1, stadium IC, 2012, Tonje S. Steigedal 2 Grunnlaget for regulering av cellens funksjoner ligger lagret i arvematerialet - i DNA- molekylet. For at genene skal utøve sin funksjon, må de imidlertid uttrykkes i form av et genprodukt. I de fleste tilfeller er endeproduktet et protein, men det kan også være RNA. Mengden av ett bestemt protein vil variere fra celletype til celletype, og i forskjellige stadier i cellens livssyklus. Reguleringen av mengden av et protein skjer på flere nivåer, og vil i hovedsak være differansen mellom det som syntetiseres og det som degraderes (unntatt proteiner som eksporteres fra cellen). Det er viktig for cellen at det til enhver tid er balanse mellom disse to prosessene. 1
3 1. Transkripsjon 2. Posttranskripsjonell prosessering 3. mrna degradering 4. Translasjon 5. Posttranslasjonell prosessering 6. Protein degradering 7. Protein plassering og transport 4 Bare et fåtall av genene uttrykkes i hver celle Det finnes ca 25 000 gener i det humane genomet. Bare en del av disse uttrykkes i hver celle (cellespesifikt uttrykk). Noen gener uttrykkes bare i fosterutviklingen (utviklingsgener). Andre gener uttrykkes i alle celler (husholdsgener), og danner proteiner som trengs for energiproduksjon osv. Proteinkodende gener transkriberes av RNA polymerase II, som trenger en rekke såkalte transkripsjonsfaktorer (TF) for å transkribere DNA. I tillegg til de proteinkodende genene finnes også gener som har ulike typer RNA som sluttprodukt. Disse transkriberes av RNA polymerase I og III. 2
5 Organismetype Organisme Genomstørrelse (basepar) Proteinkodende gener Antall proteiner Bakterie E.coli 4.6 Mb ~4.500 ~4.500 Gjær Saccharomyces cerevisiae 12.1 Mb ~6.000 ~6.500 Plante Arabidopsis thaliana 157 Mb ~27.000 ~42.000 Pattedyr Homo sapiens 3.2 Gb ~25.000 ~110.000 E.coli Fisk Protopterus aethiopicus 130 Gb?? Liten sammenheng mellom genomstørrelse kompleksitet Pattedyr: Mange gener som ikke koder for proteiner!! Pattedyr: Mange gener kan gi opphav til mange ulike proteiner (genspleising) Saccharomyces cerevisiae Arabidopsis thaliana Homo sapiens Protopterus aethiopicus 6 Genregulering; essensielt for differensiering Mange proteiner dannes i store mengder i spesialiserte celler, mens de ikke fins i andre celler. Eks.: hemoglobin i røde blodlegemer, eller immunglobuliner i B-celler. En typisk human celle syntetiserer 10 000-20 000 proteiner. Av disse utgjør ca 2 000 de vanlige proteinene (>50 000 kopier av hvert i hver celle), og mengden av disse er svært lik fra celle til celle. Ulikheter i et relativt lite antall proteiner kan gi cellene helt ulikt utseende og funksjon. En rekke sykdommer, som f. eks. ulike krefttyper og fødselsdefekter har vist seg å ha feil i det cellulære maskineriet som regulerer genekspresjon. Dette har derfor blitt et svært hot felt innen medisinsk forskning. 3
7 Utfordringer for transkripsjon: Skille gen fra ikke-gen. Identifisere riktig gen (blant >25.000). Slå på og av gener etter behov. Finregulere uttrykk av et gitt gen. Sørge for uttrykk av det riktige sett av gener i ulike celler/celletyper. Og dette i et virvar av over 2m DNA pakket tett sammen i cellekjernen!! 8 Hva bestemmer hvilke proteiner som skal lages i en celle? Mengden av svært mange proteiner i cellen reguleres via signaler utenfra, f. eks. hormoner og vekstfaktorer. Disse binder til reseptorer i cellemembranen, som igjen aktiverer signalaskader inne i cellen, som til slutt aktiverer transkripsjonsfaktorer (aktivatorer eller repressorer) inne i kjernen. DNA Transkripsjonsfaktor Eks: c-jun, ATF-2 Transkripsjon Signalkaskade (protein kinaser. F.eks: Ras/Raf/MAP/ERK) Protein Hormon/ vekstfaktor Reseptor, F.eks: EGF-reseptor PDGF-reseptor Insulinreseptor β-adrenerge reseptorer 4
9 mirna Cellekjerne n DNA Transkripsjon Kjerneproteiner Genuttrykket kan reguleres på alle nivåene, men transkripsjonsreguleringen ser ut til å være viktigst for de fleste genprodukter mrna prosessering rrna Modent mrna mrna trna Primærtranskript snrna DNA Andre mitok. proteiner Mitokondrier rrna mrna trna Ribosomer Primært polypeptid Modent protein Sekretert protein Ribosomale mitokondrieproteiner Til andre organeller og cytosol 10 Ikke alle gener koder for protein mrna trna rrna snrna mirna : messenger RNA; koder for aminosyrene i et polypeptid : transfer RNA; bringer aminosyrene til ribosomer under translasjon : ribosomal RNA; del av ribosom (som oversetter mrna til polypeptid) : small nuclear RNA; danner komplekser med proteiner (eks. i spleiseproteiner ) : micro RNA regulerer transkripsjon og translasjon 5
11 Eukaryotisk gen med kjernepromotor og proksimal kontrollregion Genregulerende protein bindes til regulatoriske sekvenser. Proximale sekvenser/kontroll elementer nær promotor. Distale sekvenser/kontroll elementer flere tusen basepar unna promotor. Antall, eksakt lokalisasjon og kombinasjon av sekvenser varierer fra gen til gen. 12 Transkripsjonsprosessen utført av RNA polymerase II starter oftest ved at transkripsjonsfaktor TFIID gjenkjenner en kort nukleotidesekvens TATA. Når TFIID er bundet, kan andre transkripsjons-faktorer, sammen med RNA polymerasen, binde. Til slutt binder TFIIH, som fosforylerer RNA-polymerasen, slik at transkripsjon kan begynne. Det er mulig at en del gener er permanent bundet til deler av initieringskomplekset (bl. a TFIID), slik at de allerede er delvis aktiverte. IIE IIH -25 TATA IID IID IIB IID IIB IIH IIE IIF IID IIB IID P P P P +1 Transkripsjonstart IIF RNA PolII Komplett initieringskompleks Transkripsjon 6
13 Inkorporeringen av de ulike transkripsjonsfaktorene kan utgjøre det hastighetsbegrensende trinnet i transkripsjonen. Men den kan påskyndes av såkalte aktivatorer som gjenkjenner og binder til enhancersekvenser foran genet. Disse kan ofte være lokalisert tusenvis av basepar fra TATA- boksen, og det var lenge et mysterium hvordan disse proteinene kunne fjernstyre transkripsjonen. DNA TBP Det viste seg etterhvert at en av subenhetene til TFIID, det såkalte TATA-bindende proteinet (TBP) hadde evnen til å introdusere en knekk i DNA molekylet, slik at proteiner bundet oppstrøms, kunne folde tilbake og komme i kontakt med transkripsjons-komplekset. 14 Transkripsjonsaktivatorer stabiliserer transkripsjonsinitieringskomplekset Transkripsjonsaktivatorer IIH IIE IIF IID IIB RNAPolII Enhancersekvenser Tilsvarende finnes det også repressorsekvenser ( silencere ), som kan binde repressorproteiner som hindrer transkripsjon. I enkelte tilfeller kan repressorer og aktivatorer også konkurrere om den samme bindingssekvensen. Silencer TBP induserer knekk i DNA-molekylet, slik at enhancersekvensene med bundete aktivatorer kan stabilisere binding av subenhetene i transkripsjonskomplekset. IIH IIE IIF IID IIB RNAPolII Transkripsjon 7
15 Eksempel på klasser av transkripsjonsfaktorer Eukaryote transkripsjonsfaktorer inneholder strukturelle motiv som binder spesifikke DNAsekvenser. Affiniteten til riktig bindingssete er ofte 10 4-10 6 ganger høyere enn tilfeldig sekvens. Typen bindingsmotiv danner grunnlaget for klassifiseringen. "glidelås " Merk: de fleste aktive transkripsjonsfaktorer binder som dimerer. De kan være satt sammen av to identiske (homo-) eller to ulike (hetero-) subenheter. 16 Eksempel på klasser av transkripsjonsfaktorer Eksempel (Helix-turn-helix); Homebox containing (Hox gen): En gruppe proteiner med et konservert domene på ca 60 aminosyrer. Ble først oppdaget i bananfluen, og har overordnede transkripsjonskontrollfunksjoner. Ofte knyttet til regulering av organutvikling. Mutasjoner i disse genene kan blant annet føre til endret plassering av hele kroppsdeler. Homebox-proteinet Antennapedia 8
17 Ulike transkripsjonsfaktorer kan danne kompleks Flere klasser av transkripsjonsfaktorer kan danne heterodimerer. Dette øker variasjonen i både DNA-bindingsspesifisitet og mulige effekter via kombinasjoner av aktiveringsdomener. Slike heterodimerer kan i tillegg bestå av både en aktivator og en inhibitor. 18 Betydning av DNA- pakking I tillegg til selve gensekvensen, vil transkripsjonen være avhengig av genets posisjon i genomet. I svært kondenserte regioner av DNAet (heterokromatin), er transkripsjonsaktiviteten mye lavere enn i andre deler av DNAet. Dette skyldes sannsynligvis at transkripsjonsmaskineriet har lavere tilgjengelighet til de aktuelle genene. Mengden heterokromatin varierer med cellens proteinsynteseaktivitet. Mange gener bærer spesielle sekvenser i sin regulatordel, og gjør at DNA-strukturen kan dekondensere lokalt. Slike regioner kalles locus control regions (LCR), og vil kunne øke transkripsjonen av genet dramatisk, uansett hvor i genet den settes inn. Eksakt hvordan dette skjer, er lite kjent. 9
H1 03.12.12 19 Kromatin remodelleringsfaktorer Histonacetyltransferaser /deacetylaser Aktivator SWI/SNF (SWItch/Sucrose NonFermentable) eller RSC (Chromatin structure remodeling) kompleks deacetylering acetylering ADP + Pi ATP TATA Inr En kjenner nå flere system i cellene som er med på å modulere kromatinstrukturen før transkripsjon. To av disse er konserverte proteinkompleks kalt hhv. SWI/SNF, og RSC. Begge er ATP-avhengige, og regulerer sannsynligvis dekondensering av kromatin i større områder (Locus control regions?). Et tredje er et enzymsystem som regulerer histon acetylering/deacetylering. -25 +1 20 Humant kromatin består av en repeterende enhet kalt nukleosomer, som består av 146 bp DNA tvinnet ca 2 ganger rundt en oktamer av histon,, og. Et femte histon, H1, binder mellom disse, og er med på å opprettholde en ordnet struktur i kromatinet. I histonenes N-terminale regioner finnes mange lysiner, som kan acetyleres, og derved påvirke kromatinets struktur. Nukleosomer utgjør en betydelig barriere for binding av transkripsjonsregulerende proteiner til DNAet. Hvordan kan så transkripsjonsfaktorer binde til DNAet når dette er organisert i kromatin? DNA helix H1 H1 Lysinrike N-terminale sekvenser (positivt ladet) 10
21 I noen tilfeller kan flere transkripsjonsaktivatorer som binder til ulike regulatorsekvenser inne i nukleosomene være nok til at nukleosomstrukturen løsner og tillater aktiv transkripsjon. I de senere år har en imidlertid funnet at det eksisterer molekylære maskiner som har evnen til å remodellere kromatin på mange ulike måter og derved regulere binding av transkripsjonsfaktorer. Slike modifikasjoner inkluderer blant annet acetylering, metylering, fosforylering og ubiquitinylering. Bindingsregioner for transkripsjonsfaktorer Transkripsjonsaktivatorer H1 22 Histon acetyltransferaser (HAT) og histon deacetylaser (HDAC) regulerer histonenes netto ladning, og derigjennom deres interaksjon med DNA + + + + + Lysin + ++ + + + + + DNA i inaktiv form + CH 3 C=O S Coenzyme A CH 3 C=O OH HAT SH Coenzyme A HDAC H 20 + + + DNA i aktiv form Acetylering av N-terminale lysiner fører til en nøytralisering av Lys-ladningen, og svekket histon- DNA binding. Det er også påvist at HATs er koaktivatorer for transkripsjonen. + 11
23 Ada 2 Activator (Gcn4) HAT (Gcn5) acetylering TATA Inr -25 +1 En har påvist direkte kobling mellom HAT (Gcn5), og en transkripsjonsaktivator (Gcn4) via et adaptorprotein (Ada2) kan skru på transkripsjon. Videre kan repressorproteiner (eks. MeCP2 i nerveceller) rekruttere HDAC og skru av transkripsjon). Mutasjoner i MeCP2 er årsak til Retts syndrom (Nerveutviklingsuregelmessighet, opptrer nesten bare hos jenter/kvinner; skoliose, veksthemming, lammelser, skjelving og autisme. 24 Tre mulige RNA-aktiveringstilstander Inaktivt gen. Må via kromatin remodellering for å kunne aktiveres. TATA -25 Av Inr +1 Delvis aktivert gen. Kan lett induseres, men binding av aktivatorer kan muligens kreve kromatin remodellering. TFIID TBP TATA -25 Av Inr +1 Aktivt gen. Både TFIID og aktivatorer bundet, og kan lett rekruttere RNA polymerase II holoenzym uten ytterligere kromatin remodellering. direkte Aktivator RNA pol II rekruttering indirekte På TBP TAFII250 TATA 150 Inr -25 +1 12
25 DNA inaktivering I eukaryoter kan bestemte kondenserte, inaktiverte deler av DNAet arves fra celle til celle. Det mest kjente eksemplet på dette er inaktivering av X-kromosomer. Da en dobbel dose proteiner som kodes av X, sannsynligvis er dødelig for cellene, inaktiveres det ene X-kromosomet en tid etter befruktningen (i de tilfeller avkommet er hunkjønn), og kan sees i mikroskop som et såkalt Barr body. Hvilket av de to kromosomene som kondenserer og inaktiveres, er tilfeldig valgt, og voksne individer vil derfor være en mosaikk av aktive X-kromosomer fra far og mor. Dette sees også tydelig ved X-bundne, dominant nedarvede sykdommer, som ofte har en mye mildere fenotype hos kvinner enn hos menn. 26 Inaktiveringen av et X-kromosom starter med at det transkriberes et ikke-kodende RNA-molekyl fra genet Xist som sitter på X-kromosomet. Dette RNAet dekker det inaktive X-kromosomet, og hindrer transkripsjon av X- bundede gener. I tillegg rekrutterer Xist-RNAet proteiner som undertrykker transkripsjon, metylerer C i DNAet, samt en metylase som metylerer histon og fører til kromatinkondensering. Det inaktive X-kromosomet omsettes derfor effektivt til inaktivt heterokromatin (Barr body). Inaktiverte X-kromosomer (hvite) i humane diploide fibroblaster med henholdsvis XY, XX og XXX karyotype 13
27 Genomisk imprinting For de fleste av våre autosomale gener er ekspresjonen av et allel uavhengig om det er arvet fra far eller mor. For enkelte gener (ca 30 kjente) er det enten allelet fra far eller fra mor som uttrykkes. Dette kalles genomisk imprinting, og det må bety at det er bestemte egenskaper ved genene som signaliserer deres opphav. Det må også være en mekanisme for å fjerne disse signalene, f. eks. hvis en mann overfører et gen som han opprinnelig arvet fra sin mor. En kjenner fremdeles lite til detaljene om hvordan slik imprinting foregår, men metyleringsmønsteret i DNAet er sentralt (metylering av 5-posisjon i C, 5-meC CpG" er kortform av " C phosphate G ", ) Slik metylering er spesielt hyppig i CpG-holdige sekvenser som finnes i promoterregionene til mange gener. 28 Regulering av mrna spleising mrna spleising kan reguleres aktivt av cellene, slik at ulike transkript (og derved proteiner) kan dannes fra ett og samme gen etter behov. Dette reguleres ved binding av aktivator- og repressormolekyler på pre-mrna. Eksempel: CREM (camp response element modulator); Transkripsjonsfaktor med 44 ulike (kjente) spleisevarianter 14
29 Eksempel på betydning av alternativ mrna-spleising (eks: Uracil-DNA glykosylase) P A P B IA IB II III IV V VI Katalytisk domene Unike N- terminale signalsekvenser UNG1 UNG2 Til mitokondrier Til kjerner 30 Regulering av mrna lokalisering Spesifikke mrna lokaliseres til spesifikke steder i cellen, noe som er av fundamental betydning for multicellulære organismer. Ulike transportmekanismer benyttes, og ved bestemmelsesstedet holdes mrna-molekylene på plass ved ankerproteiner. Slik regulert lokalisering er f. eks en viktig reguleringsmekanisme i den tidlige embryoutviklingen. 15
31 Annen regulering på RNA-nivå RNA editering (5 cap av metylguanosin, PolyA hale, spleising) Regulering av RNA-transporten ut av kjernen mrna-levetid Levetiden til ulike mrna kan variere fra noen få minutter til flere dager. RNA interferens RNA sekundærstruktur; danner ofte hårnålsstruktur 32 RNA-interferens og mirna Nobelprisen i medisin i 2006 gikk til Andrew Fire (Stanford) og Craig Mellon (Univ. of Massachusetts) for sin banebrytende oppdagelse av RNA interferens. De fant i 1993 at korte, dobbelttrådete RNA molekyler sprøytet inn i celler (kalte disse small inhibitory RNA, sirna) kunne redusere eller skru av uttrykket av gener. Senere er det funnet at tilsvarende RNA lages i cellene selv (kalles micro RNA, mirna). Hele 3% av våre gener koder for mirna! Disse er viktige både for organismens utvikling, og de fysiologiske funksjonene til både celler og vev. 16
33 Mekanisme; mirna DROSHA kutter ved foten av dsrna hairpins laget i kjernen, og transporterer disse til cytoplasma. Her er DICER, som kutter dette videre til korte sirna fragment. En del av DICER blir sittende på fragmentene, og flere proteiner rekrutteres og danner RISC (RNA induced silencing complex), som fjerner den ene RNA-tråden. RISC-miRNA komplekset rekrutterer inn Argonaut-proteiner, og sammen vil komplekset gjenkjenne komplementære mrna, og kutte disse ved aktivering av SLICER-aktiviteten i et av Argonautproteinene. Det er beregnet at 10-30% av alle gener reguleres ved mirna. 34 Regulering av translasjon Nukleotidesekvensen i mrna-leader region påvirker blant annet bindingen til ribosomer. Eukaryotiske translasjonsinitieringsfaktorer gjenkjenner 5 cap på mrna rekruttering av translasjonskompleks. Translasjonsregulatorer avhenger også av PolyA-hale på mrna. Translasjonseffektiviteten kan også reguleres av mirna. 17
35 Andre viktige faktorer som påvirker genuttrykk Post-translasjonell prosessering av proteiner Spesifikk kutting av aminosyrekjeden, fosforylering, glykosylering, nitrosering, acetylering, ribosylering etc., kan være helt avgjørende for å bestemme proteinets aktivitet, transport, eller interaksjon med andre proteiner. Proteinnedbrytning Stabiliteten av ulike proteiner varierer kraftig, og mange blir raskt nedbrutt av spesifikke proteaser i cellene. Dette blir også ofte regulert ved post-translasjonelle modifikasjoner. 36 Regulering av proteinnedbrytning Stress p53 Kinase HDM2, Ubiquitin 6-20 min U U U UU U UU U U P U U U U P P P P P Ca 20 t Proteasom Stressindusert N-terminal fosforylering av p53 og HDM2 hemmer p53/hdm2-interaksjon og ubiquitinering av p53. Derved øker levetiden til p53 dramatisk. 18
37 Hvordan kan kjennskap til genekspresjon påvirke morgendagens legemidler? Ved å kunne påvirke uttrykket av ulike gener vil en teoretisk kunne bli i stand til å kontrollere en rekke sykdommer. RNAi har stort potensiale for å nedregulere ekspresjon, men kan også brukes til å hemme syntesen av repressorer, for å øke ekspresjon. En annen mulighet er syntetiske molekyler som påvirker selve transkripsjonsapparatet. Slike agens kunne også gjøres så spesifikke at de selektivt påvirket transkripsjonsfaktorer som produseres av infeksiøse agens (eks HIV), uten å påvirke de humane transkripsjonsfaktorene. Det foregår i dag intens forskning på dette området, f. eks. i forbindelse med hyperkolesterolemi (oppregulere produksjon av LDLreseptor i leverceller). 38 Storskala studier av genekspresjon For å kunne studere hvordan flere tusen gener i bestemte celler uttrykkes samtidig, har en utviklet metoder for både mrna og proteinkvantifisering Eks: mrna: Healthy cells Sick cells 19
39 Eks: Protein Alle proteinene fra en celletype kan isoleres og separeres ved 2Dgelelektroforese. Etter farging av gelen, kan endring i mengde mellom friske/syke celler kvantifiseres. Ukjente proteiner kan også identifiseres ved hjelp av massespektrometriske metoder 2D-gel av totalcelleekstrakt farget med Comassie brilliantblå. Gelbildene er digitalisert og analysert med PDQuest software. Ulikt uttrykte proteiner er markert med gult. I de forstørrede områdene kan en se at karbonsyre anhydrase (CAII) og glutation-s-transferase (GST)-nivået er høyt i friske celler, mens flere isoformer av CAII er sterkt redusert i tumorcellene. Normal colon Colon tumor 40 Oppsummering: Hva bør du kunne etter denne forelesningen? Relevante læringsmål, Biokjemi; 5 Genetikk, cellebiologi 5.1 Studenten skal kunne: 5.1.1 gjøre detaljert rede for nukleinsyrenes kjemiske og fysiske egenskaper, den genetiske koden, replikasjon, transkripsjon, translasjon og prinsipper for regulering av genekspresjon 5.1.2 beskrive de viktigste metodene innen moderne molekylærbiologi, og forklare prinsippet for hybridisering 1. Transkripsjon (DNA pakking, HAT/HDAC, promotorelement, epigenetikk/genomisk imprinting,.. 2. Posttranskripsjonell prosessering (mrna stabilitet, ) 3. mrna degradering (polyadenylering, RNAi, 4. Translasjon (alternativ spleising ulike protein) 5. Posttranslasjonell prosessering (Fosforylering, acetylering,..) 6. Protein degradering (Ubiquitinering, ) 7. Protein plassering og transport Ulike metoder for å studere genekspresjon 20