Regulering av DNA Transkripsjon i Eukaryote Organismer ID, Kull 99, Vår 2001 Frank Skorpen IKM, DMF 1
Regulering av gen-uttrykk på mange nivåer Klargjøring av DNA Transkripsjon Initiering Stopp hnrna prosessering mrna Transport Translasjon Stabilitet Protein Kjemisk modifisering Prosessering Lokalisering Stabilitet 2
Gen-uttrykk reguleres primært ved regulering av transkripsjons-initiering Klargjøring av DNA Transkripsjon Initiering Stopp hnrna prosessering mrna Transport Translasjon Stabilitet Protein Kjemisk modifisering Prosessering Lokalisering Stabilitet 3
Nukleære RNA polymeraser RNA pol I transkriberer rrna gener RNA pol II transkriberer protein-kodende gener (klasse II gener) RNA pol III transkriberer trna gener 4
Geners regulatoriske områder 5 TRANSKRIPSJONSENHET Exon Intron 3 konsensus: TATAAT Start TATA Inr Distal -200 Proximal -50-25 1 ENHANCER ELEMENTER CORE PROMOTER 5
Mulige transkripsjonsfaktor-bindende elementer kan identifiseres ut i fra DNA sekvens 301 tcaaagctcactacagctcagaccctctggcctcaagcgatcctccagcctgggcctcccaaagcgctaggattacaggcgtgggccaccgcgcctgacc AP2 C-MYB 401 agtcttctcttcttgcagctgagccttaagagcctgtccaaagagcagaggtgggctgaaggcacaaagcgaatgaaagaataggcccccgggcaccgtt AP2 AP2 C-MYC SP1 SP1/AP2 501 gcacgccccacctcctcccaggggcgttgcactccagcccctcccgcacatgcgcactgggccttccaccgccccccgcccccagcaaagccccccgctc E2F CCAAT Start of exon 1A 601 ggagcatgcgcgggccgcttggcgccaattgctgaccgccacagccacagccagggctagcctcgccggttcccgggtggcgcgcgttcgctgcctcctc Start codon 1A PEA3 701 AGCTCCAGGATGATCGGCCAGAAGACGCTCTACTCCTTTTTCTCCCCCAGCCCCGCCAGGAAGCGACACGCCCCCAGCCCCGAGCCGGCCGTCCAGGGGA 6
Forskjellige sett av aktivatorer aktiverer forskjellige gener A B C Gen 1 A D E Gen 2 7
Forskjellige typer celler uttrykker forskjellige gener fordi de inneholder forskjellige sett av transkripsjons-aktivatorer Celletype I Celletype II A C B D E B E C A A A D 8
Transkripsjons-aktivatorer rekrutterer transkripsjonsmaskineriet til promoteren Aktiveringsdomene Transkripsjonsmaskineri TATA Inr DNA-bindingsdomene -25 CORE PROMOTER 1 9
Mange aktivatorer binder som homoeller heterodimérer Dimériseringsdomene TATA Inr Distal -200 Proximal -50-25 1 ENHANCER ELEMENTER CORE PROMOTER 10
Transkripsjons-aktivatorer: familier Helix-turn-helix Leucine zipper Helix-loop-helix Zinc finger andre 11
Helix-turn-helix COOH 1 3 2 Leucine zipper proteiner fungerer som dimérer av to subenheter, hver delt i to helix-regioner. Leucine (L) residier i C- terminalen danner en hydrofob overflate for interaksjon mellom de to protein subenhetene. Positive aminosyrer N-terminalt for leucinene danner kontaktflaten med DNA. HOOC COOH NH 2 L L L L L L Helix-turn-helix motivet finnes i en rekke prokaryote regulatoriske proteiner og i homeodomain proteiner i eukaryoter. Helix 3 er recognition helix som kontakter major groove i DNA helixen. Helix 1 and 2 ligger over helix 3 og kan kontakte andre proteiner. L L NH 2 NH 2 Leucine zipper
Helix-loop-helix HOOC COOH Helix Loop Diagram av en zinc finger bestående av to cysteine (C) og to histidine (H) residier koordinert rundt et sink atom. Andre høyt konserverte aminosyrer i denne klassen av zinc fingre er også vist. Zinc fingre kan også bruke fire cysteiner til å koordinere zinc atomet, slik som i steroid hormon receptorer. Helix P L NH 2 NH 2 Helix-loop-helix proteiner har to helixer bundet sammen med en loop av ukjent struktur. Disse helixene danner overflaten for dannelsen av dimérer. En tredje helix rik på positive aminosyrer er ansvarlig for DNA-binding. NH 2 Y C H Zn C H C 2 H 2 zinc finger COOH
14
Transkripsjons-aktivatorer kan slås på og av PROTEIN- SYNTESE LIGAND- BINDING FOSFORYLERING BINDING TIL ANNEN SUBENHET AKTIV INAKTIV P DNA-bindende subenhet Aktiverende subenhet 15
Signal-aktivering av gener Steroid hormon reseptor Steroid hormon TRANSKRIPSJON P P Signalkaskade Insulin Insulin reseptor 16
Aktivatorer rekrutterer RNA pol II og et sett av 5 generelle transkripsjonsfaktorer IID IIH IIF IIE RNA pol II IIB Aktivator TATA Inr -50 1 17
TBP binder til TATA-element og danner en plattform for binding av de andre faktorene TAF II s Activator -50 TBP TATA Inr 1 18
Rekruttering skjer vanligvis i to trinn: først TFIID, deretter resten av komplekset IIE IIH IIF IIB RNA pol II Aktivator -50 IID TATA Inr 1 19
Generelle transkripsjonsfaktorer og RNA pol II responderer ikke til aktivatorer in vitro IID IIH IIF IIE RNA pol II IIB Aktivator TATA Inr -50 1 20
Aktivatorer virker vanligvis gjennom ikke-dna-bundne ko-aktivatorer The Core Srb/Mediator Complex Srb2, -4, -5, -6, and -7; (pos) Med1, -2, -4, -6, -7, and -8; (pos) Gal11, Sin4, Rgr1, Rox3, and Pgd1 (neg) TBP IIH IIF IIE RNA pol II Srb4 IIB Srb10 CDK (neg) Srb9 Srb11 Activator TATA Inr -50 1 21
H4 H3 H2A H2A H3 H2B H2B H4 In vivo foreligger DNA i form av kromatin. Kromatin virker hemmende på DNA transkripsjon. H2B H2A H4 H4 H3 H3 H2B H2A H1 H1 H4 H3 H2A H3 H2B H4 H1 H2A H2B Nukleosom: 180-200 bp DNA tvunnet rundt en oktamer av histoner H4 H2B H3 H2A H3 H4 H2B H2A DNA helix
Histon acetyltransferaser (HATs) og histon deacetylaser (HDACs) CH 3 C=O H2B H2A H4 S Coenzyme A HAT SH Coenzyme A H2B H2A H4 H4 H3 H3 H4 H3 H3 H2B H2A CH 3 C=O OH HDAC H 2 0 H2B H2A
HAT enzymer kan dirigeres til promotere ved å binde til aktivatorer p300/cbp, CBP: CREB-binding protein p300/cbp p300/cbp P/CAF P/CAF: p300/cbp-associating Factor E2F-1 CREB c-jun Fos p53 Nukleosom
TAF II 250 har intern HAT aktivitet TFIID TAF II 250 HAT aktivitet Aktivator TATA 25
Mange repressorer fungerer ved å rekruttere HDAC aktiviteter Rb E2F/DP HDAC1 Deacetylering og represjon HDAC1 SIN3 Mad Max HDAC2 YY1 26
SWI/SNF bruker ATP til å remodellere nukleosomstrukturer Swi - Snf Complex Swi2 ATP Aktivator ADP P i TATA 1 Inr 27
SWI/SNF kan rekrutteres som del av RNA pol II holoenzym Swi - Snf Complex RNA pol II holoenzym ATP Swi2 ADP P i Aktivator TATA 1 Inr 28
Rekruttering ved synergi IIH IIF IIB IIE RNA pol II Swi - Snf ATP ADP P i HATs Srb/Mediator TBP TAF II 250 Aktivator 1 DNA-bøyende ko-aktivator TATA Inr
Modell av pre-initieringskompleks Aktivatorer Generelle (basale) transkripsjonsfaktorer Ko-aktivatorer/ TBP-assosierte faktorer RNA pol II 30
Produksjon av mrna 5 Intron Exon 3 Kopiering til pre-mrna 5 3 Fjerning av introns, påsetting av m 7 G(5 )pp cap, 3 -ende-kløyving og polyadenylering 5 -m 7 Gpp mrna AAAAAAA-3
RNA pol II holoensym er involvert i både RNA-kjede forlengelse, RNA prosessering, og terminering av transkripsjon pre mrna CTD (YSPTSPS) n Elongeringsfaktorer Spleisefaktorer AAUAAA Fjerning av intron elongating RNA pol II (Pol IIo) Kløyvings- / polyadenyleringsfaktorer
Oppsummering: Transkripsjonsaktiviteten av et gen bestemmes av hvor effektivt RNA pol II holoenzym rekrutteres til promoteren Dette bestemmes av den synergistiske effekten av de til enhver tid bundne aktivatorer Gener reguleres forskjellig fordi de binder forskjellige sett av aktivatorer Aktivatorer virker vanligvis gjennom ikke-dna-bundne ko-aktivatorer 33
In vivo foreligger DNA i form av kromatin. Kromatin hemmer transkripsjons-initiering Assosiert med RNA pol II finnes enzymaktiviteter som re-modellerer kromatin, slik som SWI/SNF og HATs/HDACs SWI/SNF og HATs/HDACs kan også rekrutteres via interaksjon med sekvens-spesifikke aktivatorer Forskjellige promotere har forskjellige krav til sammensetningen av RNA pol II holoenzym 34