REGULERING AV TRANSKRIPSJON I EUKARYOTE ORGANISMER

REGULERING AV TRANSKRIPSJON I EUKARYOTE ORGANISMER av Frank Skorpen, IKM, DMF, NTNU FORELESNING April 2001 Cellebiologi - Hovedfag 1

REGULERING AV TRANSKRIPSJON I EUKARYOTE ORGANISMER Det er flere nøkkel-mekanismer for regulering av gen-uttrykk (gen-ekspresjon) i eukaryote celler. Disse omfatter aktivering (klargjøring) av gen-struktur, initiering av transkripsjon, terminering av transkripsjon, nukleær RNA-prosessering, mrna transport, mrna translasjon, og mrna stabilitet. Videre kan gen-uttrykk reguleres på post-translasjonelt nivå (protein-nivå). Dette omfatter bl.a. kjemisk modifisering eller prosessering av proteinet, intracellulær lokalisering, samt protein-stabilitet. Selv om alle disse mekanismene bidrar til å regulere gen-uttrykk, så skjer vanligvis hoveddelen av reguleringen på transkripsjons-initierings nivå. Transkripsjons-initiering eller -aktivering i eukaryote celler krever et nært samarbeid mellom en rekke protein-faktorer: RNA polymerase, generelle transkripsjonsfaktorer, sekvensspesifikke DNA-bindende aktivatorer og repressorer, samt ko-aktivatorer (adaptor-proteiner). I eukaryoter finnes tre forskjellige RNA polymeraser i kjernen som syntetiserer RNA på et DNA templat. Som en hovedregel kan en si at RNA pol I transkriberer ribosomale gener (rdna), RNA pol II transkriberer proteinkodende gener, og RNA pol III transkriberer trna gener. I tillegg transkriberer RNA pol II og III et mindre antall small nuclear RNA genes, hvis produkt tjener som ko-faktorer i forskjellige celluære prosesser, slik som RNA spleising. (En fjerde RNA polymerase finnes forøvrig i mitokondriene). Dette notatet fokuserer på transkripsjons-initiering med RNA pol II som et ledd i syntesen av mrna. Notatet er tenkt som utfyllende tekst til vedlagte kopier av slides. Promotere og enkancere/silencere I forbindelse med gener finnes regulatoriske områder som styrer uttrykket av det tilhørende gen, som oftest etter cellas behov. Genet kan være uttrykt mer eller mindre konstant, slik som for β-actin eller glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), uttrykt primært i S-fasen av cellesyklus (eks. DNA polymerase α), eller uttrykt bare ved tilstedeværelse av spesifikke signaler (eks. hormoninduserte gener). Hvordan genet skal uttrykkes bestemmes av organiseringen (DNA-sekvensen) av de tilhørende regulatoriske områder, dvs. genets promoter og enhancer/silencer sekvenser. Promotere Promoter-regionen er vanligvis lokalisert like foran (5, eller oppstrøms for) genet, og er pr. def. en del av genet. Promotere kan igjen deles i minst to funksjonelle områder: core promoter, som er bindings-stedet for RNA polymerase-komplekset (RNA pol II + et sett av 5 generelle transkripsjonsfaktorer: TFIID,-B,-F,-E,-H), og proximale promoter som utgjør bindingsområdet for sekvens-spesifikke DNA-bindende proteiner, transkripsjons-aktivatorer eller -repressorer. Bindings-elementene i proximale promoter blir vanligvis omtalt som proximale enhancer-elementer. Samspillet mellom aktivatorer og repressorer bestemmer hvor hyppig RNA polymerasekomplekset binder til core-promoter og starter transkripsjon. Core-promoter elementer 2

Det best beskrevne core-promoter elementet er TATA-boksen, som utgjør bindings-setet for TATA-bindende protein (TBP). TBP er en komponent av den generelle transkripsjonsfaktoren TFIID (TBP + flere TBP associated factors, TAFs). Bindingen av TBP til TATA-boksen danner en plattform for binding av RNA polymerasen og de andre generelle faktorene i komplekset. I tillegg til TATA-boksen er INR (initiator element), TBBE (TFIIB-bindende element), samt DPE (downstream promoter element) beskrevet som core-promoter elementer, men funksjonen til disse elementene er framdeles lite kjent. Forskjellige gener har gjerne forskjellig sammensetning av core-promoter elementer; noen har bare ett av elementene mens andre har en kombinasjon av flere. TATA-bindende protein (TBP) binder også til promotere som mangler TATA-boks, men bindingen er da vanligvis avhengig av de assosierte TAFs. Enhancere/silencere I tillegg til promoteren finnes regulatoriske områder som i prinsippet kan være lokalisert hvor som helst (men vanligvis på samme kromosom innenfor en avstand på noen få tusen basepar fra genet). Disse områdene kalles distale enhancere og silencere, og binder aktivatorer eller repressorer som bidrar til å forsterke eller redusere gen-uttrykket. Mens funksjonen av de proximale enhancer-elementene er avhengig av lokalisering og orientering i forhold til core-promoteren, fungerer de distale enhancerne uavhengig av avstand og orientering (dvs. de kan være lokalisert både 5 for genet, 3 for genet, i genet, og de kan inverteres). Det finnes ingen gener som er eksakt lik i sin organisering av promotere og enhancere/silencere; derfor kan uttrykket av gener reguleres individuelt. Gener uttrykkes forskjellig fordi de binder forskjellige sett av transkripsjons-aktivatorer og repressorer, og, forskjellige celler uttrykker forskjellige gener fordi de inneholder forskjellige sett av transkripsjons-aktivatorer og repressorer. Aktivatorer og repressorer Aktivatorer Aktivatorer er proteiner og har minst to funksjonelle domener, et DNA-bindende domene og et aktiveringsdomene. Gjennom DNA-bindende domene binder aktivatoren til korte (vanligvis 4-10 bp), spesifikke DNA-sekvenser i promotere og enhancere (gjenkjennings-setet for aktivatoren). Aktiveringsdomenet er involvert i rekruttering og interaksjon med transkripsjonsmaskineriet. Man vet lite om hva som kjennetegner aktiveringsdoméner; de har ingen typisk struktur og i mange tilfeller er deres eneste karakteristika en netto negativ ladning. Mange aktivatorer binder som homo- eller heterodimerer. Disse aktivatorene har derfor et tredje domene, dimeriseringsdomenet. Aktivatorer deles inn i familier ut ifra struktur. De mest kjente er: Zink finger proteiner (eks. TFIIA ko-aktivator) Helix-loop-helix (binder som dimér, eks. c-myc/max) Helix-turn-helix (binder som dimér, eks. homeoproteiner) Leucine zippere (binder som dimér; eks AP1=Fos-Jun; Jun-Jun) 3

Repressorer Kunnskapen om hvordan silencere og repressorer fungerer er begrenset. I noen tilfeller overlapper repressor-elementer helt deller delvis med enhancer-elementer, slik at binding av repressor utelukker samtidig binding av aktivator. Noen repressorer, hvis funksjon er relativt godt beskrevet, vil bli omtalt senere i dette notatet. Aktivatorer rekrutterer transkripsjonskomplekset Selv om alle eukaryote RNA polymeraser er store, komplekse proteiner bestående av minst 12 forskjellige subenheter, er de ikke i stand til å gjenkjenne promoteren på egen hånd. Transkripsjons-aktivatorer tror man først og fremst stimulerer transkripsjon ved å rekruttere RNA pol II og de generelle transkripsjons-faktorene (TFIID, -B, -F, -E, -H) til core promoter, ikke ved å aktivere et allerede bundet transkripsjonskompleks. Bakgrunnen for denne teorien er det faktum at aktivatoren selv må være bundet til DNA for å kunne aktivere. De generelle transkripsjons-faktorene er nødvendige for å bygge opp et funksjonelt preinitierings-kompleks (PIC), og er sannsynligvis nødvendige for transkripsjon av alle gener. Så snart et funksjonelt PIC er etablert, fosforyleres det C-terminale domenet av den største RNA pol II subenheten, promoteren smelter (dvs. de to trådene i DNA skiller lag og det dannes et åpent promoter-kompleks), og transkripsjonen av genet starter. Det er holdepunkter for at rekrutteringen av RNA pol II + de generelle faktorer kan skje på to måter: 1. Trinnvis rekruttering av individuelle faktorer. Starter med rekruttering av TFIID (hvor TBP binder til TATA-boksen, eller tilsvarende bindings-sete i TATA-løse promotere). TBP deformerer TATA-boksen på en slik måte at TBP/DNA -komplekset danner en plattform for videre binding av TFIIB, som igjen definerer hvor RNA polymerasen skal binde. Deretter følger i ordnet rekkefølge TFIIF + RNA pol II, og TFIIE + TFIIH. 2. To-trinns rekruttering. Først rekruttering av TFIID; deretter et kompleks bestående av de resterende faktorer og RNA pol II (+ flere faktorer som vi kommer tilbake til). In vitro-studier har vist at etablering av et funksjonelt pre-initierings-kompleks er alt som skal til for å starte transkripsjon. Men, nivået av transkripsjon som oppnås in vitro er vanligvis marginalt. Effektiv transkripsjon oppnås først når mange aktivatorer binder til promoterelementer og enhancer-elementer samtidig. På denne måten kan aktivatorer virke synergistisk; dvs. den samlede aktiverende funksjon er større (vanligvis mye større) enn summen av bidraget fra hver enkelt aktivator. Man tror derfor at rekruttering in vivo først og fremst skjer etter modell 2 beskrevet over, og at mange aktivatorer samtidig, direkte eller indirekte, kontakter flere komponenter av et større transkripsjonskompleks og besørger effektiv rekruttering i to trinn; først TFIID, deretter resten av komplekset. Aktivatorer kan stimulere transkripsjon ved å bringe andre DNA-bundne aktivatorer i kontakt med hverandre Gen-regulering i eukaryote krever gjensidig påvirkning fra mange regulatoriske elementer i promoteren, og noen aktivatorer kan bidra til synergi ved å bringe andre transkripsjonsaktivatorer i kontakt med hverandre. F.eks. kan dimérer av Fos og Jun (leucine zipper som binder til AP-1 elementer) virke ved å bøye DNA-helixen; Fos-Jun heterodimérer bøyer DNA-helixen i én retning, mens Jun/Jun homodimérer bøyer helixen i motsatt retning. Dersom en gunstig konformasjon for kontakt 4

mellom aktivatorer bare oppnås ved bøying den ene veien vil transkripsjons-nivået av genet påvirkes av hvilken type dimér som binder. Et annet eksempel er YY1 (yin-yang 1). YY1 er et zinc-finger protein som virker som en aktivator når den binder CCAT elementer på den ene siden av DNA helixen, men som fungerer som en repressor når den binder samme sekvens på den andre siden av DNA helixen. Dette har også sammenheng med bøying av DNA-helixen i forskjellig retning. 5 -CCAT-3 aktivator 5 -ATGG-3 repressor 3 -GGTA-5 3 -TACC-5 I disse eksemplene virker ikke aktivatorene direkte på transkripsjons-maskineriet, men bidrar til mer effektiv rekruttering via andre aktivatorer. I disse tilfellene er det derfor riktigere å si at aktivatorene fungerer som DNA-bundne ko-aktivatorer. Aktivatorer virker vanligvis gjennom ikke-dna-bundne ko-aktivatorer In vitro-studier med RNA polymerase II og rensede generelle transkripsjonsfaktorer har vist at DNA-bundne aktivatorer vanligvis ikke er tilstrekkelig for rekruttering av transkripsjonskomplekset til promotere. Det betyr at andre faktorer i tillegg er nødvendige for transkripsjon in vivo. Et stort kompleks ble isolert fra gjær og vist å kunne aktivere transkripsjon in vivo. Dette komplekset, kalt SRB/Mediator komplekset, bestående av opptil 16 forskjellige subenheter, har blitt vist å være assosiert med RNA pol II og noen av de generelle transkripsjonsfaktorene i et stort kompleks kalt RNA polymerase II holoenzym. Funksjonen til alle SRB/Med proteinene er ikke klarlagt. Noen SRB proteiner har blitt vist å være adaptor-proteiner, og virker stimulerende på transkripsjon ved å overføre signalet fra aktivatoren til transkripsjons-maskineriet. Andre proteiner i komplekset (Srb8, -9, -10 og 11) virker negativt på transkripsjon ved å hindre dannelsen av et funksjonelt pre-initieringskompleks. For eksempel, Srb10 og Srb11 danner et cyclin-avhengig cyclin-kinase kompleks som fosforylerer det C-terminale domene av RNA pol II før den er bundet til core-promoter. Dette gjør at polymerasen ikke kan binde. Bruk av micro-array teknikk (hvor det er mulig å se på uttrykket av flere tusen gener samtidig) har vist at minst ét av SRB-proteinene, Srb4, er essensiell for transkripsjon av de aller fleste gener. Dette viser at transkripsjons-aktivatorer vanligvis virker gjennom ikke-dnabundne ko-aktivatorer eller adaptor-proteiner. Transkripsjons-aktivatorer kan slås på og av Aktivatorer foreligger ikke i aktiv form hele tiden. Dette ville gjøre det vanskelig å fin-regulere gen-aktiviteten, og det er heller ikke fordelaktig for cellen å lage proteiner i overskudd. Derfor kan aktivatorer slås på og av etter behov. Aktivatorer kan for eksempel nydannes som respons på et stimuli. Dette krever transkripsjon og påfølgende translasjon, og er derfor en relativt treg respons. Aktivatorer kan også foreligge i cella i inaktiv form, og aktiveres ved en kjemisk modifisering, slik som fosforylering eller acetylering. Dette vil kunne gi en rask respons. Aktivatorer som foreligger i svært små mengder kan også aktiveres ved proteinstabilisering; dvs. proteinets levetid øker med påfølgende akumulering i cella. For eksempel: ioniserende stråling eller UV-stråling (som begge gir DNA-skade) fører til at p53 proteinet stabiliseres. p53 er en transkripsjonsfaktor nødvendig for å indusere gener ansvarlige for å 5

stoppe celle-syklus i G1 fasen, samt for induksjon av gener involvert i DNA reparasjon og apoptose. Aktivatorer kan foreligge i aktiv form, men i cytosol. Som svar på et stimuli blir de transportert aktivt inn i kjernen. Aaktivatorer kan også aktiveres ved binding av et signalmolekyl, for eksempel et hormon (eks. steroid hormon reseptor + steroid hormon), eller ved at DNA-bindende doméne og aktiveringsdoméne bringes sammen først når det foreligger bestemte forhold i cella. Transkripsjons-aktivering i kromatin DNA i eukaryoter er organisert som kromatin; dvs. ca 180-200 bp av DNA er tvunnet rundt en oktamer av basiske proteiner, histoner, i det som kalles en nukleosom. Mellom nukleosomene (linker-regionen) kan DNA være assosiert med ytterligere et histon, H1. Pakkingen av eukaryot DNA i nukleosomstrukturer har dramatiske effekter på enhver prosess som forutsetter interaksjon mellom DNA og DNA-bindende proteiner, herunder DNA replikasjon, DNA reparasjon og DNA transkripsjon. Nukleosomer hemmer bindingen av transkripsjons-faktorer, og slike strukturer må derfor løses opp eller remodelleres for å få initiert transkripsjon. To typer høyt konserverte enzymsystemer har blitt isolert og vist å være involvert i remodellering av kromatin: ATP-avhengige remodellerings-systemer, og nukleære histon acetyltransferaser (HATs) og histon deacetylaser (HDACs). Begge typer enzymer kan rekrutteres til promotere via direkte interaksjon med transkripsjons-aktivatorer, og kan også finnes som en del av enkelte RNA polymerase holoenzym-komplekser. Histon acetyltransferaser (HAT) Overfører en acetylgruppe fra acetyl co-a til lysin i histonenes N-terminale del. Hver acetylgruppe nøytraliserer en positiv landning, og dette svekker interaksjonen mellom DNA (negativt ladet) og histonet. HAT aktivitet har blitt vist å være assosiert med en rekke forskjellige transkripsjonsfaktorer, enten ved at transkripsjonsfaktoren selv har HAT aktivitet, eller ved at et HAT enzym binder til transkripsjons-faktoren. På denne måten kan HAT aktivitet rekrutteres til promoterområder. Man vet ikke helt hvordan aktivatorer kan gjenkjenne bindings-setet sitt når det foreligger i kromatin, men man antar at den likevel kan ha en svak affinitet for setet. Aktivator-bundet HAT-aktivitet kan da løse opp kromatinstrukturen slik at aktivatoren lettere kan binde. CREB, E2F, p53, og Fos/Jun er alle eksempler på aktivatorer som kan binde HAT-aktivitet. Noen faktorer har intern HAT aktivitet. Et eksempel er den største TBP assosierte faktoren (TAF), TAF II 250. Man antar at TAF II 250 er viktig for å løse opp nukleosom-struktur i området hvor TBP skal binde. HAT enzymer kan også acetylere transkripsjonsfaktorer, slik at disse endrer sin aktivitet. Etter UV-bestråling vil p300/cbp (CREB-binding protein associated factor) acetylere p53 slik at denne øker sin binding til DNA. Histon deacetylaser (HDAC) 6

Histon deacetylaser virker motsatt av HAT de fjerner acetylgrupper fra histoner, og på denne måten forsterkes interaksjonen mellom histoner og DNA. Dette hemmer transkripsjon. HDAC-proteiner virker derfor som transkripsjons-repressorer. Flere HDAC-aktiviteter har blitt isolert fra humane celler. Tumor-suppressor proteinet Rb (retinoblastoma) undertrykker transkripsjon ved å binde HDAC1. HDAC1 deacetylerer nukleosomer i promotere som f.eks. binder Rb via transkripsjonsfaktoren E2F. E2F binder til E2F elementer i gener som uttrykkes primært i S-fasen, og utenfor S-fasen undertrykkes disse genene bl.a. ved å binde E2F/Rb/HDAC komplekser. HDAC2 kan binde til transkripsjonsfaktoren YY1 og undertrykke transkripsjon på tilsvarende måte som for Rb/HDAC1. ATP-avhengige remodellerings-systemer; SWI/SNF SWI/SNF komplekset (for switching mating type, og sucrose non-fermenting; refererer til gjær med mutasjoner i dette systemet) er en 2 MDa multi-subenhet DNA-avhengig ATPase som bidrar til regulering av gen-ekspresjon ved å endre kromatin-struktur. Komplekset ble først påvist i gjær, men tilsvarende systemer finnes også i humane celler. Eksakt hvordan SWI/SNF bruker ATP til å remodellere nukleosomer er ikke klart. Det som er klart er at siden det bare er noen få hundre SWI/SNF- komplekser per celle så må komplekset rekrutteres spesifikt til de promoterene som er avhengige av remodellering. Én måte komplekset kan rekrutteres på er gjennom direkte interaksjon med sekvens-spesifikke aktivatorer. En annen mulighet er at komplekset rekrutteres som en del av et større RNA pol II holoenzymkompleks. Noe overaskende har det vist seg at uttrykket av en hel rekke gener faktisk er negativt regulert av SWI/SNF. Bakgrunnen for dette er ikke kjent, men kan muligens forklares med at kromatin remodellering i noen gener gjør det lettere for repressorer å binde, eller at SWI/SNF i realiteten kan remodellere nukleosom-strukturer begge veier, dvs. også mot en tettere struktur. En direkte link mellom SWI/SNF og hemming av gen-ekspresjon kommer fra studier som har vist at SWI/SNF kan interaktere med tumor-suppressor proteinet Rb (jfr. HDAC1 og Rb over). Det er også vist at aktiviteten av SWI/SNF kan reguleres gjennom forskjellige faser av cellesyklus ved fosforylering og de-fosforylering. Det betyr at komplekset kan spille en viktig rolle i celle-syklus-regulert gen-ekspresjon. Det er indikasjoner på at HATs, HDACs og ATP-avhengige remodellerings-systemer kan eksistere i store komplekser i cella (av og til som en del av RNA pol II holoenzym), og at de arbeider sammen på promotere som er sensitive for nukleosom-struktur. Hvordan slike systemer arbeider sammen, dvs. i hvilken rekkefølge, er ukjent. Oppsummering Transkripsjonsaktiviteten av et gen bestemmes i hovedsak av hvor effektivt RNApolymerase II og de generelle transkripsjons-faktorene rekrutteres til promoteren og danner et funksjonelt pre-initierings-kompleks. Hvor effektivt dette skjer bestemmes av den co-operative og synergistiske effekten av de til enhver tid bundne aktivatorer og repressorer. Hvilke aktivatorer og repressorer som binder reguleres via signal-spor i cella. In vivo eksisterer transkripsjonsmaskineriet i store komplekser, RNA pol II holoenzym, hvis sammensetning kan variere fra promoter til promoter. Hvordan sammensetningen av 7

holoenzymet bestemmes er ikke kjent, men en mulighet er at dette styres helt eller delvis av promoter- og enhancer-bundne aktivatorer. Det foreligger visse indikasjoner på at større sett av gener, med lignende eller utfyllende funksjoner, krever visse nøkkel-komponenter av holoenzymet. Dette kan være sett av gener involvert i celle-syklus kontroll, gener involvert i DNA reparasjon, eller gener involvert i DNA syntese, osv. Bortfall av slike nøkkel-komponenter i transkripsjonskomplekset vil dermed påvirke uttrykket av et helt sett av gener, og illustrerer en meget effektiv måte å regulere gener på. Sett av gener kan slås på eller av etter behov, bare ved å regulere aktiviteten (eks. ved fosforylering) eller tilgjengeligheten (eks. nukleær versus cytoplasmisk lokalisering) av en eller noen få nøkkelkomponenter. Assosiert med RNA pol II holoenzymkomplekset finnes kromatin-remodellerende komplekser. Disse kompleksene, eksemplifisert ved SWI/SNF og HATs/HDACs, er nødvendige for å klargjøre promotere for aktivatorbinding, og for binding av RNA pol II og de generelle transkripsjons-faktorene. Ikke alle promotere er avhengige av kromatin remodellering, og SWI/SNF og HATs/HDACs rekrutteres derfor selektivt som del av promoter-spesifikke holoenzymkomplekser. SWI/SNF og HATs/HDACs kan også rekrutteres aktivt til visse promotere via direkte interaksjon med sekvens-spesifikke aktivatorer. 8