte være lokalisert tusenvis av basepar fra TATA- boksen, og det var lenge et mysterium hvordan disse proteinene kunne fjernstyre transkripsjonen. Det viste seg etterhvert at en av subenhetene til TFIID, det såkalte TATA-bindende proteinet (TBP) hadde evnen til å introdusere en knekk i DNA molekylet, slik at proteiner bundet oppstrøms, kunne folde tilbake og komme i kontakt med transkripsjons-komplekset DNA TBP

Transkripsjonsaktivatorer stabiliserer transkripsjonsinitieringskomplekset Transkripsjonsaktivatorer IIH IIE IID IIF IIB RNAPolII Enhancersekvenser Tilsvarende finnes det også repressorsekvenser ( silencere ), som kan binde repressorproteiner som hindrer transkripsjon. I enkelte tilfeller kan repressorer og aktivatorer også konkurrere om den samme bindingssekvensen Silencer TBP induserer knekk i DNA-molekylet, slik at enhancersekvensene med bundete aktivatorer kan stabilisere binding av subenhetene i transkripsjonskomplekset IIH IIE IID IIF IIB RNAPolII Transkripsjon

Ulike klasser transkripsjonsfaktorer Eukaryote transkripsjonsfaktorer inneholder strukturelle motiv som binder spesifikke DNA-sekvenser. Typen bindingsmotiv danner også grunnlaget for klassifiseringen. Eksempler på disse er: Homeodomain-proteiner (Hox-gener): En gruppe proteiner med et konservert domene på ca 60 aa. Først ble oppdaget i bananfluen, og har overordnede transkripsjonskontroll-funksjoner. Mutasjoner i disse genene kan blant annet føre til endret plassering av hele kroppsdeler. Sinkfinger-proteiner: En stor gruppe transkripsjonsfaktorer som inneholder Zn bundet til flere Cysteiner. Mange av disse fungerer som nukleære reseptorer for lipidløselige hormoner (f. eks. Steroider, retinsyre, tyroidhormoner) Sinkfinger-proteinet Gal4 Homeodomain-proteinet Antennapedia

Leucin-zipper-proteiner: Fungerer som dimerer. Inneholder aminosyren leucin i hver 7. posisjon som holder de to subenhetene sammen og muliggjør DNA-binding Helix-loop-helix-proteiner: Også en stor gruppe transkripsjonsfaktorer som virker som dimerer. Inneholder en basisk N- terminal region som interagerer med DNA. Gcn4 Max

Ulike transkripsjonsfaktorer kan danne kompleks Flere klasser av transkripsjonsfaktorer kan danne heterodimerer. Dette øker variasjonen i både DNAbindingsspesifisitet og mulige effekter via kombinasjoner av aktiveringsdomener Slike heterodimerer kan i tillegg bestå av både en aktivator og en inhibitor

Betydning av DNA- pakking I tillegg til selve gensekvensen, vil transkripsjonen være avhengig av genets posisjon i genomet. I svært kondenserte regioner av DNAet, kalt heterokromatin, er transkripsjonsaktiviteten er mye lavere enn i andre deler av DNAet. Dette skyldes sannsyneligvis at transkripsjonsmaskineriet har lavere tilgjengelighet til de aktuelle genene. Mengden heterokromatin verierer med cellens proteinsynteseaktivitet. Det har også vist seg at mange gener bærer spesielle sekvenser i sin regulatordel, og som gjør at DNA-strukturen kan dekondensere lokalt. Slike regioner kalles locus control regions (LCR), og vil kunne øke transkripsjonen av genet dramatisk, uansett hvor i genet den settes inn. Eksakt hvordan dette skjer, er lite kjent Aktiv lymfocytt Inaktiv lymfoblast

H4 H3 H2A H2A H3 H2B H4 H2B Humant kromatin består av en repeterende enhet kalt nukleosomer, som består av 146 bp DNA tvinnet ca 2 ganger rundt en oktamer av histon H2A, H2B, H3 og H4. Et femte histon, H1, binder mellom disse, og er med på å opprettholde en ordnet struktur i kromatinet. I histonenes N-terminale regioner finnes mange lysiner, som kan acetyleres, og derved påvirke kromatinets struktur. H4 DNA helix H2B H3 H2A H2B H4 H2B H1 H4 H3 H2A H3 H2A H4 H3 H1 H1 H4 H3 H2A H2A H3 H2B H2B H4 Nukleosomerutgjøren betydelig barriere for binding av transkripsjonsregulerende proteiner til DNAet. Hvordan kan så transkripsjonsfaktorer binde til DNAet når dette er organisert i kromatin? H2B H2A Lysinrike N- terminale sekvenser

I noen tilfeller kan flere transkripsjonsaktivatorer som binder til ulike regulatorsekvenser inne i nukleosomene være nok til at nukleosomstrukturen løsner og tillater aktiv transkripsjon. Transkripsjonsaktivatorer I de senere år har en imidlertid funnet at det eksisterer molekylære maskiner som har evnen til å remodellere kromatin på mange ulike måter og derved regulere binding av transkripsjonsfaktorer. Slike modifikasjoner inkluderer blant annet acetylering, metylering, fosforylering og ubiquitinylering H4 H2B H2B H3 H2A H2A H4 H3 H1 Bindingsregioner for transkripsjonsfaktorer

Kromatin remodelleringsfaktorer Histoneacetyltransferaser /deacetylaser SWI/SNF eller RSC kompleks Aktivator deacetylering acetylering ADP + P i ATP TATA Inr En kjenner nå flere system i cellene som er med på å modulere kromatinstrukturen før transkripsjon. To av disse er konserverte proteinkompleks kalt hhv. SWI/SNF, og RSC. Begge er ATP-avhengige, og regulerer sannsyneligvis dekondensering av kromatin i større områder (Locus control regions?). Et tredje er et enzymsystem som regulerer histon acetylering/deacetylering. -25 +1

En har nå strukturkartlagt RSC/nukleosomkomplekset. RSC kan omslutte hele nukleosomet, og ved forbruk av enegi fra ATP-hydrolyse, kan det få hele nukleosomkomplekset til å gli langs DNA molekylet, eller ogsååforflyttesegtilet annet DNA-molekyl Chaban et al., Nature Structural & Molecular Biology 15, 2008 Det ser ut som om denne remodelleringen blant annet foregår ved at RSC kan danne loops i DNA strukturen

Histon acetyltransferaser (HATs) og histon deacetylaser (HDACs) H2B H2A H4 HAT H2B H2A H4 H4 H3 H3 HDAC H4 H3 H3 H2B H2A H2B H2A En tror at acetylering av N-terminale lysiner fører til en nøytralisering av Lys-ladningen, og bidrar derved til å svekke histon-dna bindingen. En har også påvist at HATs er koaktivatorer for transkripsjonen.

Activator (Gcn4) Ada 2 HAT (Gcn5) acetylation TATA Inr -25 +1 En har påvist direkte kobling mellom HAT (Gcn5), og en transkripsjonsaktivator (Gcn4) via et adaptorprotein (Ada2) kan skru på transkripsjon. Omvendt har en sett at repressorproteiner (eks. MeCP2 I nerveceller) kan rekruttere HDAC og skru av transkripsjon). Mutasjoner I MeCP2 er årsak til Retts syndrom

Tre mulige RNA-aktiveringstilstander Inaktivt gen. Må via kromatin remodellering for å kunne aktiveres Delvis aktivert gen. Kan lett induseres, men binding av aktivatorer kan muligens kreve kromatin remodellering TATA -25 TFIID TBP TATA -25 Av Inr +1 Av Inr +1 Aktivt gen. Både TFIID og aktivatorer bundet, og kan lett rekruttere RNA polymerase II holoenzym uten ytterligere kromatin remodellering direkte Aktivator RNA pol II rekruttering TBP TAF II 250 TATA 150-25 indirekte Inr På +1

DNA inaktivering I eukaryoter kan bestemte kondenserte, inaktiverte deler av DNAet arves fra celle til celle. Det mest kjente eksemplet på dette er inaktivering av X-kromosomer. Da en dobbel dose proteiner som kodes av X, sannsyneligvis er dødelig for cellene, inaktiveres det ene X-kromosomet en tid etter befruktningen (i de tilfeller avkommet er hunkjønn), og kan sees i mikroskop som et såkalt Barr body. Hvilket av de to kromosomene som kondenserer og inaktiveres, er tilfeldig valgt, og voksne individer vil derfor være en mosaikk av aktive X-kromosomer fra far og mor. Dette sees også tydelig ved X-bundne, dominant nedarvede sykdommer, som ofte har en mye mildere fenotype hos kvinner enn hos menn

Inaktiveringen av et X-kromosom starter med at det transkriberes et ikke-kodende RNA-molekyl fra genet Xist som sitter på X- kromosomet. Dette RNAet dekker det inaktive X-kromosomet, og hindrer transkripsjon av X-bundede gener. I tillegg rekrutterer Xist-RNAet proteiner som undertrykker transkripsjon, metylerer C i DNAet, samt en metylase som metylerer histon H3 og fører til kromatinkondensering. Det inaktive X-kromosomet omsettes derfor effektivt til inaktivt heterokromatin (Barr body) Inaktiverte X-kromosomer (hvite) i humane diploide fibroblaster med henholdsvis XY, XX og XXX karyotype

Genomisk imprinting For de fleste av våre autosomale gener er ekspresjonen av et allel uavhengig om det er arvet fra far eller mor. For enkelte gener er imidlertid ikke dette tilfelle, og det er enten allelet fra far eller fra mor som uttrykkes (kjenner i dag ca 30 slike gener). Dette kalles genomisk imprinting, og det må bety at det er bestemte egenskaper ved genene som signaliserer deres opphav. Det må også være en mekanisme for å fjerne disse signalene, f. eks. hvis en mann overfører et gen som han opprinnelig arvet fra sin mor. En kjenner fremdeles lite til detaljene om hvordan slik imprinting foregår, men en vet at metyleringsmønsteret i DNAet er av betydning (metylering av 5-posisjon i C) Slik metylering er spesielt hyppig i CpG-holdige sekvenser som finnes i promoterregionene til mange gener

Regulering av mrna spleising mrna spleising kan reguleres aktivt av cellene, slik at ulike transkript (og derved proteiner) kan dannes fra ett og samme gen etter behov. Dette reguleres ved binding av aktivator- og repressormolekyler på pre-mrna

Eksempel på betydning av alternativ mrnaspleising (eks: Uracil-DNA glykosylase) P A P B IA IB II III IV V VI Katalytisk domene Unike N-terminale sekvenser UNG1 UNG2 til mitokondrier Til kjerner

Regulering av mrna lokalisering Spesifikke mrna lokaliseres til spesifikke steder i cellen, noe som er av fundamental betydning for multicellulære organismer. Ulike transportmekanismer benyttes, og ved bestemmelsesstedet holdes mrnamolekylene på plass ved ankerproteiner Slik regulert lokalisering er f. eks en viktig reguleringsmekanisme i den tidlige embryoutviklingen

Annen regulering på RNA-nivå RNA editering Regulering av RNA-transporten ut av kjernen mrna-levetid Levetiden til ulike mrna kan variere fra noen få minutter til flere dager. RNA interferens

RNA-interferens og mirna Nobelprisen i medisin i 2006 gikk til Andrew Fire (Stanford) og Craig Mellon (Univ. of Massachusetts) for sin banebrytende oppdagelse av RNA interferens. De fant i 1993 at korte, dobbelttrådete RNA molekyler sprøytet inn i celler (kalte disse small inhibitory RNA, sirna) kunne redusere eller skru av uttrykket av gener. Senere er det funnet at tilsvarende RNA lages i cellene selv (kalles micro RNA, mirna). Hele 3% av våre gener koder for mirna! Disse er viktige både for organismens utvikling, og de fysiologiske funksjonene til både celler og vev.

Mekanisme DROSHA kutter ved foten av dsrna hairpins laget i kjernen, og transporterer disse til cytoplasma. Her er DICER, som kutter dette videre til korte sirna/dsdna fragment. En del av DICER blir sittende på fragmentene, og flere proteiner rekrutteres og danner et RISCkompleks, som fjerner den ene RNAtråden RISC-miRNA komplekset rekrutterer inn Argonaut-proteiner, og sammen vil komplekset gjenkjenne komplementære mrna, og kutte disse ved aktivering av SLICER-aktiviteten i et av Argonautproteinene. DROSHA Argonaut Cleavage by SLICER activity Det er beregnet at 10-30% av alle gener reguleres ved mirna

Regulering av translasjon Best kartlagt i bakterier, hvor en kjenner flere translasjonsrepressorer. Nukleotidesekvensen i mrnaleader region påvirker blant annet bindingen til ribosomer Eks: Okt 2003 (EMBO J): Proinsulinproduksjon under streng translasjonskontroll i embryo. Her er lave nivå av insulin nødvendig for blant annet apoptose, men for høyt nivå er svært skadelig NB. Translasjonseffektiviteten kan også reguleres av mirna In-vitro translasjon av de to mrnaene gir svært forskjellig translasjon av proinsulin

Andre viktige faktorer som påvirker genuttrykk Post-translasjonell prosessering av proteiner Spesifikk kutting av aminosyrekjeden, fosforylering, glykosylering, nitrosering, acetylering, ribosylering etc., kan være helt avgjørende for å bestemme proteinets aktivitet, transport, eller interaksjon med andre proteiner Proteinnedbrytning Stabiliteten av ulike proteiner varierer kraftig, og mange blir raskt nedbrutt av spesifikke proteaser i cellene. Dette blir også ofte regulert ved post-translasjonelle modifikasjoner

Regulering av proteinnedbrytning Stress p53 Kinase HDM2, Ubiquitin U U U U U U UU U U 6-20 min P U U U U P P P P P Ca 20 t Proteasom Stressindusert N-terminal fosforylering av p53 og HDM2 hemmer p53/hdm2-interaksjon og ubiquitinering av p53. Derved øker levetiden til p53 dramatisk

Hvordan kan kjennskap til genekspresjon påvirke morgendagens legemidler? Ved å kunne påvirke uttrykket av ulike gener vil en teoretisk kunne bli i stand til å kontrollere en rekke sykdommer. RNAi har stort potensiale for å nedregulere ekspresjon, men kan også brukes til å hemme syntesen av repressorer, for å øke ekspresjon. En annen mulighet er syntetiske molekyler som påvirker selve transkripsjonsapparatet. Slike agens kunne også gjøres så spesifikke at de selektivt påvirket transkripsjonsfaktorer som kodes for infeksiøse agens (eks HIV), uten å påvirke de humane transkripsjonsfaktorene. Det foregår i dag intens forskning på dette området, f. eks. I forbindelse med hyperkolesterolemi (oppregulere produksjon av LDL-reseptor i leverceller)

Storskala studier av genekspresjon For å kunne studere hvordan flere tusen gener i bestemte celler uttrykkes samtidig, har en utviklet metoder for både mrna og proteinkvantifisering Eks: mrna: Healthy cells Sick cells

Eks: Protein Alle proteinene fra en celletype kan isoleres og separeres ved 2Dgelelektroforese. Etter farging av gelen, kan endring i mengde mellom friske/syke celler kvantifiseres. Ukjente proteiner kan også identifiseres ved hjelp av massespektrometriske metoder 2D-gel av totalcelleekstrakt farget med Coomassie brilliantblå. Til venstre ses normale kolonceller, mens til høyre ses tumorceller. Gelbildene er digitalisert og analysert med PDQuest software. Ulikt uttrykte proteiner er markert med gult. I de forstørrede områdene kan en se at karbonsyre anhydrase (CAII) og glutation-stransferase (GST)-nivået er høyt i friske celler, mens flere isoformer av CAII er sterkt redusert i tumorcellene.